Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antybiotyku A-4696G oraz jego farmaceutycznie dopu¬ szczalnych soli addycyjnych z kwasami. Antybiotyk ten jest nowym skladnikiem kompleksu antybiotyku A-4696 i zostal okreslony jako czynnik G antybiotyku A-4696 lub antybiotyk A^696G. Jest on przydatny jako srodek przeciwko bakteriom gram-dodatnim oraz jako srodek przyspieszajacy wzrost zwierzat.Antybiotyk A-4696G jest substancja zasadowa tworzaca sole addycyjne z kwasami. Szczególnie przy¬ datnymi zwiazkami wytwarzanymi sposobem wedlug wynalazku sa farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne A-4696G z kwasami. Dla uproszczenia przy omawianiu ich przydatnosci stosuje sie okreslenie „antybiotyk A-4696G", które odnosi sie do czynnika G antybiotyku A-4696 lub farmaceutycznie dopuszczalnej soli czynni¬ ka G antybiotyku A-4696.Wiadomo, ze wiele drobnoustrojów wytwarzajacych antybiotyki wytwarza w czasie fermentacji wiecej niz jedna substancje antybiotyczna. Niektóre wytwarzaja kompleks substancji antybiotycznych o podobnej lub róznej strukturze. Jednym z takich drobnoustrojów jest szczep Actinoplanes ATCC 23342, wytwarzajacy anty¬ biotyk A-4696, ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 3 952 095. W kompleksie A^4696 wykryto nastepnie czynniki A i B antybiotyku A-4696 ujawnione w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr4115 522.Wyodrebnianie poszczególnych substancji antybiotycznych z kompleksu antybiotyku zawierajacego wiele czynników czesto stwarza problemy, zwlaszcza wówczas, gdy do wykorzystania praktycznego nadaje sie poje¬ dynczy czynnik. Usilowania otrzymania pojedynczego czynnika obejmuja selekcje szczepu oraz mutacje drobno¬ ustroju w nadziei, ze nowy szczep wytwarzac bedzie pojedynczy czynnik lub wieksze ilosci pozadanego czynni¬ ka. Czesto w wyniku takich usilowan wykrywa sie nowy szczep, który wytwarza nowy zwiazek antybiotyczny, sam lub w polaczeniu z czynnikami wytwarzanymi przez szczep dotychczasowy.2 131 763 Sposobem wedlug wynalazku otrzymano nowy czynnik antybiotyku A-4696, przez hodowle nowego szczepu Actinoplanes missouriensis, organizmu znanego z tego, ze wytwarza kompleks antybiotyku A-4696 oraz poszczególne czynniki A i B.Wynalazek niniejszy wynika z prac badawczych obejmujacych selekcje szczepów, mutacje szczepów i meto¬ dy rozdzielania, prowadzonych nad antybiotykiem A-4696.Sposób wytwarzania glikopeptydu A - 4696G lub jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami polega wedlug wynalazku na tym, ze prowadzi sie hodowle organizmu Actinoplanes missouriensis ATCC 31681 w wodnej pozywce hodowlanej zawierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu i sole nieorganiczne w warunkach wglebnej fermentacji aerobowej az do uzyskania produktu o znacznej aktywnosci antybiotycznej i powstaly zwiazek ewentualnie przeprowadza sie w sól.Antybiotyk wyodrebnia sie z surowej brzeczki fermentacyjnej przez adsorpcje na zywicach, a oczyszcza przez chromatografie.Glikopeptyd A-4696G lub jego farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami zwiekszaja wy¬ dajnosc wykorzystania paszy przez zwierzeta przezuwajace, przy podaniu doustnym w ilosci zwiekszajacej wydzielenie propionianów. W tym celu zwierzetom przezuwajacym podaje sie pasze, przedmieszke paszowa lub dodatek paszowy zawierajacy odpowiednia ilosc zwiazku A-4696G lub jego farmaceutycznie dopuszczalnej soli addycyjnej z kwasem.Antybiotyk A-4696G lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól addycyjna z kwasem stosuje sie równiez do przyspieszania wzrostu kurczat. W tym celu podaje sie kurczetom albo w karmie albo w wodzie pitnej, odpowiednia ilosc tego antybiotyku.Antybiotyk A-4696G jest glikopeptydem zawierajacym dwie zasadowe grupy aminowe. W postaci dwu- chlorowodorku jest zwiazkiem krystalicznym o bialej barwie. Analiza elementarna dwuchlorowodorku A—4696G wykazuje, ze ma on nastepujacy przyblizony sklad procentowy: wegiel 52,90%, wodór 4,29%, azot 6,39%, tlen 30,96% (z róznicy), chlor 5,46%. A-4696G ma przyblizona mase czasteczkowa okolo 1700.Antybiotyk A -4696G (w postaci dwuchlorowodorku) wykazuje widmo adsorpcyjne w podczerwieni przy uzyciu pastylki KBr, przedstawione na zalaczonym rysunku. Charakterystyczne maksima adsorpcji wystepuja przy nastepujacych czestotliwosciach (cm"1) = 3384 (szerokie), 2924 (slabe), 1730 (rozciagniete), 1659 (inten¬ sywne), 1616 (slabe), 1590 (slabe), 1504 (intensywne), 1488 (rozciagniete), 1427 (srednie), 1289 (slabe), 1226 (dublet), 1214 (dublet), 1179 (slabe), 1060 (intensywne), 1028 (slabe), 1015 (rozciagniete), 986 (slabe), 899 (bardzo slabe), 881 (bardzo slabe), 815 (slabe), 801 (rozciagniete), 769 (rozciagniete), 751 (rozciagniete) i 711 (slabe).Przy miareczkowaniu elektrometrycznym A--4696G w 66% wolnym roztworze dwumetyloformamidu (poczatkowe pH 7,89) nastepuje stopniowe zuzycie roztworu mianowanego w zakresie pH od 3,5 do 13,5.Dwuchlorowodorek A—4696G w wodzie wykazuje widmo adsorpcyjne w nadfiolecie o maksimum absor¬ pcji przy 279 nm (Ej1^ = 53).Dwuchlorowodorek A-4696G rozpuszcza sie w wodzie, natomiast jest nierozpuszczalny w rozpuszczalni¬ kach, takich jak metanol, aceton, eter dwuetylowy, chloroform, benzen itp.Oprócz A-4696G w postaci wolnej zasady i chlorowodorku sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie równiez inne sole addycyjne z kwasami A-4696G. Reprezentatywnymi i odpowiednimi solami A-4696G sa sole powstajace w znanych reakcjach z kwasami zarówno organicznymi,jak i nieorganicznymi, takimi jak kwas siarko¬ wy, solny, fosforowy, octowy, bursztynowy, cytrynowy, mlekowy, maleinowy, fumarowy, palmitynowy, cholo¬ wy, pamoesowy, sluzowy, D-glutaminowy, d-kamforowy, glutarowy, glikolowy, ftalowy, winowy, mrówkowy, laurynowy, stearynowy, salicylowy, metanosulfonowy, benzenosulfonowy, sorbowy, pikrynowy, benzoesowy, cynamonowy i inne podobne kwasy.Solami „farmaceutycznie dopuszczalnymi" sa sole, które nie sa jako calosc nadmiernie toksyczne dla zwierzat cieplokrwistych.Czynnik G antybiotyku A-4696, podobnie jak kompleks antybiotyku A-4696 i poszczególne jego czynni¬ ki, ulega hydrolizie w ciagu okolo 70 minut przy ogrzewaniu w temperaturze wrzenia w 5% kwasie solnym, tworzac pseudoaglikon o wzorze przedstawionym na rysunku. Pseudoaglikon wytraca sie z mieszaniny hydrolity- cznej.Jak widac z wzoru przedstawionego na rysunku pseudoaglikon zawiera 6 fenolowych grup hydroksylowych oraz wolna grupe aminowa, oprócz grupy aminowej w przylaczonym aminocukrze, ristozaminie. Podobnie jak inne czynniki antybiotyku A-4696, czynnik G wytwarzany sposobem wedlug wynalazku zawiera cukry oboje¬ tne przylaczone do pierscienia pseudoaglikonu poprzez jedna lub wiecej grup fenolowych. Cukry te mozna usunac przez hydrolize kwasowa czynnika G. Wsród cukrów obojetnych zidentyfikowanych w hydrolizacie131763 3 kompleksu antybiotyku A-4696 znajduje sie mannoza, glikoza i ramnoza. Czynnik G rózni sie od innych czynników antybiotyku A—4696 rodzajem i iloscia cukrów obojetnych przylaczonych do pierscienia, a takze miejscem przylaczenia. W czasie hydrolizy zachowuje sie on podobnie jak czynniki B^ i Ci .Czynnik G odróznic mozna od znanego czynnika A, a takze od innych czynników na podstawie jego retencji "w cisnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC). Ponizej zestawiono wartosci retencji (wartosci Kl) dla szeregu czynników antybiotyku A-4696 z zastosowaniem HPLC z odwróceniem faz C|g (Waters Assoc. /zBondpack Cjg) w temperaturze otoczenia, przy uzyciu jako rozpuszczalników mieszanin 2% wodny kwas octowy: acetonitryl (90:10 objetosciowo) i 2% wodny kwas octowy:acetonitryl (70:30 objetosciowo).A-4696 A Bi B2 B3 Cla c3 El G Wartosc K' 1,60 1,99 3,84 2,50 2,92 4,23 0,38 4,42 Nowy drobnoustrój stosowany w sposobie wedlug wynalazku otrzymano w szeregu mutacji nitrozoguani- dynowych ze szczepu Actinoplanes missouriensis ATCC 23342, który wytwarza kompleks antybiotyku A—1696, ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjedn. Ameryki nr 3 952 095. Nowy drobnoustrój wytwarza czynnik G jako glówny skladnik w ilosci odpowiadajacej okolo 30% aktywnosci calkowitej. Równoczesnie wytwarzane sa inne czynniki antybiotyku A—4696.Dla scharakteryzowania nowy drobnoustrój porównano z hodowla macierzysta 23342. Obydwie hodowle wytwarzaja podobne micele podstawowe lub pierwotne. Nie zaobserwowano miceli powietrznych ani wtórnych.Nie zaobserwowano zarodni. W celu zainicjowania powstawania zarodni wykorzystano trzynascie osrodków po¬ krytych agarem, jak równiez pylek kwatowy Uquidambar, Pinus i Passiflora. Nie zaobserwowano w zadnym przypadku zarodni ani za pomoca mikroskopu optycznego, ani mikroskopu skaningowego.Zarodnie w hodowli ATCC 23342 zostaly zaobserwowane wczesniej przez dr Johna N. Coucha z University of North Carolina. Opisano je jako raczej niewielkie podsfery o wielkosci 4—11 /im, rzadko jako sfery, zazwyczaj o nieregularnym ksztalcie. Tak np. w przekroju scianka ich byla nieregularnie pofalowana.Dorosle zarodniki ulozone byly w jedna lub wiecej niewyraznych spirali w zarodni. W wyniku specznienia substancji miedzyzarodnikowej nastepuje pekanie zarodni, co powoduje, ze powieksza sie ona i przybiera prawie gladki kulisty ksztalt. Zarodniki, o srednicy okolo 1-1,5 jLtm, sa ruchliwe i maja ksztalt podsferyczny do sfery¬ cznego.Hodowla ATCC 23342 posiada scianki komórkowe typu II, zawierajace zarówno kwas mezo-2,6-dwuamino- pimelinowy, jak i kwas hydroksydwuaminopimelinowy [patrz Becker B. i wspólpracownicy „Rapid Differentia- tion between Norcardia and Streptomyces by Paper Chromatography ofWhole Celi Hydrolysates", Appl. Micro- biol. 11:421-423(1964)].Hodowla ATCC 23342 i hodowla ATCC 31681 róznia sie glównie pigmentowaniem miceli pierwotnych, Hodowla ATCC 23342 posiada micele zabarwione na kolor pomaranczowy zmieniajacy sie od umiarkowanie lub brazowo-pomaranczowego do silnie pomaranczowo-zóltego, w zaleznosci od pozywki. Hodowla ATCC 31681 nie ma wyraznego zabarwienia. Zabarwienie miceli najlepiej okreslic mozna jako zóltawo-szare. Hodowla ATCC 31681 nie wytwarza zadnego charakterystycznego rozpuszczalnego pigmentu.Hodowla ATCC 23342 wytwarza czerwonawo-brazowy pigment rozpuszczalny w pozywkach z agaru ISP nr 7 oraz z pasty pomidorowej i owsianki.Melibioza wykorzystywana jest przez ATCC 23342, lecz nie przez ATCC 31681. Zestawienie podobienstw i róznic miedzy ATCC 23342 i ATCC 31681 podano w tablicy 1.Tablica 1 Porównanie charakterystyk ATCC 31681 i ATCC 23342 1 Podobienstwa \ Wrazliwosc na antybiotyki [ Biosynteza czynników A—4696 | Próba katalazowadodatnia Róznice Wykorzystanie wegla Zabarwienie miceli Stopien uplynnienia zelatyny ciag dalszy tablicy na str. 4V 4 131763 ciag dalszy tablicy Podobienstwa Wrazliwosc na antybiotyki Biosynteza czynników A—4696 Próba katalazowa dodatnia Wzrost w osrodku ze skosu agarowego Brak miceli powietrznych Brak wytwarzania barwników Brak zarodni Tolerancja NaCl Redukcja azotanów: ujemna Optymalny wzrost na agarze Bennetta Zakres pH wzrostu Próba fosfatazowa: ujemna Próba z mlekiem odciaganym: ujemna Tolerancja sacharozowa Zakres temperatur Próba ureazowa:dodatnia Róznice Wykorzystanie wegla Zabarwieniemiceli Stopien uplynnienia zelatyny Stopien tworzenia pierscieni wzrostu w mleku Stopien hydrolizy skrobi Wzrost w wybranych osrodkach Charakter wzrostu na agarze ISP nr 7 i z maleinianu wapniowego Pigment rozpuszczalny Wytwarzanie czynników A-4696 ; 1 Postepowano zgodnie z metodami zalecanymi w International Streptomyces Project (ISP) dla charakteryzo¬ wania gatunku Streptomyces i[patrz E.B. Shirling i D. Gottlieg, „Methods of Characterization of Streptomyces Species. Internal. Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3): 313-340 (1966) ], stosujac pewne badania dodatko¬ we.Wykorzystanie wegla oznaczano w podstawowym osrodku ISP nr 9, do którego dodawano sterylizowane filtracyjnie zródla wegla do uzyskania stezenia ostatecznego 1,0%. Plytki inkubowano w temperaturze 30°C i analizowano po 14 dniach.Wytwarzanie pigmentu melanoidowego oznaczano przy uzyciu ISP nr 1 (bulion z tryptonu i ekstraktu drozdzowego). Zadna z hodowli nie rosla po 7 dniach inkubacji na ISP nr 6 (agar z peptonu, ekstraktu drozdzo¬ wego i zelaza) lub ISP nr 7 (agar tyrozynowy).Hydrolize skrobi oznaczano przez badanie obecnosci skrobi za pomoca jodu na ISP nr 4 (agar z soli nieorganicznych i skrobi).Zakres temperatury, tolerancje NaCl i sacharozowa, zakres pH oraz wrazliwosc na antybiotyki oznaczano stosujac plytki ISP nr 2 (agar z ekstraktu drozdzowo-slodowego). Plytki inkubowano w temperaturze 30°C przez 14 dni. Przeprowadzono próby w temperaturze 5, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45, 50 i 55°C. Tolerancje NaCl mierzono przez dodawanie do agaru NaCl do uzyskania stezenia 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15 i 20%. Zakres pH okreslano stosujac nastepujace bufory przy stezeniu 0,05 M: kwas cytrynowy, pH 3,4, 5; kwas 2-/N-morfolino/- etanosulfonowy, pH 6; kwas 3-/N-morfolino/propanosulfonowy, pH 7; N-trój/ hydroksymetylo/metyloglicyna, pH8; kwas 2-/cykloheksyloamino/etanosulfonowy, pH 8,5, 9,0, 9,5; kwas 3-cykloheksyloamino-l, 1-propano- sulfonowy, pH 10, 11. Jako skorygowana wartosc przyjmowano pH agaru po 14 dniach inkubacji, gdyz w przypadku pewnych buforów nie mozna bylo utrzymac nastawionych wartosci pH. Toksycznosc buforów , badano przez doprowadzenie wszystkich buforów do pH 7,0 i oznaczanie wzrostu. Hodowla ATCC 23342 byla wrazliwa na kwas cytrynowy.W badaniach enzymatycznych postepowano zgodnie z metodami Blazevica i Ederera (DJ. Blazevic i G.M.Ederer, „Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology", John Wiley and Sons, New York,N.Y., 1975). Nazwy kolorów ustalano wykorzystujac ISCC—NBC Centroid Color Charts, próbka standardowa nr 2106 [patrz K.L. Kelly i D.B. Judd, The ISOC-NBS Centroid Color Charts Standard Sample No. 2106, U.S. Dept. of Commerce, National Bureau of Standards, Washington, D.C. 20234].Wrazliwosc na antybiotyki okreslano stosujac krazki uczulajace polozone na powierzchni zaszczepionego agaru. Stosowano nastepujace antybiotyki: Cefalotyna (sodowa) 30 /ig, Erytromycyna (estolan) 15 jig, Gentamy- cyna 10 /xg, linkomycyna 2 pig, Nalidbdc acid 30 /ig Penicylina 10 /ig, Polimixina G 300 jednostek, Streptomy¬ cyna 10 ix%, Tetracyklina 30 /ug, Vankomycyna, chlorowodorek 30jug. Zarówno kultura ATCC 23342, jak i ATCC 31681, byly wrazliwe na wszystkie badane antybiotyki.Charakterystyki hodowli ATCC 23342 i ATCC 31681 porównano w tablicy 2.131763 5 Tablica 2 Charakterystyka hodowli 1 7 Agar^ ISP nr 2 ISP nr 3 ISP nr 4 ISP nr 5 ISP nr 7 Bennetta Maleinian wapniowy Czapka G R J Am SP G R 1 Am SP • G R Am 1 sp G R Am SP G R Am SP j G ] R Am SP G R Am 1 SP G R Am 1 SP 1 ATCC 23342 1 dobry 1 53. umiarkowanie-pomaranczowy 1 brak 1 brak 1 slaby 1 76. jasno zóltawo—brazowy 1 brak 1 brak obfity 50. silnie pomaranczowy brak brak umiarkowany 68. silnie pomaranczowy brak brak slaby 54. brazowawo -pomaranczowy brak czerwonawo-brazowy obfity 53. umiarkowanie pomaranczowy brak brak dobry | 50. silnie pomaranczowy (jaskrawy) | brak | brak | dobry | 71. umiarkowany pomaranczowo- -zólty brak | brak | 1 ATCC 31681 1 slaby 1 zoltawo-szary I buk 1 brak 1 slaby 1 93. zóltawo-szary 1 brak 1 brak 1 umiarkowany | 93. zóltawo-szary 1 brak brak ! dobry 93. zóltawo-szary brak brak | brak brak | brak J brak | dobry | 93. zóltawo-szary | brak (powierzchnia wilgotna) ( brak | brak brak | brak ( brak | umiarkowany | 93. zóltawo-szary brak 1 brak |6 131763 Agar~ Asparaginiani TPO Anio- [ Hensens 53H sredni Pepton Czapka G R ! Am SP G R Am SP C R Am SP G R Am 1 SP G R Am 1 SP 1 ATCC 23342 dobry 71. umiarkowany pomaranczowo - zólty brak brak dobry 55. silnie brazowy brak slabo czerwonawo- brazowy slaby 70. slabo pomaranczowo- zólty brak brak umiarkowany 54. brazowawo-pomaranczowy brak brak obfity 54. brazowawo pomaranczowy brak | brak ATCC 31681 umiarkowany 93. zóltawo -szary brak brak ] slaby 1 93. zóltawo -szary | brak | brak | umiarkowany | 93. zóltawo-szary | brak | brak | umiarkowany | 79. slabo zóltawo-brazowy j brak | brak | obfity 1 90. szarawo-zólty | brak | brak | 1/ G = wzrost; R = odwrotna strona lub spód hodowli; Am = micela powietrzna; SP = pigment rozpuszczalny Liczby w tablicy oznaczaja numery kart kolorowych ISCC-NBC Centroid Color Charts 2/ ISP = agary International Streptomyces Project TPO = agar z pasty pomidorowej i owsianki. 53H sredni ma sklad nastepujacy: Ekstrakt drozdzowy 2 g CaC03 3 g Na2S203 . 5H20 0,5 g SokV8 200 ml Agar 20 g Woda dejonizowana 800 ml W tablicach 3 i 4 porównano wykorzystanie wegla (tablica 3) i rózne charakterystyki fizjologiczne (tablica 4).131763 7 Tablica 3 Wykorzystanie wegla 1 Zródlo wegla 1 Kontrolne - brak wegla 1 D-Glikoza 1 L—Arabinoza 1 Celobioza [ D-Fruktoza 1 D-Galaktoza 1 i-Inozyt 1 D-Mannit 1 Melibioza Rafinoza D-Ramnoza D-Ryboza Salicyna Sacharoza D-Ksyloza ATCC 23342 - + + + + + + + + + + - + + + — + + — + + + + + ATCC 31 681 - + + + + »'+) — + — — (+) - (+) + 1 + + + = wykorzystanie dodatnie, równe lub wyzsze, niz wykorzystanie kontrolne glikozy + = wykorzystanie dodatnie, nizsze od kontrolnego glikozy, wyzsze od kontrolnego bez wegla (+) = wzrost watpliwy, wykorzystanie niepewne - = brak wzrostu, wykorzystanie ujemne Tablica4 Dodatkowe charakterystyki fizjologiczne 1 Charakterystyka 1 ISP 1 (wytwarzanie barwników) 1 Katalaza 1 Fosfataza 1 Ureaza 1 Zakres temperatur wzrostu 1 Tolerancja NaCl 1 Tolerancja sacharozowa [ Redotecja azotanów 1 Hydroliza skrobi 1 Zakres pH wzrostu 1 Mleko odciagane: pierscien wzrostu Mleko odciagane: reakcja 1 Uplynnianie zelatyny Pigment rozpuszczalny 1 ATCC 23342 — + + (powoli) + (powoli) 15-37°C 2% • 15% — + (umiarkowanie) 6-7 + — + (40%) + ATCC 31681 — + + (powoli) 1 + (powoli) 15-37°C 2% ] 15% — + (slabo) 6-7 — — + (20%) — 18 131 763 Szczep Actinoplanes missouriensis wytwarzajacy A—4696G, czyli ATCC 31681, otrzymuje sie jako czysta kulture nie zawierajaca innych szczepów przez hodowanie mikroorganizmu na skosach, plytkach agarowych i w sterylnych wodnych pozywkach. Nowy zmutowany szczep uzyteczny jest przy otrzymywaniu antybiotyku A-4696G.Wyzej opisany szczep Actinoplanes missouriensis ATCC 31681 w czasie hodowania wytwarza czynnik G oraz inne substancje antybiotyczne, przy czym czynnik G stanowi okolo 30% calkowitej aktywnosci. Nowy szczep hodowac mozna w róznych pozywkach hodowlanych zawierajacych przyswajalne zródla wegla, azotu i sole nieorganiczne. Do odpowiednich zródel wegla naleza np. weglowodany takie, jak skrobia, glikoza, dekstry¬ na itp. Drobnoustrój moze równiez wykorzystywac jako zródlo wegla gliceryne. Dogodnym i tanim zródlem weglowodanów jest melasa, jednak korzystnym zródlem jest skrobia. Do zródel azotu naleza: aminokwasy, peptony i drozdze. Jako zródlo azotu sluzyc moga równiez oleje pozywkowe, takie jak olej sojowy i olej arachidowy. Korzystnym jednak zródlem azotu sa drozdze.Podobnie jak w przypadku innych drobnoustrojów wytwarzajacych antybiotyki, do pozywki hodowlanej wprowadza sie sole nieorganiczne. Stosowac mozna sole dostarczajace kationów i anionów, takich jak sodowy, potasowy, wapniowy, amonowy, fosforanowy, chlorkowy, siarczanowy itp. Podobnie, mozna dodawac pierwia¬ stki sladowe niezbedne do wzrostu drobnoustrojów, zarówno oddzielnie, jak i w polaczeniu z innymi pozywka- mi. Takie sladowe ilosci niezbednych pierwiastków wystepuja zazwyczaj w wystarczajacych ilosciach jako zanie¬ czyszczenia w innych skladnikach osrodka.Zródla czynników wzrostu, takie jak gorzelniane produkty rozpuszczalne i ekstrakty drozdzowe wprowa¬ dzac mozna do pozywki hodowlanej czynnika G w celu zwiekszenia wytwarzania antybiotyku.Nowy szczep wytwarzajacy czynnik G hodowac mozna w szerokim zakresie pH, jednak maksymalna wydaj¬ nosc uzyskuje sie, gdy pH pozywki hodowlanej wynosi od okolo 6 do okolo 7, a korzystnie od okolo 6,5 do 7.W czasie wzrostu drobnoustrojów pH pozywki zwieksza sie od zakresu korzystnego do wartosci od okolo 7,0 do 7,5.Niewielkie ilosci antybiotyku uzyskuje sie przez fermentacje w wytrzasanych kolbach o wielkosci od okolo 250 do 2000 ml. Przy produkcji czynnika antybiotycznego w wiekszej skali stosuje sie kadzie fermentacyjne o pojemnosci od 94 625 do 189 250 litrów. Produkcje czynnika G w duzej skali prowadzi sie korzystnie w warun¬ kach wglebnej fermentacji aerobowej. Podobnie, jak w przypadku produkcji'innych antybiotyków na duza skale, wielka sterylna kadz fermentacyjna wypelniona osrodkiem hodowli zaszczepia sie odpowiednia iloscia zaczynu, aby osiagnac poczatek wzrostu w rozsadnym czasie po zaszczepieniu. Zaczyn dla wielkich kadzi fermen¬ tacyjnych uzyskuje sie w sposób nastepujacy. Najpierw drobnoustroje wyhodowane na skosie agarowym stosuje sie do zaszczepienia wytrzasanej kolby zawierajacej pozywke hodowlana. W wytrzasanej kolbie odpowiedniej wielkosci prowadzi sie hodowle, po czym w pelni rozwinieta pozywke hodowlana przenosi sie do tzw. pozywki posredniej o wiekszej objetosci, zawartej w duzym zbiorniku posrednim. Gdy wzrost w zbiorniku posrednim osiagnie stan optymalny, zawartosc jego przenosi sie do kadzi fermentacyjnej w duzej skali.A. missouriensis ATCC 31681 hodowac mozna w srodowisku fermentacyjnym w temperaturze od okolo 20 do okolo 40°C. Dla maksymalnej produkcji czynnika G korzystna temperatura wynosi okolo 30°C.W czasie fermentacji nowego szczepu, przez pozywke hodowlana przedmuchuje sie sterylne powietrze, mieszajac zawartosc za pomoca mieszadla. Szybkosc napowietrzania moze wynosic od okolo 0,1 do okolo 1,0 objetosci powietrza na objetosc pozywki hodowlanej na minute. Korzystnie szybkosc napowietrzania wynosi okolo 0,5 objetosci powietrza na objetosc pozywki hodowlanej na minute.Zazwyczaj w warunkach fermentacji opisanych powyzej maksymalna wydajnosc czynnika G uzyskuje sie po okolo 4—6 dniach. Przebieg fermentacji mozna sledzic przez pobieranie w odstepach czasu próbek pozywki hodowlanej w celu oznaczenia aktywnosci antybiotycznej. Jednym z odpowiednich organizmów doswiadczalnych jest Bacillus subtilis. Aktywnosc wobec tego organizmu okresla sie w standardowej próbie mikrobiologicznej na plytce, takiej jak metoda kubka i plytki lub krazka papierowego na plytkach agarowych zaszczepionychorganiz¬ mem doswiadczalnym* Przy wyodrebnianiu czynnika G z bulionu fermentacyjnego stosuje sie korzystnie chromatografie na zywicy bez grup funkcyjnych. Odpowiednia zywica befc grup funkcyjnychjest diaion HP 20 produkowany przez Mitsubishi. Stosowac mozna równiez inne podobne zywice bez grup funkcyjnych, takie jak Amberlite XAD—4131 763 9 (Rohm and Haas Co.) i Duolite SES 861 (Diamond Shamrock). Przykladowo w celu odzyskania i wyodrebnienia czynnika G brzeczke rozciencza sie rozpuszczalnikiem organicznym mieszajacym sie z woda, takim jak aceton, po czym pH calej rozcienczonej brzeczki fermentacyjnej obniza sie do wielkosci w zakresie od okolo 1,5 do 2,0 i zakwaszona brzeczke filtruje sie w celu oddzielenia miceli i innych czesci nierozpuszczalnych. W celu zwieksze¬ nia szybkosci filtracji stosuje sie pomocniczy material filtracyjny, taki jak ziemia okrzemkowa lub inny dostepny w handlu dodatek filtracyjny. Czesci nierozpuszczalne oddzielic mozna równiez przez odwirowanie. pH przefil- trowanej brzeczki podwyzsza sie z kolei do wielkosci w zakresie od okolo 3 do okolo 4 i bulion odparowuje sie w celu usuniecia rozpuszczalnika organicznego. Przefiltrowana brzeczke przepuszcza sie nastepnie przez zywice bez grup funkcyjnych, a antybiotyk eluuje sie mieszanina wody i rozpuszczalnika organicznego, taka jak wodny roztwór metanolu, etanolu lub acetonu. Zazwyczaj rozpuszczalnik organiczny stanowi od okolo 20 do okolo 50% objetosciowych mieszaniny rozpuszczalników. Frakcje eluatu zawierajace antybiotyk zateza sie do malej objetosci, po czym antybiotyk wytraca sie w postaci wolnej zasady przez zakwaszenie koncentratu do pH w zakresie od okolo 6,5 do 7.Alternatywnie, po fermentacji czynnik G wyodrebnic mozna z osrodka fermentacyjnego znanymi metoda¬ mi, takimi jak adsorpcja na odpowiedniej zywicy jonowymiennej, a nastepnie rozdzielanie chromatograficzne. Do odpowiednich zywic naleza slabo usieciowane kationity, takie jak Amberlite IR—116.Jak stwierdzono powyzej, czynnik G A-4694 jest substancja zasadowa zawierajaca dwie zasadowe grupy aminowe. Czynnik G tworzy sole addycyjne z kwasami nieorganicznymi i organicznymi. Sole czynnika G wytwa¬ rza sie znanymi sposobami, np. chlorowodorek wytwarza sie przez zmieszanie wolnej zasady z kwasem solnym w wodnym roztworze metanolu. Dwuchlorowodorek wytracony z roztworu odfiltrowuje sie i susy. Sól siarcza¬ nowa otrzymac mozna przez dodanie kwasu siarkowego do roztworu czynnika G w wodnym roztworze metanolu lub etanolu.Czynnik G i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami, nie wykazujace wlasciwosci toksycznych, hamuja wzrost drobnoustrojów chorobotwórczych dla ludzi i zwierzat. Tak np. minimalne stezenie hamujace, MIC, czynnika G wobec Streptococcus pneumoniae wynosi 0,5 Mg/ml, wobec Streptococcus pyogenes 0,25 /xg/ml, a wobec Staphylococcus aureus 1,0/ig/ml. Minimalne stezenia hamujace oznaczano metoda rozcien¬ czania agaru.Czynnik G wykazuje in vivo aktywnosc wobec tych samych drobnoustrojów. Przykladowo w próbach ochrony myszy zaobserwowano nastepujace wielkosci EDso P° podaniu antybiotyku myszom, którym wstrzyknieto wymienione drobnoustroje chorobotwórcze.Drobnoustrój ED50 (mg/kg x 2, sc.) Streptococcuspneumoniae 0,39 Streptococcuspyogenes 0,57 Staphylococcusaureus 0,78 Czynnik G i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole stosowac mozna do zwalczania zarazen u ludzi i zwie¬ rzat przy podawaniu pozajelitowym w skutecznych dawkach od okolo 1,5 do okolo 100 mg/kg wagi ciala.Sposób podawania moze zmienic sie od jednej dawki na dzien do wielu dawek dziennie. Czas leczenia i wielkosci dawek moga zmieniac sie w zaleznosci od takich czynników, jak konkretny zwalczany drobnoustrój, stopien zarazenia oraz stan ogólny pacjenta.Antybiotyk mozna przygotowac w formie odpowiednich dawek do podawania pozajelitowego, takich jak ampulki, np. do iniekcji, lub mozna go alternatywnie podawac przez wstrzykiwanie dozylne w formie roztworu w odpowiednim plynie fizjologicznym, takimjak roztwór Ringera, 5% dekstroza lub sól fizjologiczna.Czynnik G jest równiez skuteczny w przyspieszaniu wzrostu wagi kurczat przy wprowadzeniu do karmy dla kurczat lub wody pitnej. Czynnik G przy wprowadzeniu do karmy dla kurczat w stezeniu od okolo 2,5 do okolo 100 ppm zwieksza przyrost wagi kurczat przy zwiekszonej efektywnosci karmy w porównaniu z próbami kon¬ trolnymi. Przy podawaniu w wodzie pitnej korzystnie stosuje sie farmaceutycznie dopuszczalna sól czynnika G.Do tego sposobu podawania dogodna forma antybiotyku jest dwuchlorowodorek. Stezenie A—4696G lub jego soli w wodzie pitnej dla ptactwa wynosi od okolo 1,5/zg/ml do okolo 50 Mg/ml, a korzystnie okolo 10-20/xg/ml.Jak opisano powyzej, czynnik G podawac mozna przez wprowadzenie do karmy dla ptactwa, lub alterna¬ tywnie do wody pitnej. Ptactwu mozna podawac karme zawierajaca A—4696G przez caly okres wzrostu do osiagniecia maksymalnego przyrostu wagi.A—4696G mozna wprowadzac do zwyklej karmy stosowanej dla kurczaków. W tym celu wydzielony i zasadniczo czysty czynnik A—4696G mozna stosowac do wymieszania z karma dla ptactwa. Alternatywnie, wysoce oplacalna i dogodna forma czynnika G do zastosowania w tej metodzie uzyskuje sie przez wysuszenie10 131 763 pelnego bulionu fermentacyjnego otrzymujac czynnik G wymieszany z micelami powstalymi w czasie fermenta¬ cji. Wysuszona kompozycje miceli z czynnikiem A 4696G mozna poddawac analizie w celu oznaczenia zawar¬ tosci czynnika G, po czym odpowiednia ilosc kompozycji wprowadzac do karmy dla kurczaków. Kompozycja miceli z czynnikiem G dodaje równiez karmie wartosci odzywczej w formie sacharydów i aminokwasów zawar¬ tych w micelach.Mieszanine A—4696G z micelami mozna równiez otrzymac przez oddzielenie miceli od bulionu i po wy¬ dzieleniu czynnika G z brzeczki sposobem opisanym powyzej, przez zatezenie eluatów z kolumny zawierajacych czynnik G i wymieszanie koncentratu z oddzielonymi micelami przez suszenie.Czynnik G A-4696 i jego farmaceutycznie dopuszczalne nietoksyczne sole sa skutecznymi promotorami wzrostu dla zwierzat przezuwajacych takich, jak bydlo, kozy i owce. Skutecznosc wykorzystania weglowodanów u przezuwaczy wzrasta, gdy flora pierwszego zoladka jest stymulowana do wytwarzania raczej zwiazków propio- nianowych, niz octanowych lub maslowych jako skladników lotnych zoladkowych kwasów tluszczowych (patrz Church i inni, „Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants", Vol. 2, 1971, strony 622 i 625). A^696G w postaci wolnej zasady, a korzystnie jako farmaceutycznie dopuszczalna sól wzmaga powstawanie propionianów w stosunku do octanów i maslanów w plynie pierwszego zoladka. Taknp. w próbach prowadzonych z plynem z pierwszego zoladka w kolbach do ciaglej fermentacji, symulujacych dzialanie pierwszego zoladka przezuwa¬ czy, A—4696G zwieksza wytwarzanie propionianów w stosunku do innych kwasów tluszczowych.Próby przeprowadzono w nastepujacy sposób.Kolbami stosowanymi w próbach byly gazoszczelne kolby wyposazone w otwór wlotowy do cieczy i cial stalych oraz rurki odlotowe gazu polaczone z detkami do zbierania gazów fermentacyjnych. Objetosc badanego plynu w kolbach utrzymywano na poziomie 500 ml za pomoca rurki prowadzacej do zbiornika. Zawartosc kolb mieszano w sposób ciagly w czasie próby za pomoca mieszadla magnetycznego. W czasie próby temperature w kolbach utrzymywano na poziomie od okolo 38 do okolo 40°C.Do kazdej kolby dodano 500 ml przefiltrowanego plynu zoladkowego mlodego byka z przetoka, którego karmiono ta sama pasza, która stosowano w plynie próbnym. Kolby zamknieto i zamocowano detki zbierajace gaz. Do kolb dodawano w sposób ciagly z szybkoscia okolo 1 litra na dzien ciekly bufor (pH 6,8-7,0) o naste¬ pujacym skladzie.Skladnik g/litr Wodorofosforansodowy 2,2 Chlorek magnezowy 0,036 Wodoroweglansodowy 5,9 Chlorekpotasowy 0,34 Chloreksodowy 0,28 Mocznik 1,0 Chlorekwapniowy 0,024 Do kazdej kolby dodawano dwa razy dziennie po 10 g paszy. Po kazdym dodaniu paszy wylot gazu zamykano i kolbe przedmuchiwano dwutlenkiem wegla. Pasza skladala sie w 50% z siana lucerny i w 50% z na¬ stepujacych skladników.Skladnik % wagowy Zgrubnie mielonakukurydza 40,85 Zgrubnie rozdrabniane kaczany kukurydziane 35 Maczka sojowa (50%bialka) 8,1 Maczkalucerny . 4 Melasa 10 Mocznik 0,65 Fosforandwuwapniowy 0,6 Weglanwapniowy 0,3 Chloreksodowy 0,3 Przedmieszka witamin A iE2 0,07 Przedmieszka witaminyE 0,05 Przedmieszka mineralówsladowych 0,04 Byk, z którego pobierano plyn zoladkowy byl równiez karmiony ta sama pasza.Kazdego dnia w czasie próby zbierano odciek i odgaz, poddajac je nastepnie analizie. Fermentacje prowa¬ dzono przez 4 dni przed dodaniem antybiotyku do paszy. Po czterodniowym okresie dochodzenia do stanu równowagi i wzglednym ustaleniu sie skladu odgazów i odcieku, rozpoczeto podawanie paszy zawierajacej A—4696G, po czym fermentacje kontynuowano przez 7 dni stosujac taka modyfikowana pasze.131763 11 Sklad i zawartosc octanów, propionianów i maslanów w odcieku z kazdej kolby ustalano na podstawie chromatografii gazowej. Wyniki uzyskane dla A—4696G podano w tablicy 5.Tablica 5 Wplyw A-4696G na sklad pierwszego zoladka przezuwacza Obróbka kontrolna A-4696G3 Dawka1 g/ml 0 4 Wytwarzanie VFA 2 c2 43,6 39,0 c3 15,2 21,4 c4 5,4 3,3 VFA calkowicie 64,2 63,7 % molowy produkcji C3 23,7 33,6 1/ stezenie w plynie próbnym 2/ podane wielkosci oznaczaja milimole lotnych kwasów tluszczowych (VFA) na dzien 3/ A-4696G w postaci wolnej zasady Antybiotyk A—4696 powoduje zwiekszenie wydajnosci wykorzystania paszy u przezuwaczy z rozwinietym dzialaniem pierwszego zoladka. A-4696G podaje sie doustnie w ilosci co najmniej takiej, aby wytwarzanie propionianów w pierwszym zoladku uleglo zwiekszeniu. Podawana ilosc A-4696G wynosi od okolo 0,1 mg/kg wagi ciala na dzien do okolo 5 mg/kg na dzien. Korzystny zakres dawki wynosi od okolo 0,25 mg/kg na dzien do okolo 3 mg/kg na dzien.Czynnik G A-4696 i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole, np. siarczan, chlorowodorek lub fosforan, podawac mozna w postaci pigulek o przedluzonym dzialaniu, w blokach mineralnych lub bialkowych, jako dodatek paszowy lub w pelnej karmie zwierzecej. W przypadku zwierzat na pastwiskach dogodne jest podawanie pastylek o przedluzonym dzialaniu. Pastylki takie lub pigulki wytwarzac mozna z zastosowaniem polimerów zapewniajacych wydzielanie sie A-4696G w ciagu szeregu tygodni. Wytwarza sie przy tym pigulki o wystarczaja¬ co duzej gestosci, tak aby pozostawaly one w pierwszym zoladku zwierzecia i nie przemieszczaly sie przez przewód trawienny. Wysoka gestosc mozna osiagnac przez dodanie do pigulek czastek metali.Bloki mineralne zawierajace A-4696G sa równiez korzystne do podawania zwierzetom na pastwisku. Bloki mineralne sa od dawna znane w hodowli zwierzat i zawieraja w silnie sprasowanej postaci fizjologicznie niezbedne sole, mineraly i odzywki, takich jak fosforany, weglany, sole wapniowe, pierwiastki sladowe, np. cynk, mangan itp., witaminy, steroidy i inne skladniki. A-4696G wprowadzac mozna do takich bloków w stezeniu od okolo 0,05 do okolo 5%.Korzystne jest podawanie A-4696G przez wprowadzenie go jako dodatku do paszy zwierzecej. Kompozy¬ cje paszowe zawierajace A-4696G i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole sa kompozycjami nowymi.Kompozycje paszowe dla zwierzat wytwarza sie zazwyczaj etapowo. Najpierw zwiazek miesza sie ze sklad¬ nikami obojetnymi uzyskujac przedmieszke paszowa. W tej postaci zwiazek transportuje sie od producenta do lokalnej wytwórni pasz. Przedmieszki moga byc plynne lub stale i moga zawierac od okolo 1 do okolo 90% zwiazku. Skladniki obojetne przedmieszki paszowej nie sa limitowane. Moga nimi byc dowolne powszechnie stosowane fizjologicznie dopuszczalne nosniki. Do nosników cieklych naleza np. glikole takie jak glikole poliety¬ lenowe o róznych ciezarach czasteczkowych oraz glikol propylenowy, oleje takie jak oleje roslinne i rafinowany olej mineralny oraz fizjologicznie dopuszczalne alkohole takie jak etanol. Do stalych nosników przedmieszki naleza np. wermikulit, ziemia okrzemkowa, fizjologicznie dopuszczalne glinki,takiejak stapulgit i montmoiylonit oraz granulowane lub sproszkowane skladniki paszowe, takie jak kruszona kukurydza, maczka sojowa, maczka lucerny, luski ryzowe, kruszone kaczany kukurydziane, kruszona pszenica lub owies oraz wszelkiego rodzaju materialy odpadowe z przeróbki ziarna. Takie skladniki stalych przedmieszek paszowych sa czesto granulowane, pastylkowane lub poddawane innej obróbce, aby zapewnicjednorodnosc przedmieszki paszowej.Ponizej podano przyklady typowych kompozycji przedmieszek paszowych.I.Owies kruszony Glikol propylenowy lignina Dwuchlorowodorek A-4696G 84% 2 3 1112 131763 II.Kukurydzazólta 24% Kruszone kolbykukurydziane 25% Olejmineralny 1 SiarczanA-4696G 30 III.Maczkasojowa 10% FosforanA-4696G 90 IV.Glikolpolietylenowy 90% DwuchlorowodorekA—4696G 9 Esterpolioksyetylenowy 1 V.Wermikulit 33% Olej z nasionbawelny 2 A-4696G 65 VI.Luskiryzowe 22,5% Melasa 2,5 SiarczanA-4696G 75 VII.Olejmineralny 90% Esterpoliglicerynowy 5 A-4696G 5 VIII.Kruszone kaczanykukurydziane 74% Olejsojowy 1 DwuchlorowodorekA-4696G 25 Do korzystnych kompozycji przedmieszek naleza te, które zawieraja okolo 110 g A—4696G lub jego soli na kilogram przedmieszki lub okolo 220 g A—4696G lub jego soli na kilogram przedmieszki.Produktem drugiego etapu wytwarzania paszy dla zwierzat jest dodatek paszowy lub koncentrat. Dodatka¬ mi sa kompozycje zawierajace zwiazek wytwarzany sposobem wedlug wynalazku zmieszany z substancjami po¬ zywkowymi, takimi jak mineraly, sole nieorganiczne, pierwiastki sladowe i witaminy. Dodatki czesto miesza sie przez rozcienczanie przedmieszki paszowej innymi skladnikami. Czesto prowadzi sie to w lokalnych wytwór¬ niach pasz obslugujacych wielkie stada zwierzat domowych. Dodatek mozna wykorzystywac przy wytwarzaniu kompletnych kompozycji mieszanek paszowych zawierajacych A—4696G lub po prostu wysypywac na pasze niemodyfikowane w korytach lub zbiornikach paszowych. Stezenie A—4696G w dodatku paszowym zmienia sie w szerokich granicach w zaleznosci od ilosci dodatku podawanego kazdemu zwierzeciu. Zazwyczaj stezenia te wynosza od okolo 0,02 do okolo 1%, korzystnie od okola0,02 do okolo 0,5%. Przyklady skladu dodatków paszowych zawierajacych zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku sa nastepujace.I.Kruszone kolbykukurydziane 38,5% Maczkasojowa 25,0 Kruszonakukurydza 20,0 Kruszonyowies 10,0 Melasa 2,5131763 13 Sól Przedmieszka witamin Tluszcz zwierzecy Fosforan A-4696G Maczka sojowa Biuret Fosforan dwuwapniowy Trójpolifosforan sodowy Siarka Melasa Sól Przedmieszka mineralów sladowych A-4696G Maczka sojowa Maczka lucerny Mocznik Fosforan dwuwapniowy Wapien kruszony Sól Przedmieszka witamin Siarczan A-4696G Maczka sojowa Fosforan dwuwapniowy Dwuchlorowodorek A-4696G Maczka sojowa Mocznik Fosforan dwuwapniowy Weglan wapniowy Sól Wodoroweglan sodowy Przedmieszka mineralów sladowych i witamin A-4696G II III.IV.V. 0,4 1,1 1,5 1,0 64,29% 10,0 4,2 2,1 0,4 6,0 12,8 0,2 0,01 49,59% 24,8 12,4 2,5 7,4 2,5 0,8 0,01 89,55% 10,0 0,45 10,75% 20,0 16,0 24,0 20,0 2,0 7,2 0,05 Pasze dla przezuwaczy sporzadza sie zazwyczaj i korzystnie na podstawie zbóz, przystosowujac je do potrzeb takich zwierzat. Zazwyczaj suche lub zawiesinowe pasze dlaprzezuwaczy na podstawie ziarna takiegojak pszenica, owies, jeczmien, kukurydza itp. traktuje sie zwiazkami wytwarzanymi sposobem wedlug wynalazku w taki sam sposób, jaki jest od wielu lat powszechnie praktykowany w hodowli zwierzat przy dodawaniu srodków leczni¬ czych do paszy. Pasze takie zazwyczaj skladaja sie z ziarna jako podstawy, uzupelnianego nastepnie witaminami, mineralami, solami, nieorganicznymi i innymi waznymi substancjami odzywczymi, aby zapewnic prawidlowe karmienie przezuwaczy. Pasza powinna zawierac od okolo 5 czesci na milion (ppm) do okolo 500 ppm A—4696G lub jego soli. Korzystne pasze zawieraja go w ilosci od okolo 10 do okolo 250 ppm. Przyklady typowych kompozycji paszowych, w których wykorzystuje sie zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynala¬ zku, sa nastepujace.14 Sieczka lucerny Ziarno sorgowe Maczka sojowa Mieszanina mocznika z ziarnem, 70% bialka Fosforan dwuwapniowy Sladowe sole mineralne Dodatek witaminowy A-4696G Sorgo kruszone Maczka lucerny Luski nasion bawelny Maczka z nasion bawelny Sól Wapien mielony Fosforan A-4696G Pszenica Kaczany kukurydziane Melasa z trzciny cukrowej Maczka sojowa Fosforan dwuwapniowy Wapien Mineraly sladowe A-4696G Rozdrobnione siano tymotki Rozdrobnione siano lucerny Kukurydzakruszona Maczka sojowa oleista Melasa Przedmieszka soli mineralizowanej sladowo i Siarczan A- 4696G 131 763 I.II.III.IV. witamin 54,88% 36,20 4,10 3,60 0,90 0,23 0,09 5 ppm 60,0% 15,0 15,0 8,5 1,0 0,5 250 ppm 44,54% 45,00 3,00 6,40 0,65 0,38 0,03 50 ppm 15% 15 50 10 9 1 100 ppm Czynnik G A-4696 jest równiez uzyteczny jako promotor wzrostu drobiu i trzody chlewnej. W tym celu A-4696G i jego farmaceutycznie dopuszczalne sole podaje sie w paszy dla zwierzat lub w wodzie pitnej. Korzy¬ stnie dwuchlorowodorek A—4696G lub inna sól rozpuszczalna w wodzie podaje sie w wodzie pitnej.Nastepujace przyklady dokladniej ilustruja niniejszy wynalazek.Przyklad I. Przygotowano pozywkowy skos agarowy do zaszczepiania szczepem wytwarzajacym A-4696G, o nastepujacym skladzie.Skladnik Dosc (% wagowe) Cerelosa (glikozatechniczna) 0,5 Dekstrynaziemniaczana 2,0 Maczka sojowaNutrisoy 1,5 Ekstraktdrozdzowy 0,25 Weglanwapniowy 0,1 Agar 2,0 Skos zaszczepiono A-4696G ATCC 31681, a nastepnie inkubowano w temperaturze 30°C w ciagu okolo 6 dni. Po inkubacji mate micelarna na skosie hodowlanym przykryto sterylna woda destylowana i rozpulchniono przez zdrapywanie za pomoca sterylnej paleczki lub petli uzyskujac zawiesine wodna miceli.131763 15 Zawiesine wodna wykorzystano do zaszczepienia 100 ml sterylnej pozywki wegetatywnej o tym samym skladzie, jak skos agarowy opisany powyzej. Zaszczepiona pozywke inkubowano w ciagu okolo 48 godzin w temperaturze okolo 30°C. W czasie inkubacji pozywke wegetatywna mieszano w wytrzasarce rotacyjnej obra¬ cajacej sie z szybkoscia okolo 250 obrotów/minute. Po osiagnieciu wzrostu na pozywce 10 ml hodowli pobrano i zastosowano do zaszczepienia sterylnej pozywki posredniej o nastepujacym skladzie.Skladnik Ilosc (% wagowe) Cerelosa 0,5 Drozdze 0,25 MaczkaNutrisoy 1,5 Skrobiakukurydziana 2,0 Weglanwapniowy 0,1 Srodek przeciwpieniacy (Sag 471)x 0,05 x Sag 471 - silikonowy srodek przeciwpieniacy dostepny z Union Carbide.Pozywke posrednia zaszczepiono na okolo 24 godziny w temperaturze okolo 30°C mieszajac ja na wytrzasarce rotacyjnej pracujacej z szybkoscia 250 obrotów/minute. Dojrzala pozywke wegetatywna zastosowa¬ no nastepnie do zaszczepienia sterylnej pozywki do wytwarzania A -4696G o nastepujacym skladzie.Skladnik Dosc (% wagowe) Cerelosa 2,5 Drozdze 2,0 Weglanwapniowy 0,2 Siarczanamonowy 0,025 Kwasny fosforandwupotasowy 0,05 Gliceryna 1,5 Melasa 1,5 Skrobiakukurydziana 3,5 Srodek przeciwpieniacy (Sag471) 0,03 Fermentacje prowadzono w ciagu 143 godzin w temperaturze okolo 30°C, mieszajac i napowietrzajac sterylnym powietrzem z szybkoscia okolo 1/2 objetosci powietrza na objetosc pozywki hodowlanej na minute.W czasie fermentacji pH osrodka wzroslo z wielkosci poczatkowej okolo 6,5 do wielkosci okolo 8,0.Porcje (30 litrów) pelnej brzeczki fermentacyjnej rozcienczono 30 litrami acetonu i pH doprowadzono do 1,8 za pomoca 6N kwasu solnego. Zakwaszona pelna brzeczke przefiltrowano stosujac pomocniczy material filtracyjny, po czym czesci nierozpuszczalne przemyto na filtrze woda, pH przesaczu doprowadzono do 3,5 za pomoca 150 ml 50% wodorotlenku sodowego, po czym przesacz zatezono pod obnizonym cisnieniem do obje¬ tosci 29 litrów. pH ponownie podwyzszono z 2,2 do 3,1 za pomoca wodorotlenku sodowego i przefiltrowano w celu usuniecia czesci nierozpuszczalnych. Przesacz zawierajacy antybiotyk przepuszczono przez kolumne o srednicy 7,62 cm zawierajaca 5 litrów zywicy bez grup funkcyjnych Mitsubishi Dianion HP-20 (zywica styre- nowo-dwuwinylobenzenowa), wstepnie potraktowanej alkoholem metylowym i przemytej woda. Szybkosc prze¬ plywu wynosila 250 ml/minute. Po zaadsorbowaniu antybiotyku na zywicy kolumne przemyto 5 litrami wody i eluowano kolejno 21 litrami 20% wodnego roztworu alkoholu metylowego, 15 litrami 50% wodnego roztworu alkoholu metylowego i 15 litrami wodnego roztworu acetonu. Przy przemywaniu i eluowaniu zbierano frakcje po 4 litry. Frakcje 8, 9 i 10 zawieraly wiekszosc substancji antybiotycznie aktywnej i równoczesnie byly wolne od wiekszosci zanieczyszczen. Frakcje 8, 9 i 10 polaczono i zatezono do objetosci 6 litrów pod obnizonym cisnie¬ niem. Po doprowadzeniu pH koncentratu do 6,8 za pomoca wodorotlenku sodowego w wodzie wylano go do 60 litrów alkoholu izopropylowego. Wytracony z mieszaniny A—4696G odfiltrowano i wysuszono. Otrzymano w ten sposób 54,2 g A—4696G w zasadniczo czystej postaci.Przyklad II. Wytwarzanie dwuchlorowodorku A—4696G. A—4696G w postaci wolnej zasady roz¬ puszczono w wodnym roztworze metanolu i roztwór ten rozcienczono IN kwasem solnym. Po wymieszaniu zakwaszony roztwór mozna rozcienczyc acetonem w celu wytracenia dwuchlorowodorku A—4696G.Przyklad III. Alternatywna metoda wytwarzania A—4696G. Bulion fermentacyjny otrzymany spo¬ sobem wedlug przykladu przesaczono po dodaniu 5% (wagowo/objetosciowych) pomocniczego materialu filtra¬ cyjnego (Celite 545). Placek filtracyjny ponownie zdyspergowanp w równej objetosci dejonizowanej wody, po czym pH zawiesiny wodnej doprowadzono do 10,5 za pomoca wodorotlenku sodowego w wodzie. Zdyspergowa- ne czesci stale oddzielono przez filtracje i przemyto woda. Przesacz i wode z przemycia polaczono i uzyskany roztwór zakwaszono 20% (wagowo/objetosciowego) wodnym roztworem kwasu siarkowego do pH4,5. Kwasny roztwór wyklarowano przez filtracje stosujac 1% pomocniczego materialu filtracyjnego (Celite 545). Klarowny16 131 763 roztwór przepuszczono przez kolumne zawierajaca Amberlite IR-116 (w formie Na+), po czym kolumne przemyto woda dejonizowana. Zywice IR-116 usunieto z kolumny ieluowano periodycznie przy pH 10,5 wodnym roztworem wodorotlenku sodowego. Eluat z zywicy zobojetniono (pH 7) 20% (wagowo/objetoscio¬ wym) wodnym roztworem kwasu siarkowego, a nastepnie przemyto trzykrotnie dejonizowana woda. Przemywki wodne zobojetniono i polaczono z zobojetnionym eluatem. Uzyskany roztwór zatezono, a nastepnie suszono sublimacyjnie.Tak uzyskany surowy kompleks dodano powoli do dejonizowanej wody, intensywnie mieszajac. Uzyskana zawiesine mieszano w ciagu 20 minut, a nastepnie zobojetniono (pH 7) za pomoca 10% roztworu wodnego wodorotlenku amonowego. Nierozpuszczalny A—4696G oddzielono przez filtracje prózniowa, przemyto woda dejonizowana i wysuszono sublimacyjnie.Wysuszony odsolony A- 4696G zdyspergowano w wodzie dejonizowanej i pH zawiesiny doprowadzono do 2,7 przez, dodanie 3N kwasu solnego. Zakwaszony roztwór wirowano w ciagu 40 minut z szybkoscia 2500 obrotów/minute. Roztwór znad osadu zdekantowano i wprowadzono do kolumny zawierajacej zywice odbarwia¬ jaca (Duolite S761). Skladniki aktywne eluowano woda dejonizowana z szybkoscia 30 ml/minute. Eluowanie sledzono za pomoca chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Odciek zawierajacy antybiotyk A-4696G zatezo¬ no (3 mm, 35°C) i suszono sublimacyjnie.Takotrzymany suchy odbarwiony antybiotyk A-4696G rozpuszczono w wodzie dejonizowanej. Uzyskany roztwór wodny przefiltrowano i wprowadzono do kolumny chromatograficznej zawierajacej poliamid (Machery and Nagel SC6). Kolumne eluowano woda dejonizowana. Eluowanie sledzono na podstawie pomiarów aktyw¬ nosci w nadfiolecie i za pomoca TLC. Frakcje polaczono na podstawie identycznych oznaczen TLC i suszono sublimacyjnie. Dodatkowe oczyszczenie uzyskano przez powtórna chromatografie.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania antybiotyku A-4696G oraz jego farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami, znamienny tym, ze prowadzi sie hodowle organizmu Actinoplanes missouriensis ATCC 31681 w wodnej pozywce hodowlanej zawierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu i sole nieorganiczne w wa¬ runkach wglebnej fermentacji aerobowej az do uzyskania produktu o znacznej aktywnosci antybiotycznej i po¬ wstaly zwiazek ewentualnie przeprowadza sie w sól. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania dwuchlorowodorku A-4696G powstaly na drodze mikrobiologicznej zwiazek poddaje sie reakcji z kwasem solnym. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania siarczanu A-4696G powstaly na drodze mikrobiologicznej zwiazek poddaje sie reakcji z kwasem siarkowym. i131 763 o4 -o131 763 Przepuszczalnosc \ o/ ^ o C/k cv ^ Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad' 100 egz.Cena 100zl PL PL PL