DD211476A5 - Tierfutter fuer wiederkaeuer und huehner - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Tierfutter fuer Wiederkaeuer und Huehner, das auch eine Futtervormischung oder ein Ergaenzungsfutter sein kann. Es enthaelt als Wirkstoff den Faktor G des Antibiotikums A-4696 oder ein unbedenkliches Salz davon. Mit dem neuen Futter laesst sich vor allem eine Bekaempfung grampositiver Bakterien, eine Erhoehung der Futterverwendung und eine Wachstumsfoerderung erreichen.

Description

Titel der Erfindung:

Tierfutter für Wiederkäuer und Hühner Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf ein Tierfutter für Wiederkäuer und Hühner, das auch eine Futtervormischung oder ein Ergänzungsfutter sein kann, das als Wirkstoff den Faktor G des Antibiotikums A-4696 oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon enthält, und durch das sich vor allem eine Bekämpfung grampositiver Bakterien, eine Erhöhur der Futterverwertung und eine Wachstumsförderung bei solchen Tieren erreichen läßt.

Das Antibiotikum A-4696G ist ein Glykopeptidantibiotikum, welches gebildet wird, indem man einen das Antibiotikum A-4696G produzierenden Stamm von Actinoplanes missouriensis wie ATCC 31681, in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen züchtet.

Das hierdurch erhaltene Antibiotikum wird aus der rohen Fermentationsbrühe durch Adsorption an Harze gewonnen und chromatographisch gereinigt.

Das Antibiotikum A-4696G ist eine basische Substanz, die Säureadditionssalze bildet, welche ebenfalls zur Erfindung gehör« Erfindungsgemäß besonders geeignet sind dabei die unbedenklichen Säureadditionssalze des Antibiotikums A-4696G. D< Einfachheit halber wird im folgenden einfach von der Verbindung A-4696G gesprochen, und diese Angabe bezieht sich dann entweder auf den Faktor G des Antibiotikums A-4696 oder ein unbedenkliches Salz des Faktors G des Antibiotikums

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Es gibt bereits eine Reihe von Antibiotika, die Tierfutter als Wirkstoff zugesetzt oder Tieren verabreicht werden, um hierdut die verschiedensten Wirkungen zu erzielen, wie eine Bekämpfung grampositiver Bakterien, eine Erhöhung der Futterverwertung oder eine Wachstumsförderung. Ein derartiges Antibiotikum ist das aus US-PS 3952095 bekannte Antibiotikum A-4696. Später wurden dann die im Komplex A-4696 enthaltenen Faktoren A und B des Antibiotikums A-469 aufgefunden, und in diesem Zusammenhang wird auf die US-PS 4115522 verwiesen.

Aufgabe der Erfindung:

Die bekannten Antibiotika verfügen bei dem in Rede stehenden Anwendungsgebiet zwar über eine entsprechende Wirksamkeit, sind diesbezüglich jedoch immer noch verbesserungsbedürftig; Sie unterliegen zudem im Laufe der Zeit eir Resistenzbiidung. Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Futters für Wiederkäuer und Hühner, das ei Erhöhung der Futterverwertung, insbesondere bei Wiederkäuern und eine Verbesserung des Wachstums, insbesondere ί Hühnchen ergibt.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch ein Tierfutter für Wiederkäuer und Hühner aus einer die Futterverwertung erhöhenden und das Wachstum fördernden Menge eines Wirkstoffs neben dem eigentlichen Futter um oder dem Trinkwasser, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Wirkstoff den Faktor G des Antibiotikums A-4696 oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz dieses Antibiotikums enthält, das ein Glykopeptid mit zwei basischen Aminogrupf ist, das in Form des Dihydrochlorids eine weiße kristalline Verbindung ist, die praktisch löslich ist in Wasser und unlöslicr ist in organischen Lösungsmitteln, wie Methylalkohol, Aceton, Chloroform oder Benzol, das eine ungefähre prozentuale Elementarzusammensetzung von 52,90% Kohlenstoff, 4,29% Wasserstoff, 6,39% Stickstoff, 30,96% Sauerstoff und 5,46°/ Chlor hat, das im Infrarotbereich bei Untersuchung anhand von Kaliumbromidpellets folgende Absorptionsmaxima aufweist:

3384 (breit), 2924 (schwach), 1730 (Schulter), 1 659 (stark), 1 616 (schwach), 1 590 (schwach), 1 504 (stark), 1488 (Schulter) 1427 (mittel), 1 289 (schwach), 1 226 (Double«), 1 214 (Doublett), 1179 (schwach), 1119 (schwach), 1 060 (stark), 1 028 (schwach), 1015 (Schulter), 986 (schwach), 899 (sehr schwach), 881 (sehr schwach), 815 (schwach), 801 (Schulter), 769 (Schulter), 751 (Schulter) und 711 (schwach) cm"¹, das in Wasser ein Absorptionsmaximum im Ultraviolettbereich bei 279 nm von e] °£_m = 53 aufweist, das sich in Form der freien Base bei pH-Werten zwischen 3,5 und 13,5 in 66%igem wäßri Dimethylformamid kontinuierlich elektrometrisch titrieren läßt, und das bei Hydrolyse über eine Zeitdauer von etwa 70 Minuten in 5%iger wäßriger Chlorwasserstoffsäure bei Rückflußtemperatur das Pseudo-Aglykon der folgenden Form¹

bildet: . -

ί OH

i OtO ^r

(L-Ristosamin A- ^ - -

Io [o!

CH

Die Verwendung der unbedenklichen Säureadditionssalze dieses Glykopeptidantibiotikums gehört ebenfalls zur Erfindung.

Der neue Faktor G des Glykopeptidantibiotikums A-4696 hemmt das Wachstum von Mikroorganismen, die Krankheitserreger für Mensch und Tier sind. Der Faktor G des Antibiotikums A-4696 stellt vor allem ein antibakteriell Mittel dar, das sich insbesondere durch seine Wirksamkeit gegenüber grampositiven Bakterien auszeichnet. Beiner ist der Faktor G dieses Antibiotikums A-4696 auch ein wertvolles wachstumsförderndes Mittel bei Tieren.

Der Faktor G des Glykopeptidantibiotikums A-4696 oder ein entsprechendes Säureadditionssalz hiervon wird hergestellt, indem man den Mikroorganismus Actinoplanes missouriensis ATCC 31681 in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen so lange züchtet, bis eine wesentliche Menge an antibiotischer Aktivität gebildet werden ist.

Die Glykopeptid-Verbindungen A-4696G oder die entsprechenden unbedenklichen Säureadditionssalze hiervon erhöhen die Futterverwertung bei Wiederkäuern, wenn man sie solchen Tieren oral in einer hierzu geeigneten Menge verabreicht. Zu diesem Zweck verabfolgt man dem jeweiligen Wiederkäuer ein Futter, Futtervorgemisch oder Ergänzungsfutter, das eine geeignete Menge an Verbindung A-4696G oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon enthält.

Durch die Verbindung A-4696G oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon läßt sich ferner auch das Wachstum von Hühnchen fördern. Dies läßt sich erreichen, indem man den Hühnchen eine jeweils geeignete Menge einer solchen Verbindung entweder zusammen mit ihrem Futter oder mit dem Trinkwasser verabfolgt.

Das Antibiotikum A-4696G ist in Form des Dihydrochlorids eine weiße kristalline Verbindung. Dieses Dihydrochlorid von A-4696G weist folgende ungefähre prozentuale Elementarzusammensetzung auf: 52,90% Kohlenstoff, 4,29% Wasserstoff, 6,39% Stickstoff, 30,96% (durch Differenzbestimmung) Sauerstoff und 5,46% Chlor.

Das Antibiotikum A-4696G hat ein ungefähres Molekulargewicht von etwa 1700.

Das Antibiotikum A-4696G hat als Dihydrochlorid in einem Kaliumbromid-Pellet das aus der Zeichnung hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Es verfügt über folgende signifikante Absorptionsmaxima bei den angegebenen Frequenzen (cm"¹): 3384 (breit), 2924 (schwach), 1730 (Schulter), 1 659 (stark), 1 616 (schwach), 1 590 (schwach), 1 504 (stark), 1 488 (Schulter), 1427 (mittel), 1 289 (schwach), 1 226 (Doublett), 1 214 (Double«), 1179 (schwach), 1119 (schwach), ι 060 (stark), 1028 (schwach), 1015 (Schulter), 986 (schwach), 899 (sehr schwach), 881 (sehr schwach), 815 (schwach), 801 (Schulter), 76S (Schulter), 751 (Schulter) und 711 (schwach).

Eine eiektrometrische Titration des Antibiotikums A-4696G in 66%igem wäßrigem Dimethylformamid (Beginn bei pH 7,89) ergibt, daß das Titriermittel in gradueller Menge bei pH-Werten zwischen 3,5 und 13,5 verbraucht wird.

Das Dihydrochlorid des Antibiotikums A-4696G weist in Wasser ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum auf, das ein

Absorptionsmaximum bei 279nm von e] °'°_m = 53 hat.

Das Dihydrochlorid des Antibiotikums A-4696G ist in Wasser löslich, jedoch unlöslich in Lösungsmitteln, wie Methanol, Aceton, Diethylether, Chloroform, Benzol und dergleichen.

Zusätzlich zur freien Base und zum Hydrochlorid bildet das Antibiotikum A-4696G auch noch andere Säureadditionssalze, die ebenfalls zur Erfindung gehören. Beispiele für solche Salze des Antibiotikums A-4696G sind die Salze, wie sie durch übliche Reaktion sowohl mit organischen Säuren als auch mit anorganischen Säuren gebildet werden, und hierzu gehören Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure,Zitronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Kohlensäure, Pamoasäure, Mucinsäure, D-Glutaminsäure, d-Kampfersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Ameisensäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure und ähnliche Säuren.

Als unbedenkliche Säureadditionssalze werden solche Salze verstanden, die gegenüber warmblütigen Tieren insgesamt nicht zu toxisch sind.

Der Faktor G des Antibiotikums A-4696 erfährt genauso wie der Komplex des Antibiotikums A-4696 oder dessen einzelne Faktoren eine Hydrolyse, wenn man ihn über eine Zeitdauer von etwa 70 Minuten in rückfiießender 5%iger Chlorwasserstoffsäure behandelt, wobei das Pseudo-Aglykon der folgenden Strukturformel gebildet wird:

OH

(1,Ri^=S-On₊-O Ιο; Ιοί IqI

/ · Cl γ V ^tHa

ίοί 01

CHa OH

Diese Verbindung wird in der amerikanischen Patentanmeldung Nr.217961 vom 18. Dezember 1980 beschrieben.

Das Pseudo-Agiykon fällt aus dem Hydrolysegemisch aus.

Obiger Formel zufolge enthält das Pseudo-Agiykon sechs phenolische Hydroxylgruppen und eine freie Aminogruppe zusätzlich zu der Aminofunktion im gebundenen Aminozucker, nämlich dem Ristosamin. Wie die anderen Faktoren des Antibiotikums A-4696 enthält auch der Faktor G des Antibiotikums A-4696 Neutralzucker, die an den Pseudo-Aglykonkern über eine oder mehr phenolische Gruppen gebunden sind. Diese Zucker lassen sich durch saure Hydrolyse vom Faktor G entfernen. Zu diesen im Hydrolysat des Komplexes A-4696 identifizierten Neutralzuckern gehören Mannose, Glucose und Rhamnose. Der Faktor G scheint sich von den anderen Faktoren des Antibiotikums A-4696 in der Art und Anzahl der an den Kern gebundenen Neutralzucker und ferner auch hinsichtlich der Bindungsstelle zu unterscheiden. Der Faktor G des Antibiotikums A-4696 verhält sich bei der Hydrolyse ähnlich wie die in diesem Antibiotikumkomplex unter anderem noch

enthaltenen Faktoren B₃ und C₁₃.

Der Faktor G läßt sich von dem bekannten Faktor A und ferner auch von den Faktoren B₃ und C-i_a durch seine Verweilzeit im Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm unterscheiden. Die Retentionswerte (K'-Werte) für mehrere Faktoren des Antibiotikums A-4696 unter Arbeiten mit einer C-ig-Umkehrphasenhochleistungsflüssigkeitschromatographie (Waters Assoc. ^Bondapak C₁₈) bei Umgebungstemperatur und Verwendung von Lösungsmitteln aus 2%iger wäßriger Essigsäure zu Acetonitril (90:10, Vol/Vol) und 2%iger wäßriger Essigsäure zu Acetonitril (70:30, Vol/Vol) gehen ausfolgender Aufstellung

hervor.

Jeweiliger Faktor des Anti- K'-Werte

biotikums A-4696

A 1,60

B₁ 1,99

B₂ 3,84

B₃ 2,50

C_1a 2,92

C₃ 4,23

E₁ 0,38

G 4,42

Der Mikroorganismus

Der zur Herstellung des Faktors G des Antibiotikums A-4696 benötigte Mikroorganismus ist zugänglich durch eine Reihe von Nitrosoguanidin-Mutationen ausgehend von einem Stamm von Actinoplanes missouriensis ATCC 23342, und der letztgenannte Stamm bildet den Komplex A-4696, wie dies aus US-PS 3952095 hervorgeht. Dieser neue Mikroorganismus bildet den Faktor G als überwiegenden Faktor in Mengen, die etwa 30% der gesamten Aktivität entsprechen. Gleichzeitig damit werden auch andere Faktoren des Antibiotikums A-4696 gebildet. Zu Charakterisierungszwecken wurde der neue Mikroorganismus mit der Stammkultur ATCC 2342 verglichen. Beide Kulturen bilden ähnliche Substrate oder Primärmycele.

Es lassen sich weder Luftmycele noch Sekundärmycele beobachten. Ferner können auch keine Sporangien beobachtet werden. Die Versuche zur Einleitung einer Sporangienbildung wurden unter Anwendung von 13 Agarbeschichtungsmedien sowie von Pollen von Liquidambar, Pinus und Passiflora durchgeführt. Hierbei konnten weder mittels eines Lichtmikroskops noch mit einem Elektronenabtastmikroskop Sporangien beobachtet werden.

Von Dr. John N.Couch, University of North Carolina wurden in der Kultur ATCC 23342 jedoch früher Sporangien beobachtet.

Hierbei handelt es sich um ziemlich kleine (4 bis 11 μνη) subkugelförmige, selten kugelförmige Sporangien, die gewöhnlich eine irreguläre Wand haben, nämlich in senkrechtem Schnitt über eine irreguläre wellenartige Wand verfügen.

Im Sporangium sind reife Sporen in einer oder mehreren nicht unterscheidungsfähigen Spiralen angeordnet. Die Sporangien platzen auf durch Quellung einer intersporalen Substanz, wodurch das Sporangium größer wird und eine nahezu glatte sphärische Gestalt annimmt. Die Sporen sind motii, haben einen Durchmesser von etwa 1 bis 1,5μ.Γη und sind kugelförmig

bis subkugelförmig.

Die Kultur ATCC 23342 hat eine Zellwand vom Typ II, wobei sich in der Zellwand sowohl Meso-2,6-diaminopimelinsäure als auch Hydroxydiaminopimelinsäure feststellen läßt(Appl. Microbiol.11, 421 bis 423 [1964J).

Die Kultur ATCC 23342 unterscheidet sich von der Kultur ATCC 31681 vorwiegend in der Pigmentierung des Primärmycels.

Die Kultur ATCC 23342 hat ein orange gefärbtes Mycel, dessen Farbe je nach dem Medium von mittel- bis bräunlich-orange zu stark orange-gelb reicht. Die Kultur ATCC 31681 hat keine unterscheidbare Farbe. Das Mycel wird am besten durch die Angabe gelblich-grau beschrieben. Von der Kultur ATCC 31681 werden keine charakteristischen löslichen Pigmente

gebildet.

Die Kultur ATCC 23342 bildet auf Agrarmedien aus ISP Nr. 7 und Tomatenpaste-Hafermehl ein rötlich-braunes lösliches

Pigment.

Von der Kultur ATCC 23342 wird Melibiose verbraucht, nicht jedoch von der Kultur ATCC 31681. Eine Zusammenfassung der Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen der Kultur ATCC 23342 und der Kultur ATCC 31681 geht aus folgender Tabelle I

hervor.

TABELLE I

Vergleich der Charakteristiken von ATCC 31681 und ATCC 23342

Ähnlichkeiten

Unterschiede

Antibiotische Empfindlichkeit Biosynthese von Faktoren von A-4696 Katalase positiv Wachstum auf Schrägagarmedien Kein Luftmycel

Kohlenstoffverwertung Farbe des Mycels Ausmaß an Gelatineverflüssigung Ausmaß an Wachstumsringbildung in Milch

•tv.

Tabelle I Fortsetzung Ähnlichkeiten

Unterschiede

Ausmaß an Stärkehydrolyse

Wachstum in ausgewählten vegetativen Medien

Wachstumscharakteristiken auf ISP Nr. 7 und Calciumaleat-

Agar

Lösliches Pigment

Bildung von Faktor A-4696

Keine Chromogenizität

Keine Sporangien

NaCI-Verträglichkeit

Nitratreduktion: negativ

Optimales Wachstum auf Bennett-Agar pH-Bereich an Wachstum

Phosphatase: positiv

Magermilch: negativ

Saccharoseverträglichkeit

Temperaturbereich

Urease: positiv

Methoden:

Es wurden die vom International Streptomyces Project (ISP) zur Charakterisierung von Streptomycesarten empfohlenen Methoden (International Journal of Systematic Bacteriology, 16(3), 313 bis 340 (1966) zusammen mit bestimmten

ergänzenden Versuchen angewandt.

Die Bestimmung der Kohienstoffverwertung erfolgte unter Verwendung von Grundmedium ISP Nr. 9 unter Zusatz filtersterilisierter Kohlenstoffquellen bis zu einer Endkonzentration von 1,0%. Die Platten wurden bei 30⁰C bebrütet und

nach 14 Tagen abgelesen.

Die Bildung an Melanoidpigment (Chromogenität) wurde unter Verwendung von ISP Nr. 1 (Trypton-Hefeextrakt-Brühe) bestimmt. Keine der Kulturen wuchs nach 7 Tage langer Bebrütung auf ISP Nr.6 (Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar) oder ISP

Nr.7 (Tyrosin-Agar).

Die Bestimmung der Stärkehydrolyse erfolgte durch Untersuchung der Gegenwart von Stärke mittels Jod auf ISP Nr. 4-Platten

(anorganische Salze-Stärke-Agar).

Temperaturbereich, NaCI-Verträglichkeit, Saccharoseverträglichkeit, pH-Bereich und Antibiotikaempfindlichkeit wurden bestimmt unter Verwendung von ISP Nr.2-Platten (Hefe-Malzextrakt-Agar). Die Platten wurden 14 Tage bei 3O⁰C inkubiert.

Es wurde bei Temperaturen von 5,10,15, 20, 25, 30, 37, 40, 45, 50 und 55⁰C gearbeitet.

Die NaCI-Verträglichkeit wurde gemessen durch Zusatz von NaCI zu Agar bis zu Mengen von 0, 2,4, 6, 8,10 und 12%.

Die Saccharoseverträglichkeit wurde gemessen durch Zusatz von Saccharose bis zu 0, 2,4, 6,8,10,12,15 und 20%.

.Der pH-Bereich wurde bestimmt unter Verwendung folgender Puffer unter einer Konzentration von jeweils 0,05MoI:

Citronensäure, pH3,4 und 5, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, pH6, 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, pH7, N-Tris(hydroxymethy()methylglycin, pH8, 2-(Cyclohexylamino)ethansulfonsäure, pH8,5, 9,0 und 9,5, 3-Cyclohexylamino-1,1-

propansulfonsäure, pH 10 und 11.

Der pH-Wert des Agars nach 14tägiger Bebrütung wurde als korrekter Wert angesehen, da einige Puffer ihre eingestellten

pH-Werte nicht beibehielten.

Die Toxizität des Puffers wurde durch Einstellung aller Puffer auf pH 7,0 und Bestimmung des Wachstums untersucht. Die

Kultur ATCC 23342 war gegenüber Citronensäure empfindlich.

Die Enzymuntersuchungen wurden unter Anwendung der Methoden von Blazevic und Ederer verfolgt. (D. J. Blazevic und G.M.Ederer „Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology", John Wiley and Sons, New York, N.Y. 1975) Die Zuordnung der Farbnamen erfolgte gemäß ISCC-NBS Centroid Color Charts, Standardprobe Nr.2106 (K. L.Kelly und D.B.Judd, The ISCC-NBS Centroid Color Charts Standard Sample No. 2106, U.S. Nept. of Commerce, National Bureau of

Standards, Washington, D.C. 20234).

Die antibiotische Empfindlichkeit wurde bestimmt unter Verwendung von Empfindlichkeitsscheiben, die auf die Oberfläche angeimpfter Agarplatten geklotzt waren. Hierzu wurden folgende Antibiotika verwendet: Cephalothin (Natrium) 30/xg, Erythromycin (Estolat) 15/ng, Gentamicin 10,ug, Lincomycin 2/xg, Nalidixsäure 30,ug, Penicillin 10μg, Polymixin G 300 Einheiten, Streptomycin 10μg, Tetracyclin 30/xg, Vancomycin HCI 30/xg. Sowohl Kulturen von ATCC 23342 als auch von

ATCC 31681 waren gegenüber allen untersuchten Antibiotika empfindlich.

Die Züchtungseigenschaften der Kulturen ATCC 23342 und ATCC 31681 gehen vergleichsweise aus der folgenden Tabelle Il

hervor.

TABELLE Il Züchtungscharakteristiken¹¹

Agar²¹

ATCC 23342

ATCC 31681

ISP Nr. 2

ISP Nr. 3

ISP Nr. 4

G gut

R 53. mittelorange

Am nichts

SP nichts

G schlecht

R 76. hell-gelblich-braun

Am nichts

SP nichts

G reichlich

R 50. stark orange

Am nichts

SP nichts

schlecht

93. gelblich-grau

nichts

nichts

schlecht

93. gelblich-grau

nichts

nichts

ausreichend

93. gelblich-grau

nichts

nichts

TABELLE II (Fortsetzung)

Agar²¹

ATCC23342 ATCC 31681

ISP Nr. 5

ISP Nr. 7

Bennett

Calciummalat

Czapek

Giucose-Asparagin

Anio-Hensens

53H-Medium

Q ausreichend

R 68. stark orange

Am nichts

SP nichts

R schlecht

R 54. bräunlich-orange

Am nichts

SP rötlich-braun

G reichlich

R 53. mittel-orange

Am nichts

SP nichts

R gut

R 50. stark orange (glänzend)

Am nichts

SP nichts

G gut

R 71. schwach orange-gelb

Am nichts

SP nichts

G gut

R 71. schwach orange-gelb

Am nichts

SP nichts

G gut

R 55. stark braun

Am nichts

SP schwach rot-braun

G schlecht

R 70. hell-orange-gelb

Am nichts

SP nichts

Gausreichend

R 54. bräunlich-orange gut

93. gelblich-grau nichts nichts nichts nichts nichts nichts gut

93. gelblich-grau nichts (feuchte Oberfläche) nichts nichts nichts nichts nichts ausreichend

93. gelblich-grau nichts nichts ausreichend

93. gelblich-grau nichts nichts schlecht

93. gelblich-grau nichts nichts ausreichend

93. gelblich-grau nichts nichts ausreichend 79.1.gy.

gelblich-braun nichts nichts reichlich

90. gräulich-gelb nichts nichts

Am nichts SP nichts Czapek-Pepton G reichlich

R 54. bräunlich-orange Am nichts SP nichts DG = Wachstum

R = Ümkehrseite oder Unterseite der Kolonie Am = Luftmycel SP = lösliches Pigment

Die in obiger Tabelle angegebenen Zahlen sind die Nummern der Farbkarte von ISCC-NBS Centroid Coior Charts 2) ISP = International Streptomyces Project Agar

TPO = Tomatenpaste- Hafermehl-Agar Das Medium 53H hat folgende Zusammensetzung: Hefeextrakt 2g

CaCO₃ 3 g

Na₂S₂O₃-OH₂O 0,5 g

V₃-Saft 200 ml

Agar 20 g

Deionisiertes Wasser 800 ml

!n den folgenden Tabellen III und IV werden die Kohlenstoffverwertung (Tabelle !II) und verschiedene physiologische Charakteristiken (Tabelle IV) verglichen.

TABELLE III

Kohlenstoffverwertung

Kohlenstoffquelle ATCC 23342 . ATCC31681

Kontrolle—kein Kohlenstoff - -

D-Glucose ++ +

L-Arabinose ++ +

Cellobiose ++ +

D-Fructose ++ +

D-Galactose ++ ( + )

Isoinosit — -

D-Mannit ++ +

Melibiose + —

Raffinose - —

D-Rhamnose ++ ( + )

D-Ribose - -

Salicin + ( + )

Saccharose ++ +

D-Xylose ++ '+

+ + = gleiche bis/oder > Glucosekontrolle, positive Verwertung + = < Glucosekontrolle, > keine Kohlenstoffkontrolle, positive Verwertung (+) = fragliches Wachstum, zweifelhafte Verwertung

- = kein Wachstum, negative Verwertung

TABELLE IV

Zusätzliche physiologische Charakteristiken

ATCC23342 ATCC 31681

ISPNr. 1 (Chromogenität) - -

Catalase + + +

Phosphatase + (langsam) + (langsam)

Urease +(langsam) +(langsam)

Temperaturwachstumsbereich 15 bis 37 ⁰C 15 bis 37 ⁰C

NaCI-Verträglichkeit <2% <2%

Saccharose-Verträglichkeit 15% 15%

Nitrat-Reduktion - -

Stärke-Hydrolyse +(ausreichend) +(schwach)

pH-WachstujTisbereich 6bis7 6fcmäZ

Magermilch: Wachstumsring + -

Magermilch: Reaktion - -

Gelatine-Verflüssigung +(40%) +(20%)

Lösliches Pigment . + -

Der das Antibiotikum A-4696G produzierende Stamm von Actinoplanes missouriensis, nämlich ATCC 31681, ist zugänglich als Reinkultur, die frei von anderen Stämmen ist, indem man den Mikroorganismus auf Schrägagar und in sterilen wäßrigen Nährmedien züchtet. Dr neue mutierte Stamm eignet sich zur Herstellung des Antibiotikums A-4696G. Zur Erfindung gehört daher weiter auch eine Reinkultur des oben beschriebenen Stamms ATCC 31681 von Actinoplanes missouriensis.

Der obige Stamm ATCC 31681 von Actinoplanes missouriensis bildet bei entsprechender Züchtung den Faktor G und andere antibiotisch wirksame Substanzen, wobei der Faktor G etwa 30% der gesamten Aktivität ausmacht.

Man kann den neuen Stamm in den verschiedensten Kulturmedien wachsen lassen, die assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthalten. Zu geeigneten Kohlenstoffquellen gehören beispielsweise Kohlehydrate, wie Stärke, Glucose, Dextrin und dergleichen. Ferner kann der Mikroorganismus auch Glycerin als Kohlenstoffquelle verwerten. Eine leicht zugängliche und wohlfeile Kohlenstoffquelle ist Melasse. Stärke wird als Kohlenstoffquelle jedoch bevorzugt. Zu geeigneten Stickstoffquellen gehören Aminosäuren, Peptone und Hefe. Als Stickstoffquellen eignen sich ferner auch Speiseöle, wie Sojabohnenöl oder Erdnußöl. Die bevorzugte Stickstoffquelle ist jedoch Hefe.

Wie bei anderen Antibiotika produzierenden Mikroorganismen soll das Züchtungsmedium auch anorganische Salze enthalten. Hierzu eignen sich beispielsweise alle anorganischen Salze, die Kationen oder Anionen von Natrium, Kalium., Calcium, Ammonium, Phosphat, Chlorid, Sulfat und dergleichen liefern. In ähnlicher Weise können dem Züchtungsmedium auch entweder getrennt oder zusammen mit anderen Nährstoffen Spurenelemente zugesetzt werden, die für das Wachstum der Mikroorganismen wesentlich sind. Solche Spurenmengen an wesentlichen Elementen kommen in den anderen Bestandteilen des Mediums gewöhnlich in ausreichender Menge als Verunreinigung vor.

Das Kulturmedium zur Züchtung des Faktors G kann zur Verbesserung der Bildung dieses Antibiotikums auch entsprechende Quellen für Wachstumsfaktoren enthalten, wie Destillationsschlämpe oder Hefeextrakte.

Der neue, den Faktor G bildende Stamm kann über einen breiten pH-Bereich gezüchtet werden. Zu einer maximalen Bildung an Faktor G kommt es jedoch bei einem pH-Bereich des Züchtungsmediums zwischen etwa 6 und 7,0, und vorzugsweise zwischen etwa 6,5 und 7. Während des Wachsens des Mikroorganismus erhöht sich der pH-Wert des Mediums vom bervorzugten Bereich auf einen pH-Wert von etwa 7,0 bis 7,5.

Kleine Mengen des vorliegenden Antibiotikums lassen sich durch Schüttelkolbenfermentation unter Verwendung von Kolben mit Volumina zwischen 250 und 2000ml herstellen. Für die großtechnische Produktion des Faktors G des Antibiotikums A-4696 werden Fermenter mit Fassungsvermögen von 100000 bis 2000001 verwendet. Zur großtechnischen Produktion des Faktors G werden submerse aerobe Fermentationsbedingungen bevorzugt. Wie auch bei der großtechnischen Herstellung anderer Antibiotika werden auch bei der vorliegenden Bildung des Faktors G des Antibiotikums A-4696 die mit dem Kulturmedium beschickten großtechnischen sterilen Fermenter mit so viel· Impfgut beschickt, daß innerhalb einer annehmbaren Zeit nach erfolgter Beimpfung das Wachstum beginnt. Das für große Tanks benötigte Inokulum wird wie folgt hergestellt. Man läßt den Mikroorganismus zuerst auf Schrägagar wachsen und beimpft damit einen das Kulturmedium enthaltenden Schüttelkolben. Nahdem die Kultur im Schüttelkolben entsprechend gewachsen ist, überträgt man das vollständig entwickelte vegetative Medium in ein größeres Volumen, nämlich ein sogenanntes Stoßmedium, das in einem großen Stoßtank mittlerer Größe enthalten ist. Sobald es im Stoßtank zu einem optimalen Wachstum gekommen ist, überträgt man den Inhalt des Tanks in den großtechnischen Fermenter.

Der Mikroorganismus Actinoplanes missouriensis ATCC 31681 kann im Fermentationsmedium bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 4O⁰C wachsen. Die bevorzugte Temperatur scheint bei etwa 30⁰C zu liegen, da es hierbei zu einer maximalen Produktion des Faktors G kommt.

Während der Fermentation des neuen Stammes bläst man durch das Kulturmedium sterile Luft und durchmischt das gesamte Medium hierbei durch Rühren. Das Ausmaß der Belüftung kann etwa 0,1 bis 1,0 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute betragen. Bevorzugt wird eine Belüftung von wenigstens 0,5 Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium und pro Minute.

Unter den oben beschriebenen Fermentationsbedingungen kommt es im allgemeinen innerhalb von etwa 4 bis 6 Tagen zu einer maximalen Bildung des Faktors G. Der Verlauf der Fermentation läßt sich entsprechend verfolgen, indem man. Teilmengen des Kulturmediums von Zeit zu Zeit entnimmt und biologisch bezüglich ihrer antibiotischen Aktivität untersucht. Ein hierzu geeigneter Versuchsorganismus ist Bacillus subtilis. Die Aktivität gegenüber diesem Organismus läßt sich durch einen üblichen mikrobiologischen Plattenversuch bestimmen, beispielsweise den sogenannten Becher-Platten-Versuch, oder Papierscheiben-Versuch auf Agarplatten, die mit dem Versuchsorganismus beimpft sind. Die Gewinnung des Faktors G aus der Fermentationsbrühe erfolgt vorzugsweise chromatographisch über ein nichtfunktionelles Harz. Ein hierzu geeignetes nichtfunktionelles Harz ist das Harz Diaion HP 20 von Mitsubishi. Statt dessen können selbstverständlich auch andere ähnliche nichtfunktionelle Harze verwendet werden, wie Amberlite XAD-4 (Rohm and Haas Co.) oder Duolite SES 861 (Diamond Shamrock). Zur Gewinnung und Isolierung des Faktors G verdünnt man die Brühe mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Aceton, erniedrigt den pH-Wert der gesamten verdünnten Fermentationsbrühe dann auf einen pH-Wert zwischen etwa 1,5 und 2,0 und filtriert die angesäuerte Brühe schließlich zur Abtrennung des Mycels und anderer unlöslicher Bestandteile. Zur Verbesserung der Filtriergeschwindigkeit verwendet man zweckmäßigerweise eine Filterhilfe, wie Diatomeenerde oder eine sonstige handelsübliche Filterhilfe. Die unlöslichen Bestandteile lassen sich femer auch durch Zentrifugieren abtrennen. Der pH-Wert der angefallenen filtrierten Brühe wird dann auf etwa 3 bis 4 angehoben, worauf man die Brühe zur Entfernung des organischen Lösungsmittels verdampft. Im Anschluß daran schickt man die filtrierte Brühe durch das nichtfunktionelle Harz und eiuiert das gewünschte Antibiotikum davon miteinem wäßrigen organischen Lösungsmittelgemisch, wie wäßrigem Methanol, wäßrigem Ethanol oder wäßrigem Aceton. Das organische Lösungsmittel macht dabei gewöhnlich etwa 20 bis 50 Vol.-% des Lösungsmittelgemisches aus. Die das gewünschte Antibiotikum enthaltenden Eluatfraktionen werden auf ein geringes Volumen eingeengt, und aus dem hierbei erhaltenen Konzentrat fällt das gewünschte Antibiotikum nach Einstellung des pH-Werts auf etwa 6,5 bis 7 dann in Form der freien Base aus.

Abweichend davon kann man den Faktor G nach erfolgter Fermentation aus dem Fermentationsmedium auch durch andere herkömmliche Isolierungsverfahreh gewinnen, wie beispielsweise durch Adsorption an ein geeignetes lonenaustauscherharz und anschließende chromatographische Abtrennung. Zu hierzu geeigneten Harzen gehören die niedrigvernetzten kationischen Austauscherharze, und ein Beispiel hierfür ist Amberlite IR-116.

Der Faktor G des Antibiotikums A-4696 ist, wie bereits oben erwähnt, eine basische Substanz, die zwei basische Aminogruppen enthält. Der Faktor G bildet daher sowohl mit anorganischen als auch mit organischen Säuren Säureadditionssalze. Diese Salze des Faktors G lassen sich in üblicherweise herstellen, und zum Dihydrochlorid gelangt man beispielsweise, indem man die freie Base mit Chlorwasserstoffsäure in wäßrigem Methanol rührt. Das hierdurch aus der Lösung ausfallende Dihydrochlorid wird abfiitriert und getrocknet. In ähnlicher Weise läßt sich auch das Sulfat herstellen, indem man eine Lösung des Faktors G in wäßrigem Methanol oder wäßrigem Ethanol mit Schwefelsäure versetzt. Der Faktor G des Antibiotikums A-4696 und seine pharmazeutisch unbedenklichen nichttoxischen Säureadditionssalze hemmen das Wachstum von Mikroorganismen, die Krankheitserreger für Mensch und Tier sind. So liegt beispielsweise die minimale Hemmkonzentration (MIC-Wert) des Faktors G gegenüber Streptococcus pneumoniae bei Ο,δμς/η-ιΙ, gegenüber Streptococcus pyogenes bei 0,25/xg/ml und gegenüber Staphylococcus aureus bei 1^g/ml. Diese Werte für die minimalen Hemmkonzentrationen wurden durch die hierfür übliche Agarverdünnungsmethode bestimmt.

Der Faktor G ist auch in vivo gegenüber den gleichen Mikroorganismen wirksam. So ergeben sich beispielsweise beim sogenannten Schutzversuch an der Maus nach entsprechender Injektion des Antibiotikums mit den angegebenen pathogenen Organismen folgende ED₅₀-Werte:

Mikroorganismus ED₆₀-Werte(mg/kgx2,s.c.)

Streptococcus pneumoniae 0,39

Streptococcus pyogenes 0,57

Staphylococcus aureus —0,78

Der Faktor G und seine pharmazeutisch unbedenklichen Salze lassen sich zur Bekämpfung von Infektionen bei Mensch und Tier verwenden, wenn man den jeweiligen Wirkstoff parenteral in wirksamen Dosen zwischen etwa 1,5 und 100 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Der Dosierungsbereich kann von einer einzelnen täglichen Dosis bis zu mehrfachen täglichen

Dosen variiert werden. Dauer der Behandlung und Dosierungsmenge können schwanken in Abhängigkeit von Faktoren, wie dem jeweiligen Mikroorganismus, der Stärke der Infektion und dem Allgemeinzustand des Empfängers. Das Antibiotikum läßt sich entweder zu für eine parenterale Verabreichung geeigneten Einheitsdosisformen formulieren, beispielsweise zu für eine intramuskuläre Injektion geeigneten Ampullen, oder es kann wahlweise auch durch intravenöse Infusion verabreicht werden, und zwar beispielsweise in Form einer Lösung in einer geeigneten physiologischen Flüssigkeit, wie Ringer-Lösung, 5%iger Dextrose oder physiologischer Kochsalzlösung.

Der Faktor G eignet sich ferner auch zur Erhöhung der Gewichtszunahme bei Hühnchen, wenn man ihn Hühnchen zusammen mit dem Futter oder dem Trinkwasser verabfolgt. Bei einer Verabreichung des Faktors G zusammen mit dem Hühnchenfutter in einer Konzentration zwischen etwa 2,5 und 100 ppm ergibt sich gegenüber entsprechenden Kontrollen, die keinen solchen Wirkstoff enthalten, eine erhöhte Gewichtszunahme der Hühnchen mit verbesserter Futterverwertung. Bevorzugt wird der Faktor G zu diesem Zweck in Form eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes zusammen mit dem Trinkwasser verabreicht. Eine für diese Verabreichungsart geeignete Salzform des Antibiotikums ist beispielsweise das Dihydrochlorid von A-4696G. Das Antibiotikum A-4696G oder das entsprechende Salz ist im Trinkwasser im allgemeinen in einer Konzentration von etwa 1,5 bis 50/Ltg/ml und vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 10 bis 20μg/ml vorhanden. Zur Erfindung gehört daher weiter auch ein Verfahren zur Verbesserung des Wachstums von Hühnchen, das darin besteht, daß man Hühnchen eine wachstumsfördernde Menge des Faktors G des Antibiotikums A-4696 oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon verabreicht.

Der Faktor G läßt sich, wie oben bereits erwähnt, entweder durch Einarbeiten in das jeweilige Futter oder in das Trinkwasser verabfolgen. Eine maximale Gewichtszunahme ergibt sich insbesondere dann, wenn man den Hühnchen während der gesamten Wachstumsphase ein Futter gibt, das das Antibiotikum A-4696G als Wirkstoff enthält.

Das Antibiotikum A-4696G kann in alle für Hühnchen üblichen Futtermittel eingearbeitet werden. Zu diesem Zweck kann man den isolierten und praktisch reinen Faktor G des Antibiotikums A-4696 verwenden und mit dem Tierfutter vermischen. Besonders wirtschaftlich und günstig ist hier jedoch die Verwendung des Faktors G in einer Form, wie man sie direkt durch Trocknung der gesamten Fermentationsbrühe im Gemisch mit dem bei der Fermentation gebildeten Mycel erhält. Die hierbei anfallende getrocknete Myceizusammensetzung von A-4696G läßt sich bezüglich ihres Gehalts an Faktor G entsprechend untersuchen, so daß man die jeweils erforderliche Menge an Zusammensetzung dann dem Hühnchenfutter beigeben kann. Eine solche, den Faktor G enthaltende Myceizusammensetzung trägt zugleich auch einen gewissen Nährwert zum Futter in Form von Sacchariden und Amidosäuren bei, die im Mycel enthalten sind.

Zu einer entsprechenden Myceizusammensetzung von A-4696G kann man auch gelangen, indem man das Mycel von der Brühe abtrennt, die nach Entfernen des Faktors G von der Brühe in der oben beschriebenen Weise gewonnenen und den Faktor G enthaltenden Säuleneluate entsprechend konzentriert und das hierdurch erhaltene Konzentrat dann vor dem Trocknen mit dem abgetrennten Mycel vermischt.

Der Faktor G des Antibiotikums A-4696 und seine pharmazeutisch unbedenklichen Salze sind wirksame Wachstumspromotoren für Wiederkäuer, wie Kühe, Ziegen oder Schafe. Die Wirksamkeit der Kohlehydratverwertung bei Wiederkäuern erhöht sich bekanntlich, wenn man die Rumenflora dazu stimuliert, daß Propionatverbindungen anstelle der Acetat- oder Butyratyerbindungen der im Rumen vorhandenen flüchtigen Fettsäuren gebildet werden, und in diesem Zusammenhang wird hingewiesen auf Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants, Band 2,1971, Seiten 622 und 625. Die freie Base des Antibiotikums A-4696G oder vorzugsweise die entsprechenden pharmazeutisch unbedenklichen Salze hiervon führen zu einer bevorzugten Bildung von Propionaten gegenüber den Acetaten und Butyraten in der Rumenflüssigkeit. Anhand entsprechender Untersuchungen unter Verwendung einer Rumenflüssigkeit in kontinuierlichen Fermentationskolben, bei denen die Wirkung des Rumen nachgemacht wird, hat sich beispielsweise ergeben, daß das Antibiotikum A-4696G die Bildung der Propionate in bezug auf die anderen Fettsäuren begünstigt.

Diese Untersuchungen werden wie folgt durchgeführt.

Es werden gasdichte Kolben verwendet, die mit entsprechenden Einleitöffnungen für Flüssigkeiten und Feststoffe versehen sind und Gasauslaßröhrchen aufweisen, welche mit Blasen zum Auffangen der Fermentationsgase verbunden sind. Das Flüssigkeitsvolumen der in den Kolben enthaltenen jeweils zu untersuchenden Flüssigkeit hält man mittels eines Standrohrs, das mit einem Auffanggefäß verbunden ist, auf 500 ml. Der Kolbeninhalt wird während des gesamten Versuchs kontinuierlich mit einem Magnetrührer gerührt. Die Kolben werden während der Untersuchungen auf einer Temperatur zwischen etwa 38 und 40⁰C gehalten.

Jeden Kolben versetzt man mit 500ml Rumenflüssigkeit, die man von einem mit einer Fistel versehenen Stier erhält, der mit dem gleichen Futter gefüttert wird, das auch in der Versuchsflüssigkeit vorhanden ist. Sodann verschließt man die Kolben und befestigt die Gasauffangblasen entsprechend. In die einzelnen Kolben leitet man dann in einer Menge von etwa 1 l/Tag kontinuierlich einen flüssigen Puffer (pH 6,8 bis 7,0) folgender Zusammensetzung ein:

Bestandteile g/l

Natriumhydrogenphosphat 2,2

Magnesiumchlorid 0,036

Natriumbicarbonat 5,9

Kaliumchlorid 0,34

Natriumchlorid 0,28

Harnstoff 1,0

Calciumchlorid 0,024

Jeden Kolben versetzt man zweimal täglich mit jeweils 10g Futter. Nach jeder Futterzugabe schließt man die Abgasleitung und spült den Kolben mit Kohlendioxid. Das verwendete Futter ist zusammengesetzt aus 50% Luzemenheu und 50% folgender Bestandteile:

Bestandteile Gew.-%

Grobgemahlener Mais 40,85

Gemahlene Maiskolben 35 Sojabohnenmehl (50 % Protein) 8,1

Luzernenmehl 4

Melasse 10 Harnstoff 0,55

Dicalciumphosphat 0,6

Calciumcarbonat 0,3

Natriumchlorid 0,3

Vorgemisch aus Vitamin A und D₂ 0,07

Vorgemisch aus Vitamin E 0,05

Spuren Mineralgemisch 0,04

Der Stier, der als Lieferant für die Rumenflüssigkeit dient, wird ebenfalls mit dem gleichen Futter gefüttert.

Während des Versuchs sammelt und analysiert man einmal täglich den Flüssigkeitsabstrom und das Gas. Es wird insgesamt vier Tage lang fermentiert, bevor man das Antibiotikum dem Futter zusetzt. Nach diesem vier Tage langen Gleichgewichtslauf und nach verhältnismäßigem Konstantwerden der Zusammensetzung von Gas- und Flüssigkeitsabstrom beginnt man mit der Zugabe des das Antibiotikum A-4696G enthaltenden Futters und setzt die Fermentation dann 7 Tage mit dem behandelten Futter fort.

Die Zusammensetzung an Acetat, Propionat und Butyrat des Flüssigkeitsabstroms aus jedem Kolben wird gaschromatographisch bestimmt. Die dabei für das Antibiotikum A-4696G erhaltenen Daten gehen aus der folgenden Tabelle V hervor.

TABELLE V Einfluß von A-4696G Behandlung	auf die Zusammensetzung des Rumen Dosis11 VFA-Produktion21 μg/ml C2 C3	43,6 39,0	15,2 21,4	C4	Gesamt/VFA	Molprozentuale Bildung von C3
Kontrolle A-4696G31	0 4	5,4 3,3	64,2 63,7	23,7 33,6

1) Konzentration in der Versuchslösung

2) Die angegebenen Werte verstehen sich in Miilimol an flüchtigen Fettsäuren (VFA) pro Tag

3) Freie Base von A-4696G

Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern mit entwickelter Pansenfunlction, das darin besteht, daß man solchen Tieren oral eine propionaterhöhende Menge an Antibiotikum A-4696G verabreicht.

Zur Durchführung dieses Verfahrens verabfolgt man oral wenigstens eine solche Menge an A-4696G, daß sich hierdurch eine erhöhte Bildung an Propionaten im Rumen ergibt. Die hierzu erforderliche Menge an Antibiotikum A-4696G beträgt allgemein etwa 0,1 bis 5mg Wirkstoff pro kg Körpergewicht des Tiers und pro Tag. Vorzugsweise werden Wirkstoffmengen von etwa 0,25 bis 3 mg/kg und Tag verabfolgt.

Die Verabreichung des Faktors G des Antibiotikums A-4696 oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon, beispielsweise eines Sulfats, Hydrochlorids oder Phosphats, kann beispielsweise erfolgen in Form eines Bolus mit verzögerter Wirkstofffreisetzung, eines wirkstoffhaltigen Mineral- oder Proteinblocks, eines Ergänzungsfutters oder eines Gesamtfutters. Bei auf der Weide befindlichen Tieren erfolgt die Wirkstoffverabreichung am besten unter Verwendung eines Bolus mit verzögerter Wirkstofffreigabe. Solche BoIi lassen sich unter Einsatz von Polymeren herstellen, die einen langsamen Austritt an Antibiotikum A-4696G über eine Zeitdauer von mehreren Wochen erlauben. Die hierzu verwendeten BoIi sollen eine solche Dichte haben, daß sie im Rumen des jeweiligen Tiers verbleiben und nicht durch den Verdauungstrakt ausgeschieppt werden. Die hierzu erforderliche hohe Dichte läßt sich durch Zugabe von Metallteilchen zum jeweiligen Bolus erreichen. Für die Wirkstoffversorgung von auf der Weide befindlichen Tieren eignen sich ferner auch Mineralbiöcke, die das Antibiotikum A-4696G enthalten. Solche Mineraiblöcke sind in der Tierhaltung seit langem üblich und enthalten physiologisch geeignete Salze, Mineralien und Nährstoffe, wie Phosphate, Carbonate, Calciumsalze, Spurenelemente, wie Zink, Mangan und dergleichen, Vitamine, Steroide und andere Bestandteile in hochverdichteter Form. Sie können den erforderlichen Wirkstoff A-4696G in einer Konzentration von etwa 0,05 bis 5% enthalten.

Die bevorzugte Verabreichungsart für das Antibiotikum A-4696G besteht in einem Zusatz zum Tierfutter. Futtermittel., die das vorliegende Antibiotikum A-4696G oder ein entsprechendes pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon enthalten, sind infolge des neuen Wirkstoffgehalts neue Zusammensetzungen, die daher ebenfalls zur Erfindung gehören. Entsprechende Tierfuttermitte! werden im allgemeinen stufenweise hergestellt. Zu diesem Zweck vermischt man den jeweiligen Wirkstoff zuerst mit inerten Bestandteilen unter Bildung eines Futtervorgemisches, und in dieser Form wird der Wirkstoff dann vom ursprünglichen Hersteller an eine lokale Futtermühle geliefert. Bei den Vorgemischen kann es sich entweder um Flüssigkeiten oder um Feststoffe handeln, und diese können etwa 1 bis 90% des jeweiligen Wirkstoffs enthalten. Die inerten Bestandteile eines Futtervorgemisches sind nicht kritisch und können irgendwelche übliche physiologisch unbedenkliche Träger sein. Zu geeigneten flüssigen Trägern gehören beispielsweise Glykole, wie Poiyethylenglykole verschiedener Molekulargewichte oder Propyienglykoi, inerte Öle unter Einschluß von Pflanzenölen und raffinierten Mineralölen oder physiologisch unbedenkliche Alkohole, wie Ethanol. Zu festen Trägern für entsprechende Vorgemische gehören beispielsweise Vermiculit, Diatomeenerde, physiologisch unbedenkliche Tone, wie Attapulgitton oder

Montmorillonitton, sowie granulierte oder pulverisierte Futterbestandteile, wie zerkleinerter Mais, Sojabohnenmehl, Luzernenmehl, Reishülsen, zerkleinerte Maiskolben, zerkleinerter Weizen, zerkleinerter Hafen oder alle Sorten an bei der Getreideverarbeitung anfallenden Abfallmaterialien. Diese Bestandteile fester Futtervormischungen sind häufig granuliert, pelletisiert oder sonst wie behandelt, um sicherzustellen, daß das Futtervorgemisch homogen bleibt. Im folgenden werden einige erfindungsgemäß geeignete Beispiele für entsprechende Futtervormischungen angeführt:

Haferschrot 84%

Polypropylenglykol 2

Lignin 3

DihydrochioridvonA-4696G 11

Gelber Mais 24%

Gemahlene Maiskolben 25

Mineralöl 1

SulfatvonA-4696G 50

Sojabohnenmehl 10%

Phosphat von A-4696G 90

Polyethylenglykol 90%

DihydrochloridvonA-4696G 9

Polyoxyethylenester 1

Vermiculit 33%

Baumwollsaatöl 2

A-4696G 65

Reishülsen 22,5%

Melasse 2,5 —-

Sulfat von A-4696G 75

Mineralöl 90%

Polygiycerinester 5

A-4696G 5

Gemahlene Maiskolben 74%

Sojabohnenöl 1

DihydrochloridvonA-4696G 25

Bevorzugt werden solche Futtervormischungen, die etwa 100g oder etwa 200g A-4696G oder eines Salzes hiervon pro kg Futtervorgemisch enthalten.

Eine zweite Stufe bei der Herstellung von Tierfutter besteht in der Bildung eines Zusatzfutters oder Konzentrats. Bei solchen Zusatzfuttern handelt es sich um Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Verbindung im Gemisch mit Nährsubstanzen enthalten, wie Mineralien, anorganischen Salzen, Spurenelementen und Vitaminen. Die Bildung entsprechender Ergänzungsfutter erfolgt häufig durch Vermischen und Verdünnen eines Futtervorgemisches mit anderen Bestandteilen, und zwar gewöhnlich von den lokalen Futtermühlen an Ort und Stelle, wo sich größere Tierhaltungen befinden. solche Ergänzungsfutter werden dann entweder zur Herstellung fertiger Futtermischungen verwendet, die den Wirkstoff A-4696G enthalten, oder auch einfach überdas entsprechende keinen Wirkstoff enthaltende Futter gegeben, das sich in den Futtertrögen oder Futterbunkern befindet. Die Konzentration an A-4696G im Ergänzungsfutter schwanken innerhalb breiter Grenzen in Abhängigkeit von der Menge an Ergänzungsfutter, die dem eigentlichen Futter des jeweiligen Tiers zugesetzt werden soll. Die Konzentrationen liegen im allgemeinen bei etwa 0,01 bis 1%, und vorzugsweisee bei etwa 0,02 bis 0,5%. Beispiele für Ergänzungsfutterzusammensetzungen, die die erfindungsgemäße Verbindung enthalten, sind folgende:

Gemahlene Maiskolben 38,5%

Sojabohnenmehl 25,0

Gemahlener Mais 20,0

Gemahlener Hafer 10,0 Melasse 2,5

Salz 0,4

Vitaminvorgemisch 1,1

Tierfett 1,5

Phosphat von A-4696G 1,0

Sojabohnenmehl , 64,29%

Biuret 10,0 Dicalciumphosphat 4,2

Natriumtripolyphosphat	2,1
Schwefel	0,4
Melasse	6,0
Salz	12,8
Spurenmineral-Vorgemisch	0,2
A-4696G	0,01
III.
Sojabohnenmehl	49,59%
Luzernenmehl	24,8
Harnstoff	12,4
Dicalciumphosphat	2,5
Gemahlener Kalkstein	7,4
Salz	2,5
Vitamin-Vorgemisch	0,8
SulfatvonA-4696G	0,01
IV. Sojabohnenmehl	89,55 %
Dicalciumphosphat	10,0
Dihydrochlorid von A-4696G W	0,45
V. Sojabohnenmehl	10,75%
Harnstoff	20,0
Dicalciumphosphat	16,0
Calciumcarbonat	24,0
Salz	20,0
Natriumcarbonat	2,0
Spurenmineral-Vorgemisch und
Vitam i n-Vorgem isch	7,2
A-4696G	0,05

Entsprechende Futter für wiederkauende Tiere beruhen gewöhnlich und vorzugsweise auf Getreide und sind dem jeweiligen Bedarf solcher Tiere angepaßt. Die normalerweise trockenen oder aufgeschlämmten Futter für Wiederkäuer auf Basis von Getreiden, wie Weizen, Hafer, Gerste, Mais und dergleichen, werden genau so mit dem erfindungsgemäßen Wirkstoff behandelt wie dies in der Tierhaltung im Zusammenhang mit anderen Wirkstoffen bereits seit langer Zeit üblich ist. Solche Futtermittel enthalten gewöhnlich die entsprechenden Grundgetreide und ferner auch noch Zusatzstoffe, wie Vitamine, Mineralien, anorganische Salze und sonstige wichtige Nährsubstanzen, die für eine ausreichende Ernährung des jeweiligen Wiederkäuers wichtig sind. Ein derartiges Futter soll im allgemeinen etwa 5 bis 500 ppm A-4696G oder eines Salzes hiervon enthalten, wobei die bevorzugte Wirkstoffmenge zwischen etwa 10 und 250ppm liegt. Die folgenden Aufstellungen zeigen für derartige erfindungsgemäße Futter geeignete Zusammensetzungen.

I. Gehackte Luzerne	54,88%
Sorghumkorn	36,20
Sojabohnenmehl	4,10
Mischung aus Harnstoff und Korn, 70 % Proteingehalt	3,60
Dicalciumphosphat	0,90
Mit Spurenmineralien versehenes Salz	. 0,23
Vitaminzusatz	0,09
A-4696G Il	5 ppm
Π. Gemahlenes Sorghum	60,0 %
Luzernenmehl	15,0
Baumwollsaathülsen	15,0
Baumwollsaatmehl	8,5
Salz	1,0
Gemahlener Kalkstein	0,5
Phosphat von A-4696G Ml	250 ppm
111. Weizen	44,54%
Maiskolben	45,00
Rohrzuckermelasse	3,00-
Sojabohnenmehl	6,40
Dicalciumphosphat	0,65
Kalkstein	0,38
Spurenmineralien	0,03
A-4696G	50 ppm
IV.
Gemahlenes Timothyheu	15%
Gemahlenes Luzernenheu	15

Zerkleinerter Mais	50
Sojabohnenölmehl	10
Melasse	9
Mit Spurenmineralien versehenes Salz und Vitamin-
Vorgemisch	1
Sulfat von A-4696G	100 ppm

Der Faktor G des Antibiotikums A-4696 eignet sich ferner auch als wachstumsförderndes Mittel für Geflügel und Schweine. Zu diesem Zweck verabreicht man derartigen Tieren zusammen mit ihrem Futter oder ihrem Trinkwasser das Antibiotikum A-4696G oder ein entsprechendes pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon in geeigneter Weise. Vorzugsweise erfolgt eine Verabreichung des Dihydrochlorids von A-4696G oder eines sonstigen wasserlöslichen Salzes zusammen mit dem Trinkwasser.

Ausführungsbeispiele:

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen weiter erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von Antibiotikum A-4696G ·

Es wird eine Nähragarschräge folgender Zusammensetzung hergestellt, die dann zur Beimpfung mit dem das Antibiotikum A-4696G bildenden Stamm verwendet wird.

Bestandteile	Menge (Gew.-%)
Cerelose	0,5
Kartoffeldextrin	2,0
Sojabohnenmehl*	1,5
Hefeextrakt	0,25
Calciumcarbonat	0,1
Agar	2,0
* Sojabohnenmehl = Nutrisoy-Flour

Der Schrägagar wird mit A-4696G ATCC 31681 beimpft und dann etwa 6 Tage bei 30°C inkubiert. Nach erfolgter Inkubation bedeckt man die Mycelmatte auf der Schrägkultur mit sterilem destilliertem Wasser und löst das Ganze davon durch Abkratzen mit einem sterilen Stab oder einer Schlaufe, wodurch man zu einer wäßrigen Suspension des Mycels gelangt. Die hierbei erhaltene wäßrige Suspension wird dann als Inokulum für 100ml steriles vegetatives Medium gleicher Zusammensetzung wie das oben beschriebene Medium für den Schrägagar verwendet. Das so inokulierte Medium bebrütet man etwa 48 Stunden bei einer Temperatur von etwa 30⁰C. Das vegetative Medium wird während der Bebrütung auf einem Rotationsschüttler, der mit einer Geschwindigkeit von etwa 250 Umdrehungen/Minute läuft, durchmischt. Nach erfolgtem Wachsen des vegetativen Mediums entnimmt man 10mi der gewachsenen Kultur und verwendet diese als Inokulum für ein steriles Stoßmedium folgender Zusammensetzung.

Bestandteile	Menge (Gew.-%)
Cerelose	0,5
Hefe	0,25
Nährsojamehl*	1,5
Maisstärke	2,0
Caiciumcarbonat	0,1
Antischaummittel (Sag 471 )**	0,05
* Nährsojamehl = Nutrisoy-Flour
** Sag 471 = Silicon-Antischaummittel von Union Carbide

Das Stoßmedium wird etwa 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 30⁰C unter Durchmischung auf einem bei 250 Umdrehungen/Minute betriebenen Rotationsschüttler bebrütet. Mit dem erhaltenen gewachsenen Stoßmedium beimpft man dann das sterile Produktionsmedium für A-4696G mit folgender Zusammensetzung:

Bestandteile	Menge (Gew.-%)
Cerelose	2,5
Hefe	2,0
Calciumcarbonat	0,2
Ammoniumsulfat	0,025
Saures Dicalciumphosphat	0,05
Glycerin	1,5
Melasse	1,5
Maisstärke	3,5
Antischaummittel (Sag 471)	0,03

Die Fermentation wird über eine Zeitdauer von 143 Stunden bei einer Temperatur von etwa 3O⁰C unter Rühren und Belüften mit steriler Luft in einer Menge von etwa 0,5 Volumen/Volumen Kulturmedium und pro Minute durchgeführt. Während der Fermentation erhöht sich der pH-Wert des Mediums von anfänglich etwa 6,5 auf etwa 8,0.

Ein Teil (301) der gesamten Fermentationsbrühe wird mit 301 Aceton verdünnt und mit 6n Chlorwasserstoffsäure auf pH 1,8 eingestellt. Die angesäuerte Gesamtbrühe wird mittels einer Filterhilfe filtriert, und die zurückbleibenden unlöslichen Bestandteile werden auf dem Filter mit Wasser gewaschen. Der pH-Wert des Filtratswird mit 150ml 50%igem Natriumhydroxid auf 3,5 eingestellt und das Filtrat dann unter Vakuum auf ein Volumen von 29I eingeengt. Im Anschluß daran stellt man den pH-Wert mit Natriumhydroxid auf 2,2 bis 3,1 ein und filtriert das Ganze zur Entfernung unlöslicher Bestandteile. Das das gewünschte Antibiotikum enthaltende Filtrat leitet man dann über eine Säule mit einem Durchmesser von etwa 8cm, die 51 eines nichtfunktionellen Styrol-divinylbenzol-Harzes (Dianion HP-20 von Mitsubishi) enthält, das mit Methylalkohol vorbehandelt und mit Wasser gewaschen ist. Es wird bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 250 ml/Minute gearbeitet. Nach erfolgter Adsorption des Antibiotikums an das Harz wird die Säule mit 51 Wasser gewaschen und der Reihe nach mit 211 20%igem wäßrigem Methylalkohol, 151 50%igem wäßrigem Methylalkohol und 151 50%igem wäßrigem Aceton eluiert. Es werden jeweils 41-Fraktionen an Waschflüssigkeit und Eluat gesammelt. Die Fraktionen 8, 9 und 10 enthalten die überwiegende antibiotische Aktivität und sind ferner auch frei vom Großteil an Verunreinigungen. Die Fraktionen 8,9 und 10 werden vereinigt und unter Vakuum auf ein Volumen von 61 eingeengt. Der pH-Wert des Konzentrats wird mit wäßrigem Natriumhydroxid auf 6,8 eingestellt, worauf man das Ganze in 601 Isopropylalkohol gießt. Das aus diesem Gemisch ausfallende A-4696G wird abfiltriert und getrocknet. Auf diese Weise gelangt man zu 54,2 g Antibiotikum A-4696G in praktisch reiner Form.

Beispiel 2

Herstellung des Dihydrochloridsaizes des Antibiotikums A-4696G

Die freie Base von A-4696G wird in wäßrigem Methanol gelöst und die Lösung mit 1 η Chlorwasserstoffsäure verdünnt. Nach entsprechendem Rühren wird die angesäuerte Lösung mit Aceton verdünnt, wodurch das gewünschte Dihydrochloridsalz des Antibiotikums A-4696G ausfällt.

Beispiel 3

Anderes Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums A-4696G

Die nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellte Fermentationsbrühe wird nach Zugabe von 5% (Gewicht/Volumen) Filterhilfe (Celite 545) filtriert. Der Filterkuchen wird in einem gleichen Volumen deionisiertem Wasser suspendiert. Der pH-Wert der wäßrigen Suspension wird mit wäßrigem Natriumhydroxid auf 10,5 eingestellt. Die suspendierten Feststoffe werden abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeiten werden vereinigt, und die erhaltene Lösung wird mit 20%iger (Gewicht/Volumen) wäßriger Schwefelsäure auf pH 4,5 angesäuert. Die saure Lösung wird zur Klärung unter Verwendung von 1 % Filterhilfe (Celite 545) filtriert. Die klare Lösung leitet man dann durch eine Säule, die Amberlite IR-116 (Na⁺-Form) enthält, und die Säule wird mit deionisiertem Wasser gewaschen. Sodann entfernt man das Harz IR-116 von der Säule und eluiert das Ganze absatzweise bei einem pH-Wert von 10,5 mit einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung. Das Harzeluatwird mit 20%iger (Gewicht/Volumen) wäßriger Schwefelsäure neutralisiert (pH7) und dann dreimal mit deionisiertem Wasser gewaschen. Das hierbei anfallende Waschwasser wird neutralisiert und mit dem neutralisierten Eluat vereinigt. Die so gewonnene Lösung wird konzentriert und dann gefriergetrocknet.

Der in obiger Weise erhaltene rohe Komplex wird unter kräftigem Rühren langsam zu deionisiertem Wasser gegeben. Die anfallende Suspension wird 20 Minuten gerührt und dann unter Verwendung einer 10%igen wäßrigen Ammoniumhydroxidlösung neutralisiert (pH7). Das unlösliche A-4696G wird durch Vakuumfiltration abgetrennt, mit deionisiertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet.

Das auf diese Weise erhaltene getrocknete und von Salz befreite A-4696G wird in deionisiertem Wasser suspendiert, und die Suspension wird durch Zugabe von 3n wäßriger Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,7 eingestellt. Die angesäuerte Lösung wird 40 Minuten bei 2500 Umdrehungen/Minute zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und auf eine Säule gegeben, die ein Entfärbungsharz (Duolite S761) enthält. Die Aktivität wird von dem in der Säule befindlichen Harz mit deionisiertem Wasser unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 30ml/Minute eluiert. Der Fortgang der Elution wird dünnschichtchromatographisch überwacht. Derauf diese Weise anfallende und das Antibiotikum A-4696G enthaltende Säulenabstrom wird unter Vakuum (3 mm, 35⁰C) eingeengt und gefriergetrocknet.

Das in obiger Weise erzeugte und entfärbte Antibiotikum A-4696G wird in deionisiertem Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wird filtriert und auf eine Säule gegeben, die ein Polyamid (Machery & Nagel SC6) enthält. Die Säule wird mit deionisiertem Wasser eluiert. Der Ablauf der Elution wird durch Ermittlung der UV-Aktivität und durch Dünnschichtchromatographie überwacht. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden anhand des entsprechenden Dünnschichtchromatogramms vereinigt und gefriergetrocknet. Durch eventuelle Wiederholung des chromatographischen Verfahrens läßt sich gegebenenfalls eine weitere Reinigung erzielen.

Claims (3)

1. Erfindungsansprüche

   1. Tierfutter für Wiederkäuer und Hühner aus einer die Futterverwertung erhöhenden und das Wachstum fördernden Menge eines Wirkstoffs neben dem eigentlichen Futter und/oder dem Trinkwasser, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff den Faktor G des Antibiotikums A-4696 oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz dieses Antibiotikums enthält, das ein Glykopeptid mit zwei basischen Aminogruppen ist, das in Form des Dihydrochlorids eine weiße kristalline Verbindung ist, die praktisch löslich ist in Wasser und unlöslich ist in organischen Lösungsmitteln, wie Methylalkohol, Aceton, Chloroform oder Benzol, das eine ungefähre prozentuale Elementarzusammensetzung von 52,90% Kohlenstoff, 4,29% Wasserstoff, 6,39% Stickstoff, 30,96% Sauerstoff und 5,46% Chlor hat, das im Infrarotbereich bei Untersuchung anhand von Kaliumbromidpellets folgende Absorptionsmaxima aufweist:

   3384 (breit), 2924 (schwach), 1730 (Schulter), 1 659 (stark), 1 616 (schwach), 1 590 (schwach), 1 504 (stark), 1488 (Schulter), 1427 (mittel), 1 289 (schwach), 1 226 (Doublett), 1 214 (Doublett), 1179 (schwach), 1119 (schwach), 1 060 (stark), 1 028 (schwach), 1015 (Schulter), 986 (schwach), 899 (sehr schwach), 881 (sehr schwach), 815 (schwach), 801 (Schulter), 769 (Schulter), 751 (Schulter) und 711 (schwach) cm"', das in Wasser ein Absorptionsmaximum im Ultraviolettbereich bei 279nm von E{^_m = 53 aufweist, das sich in Form der freien Base bei pH-Werten zwischen 3,5 und 13,5 in 66%igem wäßrigem

   pimethylformamicI kontinuierlich^^elektrgmetrisch titrieren läßt, u^nd^das bei Hydrolyse über eine Zeitdauer von etwa

   70 Minuten in 5%iger wäßriger Chlorwasserstoffsäure bei Rückflußtemperatur das Pseudo-Äglykon der folgenden Formel bildet:

   Ιοί Ιοί Ιοί

   X> iNri _Λ .ο ι-u ι

   s\s\. ι ΗσΎν'γ
2. 2. Tierfutter nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff das Dihydrochlorid des Antibiotikums A-4696G enthält.
3. 3. Tierfutter nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff das Sulfat des Antibiotikums A-4696G enthält.