DE3003624A1

DE3003624A1 - Antibiotica c-19393 s tief 2 und h tief 2

Info

Publication number: DE3003624A1
Application number: DE19803003624
Authority: DE
Inventors: Mitsuko Asai; Setsuo Harada; Akira Imada
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1979-02-02
Filing date: 1980-02-01
Publication date: 1980-11-20
Also published as: GB2042532B; AU534530B2; ES488836A0; PH14316A; AU5451880A; IT1130246B; IT8019645A0; US4518529A; HU181721B; NL8000628A; FR2447922B1; CH646432A5; GB2042532A; SU1075984A3; ES8102590A1; PT70710A; SE8000842L; FR2447922A1; DK12580A

Description

Antibiotica C-19393 S₂ und Hp

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die
Antibiotika C-19393S₂ und C-19393H₂, welche neue Verbindungen sind, sowie auf deren Salze und auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Antibiotika C-19393S₂ und/oder C-19393H_?.

Es ist gelungen, eine Anzahl von Mikroorganismen aus Bodenproben zu isolieren und die durch diese Mikroorganismen erhältlichen Antibiotika zu untersuchen. Aufgrund dieser Versuche wurde festgestellt, dass ein gewisser Mikroorganismus fähig ist, neue Antibiotika zu erzeugen, wobei
dieser Mikroorganismus der Gattung Streptomyces angehört.
Es wurde auch festgestellt, dass die Züchtung dieses Mikroorganismus in einem geeigneten Züchtungsmedium neue Verbindüngen in der Kulturbrühe anzureichern vermag und dass diese Verbindungen gegen gramnegative und grampositive Bakterien eine antimikrobielle Wirkung besitzen. Es wurden somit die oben erwähnten Antibiotika isoliert, welche aufgrund
ihrer chemischen und physikalischen Eigenschaften

als neu. angesehen werden müssen und der folgenden allgemeinen Formel entsprechen:

■zn ■ _n _1N ,^ _ix NH-COCH,

R-O M \nnu 3

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■ - i\ -

worin R den Rest -SO-,Η oder das Wasserstoff atom bedeutet.

In der obigen Formel. I wird die Verbindung, in welcher R den Rest -SO,H darstellt, als Antibiotikum C-19393Sp und die Verbindung, in welcher R das Wasserstoffatom darstellt, als Antibiotikum C-19393H_? bezeichnet.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher (1) auf die Antibiotika C-19393Sp und C-19393H₂ der folgenden allgemeinen Formel:

"NH-COCH.

ⁿ~^u O COOH
15

worin R den Rest -SO-,Η oder das Wasserstoff atom bedeutet, und

(2) auf ein Verfahren zur Herstellung der besagten Antibiotika C-19393S₂ und/oder C-19393H₂, welches darin besteht, dass man einen zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus, welcher die Antibiotika C-19393S₂ und/oder C-19393Hg zu erzeugen vermag, in einem Kulturmedium züchtet, um dank dem Mikroorganismus in der Kulturbrühe die Antibiotika C-19393S₂ und/oder C-19393H₂ anzureichern, worauf man diese Antibiotika C-19393S₂ und/oder C-19393H₂ aus der besagten Brühe isoliert.

In der vorliegenden Beschreibung wird das Antibiotikum C-19393S₂ nachstehend kurz als "C-19393S_?" und das Antibiotikum C-19393H₂ kurzerhand als "C-19393H₂" bezeichnet.

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BAD ORIGINAL

Zur Herstellung der Antibiotika C-19393S₂ und/ oder C-19393H₂ verwendet man gemäss vorliegender Erfindung einen zur Gattung Sfreptomyces gehörenden, die Antibiotika C-19393Sp und/oder C-19393Hp erzeugenden Mikroorganismus.

Ein typisches Beispiel eines solchen Mikroorganismus ist Streptomyces sp. Stamm C-19393 (nachstehend hin und wieder als "Stamm C-19393" bezeichnet, welcher dadurch erhalten wurde, dass man eine Suspension einer in Schweden gesammelten Bodenprobe in sterilem Wasser auf einem Kulturmedium, welches sich aus 1 % lösliche Stärke, 0,05 % Harnstoff, 0,05 % Polypepton (Daigo Nutritive Chemicals, Ltd., Japan), 0,05 % Hefeextrafct (Difco, USA), 0,02 % Dikaliumphosphat, 0,02 % Kaliumchlorid, 0,01 % Magnesiumsulfat, 5 Ug/ml Bleomycin und 2 % Agar besteht und einen pH-Wert von 7j0 aufweist, der Plattenkultur unterzieht und den bei Züchtung der Kolonie während 2 Wochen bei 28 ⁰C gebildeten Mikroorganismus wiederholt reinigt.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Strptomyces sp. Stamm C-19393 sind die folgenden:

a) Morphologische Eigenschaften

Das Luftmycel hat eine Dicke von ungefähr 1 ii und erstreckt sich aus dem weit verzweigten, vegetativen Mycel. Dies verzweigt sich monopodial aus der Hauptachse unter Bildung von Nebenketten. Gerade verlaufende oder schwach verbogene Sporenketten, d.h. sogenannter "rectus flexibilis" (nachstehend kurzerhand mit "RP" bezeichnet) können am Ende der Seitenkette festgestellt werden. Jede Spare hat eine zylindrische Form (0,35-0,55 ρ x 0,7-1,4 n) und eine glatte Oberfläche. Es werden weder spezifische

r. β ~

Organe, wie z.B. sphärische Sporangien und' Sclerotia, noch bewegliche Sporen beobachtet.

b)

Die Züchtungseigenschaften des Stammes auf verschiedenen Medien finden sich in der folgenden Tabelle 1. Soweit nichts anderes ausgesagt wird, wurden die Eigenschaften nach Züchtung während 2 Wochen bei 28 ⁰C festgestellt .

Tabelle 1

Medium	Wachstum	Luft- mycel	Rückseite	lösliches Pigment
Saccharose Nitrat-Agar	massig	weiss	farblos	kein
Glucose- Asparagin- Ag ar	schwach	weiss	■farblos	kein
Glycerin- Asparagin- Agar	massig	weiss	farblos	kein
Stärkeagar	massig	kein	bcker	kein
Nähragar	massig	weiss	elfenbeinfarben	kein
Tyrosinagar	massig	kein	farblos	kein
Hefeextrakt- Malzextrakt- Agar .	massig	kein	gräulichgelb	kein
Weizenmehlagar	massig	weiss	farblos	kein

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Der Stamm C-19393 zeigt ein ausgiebiges Wachstum auf einem 2 # Weizenmehls 2 $ Tomatenpaste₃ 0,2 % Bovril (der Firma Bovril, England) und 2 % Agar enthaltenden Medium, welches einen pH-Wert von 7,0 aufweist (nachstehend als "T Medium" bezeichnet.), wobei gräulich-gelbe Luftmycelien reichlich gebildet werden. Es bildet sich kein lösliches Pigment.

c) Physiologische

(1) Temperaturbereich für das Wachstum: unterer Wert: <" 15 ⁰C oberer Wert : 32 bis 35 ⁰C optimale Temperatur 26,5 bis 30 ⁰C (2) Verflüssigung von Gelatine: positiv

(3) Hydrolyse von Stärke : positiv

(4) Peptonisierung von Magermilch: positiv Koagulierung von Magermilch : negativ

(5) Erzeugung von Melanoidpigmenten: Tyrosin-Agar ■ " : negativ Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar : negativ

(6) Die Assimilierung von Kohlenstoffquellen (auf Pridham-Gottlieb-Agar) erfolgt gemäss nachstehender Tabelle 2. '

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Tabelle 2

Kohlenstoffquellen Assimilation

Glycerin +

i-Inositol · . + D-Mannitol

D-Xylose +

L-Arabinose +

D-Glucose · +

D-Galactose +

D-Pructose +

Maltose + Saccharose

Rhamnose +

Raffinose

Stärke . +

Cellulose + Blindversuch (ohne Zusatz)

Bemerkung: - kein Wachstum

+ Wachstum zweifelhaft
+ Wachstum

Aus den oben erwähnten, verschiedenen Eigenschäften geht hervor, dass der Stamm C-19393 offensichtlich der Gattung Streptomyces angehören dürfte. Aufgrund der obigen Beobachtungen wurde die taxonomische Stellung des Stammes C-19393 überprüft und dabei festgehalten, dass dieser Stamm ein weisses bis gelbes Luftmycel entwickelt, die Sporenkette RP ist, die Sporenoberfläche glatt ist, Melanoidpigmente und lösliche Pigmente auf

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den Medien nicht erzeugt werden., keine bestimmte Farbe auf der Rückseite festgestellt wird und der Stamm Mannitol nicht verwertet, wobei zu diesem Zwecke die folgenden Literaturstellen herangezogen wurden:
Literaturzitat 1. S.A. Waksman, "The Actinomycetes",

Bd. 2, I96I
Literaturzitat 2. Bergey's Manual of Determinative

Bacteriology₅ 8. Ausgabe, 1974

Literaturzitat 3. E.B. Shirling und D. Gottlieb, "International Journal of Systema

tic Bacteriology", Bd. l8, S. 69-189, 1968; ibid, Bd. 18, S. 279-392, 1968; ibid. Bd. 19, S. 391-512, 1969; und ibid, Bd. 22, S. 265-394, 1972.

Es konnte indessen in den obigen Literaturstellen 1 bis 3 kein Stamm gefunden werden, welcher sämtliche Eigenschaften des Stammes C-19393 aufgewiesen hätte. Es wurde daher der neue Stamm mit 7 in der Literaturstelle 2 auf Seiten 751, Tabelle 17.4lb beschriebenen Stämmen verglichen, welche sich auszeichnen durch weisse Luftmycelien, RP, keine Melanoidpigmenterzeugung und glatte Sporenoberfläche. Streptomyces galtieri, welcher Mannitol nicht verwertet, unterscheidet sich aber vom Stamm C-19393 insofern, als der erstere auf einem Saccharosenitratmedium (nachstehend als "Czapek" bezeichnet) nicht wächst. Ausserdem sind die Arten der durch den Stamm C-19393 und S. galtieri verwerteten Quellen häufig verschieden. Unter den Stämmen, wie sie in der Tabelle 17.4Ib aufgezählt sind, ist Streptomyces albovinaceus dem Stamm C-19393 bezüglich der Verwertung von anderen Kohlenstoffquellen als Mannitol

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ähnlich, jedoch vom Stamm C-19393 insofern verschieden, als der erstere Stamm rote bis rosefarbene, lösliche Pigmente erzeugt.

Von den 41 in Tabelle 17.43b auf den Seiten 795-796 in der Literaturstelle 2 aufgezählten Stämmen, die sich durch ein gelbes Luftmycel, RP, keine Melanoidpigmenterzeugung und glatte Sporenoberfläche auszeichnen, verwertet lediglich Streptomyces canescens kein Mannitol. Dieser Stamm unterscheidet sich aber vom Stamm C-19393 insofern, als der erstere auf Czapek nur schwach wächst und überdies Xylose und Rhamnose nicht verweiltet. Dem Stamm C-19393 hinsichtlich der Verwertung von Kohlenstoffquellen ausser Mannitol ähnliche Stämme sind weiter unten beschrieben, doch unterscheidet sich ein jeder dieser Stämme vom Stamm C-19393 durch die in Klammern'vrieder gegebenen Angaben. Sowohl die Farbe des Luftmycels als auch die Erzeugung löslicher Pigmente wurden mit dem Stamm C-19393 und den typischen Stämmen der entsprechenden Spezies verglichen:

Streptomyces chrysomallus (Farbe des Luftmycels und Erzeugung von löslichen Pigmenten), Streptomyces citreofluorescens (Farbe des Luftmycels und Erzeugung von löslichen Pigmenten), Streptomyces fimicarius (sphwaches Wachstum auf Czapek), Streptomyces globisporus (grosser Sporendurchmesser, schwache Stärkeverwertung), Streptomyces globisporus subsp. vulgaris (schwaches Wachstum auf Czapek), Streptomyces griseinμs (schwaches Wachstum auf Czapek und Koagulierung von Magermilch), Streptomyces parvus (Erzeugung löslicher Pigmente und grosser Sporendurchmesser) und Streptomyces setonii (schwaches Wachstum auf Czapek und Erzeugung von löslichen Pigmenten).

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Ueberdies wurden von den in der Literaturstelle 3 beschriebenen Stämmen des "International Streptomyces Project" insgesamt 34 Stämme₃ die sich auszeichnen durch' ein weisses bis gelbes Luftmycel₃ durch keinerlei Bildung von Melanoidpigment, durch keine bestimmte Farbe auf der Rückseite, durch keine Bildung eines löslichen Pigmentes und durch die Anwesenheit von RF Sporenketten und einer glatten Sporenoberfläche, direkt mit Stämmen gemäss Literaturstellen I₅ 2 und 3 und nötigenfalls sogar mit Originalstämmen davon verglichen, indem man den Stamm auf einem '"!"-Medium, auf welchem der Stamm C-19393 relativ charakteristische Züchtungseigenschaften aufweist, züchtete, wobei man feststellte, dass Streptomyces saprophyticus relativ ähnliche Eigenschaften wie jene des Stammes C-19393 aufwies. Der Stamm C-19393 besitzt aber ein bestimmtes charakteristisches Merkmal, insofern als er nicht Mannitol zu assimilieren vermag, wogegen die meisten der Gattung Streptomyces angehörenden Species, welche weisse bis gelbe Lufmycelien aufweisen, dies zu tun vermögen. Der Stamm C-19393 unterscheidet sich somit eindeutig vom obgenannten Streptomyces saprophyticus. Daraus ergibt sich, dass der Stamm C-19393 eine neue Art darstellt, so dass er als Streptomyces sp. C-19393 bezeichnet wird. Dieser Stamm ist beim Fermentation Research Insitute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba, Japan, unter der Nummer FERM-P Nr. 4.774: am 18. Januar 1979 beim Culture Collection of the Insitute for Fermentation, Osaka, Japan, unter der Nummer IFO 13886; am· 30. Januar 1979 beim American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter der Nummer ATCC 31486.

Wenngleich der Stamm C-19393 gemäss obigen Aus-

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führungen beschrieben worden ist,, so ist doch bekannt, dass verschiedene Streptomyces-Stämme nicht fixiert sind und eine spontane oder künstliche Mutation möglich ist. Somit soll der gemäss vorliegender Erfindung verwendbare Stamm jeden beliebigen Stamm umfassen, welcher der Gattung Streptomyces angehört und die Antibiotika C-19393Sp und/oder C-19393H₂ zu erzeugen vermag.

Die Züchtung im Hinblick auf die Herstellung

•IG der erfindungsgemässen Antibiotika kann durch Wachsenlassen des oben erwähnten Stammes in einem assimilierbare Nährmittel enthaltenden Kulturmedium geschehen. Als Kohlenstoffquellen in diesem Medium können beispielsweise Glucose, Stärke, Glycerin, Dextrin, Saccharose, Hirsebrei, Melassen usw. verwendet werden. Beispiele von Stickstoffquellen sind Pleischextrakte, getrocknete Hefe, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Maisquellflüssigkext, Weizenkeime, Baumwollsamenmehl, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat usw. Nötigenfalls kann man auch dem Medium in geeigneten Mengen anorganische Salze, wie z.B. Calciumcarbonat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphorsäuresalze usw., sowie das Wachstum des Mikroorganismus günstig beeinflussende und die Herstellung der Antibiotika C-19393S₂ und C-19393H₂ begünstigende organische und anorganische Substanzen zugeben.

Auch Salze von Schwermetallen, wie z.B. Ferrosulfat, Kupfersulfat usw., und Vitamine,wie z.B. Vitamin B, _; Biotin usw., kann man nötigenfalls dem Medium zugeben. Auch die Schaumbildung verhindernde Mittel und oberflächenaktive Mittel, wie z.B. Silikonöl, Polyalkylenglykoläther

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usw._} können dem Medium hinzugefügt werden. Andere organische und anorganische Substanzen, welche das Wachstum des Mikroorganus günstig beeinflussen und die Erzeugung von C-19393Sp und/oder C-19393H₂ begünstigen, können ebenfalls in geeigneten Mengen dem Medium zugesetzt werden.

Die Züchtung kann in an sich bekannter Weise_; wie dies im allgemeinen für die Erzeugung von Antibiotika der Fall ist, erfolgen, wobei man entweder ein festes Züchtungsmedium oder ein flüssiges Züchtungsmedium einsetzt. Die Züchtung in flüssigen Medien kann durch stationäre Züchtung, durch Rühren der Kultur, durch Schüttelkultur oder aerobe Kultur erfolgen. Vorzugsweise wird man die Kultur unter Belüftung schütteln. Die Züchtung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereiche von ungefähr 15 ⁰C bis ungefähr 32 ⁰C bei einem pH-Wert von ungefähr 4 bis ungefähr 8 und dies während einer Zeitdauer von ungefähr 8 Stunden bis ungefähr 168 Stunden.

Vorzugsweise erfolgt die Züchtung während 24 bis 144 Stunden.

In der Fermentierbrühe werden die Antibiotika C-19393Sp und/oder C-19393H₂ vorwiegend extrazellulär erzeugt. Daher ist es von Vorteil, die erhaltene Kultur in mikrobielle Zellen und die überstehende Flüssigkeit mittels Zentrifugieren oder Filtrieren zu trennen und hierauf das gewünschte Antibiotikum aus der überstehenden Flüssigkeit zu isolieren. Das gewünschte Antibiotikum kann aber auch direkt aus der Fermentierbrühe gewonnen werden.

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Die Prüfung der Wirkung des erhaltenen Produktes gegenüber Comamonas terrigena IPO 13299 als Testorganismus und unter Verwendung von C-19393S₂ bzw. C-19393H_? als Referenzsubstanz lässt sich nach der Zylinderplattenmethode oder der Papierspheibenmethode unter Verwendung eines Bouillon-Agar-Mediums oder TSA (Trypticase Soy Agar der Baltimore Biological Laboratory, USA) ausführen.

Das Isolieren von C-19393S_P und 0-19393H₉ kann gemäss der für die Isolierung von Metaboliten, welche durch Mikroorganismen erzeugt worden sind, üblicherweise zur Anwendung gelangenden Methode durchgeführt werden. Da beispielsweise die zur Hauptsache extrazellulär erzeugten C-19393S₂ und C-19393H₂ wasserlösliche, saure Substanzen sind, wird man sie im allgemeinen isolieren, indem man die mikrobiellen Zellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren isoliert und dann trennt, worauf man die Wirksubstanz aus dem Piltrat reinigt und gewinnt. Es ergibt sich daraus, dass man dank des verschiedenartigen Löslichkeitsverhaltens und -ausmasses in verschiedenen Lösungsmitteln, dank des Ausfällensverhaltens oder Ausfällungsgeschwindigkeit und dank der Adsorptionsaffinitätsunterschiede zu diesem Zwecke zu verschiedenen Massnahmen greifen kann, wie z.B. Ionenaustauschchromatographie, Molekularsiebchromatographie, Konzentration unter vermindertem Druck und Gefriertrocknung usw. und dies einzeln oder in einer geeigneten Kombinationsform und zwar in beliebiger Reihenfolge oder sogar wiederholt. Beispiele von verwendbaren Adsorptionsmitteln sind Aktivkohle, Adsorptionsharze, Anionenaustauschharze, gepulverte Cellulose, Silikagel usw. oder Trägermittel mit Molekularsieb-

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eigenschaften. Beispiele von Eluierungslösungsmitteln, welche verwendet werden können, sind wässrige Lösungen von wasserlöslichen, organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Aceton, Methanol, Aethanol, Propanol, Butanol₃ Isopropanol, Isobutanol usw., oder wässrige Lösungen von Säuren oder Alkali, Puffermittel, wässrige Lösungen von anorganischen oder organischen Salzen und dies ungeachtet des Umstandes, dass die geeignet erscheinenden Lösungsmittel je nach der Art des Trägermittels versdiieden sein können.

Das Antibiotikum C-19393Sp wird nach beendeter Züchtung aus der Fermentierbrühe unter Verwendung eines Filterhilfsmittels zwecks Abtrennung der mikrobiellen Zellen abfiltriert. Das so erhaltene Filtrat wird durch eine Säule von Aktivkohle unter neutralen oder schwach sauren Bedingungen geleitet und das adsorbierte C-19393Sp mit einem hydropilen Lösungsmittelsystem eluiert. Im wässrigen Eluat findet sich dann weitgehend das antibakteriell wirksame Material. Da die erfindungsgemässe antibiotische Substanz sauer reagiert, wird man mit Vorteil für die weitere Reinigung Anionenaustauschharze vom Cl- oder CH COO" Typus, wie Amberlite IRA-400, 402 und 410 (Rohm & Haas Co., USA), Dowex-1 (Dow Chemical Co., USA), Diaion SA-21A und C (Mitsubishi Chemical Industries₃ Japan) verwenden. Die antibiotische Substanz wird dann mit einer wässrigen Natriumchloridlösung oder einer Pufferlösung weiter eluiert. Das Entsalzen des Eluates kann dadurch bewirkt werden, dass man das Eluat schwach sauer stellt und es erneut mit Aktivkohle chromatographiert und hierauf mit wässrigem Alkohol eluiert usw. Das die

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Wirksubstanz enthaltende Eluat wird dann unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur eingeengt und das Konzentrat mit Methanol oder Aethanol versetzt. Der gebildete Niederschlag wird hierauf durch Filtrieren entfernt und die erhaltene wässrige Alkohollösung erneut unter vermindertem Druck eingeengt. Der so erhaltene, eingeengte Rückstand wird mit Aceton oder einer ähnlichen Substanz versetzt und der Niederschlag durch Filtrieren abgetrennt. Das so erhaltene Pulver lässt sich vorteilhafterweise durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer Kombination von DEAE oder QAE Sephadex in Cl-Form (Pharmacia Co., Schweden) und einem Adsorptionsharz XAD (Rohm & Haas Co., USA) oder Diaion High Porous Type Resin HP-2O (Mitsubishi Chemical Industries, Japan, nachstehend hin und wieder als "Diaion HP-20" bezeichnet) weiter reinigen. Dies will besagen, dass man eine wässrige Lösung des auf diese Weise erhaltenen Pulvers durch DEAE Sephadex A-25 (Cl-Form) leitet und darauf adsorbieren lässt, worauf man nach dem Waschen mit Wasser die Säule mit 0,4-molarem wässrigem Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wird dann auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und einer Säulenchromatographie auf Aktivkohle unterworfen. Die Eluierung aus der mit Aktivkohle beschickten Säule erfolgt unter Verwendung von wässrigem Isobutanol. Bessere Resultate kann man allerdings durch Eluieren unter neutralen oder schwach basischen Bedingungen, die man durch Zugabe von verdünntem wässrigem Ammoniak oder dergleichen erzielt, durchführen. Die erhaltene Substanz wird hierauf der Säulenchromatographie unterworfen, wobei man XAD-II oder Diaion HP-20 verwendet. Die adsorbierte Wirksubstanz wird fraktioniert mit Wasser eluiert.

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Die die Wirksubstanz enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und eingeengt und das Konzentrat hierauf der Säulenchromatographie unterworfen, wobei man QAE-Sephadex A-25 (Cl-Form) verwendet. Hierauf wird mit einer 0,2-molaren wässrigen Natriumchloridlösung eluiert. Das Eluat wird mittels Aktivkohle durch Chromatographie in der gleichen Weise, wie oben beschrieben worden ist, entsalzt. Dann wird das Eluat eingeengt und das Konzentrat einer XAD-II Säulenchromatographie unterworfen und hierauf eluiert und mit Wasser fraktioniert. Die Fraktionen enthalten solche mit einem einzelnen Peak auf einem flüssigen Chromatogramm, wie dies aus den nachstehendn Angaben hervorgehen wird. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck bei niedriger Temperatur zur Trockne eingeengt. Dann versetzt man den Rückstand mit Aceton oder dergleichen, wobei man das C-19393Sp erhält.

Beim Antibiotikum C-19393H„ wird man die nach vollendeter Züchtung erhaltene Fermentierbrühe unter Verwendung eines Filterhilfsmittels zur Entfernung der mikrobiellen Zellen filtrieren. Das erhaltene Filtrat wird dann durch eine Säule von Aktivkohle unter neutralen oder schwach sauren Bedingungen geleitet und das adsorbierte C-19393H„ mit einem hydrophilen Lösungsmittelsystem eluiert. Da diese erfindungsgemässe antibiotische Substanz sauer ist, kann man mit Vorteil für die weitere Reinigung Anionenaustauschharze der Cl- oder CH,C00-Form, wie Amberlite IRA-ΊΟΟ, 402, 410, Dowex-1, Diaion SA-21A und C einsetzen. Die aktive Substanz wird mittels einer wässrigen Natriumchloridlösung oder einer Pufferlösung weiter

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eluiert. Das Entsalzen des Eluates kann so durchgeführt werden, dass man das Eluat neutral oder schwach sauer einstellt und es erneut über Aktivkohle chromatographiert und anschliessend mit wässrigem Alkohol eluiert usw.

Das die Wirksubstanz enthaltende Eluat wird unter vermindertem Druck bei einer niedrigen Temperatur eingeengt und das Konzentrat hierauf mit Methanol oder Aethanol versetzt. Der gebildete Niederschlag wird durch Filtrieren entfernt und die entstandene wässrige Alkohollösung erneut unter vermindertem Druck eingeengt. Für die weitere Reinigung des entstandenen Konzentrats bedient man sich mit Vorteil der Säulenchromatographie unter Verwendung einer Kombination von DEAE oder QAE Sephadex in Cl-Form und dem Adsorptionsharz XAD oder Diaion HP-20. Somit wird das zuvor erhaltene Konzentrat durch Diaion HP-20 hindurchgeleitet und mittels Wasser fraktioniert eluiert. Die aktiven Fraktionen werden eingeengt und das Konzentrat durch DEAE Sephadex A-25 (Cl-Form) hindurchgeleitet. Nach dem Waschen mit einer 0,02-molaren wässrigen Natrium-Chloridlösung erfolgt die Eluierung mittels 0,05-molarem wässrigem Natriumchlorid. Das entstandene Eluat wird hierauf durch Diaion HP-20 geleitet, das man zuvor mit einer wässrigen Natriumchloridlösung behandelt hatte. Die Eluierung erfolgt mit einer Methanol enthaltenden, wässrigen Natriumchloridlösung. Das Entsalzen des Eluates erfolgt über Aktivkohle mittels Chromatographie in der oben beschriebenen Weise. Das entstandene Eluat wird eingeengt und das Konzentrat unter Verwendung von Diaion HP-20 (0,149 bis 0,297 mm) der Säulenchromatographie unterworfen und anschliessend mit Wasser fraktioniert eluiert. Die wirksamen Fraktionen werden vereinigt und

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eingeengt und das Konzentrat unter Verwendung von QAE Sephadex A-25 (Cl-Form), welches zuvor mit" einer 0,2-molaren wässrigen Natriumchloridlösung behandelt worden war, der Säulenchromatographie unterworfen. Die Fraktionierung erfolgt unte-r Verwendung von 0,04-molarer wässriger Natriumchloridlösung. Die aktiven Fraktionen werden in der gleichen Weise, wie dies oben beschrieben worden ist, über Aktivkohle chromatographiert und dabei entsalzt. Das Eluat wird eingeengt und das Konzentrat unter Verwendung von.Avicel (kristalline Cellulose) (hergestellt durch Asahi Chemical Industry Co., Ltd., Japan) der Säulenchromatographie unterworfen, worauf man die Säule eluiert und mit 90$igem wässrigem Propanol fraktioniert. Das ELuat wird eingeengt und das Konzentrat unter Verwendung von XAD-II (0,07¹I bis 0,149 mm) der Säulenchromatographie unterworfen und hierauf eluiert und mit Wasser fraktioniert. Die aktiven Fraktionen werden eingeengt und das Konzentrat einer präparativen Säulenchromatographie unterworfen und anschliessend eluiert und mit einer Methanol enthaltenden Phosphatpufferlösung fraktioniert. Die ein einzelnes Peak aufweisenden Fraktionen werden vereinigt und eingeengt und das Konzentrat unter Verwendung von Diaion HP-20 (0,07^ bis Ojl49 mm) der Säulenchromatographie unterworfen und hierauf mit Wasser eluiert, um das Puffermittel zu entfernen. Die eluierten aktiven Fraktionen werden unter vermindertem Druck bei einer niedrigen Temperatur eingeengt und das Konzentrat gefriergetrocknet, wobei man das C-19393H₂ als weisses Pulver erhält.

Die erfindungsgemässen Verbindungen vermögen

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Alkalimetallsalze oder Ammoniumsalze zu bilden. Beispiele von Metallsalzen einer jeden Komponente sind die Natrium- _f Kalium-, Lithjumsalze usw. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Dinatriumsalzes von C-19393S_?, wie es gemäss Beispiel 1 erhalten wird, sind die folgenden:

(1) Aussehen: weisses Pulver

^[a]I
Wasser)

(2) Spezifische Drehung: [a]j:² -152° + 15° (c=0,5 in

υ —

(3) Elementaranalyse (%):

(über Phosphorpentoxyd während 6 Stunden bei 40 ⁰C

getrocknete Probe) C = 36,29 + 1,0

H = 3,72 + 0,5 N= 6,07 + 0,5 ' Na = 9,70 + 1,0 0 = 31,O9⁺ S = 13,13 +1,0 (Der Sauerstoffgehalt stellt den Rest dar, berechnet durch Subtrahieren der Werte der anderen Elemente)

(4) Molekulargewicht (berechnet, als wenn zwei Natriumatome pro Molekül vorhanden sind) 528 bis

(5) Bruttoformel:

geschätzte Bruttoformel: C^H^gNpNapOgSp (6) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Das in Wasser gemessene Spektrum ist aus Figur 1 er-sichtlich, wobei die Maximalwerte die folgenden sind:

λ^Η2° 240 + 2nm (E¹ * = 296 + 20) und 285 + 2nm max ^L ^cm

(E* l_m = 245 + 20)

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(7) Infrarotabsorptionsspektrum:

Das in Kaliumbromidtablette gemessene Spektrum befindet sich in Figur 2, wobei die hauptsächlichen Peaks (Wellenzahlen) die folgenden sind: 3450, 3220, 3000, 17?0, 1700, 1630, 1515, 1395, 1240-1260, 1100, IO5O, 101O₃ 98Ο, 95O₅ 915, 900, 860, 815, 795, 760, 715, 670, 625, 590, 530 (cm"¹).

(8) Dünnschichtchromatographie (Cellulose f (Tokyo Kasei Co., Ltd., Japan)

	R	_f-Wert	1
	O	,33+0,	1
(2:2:1)	O	,54+0,	1
(5:2:3)	O	,62+0,

a) Propanol:Wasser (4:1)

b) Butanol:Essigsäure:Wasser

c) Propanol:Aethanol:Wasser
15

(9) Hochleistungs-Flüssigkeitchromatographie (Waters Associates Inc., USA)
a) Microbondapak C-,g/5 % Methanol-0,02-molarer Citrat-Puffer (pH 6,3), 1,5 ml/Min/cm (ca. I69 kg/cm²) Rt = 9,0 (Min) + 1 (Min)

b) Microbondapak NH₂/7O % Methanol-0,02-molarer Borat-Puffer (pH 7,5), 1,5 ml/Min/cm (ca. 162 kg/ cm²) Rf =7,0 (Min) + 1 (Min)

(10) Löslichkeit:

In Chloroform, Aethylacetat und Aceton unlöslich, in Aethanol, Butanol und Pyridin schwach löslich in Methanol, Dimethylsulfoxyd und Essigsäure löslich und in Wasser leicht löslich.

(11) Farbreaktionen:

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Positiv: Ehrlich- und Kaliumpermanganatreaktionen Negativ: Ninhydrin-, Greig-Leaback-, Dragendorff-, Perrichlorid- und Sakaguchi-Reaktionen

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des gemäss Beispiel 2 erhältlichen Natriumsalzes von C-19393Hp sind die folgenden:

(1) Aussehen: weisses Pulver (2) Elementaranalyse {%) (an einer über Phosphorpentoxyd während 6 Stunden bei 40 ⁰C getrockneten Probe) :

C = 45,34 + 1,0 H = 4,98 + 0,5 N = 7,48 + 0,5 Na = 6,15 + 1,0 S = 8,51 + 1,0

(3) Molekulargewicht (berechnet für die 1 Natriumatom pro Molekül enthaltende Verbindung) 426 bis

(4) Bruttoformel:

geschätzte Bruttoformel: C₁I₁H₁₇N₉NaSO/-

(5) Spezifische Drehung: [a]^ - 134 (c=O,156 in Wasser)

(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum:

Das in Wasser gemessene Spektrum findet sich in Figur 3 und die maximalen Werte sind die folgenden:

A^H2° (E^ ) = 242 + 2nm (395 + 20) und 289 + 2nm max ^L ^cm ~

'. (314 + 20)

(7) Infrarotabsorptionsspektrum:

Das in Kaliumbromidtablette gemessene Spektrum findet sich in Figur 4, wobei die hauptsächlichen Peaks (Wellenzahlen) die folgenden sind:

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3400, 2980, 294O₃ 177O₅ 170O₅ 163O₅ 153O₅ 139O₅ 1265₅ 1215, 1130, .1090, 1Ο65.₅ 1θ4θ₅ 1000, 92O₅ 840, 82O₅ 790, 770, 70O₅ 620, 54O₅ 450 (cm"¹)

(8) Zirkulardichroismusspektrum (in Wasser): Positiver Cottoneffekt bei 234 nm und negativer Cottoneffekt bei 206₅ 258 und 292 nm

(9) Dünnschichtchromatographie [unter Verwendung von Cellulose f (Tokyo Kasei Co.₅ Ltd.,. Japan)]

Lösungsmittelsysteme: Rf-Wert

a) Propanol:Wasser (4:1) O₅45+O₅1

b) Butanol:Essigsäure:Wasser (2:1:1) O₅65+O₅I

c) Butanol:Pyridin:Essigsäure:Wasser (15:3:2:12), obere Schicht 0,45+0,1

(10) Hochleistungs-Flüssigchromatographie (Waters Associates Inc., USA)

a) Mierobondapak C-,0/8 % Methanol-0,02-molarer Phosphat-Puffer (pH = 6,3)₅ 2,0 ml/Min/cm

(ca. 134 kg/cm²); Rt = 5,3 + 1,0 (Min)

b) Mierobondapak NH₂/5 % Methanol-0₅02-molarer Phosphat-Puffer (pH = 5₅7), 1,3 ml/Min/cm (ca. 211 kg/ cm²); Rt = 4,8 + 1,0 (Min)

(11) Farbreaktionen:

Positiv: Ehrlich- und Kaliumpermanganat-Reaktionen Negativ: Ninhydrin-, Greig-Leaback-, Dragendorff-₅ Ferrichlorid- und Sakaguchi-Reaktionen

(12) Löslichkeit:

In Chloroform und Aethylacetat unlöslich₅ in Aceton₅

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Aethanol und Butanol spärlich löslich und in Methanol und Wasser löslich.

Aus den verschiedenen oben beschriebenen Eigenschäften geht hervor, dass die Antibiotika C-19393S_p und C-19393H Antibiotika vom ß-Lactamtypus sein dürften, wobei aufgrund der einzelnen Elementaranalysenwerte und der geschätzten Molekulargewichte die geschätzten Molekularformeln für diese beiden Antibiotika die folgenden sein dürften: C₁^H₁₆N₂Na₂O S₂ und C ^H J NaO.S. Ausgehend vom Umstände, dass beide Antibiotika Maximalwerte von X ² 2^1+3 nm und 287±*J nm beim Ultraviolettabsorptionsspektrum aufweisen, wird angenommen,'dass die erfindungsgemässen Antibiotika die gleichen Chromophoren wie bei ΜΜ-^55Ο unter den bekannten Antibiotika vom ß-Lactamtypus aufweisen.

Die Tabelle 3 zeigt Vergleichswerte von H-NMR-Spektren dieser drei Antibiotika, nämlich:

beim Antibiotikum C-19393S„ werden im Bereiche des CH-Protons im Gegensatz zum MM-4550 zwei CH.,-Signale (§1,66 ppm, 3H, s, 173 ppm, 3H,s) beobachtet; beim Antibiotikum C-19393Hp werden ebenfalls zwei CH -Signale ( 01,36 ppm, 3H, s; 1,¹JT ppm, 3H, s) beobachtet; das Hg-Proton (6 4,97 ppm, IH, m)_a das man beim MM-4550 feststellt, wird weder beim Antibiotikum C-19393S₂ noch beim Antibiotikum C-19393H„ festgestellt; die chemischen Verschiebungen der restlichen Protonsignale sind miteinander im wesentlichen gleich; die Kupplungskonstanten von H₁. bis H,_ und H_ bis H^-, erhalten durch

4 5 5b

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Spinentkopplung mittels H^-Bestrahlung sind wertmässig die gleichen; beim Antibiotikum C-19393S„ wird die Anwesenheit von SO durch die starken Aborptionsbanden bei

V^KBr 1260 und 1050 cm"¹ des IR-Spektrums bestätigt., max

während beim Antibiotikum C-19393H„ die oben erwähnte von der SO^-Gruppe herrührende Absorption im IR-Spektrum nicht beobachtet wird.

Aufgrund dieser Ueberlegungen wurde den Antibiotika C-19393S„ und C-19393H₂ die obige Formel I zugeschrieben.

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■ Tabelle 3
■"■H'NMR-Spektren von C-19393S₂ und C-19393H₂

H₂ S₂ MM-4550¹^

8-CH₃ l,36(3H₃s) l,66(3H_ss) l,il5

(100 MHz₃ 8-CH l,i|7(3H,s) l,73(3H₃s)

D₂O₃ TMS) N-Ac 2₃l6(3H,s) 2₃l6(3H₃s) 2₃O5(3H,s)

(3mg/0₃ital) H_4a 3,08(Ud₃ 3₃10(dd₃ 2₃99(dd₃

5H^{=9 J}4Ha₃5H⁼⁹

^JHHa₃b^{=l8) J}4Ha₃b^{=l8) J}4Ha₃b^=l8>⁵⁾ H^ 3₃93(dd, 3₃90(dd₃ 3₃46(dd,

^JHHb₃5H^=1O>⁵⁾
^H

6 ^, W

5
N-CH= 6₃4l(d₃J=l4) 6₃42(d₃J=l4)

S-CH= 7,59(d) 7,6O(d)

= CH-NH

D_o0/CH,CN₃ ^ DMSO-d./CH^CN

2 3 6 3

1) A.G. Brown₃ D.P. Corbett/ A. J. Eglington und T.T. Howarth₃ J. Chera. Soc.₃ Chem„ Comm., 1977, 523-525.

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Die biologischen Eigenschaften von C-19393S sind nachstehend beschrieben» Das antibiotische Spektrum von C-19393S„ in Form des Natriumsalzes gegenüber verschiedenen Mikroorganismen findet sich in der folgenden Tabelle 4. Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, ist das Antibiotikum C-?19393S„ gegen grampositive und gramnegative Bakterien wirksam.

Tabelle 4
10 Antiraikrobielles Spektrum des Natriumsalzes von C-19393S,

Minimale Hemmkonzentration

TestOrganismus

Escherichia coli NIHJ Salmonella typhimurium IPO 12 Klebsiella pneumoniae IFO 3318 Proteus vulgaris IFO 3045 Proteus mirabilis IFO 3845 Serratia marcescens IFO 12648 Alcaligenes faecalis IFO 13111 Pseudomonas aeruginosa IFO 3O8O Comamonas terrigena IFO 13299 Staphylococcus aureus 2O9P Sarcina lutea IFO 3232 Bacillus subtilis IFO 3513 Bacillus cereus IFO 3460

Bemerkung) Medium: Bouillon-Agar

Das Antibiotikum C-19393S₂ besitzt auch auf ß-Lactamase eine starke Hemmwirkung und erhöht daher in ausgesprochener Weise die Empfindlichkeit für Penicillin- oder Cephalosporinderivate von verschiedenen

12,5 ~	25
12,5
12,5
100
50
25
50
>100
6,2	5
12,5
12,5
12,5
>100

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Bakterien, welche gegen Penicillinderivate und/oder Cephalosporinderivate resistent sind. Die verstärkende Wirkung auf die antimikrobielle Aktivität von Ampicillin und Cefotiam mittels C-19393S findet sich in der folgenden Tabelle

Tabelle

Verstärkungseffekt auf die antimikrobielle Aktivität von Ampicillin und Cefotiam durch C-19393S

Test- , Organismus	3-19393S₂	minimale Hemmkonzentration Qig/ml)	Cefotiam
Escherichia col: TN 659	0 1 ug/ml 5 jig/ml	Ampicillin	0,2 0,1 0,006
Klebsiella pneumoniae TN 1725	0 1 pg/ ml 5 ^ug/ml	>800 3,13 <0,003	200 0,2 0,02
Proteus vulgaris TN 22 4	0 1 ^g/ml 5 pg/ml	800 50 0,78	200 0,2 0,2
400 ' 1,56 I₃ 56 ;

Klinisch isolierte Stämme, welche ß-Lactamase zu erzeugen vermögen Medium: Herzinfusions-Agar (Eiken Chemical Co., Japan)

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Wie aus dem obigen antimikrobiellen Spektrum augenfällig ist, besitzt das erfindungsgemässe C-19393S„ gegen grampositive und gramnegative Bakterien eine antimikrobielle Wirkung. Somit lässt sich C-19 39 3S„ für die Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Menschen und Säugetieren, z.B. bei Mäusen, Ratten, Hunden, und bei Vogelarten, wie z.B. Hausvögel, Geflügel und Enten, verwenden.

Um das C-19393S„ als Mittel für die Behandlung von z.B. E.coli-Infektionen einzusetzen, wird man das C-19393S_p in einer physiologischen Kochsalzlösung lösen, um auf diese Weise eine injizierbare Lösung zu erhalten, welche man parenteral, z.B. subkutan oder intramuskulär, in einer Dosis von 2 bis 200 mg/kg/Tag und vorzugsweise von 5 bis 50 mg/kg/Tag verabreichen kann. Für die orale Verabreichung kann man das Antibiotikum C-19393S mit Lactose vermischen und diese Mischung in Kapseln einfüllen. Auf diese Weise erhält man Kapseln, welche man in einer Dosierung · von 10 bis 500 mg/kg/Tag und vorzugsweise von 20 bis 200 mg/kg/Tag verabreichen kann.

Das erfindungsgemässe C-19393S„ kann auch als Desinfektionsmittel verwendet werden. So kann man beispielsweise ein flüssiges Präparat herstellen, indem man C-19393S„ in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0$ (Gew.-Vol.) löst. Man kann auch eine Salbe herstellen, welche 2 bis 50 mg und vorzugsweise 5 bis 20 mg C-19393S₂ pro g Paraffinöl oder Lanolin als Grundmasse enthält. Diese Salbe kann auf Händen, Beinen,

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Augen, Ohren usw. sowohl beim Menschen als auch bei den oben erwähnten Tieren als Bakterizid oder Desinfektions-.mittel verwendet werden. " ^

Wie aus dem in der Tabelle 4 ersichtlichen Resultat einwandfrei hervorgeht, besitzt das Antibiotikum C-19393S₂ eine J3-Lactamase hemmende Wirkung und erhöht daher in ausgeprägter Weise die Empfindlichkeit von auf Penicillin oder Cephalosporin resistenten Bakterien in bezug auf Ampicillin oder Cefotiam dank des Umstandes, dass diese Verbindung ß-Lactamase zu erzeugen vermag. Demzufolge kann man C-19393S für die Behandlung von Infektionen bei Mensch und Tier, z.B. Mäusen, Ratten oder Hunden, und Vogelarten, wie z.B.

Hausvögeln, Geflügel und Enten, anwenden, insbesondere aber bei bakteriellen Infektionen, welche ß-Lactam resistenten Bakterien zuzuschreiben sind; dann verwendet man das Antibiotikum in Kombination mit Penicillin- oder Cephalosporinantibiotika.

Wird C-19393S in Kombination mit anderen Mitteln vom ß-Lactamtypus für die Behandlung von Infektionen, z.B. durch j3-Lactam resistenten E.coli, verwendet, wird man gleiche Mengen an C-19393S₂ und Ampicillin in einer physiologischen Kochsalzlösung lösen, um auf diese Weise Injektionslösungen zu erhalten, die man ohne weiteres parenteral, z.B. subkutan oder intramuskulär, in einer Dosierungsmenge von 0,1 bis 20 mg/kg/S.g und vorzugsweise 0,5 bis 5 mg/kg/Tag, verabreichen kann. C-19393S kann auch oral in einer Dosierungsmenge von

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1 bis 200 mg/kg/Tag und vorzugsweise 5 bis 100 mg/kg/Tag in Form von Kapseln verabreicht werden., wobei jede Kapsel mengenmässig die gleiche Menge C-19393S- und Cephalexin enthält.

Wird C-19393S als Desinfektionsmittel verwendet, so kann es als flüssiges Präparat, beispielsweise als wässrige Lösung vorliegen, welche C-19393S„ in einer Konzentration von 0,1 bis 10$ (Gew./VoI,) und Benzylpenicillin in einer Konzentration von O₃I bis 1,0$ (Gew./ Vol.) enthält. Man kann aber auch eine Salbe herstellen_s welche 5 bis 20 mg C-19393S_? und 5 bis 20 mg Benzylpenicillin per g Paraffinöl oder Lanolin als Grundlage enthält. Diese Lösungen bzw. Salben lassen sich zum Abtöten von Bakterien oder zum Desinfizieren von Händen, Beinen_s Augen, Ohren usw. bei Mensch und den.obigen Tieren anwenden.

Das Antibiotikum C-19393S dürfte auch als Zwischenprodukt für die Synthese von neuen Typen von Pharmazeutika interessant sein. Das erfindungsgemässe Antibiotikum ist in wässriger Lösung in einem neutralen pH-Bereich beständig.

Die physiologischen Eigenschaften von C-19393H werden nachstehend beschrieben.

Das antimikrobiell Spektrum des Natriumsalzes • von C-19393H gegenüber verschiedenen Mikro-Organismen findet sich in der nachstehenden Tabelle 6. Wie aus den Resultaten der Tabelle 6 hervorgeht, besitzt

das Antibiotikum Ct19393H eine antibakterielle Wirkung gegen grampositive und gramnegative Bakterien.

Tabelle 6

Antimikrobielles Spektrum des Natriumsalzes des Antibiotikums C-19393H₂

TestOrganismus Minimale Hemmkonzentra

tion (ug/ml)

Escherichia coli IiIHJ 0,08

Salmonella typh'imurium IFO 12529 0,31

Klebsiella pneumoniae IFO 3318 O₁31

Proteus vulgaris IFO 3045 5

Proteus mirabilis IFO 3845 5

Serratia marcescens IFO 12648 O₃31

Alcaligenes faecalis IFO 13111 5

Pseudomonas aeruginosa IFO 3O8O 10

Comamonas terrigena IFO 13299 0,16

Staphylococcus aureus 2O9P 0,63

Sarcina lutea IFO 3232 0,31'-

Bacillus subtilis IFO 3513 0,31 ·

Bacillus cereus IFO 3460 10

Bemerkung) Medium: Bouillon-Agar

Wie aus der obigen Tabelle 6 ersichtlich ist, besitzt das erfindungsgemässe Antibiotikum C-19393H eine antimikrobielle Wirkung gegen grampositive und gramnegative Bakterien und kann daher für die Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Menschen und Säugetieren,

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beispielsweise bei Mäusen., Ratten und Hunden und dergl„, sowie bei Vogelarten., wie z.B. Hausvögeln, Geflügel, Enten und dergl. eingesetzt werden,

Um das C-19393H„ zur Behandlung von beispielsweise E.coli-Infektionen zu verwenden, wird es in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst, um auf diese Weise eine Injektionslösung zu erhalten, welche man parenteral, z.B. subkutan oder intramuskulär, in einer Dosierungsmenge von 0,1 bis 50 mg/kg/Tag und vorzugsweise " von 0,5 bis 20 mg/kg/Tag verabreichen kann. Für die orale Verabreichung kann das Antibiotikum C-19393H_p mit Lactose vermischt und diese Mischung in Kapseln eingefüllt werden, welche man in Mengen von 1 bis 100 mg/kg/Tag und '15 vorzugsweise von 5 bis 50 mg/kg/Tag verabreichen kann.

Ferner kann man das erfindungsgeraässe C-19393H„ auch als Desinfektionsmittel verwenden. So kann man beispielsweise ein flüssiges Mittel herstellen, indem man C-19393Hp in destilliertem Wasser bei einer Konzentration von 0,01 bis 0,1$ (Gew./Vol.) löst. Man kann aber auch eine Salbe herstellen, welche 0,2 bis 20 mg, vorzugsweise 1 bis 10 mg C-19393H pro g Paraffinöl oder Lanolin als Grundlage enthält. Eine solche Salbe bzw. eine solche Lösung lässt sich als bakterizides oder desinfizierendes Mittel für Hände, Bein, Augen, Ohren usw. beim Menschen oder den' oben erwähnten Tieren anwenden.

Das Antibiotikum C-19393H dürfte auch als Zwischenprodukt für die Synthese neuer Arten von pharmazeutischen Mitteln wertvoll sein. Das Antibiotikum

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ist in wässriger Lösung in einem neutralen pH-Bereich beständig.

Wie oben beschrieben worden ist, kann man MM-4550 als Beispiel eines relativ ähnlichen Antibiotikums wie die erfindungsgemässen Antibiotika C-19393S und C-19393HL ansehen. Das Antibiotikum MM-4550 ist aber strukturell von den Antibiotika C-19393S_? und C-19393H₂ verschieden. MC 696-SY2-A (Maeda et al., The Journal of Antibiotics, Bd. 30, S. 77Οτ772, 1977), welches die gleiche Substanz wie MM-4550 ist, ist sehr .unbeständig [Umezawa et al., The Journal of Antibiotics, Bd. 26, S. 51-54, 1973], wogegen die Antibiotika C-19393S und C-19393H beständige Verbindungen darstellen.

Die vorliegende Erfindung sei durch die folgenden Beispiele ausführlicher erläutert, ohne dass aber diese Beispiele einschränkend wirken sollen. Wo nichts anderes ausgesagt wird, entsprechen die Prozente Gewichtsteilen pro 100 Volumenteilen.

' Beispiel'1

Eine Kultur von Streptomyces sp. Stamm C-19393 (IFO 13886, ATCC 31486) wurde auf einem 200 ml T-Medium, welches sich in einem 1 Liter Erlenmeyerkolben befand, wachsen gelassen, um Sporen zu erhalten. Die so erhaltenen Sporen wurden hierauf in sterilem Wasser bei einer

Konzentration von 1,2 χ 10 lebenden Zellen/ml suspendiert. Die Sporensuspension wurde mit sterilem Wasser bis auf ein zehnfaches Volumen des ursprünglichen

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Volumens verdünnt, und dann wurde 1 ml der verdünnten Suspension verwendet, um ^O ml eines Impfmediums in einem 200 ml Erlenmeyerkolben zu impfen. Das geimpfte Medium wurde hierauf auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung während 2 Tagen bei 28⁰C gezüchtet. Die entstandene Kultur wurde dazu verwendet, um 500 ml eines Impfkulturmediums zu impfen₃ das sich in einem 2 Liter Sakaguchi-Schüttelkolben befand. Das geimpfte Medium wurde auf einer sich hin und her bewegenden Schüttelvorrichtung während 2 Tagen bei 28⁰C gezüchtet. Dann wurde die so erhaltene Impfkultur in einen Fermentierbehälter aus rostfreiem Stahl von 50 Liter Inhalt übergeführt, welcher 30 Liter eines Impfmediums enthielt, das 15 ml Actocol (Takeda Chemical Industries, Ltd., Japan) enthielt, worauf die Züchtung während 3 Tagen bei 2 8⁰C unter Belüftung bei 30 Liter/Minute und rühren mit 280 Umdrehungen pro Minute geschah. Die Kulturbrühe wurde dann in einen 2 m Fermentierbehälter eingebracht, welcher 1,2 m eines Hauptkulturmediums enthielt. Die Züchtung erfolgte dann während 5 Tagen bei 30⁰C unter Belüftung bei 840 Liter/Minute und rühren bei I80 Umdrehungen pro Minute. Das oben verwendete Impfmedium setzte sich aus 20 g Glucose, 30 g löslicher •Stärke, 10 g rohem Sojabohnenmehl, 10 g Maiskornflüssigkeit, 5 g Polypepton (Daigo Nutritive Chemicals, Ltd., Japan), 3 g Natriumchlorid und 5 g ausgefälltem Calciumcarbonat per Liter Medium zusammen, wobei der pH-Wert des Mediums vor dem Sterilisieren auf 7₃O eingestellt worden war. Das oben verwendete Hauptzüchtungsmedium setzte sich aus 30 g Glucose, 30 g löslicher Stärke, 15 g entfettetem Sojabohnenmehl, 15 g Baumwollsamenmehl,

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0,25 g Kaliuradihydrogenphosphat, 0,6 g Kaliummonohydrogenphosphat, 0,002 g Kobaltchlorid und 0,5 g Actocol per Liter des Mediums zusammen, wobei das Medium vor dem Sterilisieren auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt worden war. Sämtliche oben Verwendeten Medien wurden während 20 Minuten bei 120⁰C unter Dampf sterilisiert.

Die so erhaltene Fermentierbrühe wurde über Hyflo-Supercel (Johnes Manville Co., USA) filtriert, um 1230 Liter Filtrat zu erhalten, das hierauf auf einen pH-Wert von 6,3 eingestellt und dann durch eine mit 100 Liter Aktivkohle beschickte Säule geleitet wurde. Hierauf wurden die Antibiotika C-19393S und C-19393H aus der Säule mittels 300 Liter Wasser bzw. 700 Liter 7%igem wässrigem Isobutanol eluiert. Das das Antibiotikum C-19393S enthaltende Eluat wurde durch eine Säule von Dowex 1x2 (c£ Form, 2 Liter) geleitet und die Säule hierauf mit 6 Liter Wasser gewaschen und dann mit 32 Liter 5%igem wässrigen Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und durch eine mit 4 Litern Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit 12 Litern Wasser wurde das gewünschte Antibiotikum mit 7 Litern 8#igem Isobutanol und 12 Litern Isobutanol: wässrigem 0,05 n-Ammoniak (8:92) eluiert und das Eluat unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 150 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde hierauf mit I35O ml Methanol versetzt und der so gebildete Niederschlag durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde auf ein Volumen von 200 ml eingeengt und durch eine mit 300 ml DEAE-Sephadex A-25 (C£~-Form) beschickte Säule geleitet. Die Säule wurde nacheinander mit 0,1 molaren

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und 0,2 molaren wässrigen Natriumchloridlösungen (jeweils 900 ml) gewaschen, worauf die gewünschte antibiotische Substanz mit I5OO ml wässrigem 0,4 molarem Natriumchlorid eluiert wurde. Das Eluat wurde auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und durch eine mit 500 ml Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit 1,5 Litern Wasser wurde die Säule mit 2,5 Litern Isobutanol:wässrigem 0,05 η-Ammoniak (8:92) eluiert und das Eluat zur Trockne eingeengt. Dann wurde der Rückstand mit Aceton versetzt, wobei man 2,4 g eines blassgelben Pulvers erhielt. Nach dem Lösen des so erhaltenen Pulvers in wenig Wasser wurde die Lösung durch eine mit 1,2 1 Amberlite XAD-II(O,O74-O,i49-rnm) beschickte Säule geleitet und mit Wasser fraktioniert eluiert. Die Fraktionen, denen eine antibiotische Wirkung zukam, wurden vereinigt und eingeengt, worauf das Extrakt durch eine mit 200 ml QAE-Sephadex A-2 5 (C£ -Form)beschickte Säule geleitet wurde. Nach dem Waschen mit 600 ml wässrigem 0,1 molarem Natriumchlorid wurde die Säule mit 1,2 Liter wässrigem 0,2 molarem Natriumchlorid eluiert. Das Eluat wurde dann auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und durch eine mit 600 ml Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen . der Säule mit 1,8 Liter Wasser, wurde sie mit 3 Liter Isobutanolrwässrigem 0,05 n-Ammoniak (8:92) eluiert_o Das Eluat wurde zur Trockne eingeengt und der Rückstand hierauf mit Aceton versetzt, worauf man 1,07 g eines Pulvers erhielt. 620 mg des so erhaltenen Pulvers wurden in wenig Wasser gelöst und die Lösung durch eine mit 36Ο ml Amberlite XAD-II (0,074-0,1^9 mm) beschickte Säule geleitet. Die Säule wurde hierauf

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- 3ο -

eluiert und mit V/asser fraktioniert und jede der Fraktionen, denen eine antibiotische Wirkung zugeschrieben wurde, durch Plussigchromatographie in der oben beschriebenen Weise analysiert. Die ein einzelnes Peak '.aufweisenden Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt, worauf das Konzentrat mit Aceton versetzt wurde. Auf diese Weise erhielt man 136 mg Antibiotikum C-19393S in Form des Dinatriumsalzes als weisses Pulver.

Beispiel 2

Das gemäss Beispiel 1 erhaltene Eluat von

C-19393H₂ wurde durch eine Säule von Dowex 1x2 (c£~-Form) geleitet, die Säule hierauf mit 6 Litern Wasser gewaschen und hierauf mit I80 Litern einer 5$igen wässrigen Natrium-Chloridlösung eluiert. Das Eluat wurde durch eine mit 25 Litern Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit 75 Litern Wasser wurde das gewünschte Antibiotikum mit 175 Litern Isobutanol:Wasser (7:93) eluiert und das Eluat unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 2 bis 3 Litern eingeengt. 15 Liter Methanol wurden dem Konzentrat dann zugegeben und der auf diese Weise gebildete Niederschlag durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat wurde auf ein Volumen von 2 Litern eingeengt und durch eine mit 5 Litern Diaion HP-20 (0,149 mm Maschenweite) beschickte Säule geleitet. Hierauf wurde die Säule mit 5 Litern Wasser und 10 Litern Methanol:Wasser (Mischungsverhältnis 1:9) eluiert und fraktioniert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt und das Konzentrat durch eine mit 3 Litern DEAE-Sephadex A-25 (C£~-Form) beschickte Säule geleitet. Dann wurde die Säule mit 9 Litern einer wässrigen 0,02 molaren

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Natriumchloridlösung gewaschen und das gewünschte Antibiotikum mit 12 Litern einer O₅05 molaren wässrigen Natriumchloridlösung eluiert und fraktioniert. Die aktiven Fraktionen wurden durch eine mit 2 Litern Diaion HP-20 (0,1*19 mm Maschenweite) beschickte Säule geleitet,, welche zuvor mit 4 Litern wässrigem Natriumchlorid behandelt worden war. Nach dem Waschen mit 10 Litern 5#iger wässriger Natriumchloridlösung wurde der Wirkstoff mit 10 Litern Methanol:5 tigern wässrigem Natriumchlorid (5:95) und 10 Litern Methanol:5 tigern wässrigem Natriumchlorid (1:9) eluiert und fraktioniert. Die aktiven Fraktionen wurden durch eine mit 500 ml Aktivkohle beschickte Säule geleitet und nach dem Waschen mit I₅5 Litern Wasser mit 2,5 Litern 7#igem wässrigem Isobutanol eluiert. Das Eluat wurde eingeengt und das Konzentrat durch eine mit 1 Liter Diaion HP-20 (0,1*19 - O₅297 mm Maschenweite) beschickte Säule geleitet und mit Wasser eluiert und fraktioniert. Die Fraktionen mit antibiotischer Wirkung wurden vereinigt und eingeengt und das Konzentrat durch eine mit 200 ml QAE-Sephadex A-25 (CZ -Form) beschickte Säule geleitet₅ welche zuvor mit *100 ml einer 0,02 molaren wässrigen Natriumchloridlösung behandelt worden war« Dann wurde die Säule nacheinander mit 0,02 molaren, 0,03 molaren und O₅O4 molaren wässrigen Natriumchloridlösungen,und zwar jeweils 1 Liter_; eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden über eine mit 200 ml Aktivkohle beschickte Säule geleitet und nach dem Waschen mit O₅6 Litern Wasser mit 1 Liter 7$igem wässrigem Isobutanol eluiert„ Das Eluat wurde eingeengt und das Konzentrat anschliessend mit Propanol versetzt, um eine 90#ige wässrige Propanollösung zu erhalten,

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welche anschliessend in einer mit Avicel beschickten Säule, v/eiche zuvor mit 90 tigern wässrigem Propanol behandelt worden war, chromatographiert wurde. Die Säule wurde mit '90$igem wässrigem Propanol eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden eingeengt und das Konzentrat über 350 ml Amberlite XAD-II (0,074 bis 0,1^9 mm) chromatographiert und die Säule mit Wasser eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden eingeengt und das Konzentrat einer präparativen Hochleistungs-Flüssigchromatographie unter Verwendung von RP-18 (E. Merck & Co., BRD) als Trägermittel unterworfen und mit 10$ Methanol in 0,02 molarem Phosphatpuffer (pH 6,3) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden durch eine mit 40 ml Diaion HP-20 (0,074 - 0,1*19 mm) beschickte Säule geleitet und mit Wasser fraktioniert eluiert.

Jede der eine antimikrobielle Wirkung aufweisenden Fraktionen wurde in der oben beschriebenen Weise durch Flüssigchromatographie analysiert. Die ein einzelnes Peak aufweisenden Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet, wobei man 12 mg C-19393K_? als we;Lsses

Pulver erhielt.

Beispiel 3

1150 Liter eines Kulturbruhenfxltrates, hergestellt in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1, wurden auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und dann "durch eine mit 100 Liter Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit 300 Litern Wasser wurde die Säule mit 350 Litern Isobutanol:0,02 n-Natriumhydroxyd (8:92) eluiert..Das Eluat wurde durch eine mit 10 Litern Diaion SA-21A (C£~-Form) beschickte Säule geleitet und nach dem Waschen mit 30 Litern Wasser wurde die Säule mit

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100 Litern 5$iger wässriger Natriumchloridlösung eluiert» Das Eluat wurde hierauf durch eine mit 20 Liter Diaion HP-20 (0,297 mm) beschickte Säule geleitet, welche zuvor mit 40 Liter einer 5#igen wässrigen Natriumchloridlösung behandelt worden war. Dann wurde die Säule mit 20 Litern. 5#igen wässrigen Natriumchlorid gewaschen. Hierauf wurden die Antibiotika C-19393S "und C-19393H mit 40 Litern Wasser bzw. 60 Litern Methanol:5$igem wässrigem Natriumchlorid (5:95) aus den Säulen eluiert.

Das das -Antibiotika C-19393S enthaltende Eluat wurde auf den pH-Wert von 5 eingestellt und durch eine mit· 2 Liter Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit 6 Litern Wasser wurde die Säule mit 10 Litern 8%igem Isobutanolrwässrigem 0,05 η-Ammoniak^Jeluiert und das Eluat eingeengt. Das Konzentrat wurde durch eine mit 200 ml QAE-Sephadex A-25 (c£~-Form) beschickte Säule geleitet und die Säule nach dem Waschen mit 1 Liter 0,2 molarem wässrigem Natriumchlorid mit 1 Liter 0,4 molarem wässrigem Natriumchlorid eluiert. Nach dem Entsalzen des Eluates durch Chromatographie über Aktivkohle wurde es über Amberlite XAD-II der Säulenchromatographie unterworfen und in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 aufgearbeitet, wobei man 100 mg Antibiotikum C-I9393S in Form des Dinatriumsalzes als weisses PuI-ver erhielt.

Beispiel 4

Das gemäss Beispiel 3 erhaltene Eluat von C-19393H„ wurde auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und durch eine mit 2 Litern Aktivkohle beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen mit 6 Litern Wasser wurde

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die Säule mit einer Mischung von IO Litern Isobutanol und wässrigem 0,05 η-Ammoniak (Mischungsverhältnis 8:92) eluiert und das Eluat eingeengt. Das Konzentrat wurde durch eine mit 200 ml QAE-Sephadex A-25 (C?"-Form) beschickte Säule geleitet und nach dem Waschen mit 1 Liter 0,02 molarem wässrigem Natriumchlorid wurde die Säule mit 1 Liter 0,0*1 molarem wässrigem Natriumchlorid eluiert, Nach dem Entsalzen des Eluates durch C-hromatographie über Aktivkohle wurde es über Diaion HP-20 (0,07¹J 0,1*19 mm) der Säulenchromatographie unterworfen und die Säule mit Wasser eluiert und fraktioniert. Die ein einzelnes Peak bei der Flüssigchromatographie zeigenden Fraktionen wurden vereinigt und eingeengt und das Konzentrat gefriergetrocknet. Auf diese Weise erhielt man 48 mg C-19393H in Form des Natriumsalzes als weisses Pulver.

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Leerseite

Claims

Dr.-Ing. Schöcwaid · Dr.-I.r:. t-Wd · Dr. Fuos DJpl.-Chsm.Afck w; Κιοιμ'γτ ■ i¹ .'!.-C'^ain. Carola Keller

DirJ.-'r.tj. Sciüng · 0,·. Werner Deichmciinhaus, D-5UO0 Köln 1

Takeda Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan

Patentansprüche

Die Antibiotika C-19393S₂ und C-19393H₂ der folgenden allgemeinen Formel:

^NNH-C0CH

OOH

worin R den Rest -SO,H oder das Wasserstoffatom bedeutet, sowie die Salze dieser Verbindungen.

\ 2\ Verfahren zur Herstellung der Antibiotika C-19393S₂ tind/oder C-19393H₂, dadurch gekennzeichnet, dass man einen zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikro-Organismus, welcher die Antibiotika C-19393S_? und/oder C-19393H„ zu erzeugen vermag, in einem Kulturmedium, welches assimilierbare Kohlenstoffquellen und assimilierbare Stickstoffquellen enthält, solange züchtet, bis im Züchtungsmedium die besagten Antibiotika C-19393S₂ und/oder C-19393Hp wesentlich angereichert sind, worauf man diese Antibiotika isoliert.

3« Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet dass der Mikroorganismus Streptomyces sp. C-19393 (IPO 13886) ist.

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if. Eine im wesentlichen reine Kultur des zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus, welcher Eigenschaften aufweist, die mit jenen von IFO 13886 identifizierbar sind, wobei diese Kultur befähigt ist, in einem assimilierbare Kohl-enstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Kulturmedium eine gewinnbare Menge der Antibiotika C-19393S_O und/oder C-19393H_O zu erzeugen.

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