CS227683B2 - Production method of antibioticum a 4696 factor g - Google Patents

Production method of antibioticum a 4696 factor g Download PDF

Info

Publication number
CS227683B2
CS227683B2 CS819461A CS946181A CS227683B2 CS 227683 B2 CS227683 B2 CS 227683B2 CS 819461 A CS819461 A CS 819461A CS 946181 A CS946181 A CS 946181A CS 227683 B2 CS227683 B2 CS 227683B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
weak
antibiotic
factor
hump
atcc
Prior art date
Application number
CS819461A
Other languages
English (en)
Inventor
Charles L Hershberger
Kurt E Merkel
Robert E Weeks
Gene M Wild
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Priority to CS824512A priority Critical patent/CS227691B2/cs
Publication of CS227683B2 publication Critical patent/CS227683B2/cs

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K9/00Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/006Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
    • C07K9/008Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/06Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using actinomycetales
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/045Actinoplanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Feed For Specific Animals (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Vynález se týká nové látky ze skupiny komplexu antibiotika A-4696. Tato látka byla označena jako faktor G a bylo prokázáno, že je účinná proti gram-pozitivním bakteriím a také jako látka, urychlující růst·
Antibiotikum A-4696G je glykopeptid, který je možno získat pěstováním kmene Aetinoplanes missouriensis, například ATCC 31681 ve vodném živném prostředí v submerzní kultuře za aerobních podmínek.
Po skončené fennentaci se antibiotikum izoluje ze surového fermentačního prostředí adsorpcí na pryskyřice a Čistí se chromátografií·
Antibiotikum A-4696G je záaaditá látka, která tvoří s kyselinami adiční soli, jejichž výroba rovněž spádá do oboru vynálezu· Adiční soli antibiotika A-4696G s kyselinami, přijatelné z farmaceutického hlediska jsou zvláště výhodnými sloučeninami· Pod pojmem sloučenina A-4696G” rozumí antibiotikum A-4696 faktor G nebo některá sůl, přijatelná z farmaceutického hlediska·
Je známo, že řada mikroorganismů, produkujících antibiotika produkuje více něž jednu látku 8 antibiotickým účinkem v průběhu fermentace· Některé mikroorganismy produkují celé komplexy antibiotických látek, jejichž struktura jo padobná nebe které se svou strukturou liší· Jedním z těchto mikroogranismŮ jo Actinoplaneo sp. ATCC 23342, který produkuje antibiotikum A-4696, jak bylo popsáno v US patentu č· 3 952 095. Postupně byly objeveny .v komplexu antibiotika A-4696 faktory A a B, které jsou popsány v US patentu Č. 4 115 522.
227683 2
Oděloiní jednotlivých antibietických látek a kenplexu, který obsahuje celou řadu faktorů je často velni obtížná, zvláště v těch. případech, kdy je požadován jen jeden faktor. Je nežne postupovat tak, že se vybírá nojvhetaněší tasen nebo .se vyvolávej mutace mikroorganimu v nOdji, ža nový kmen bude vyrábět požadovaný ' faktor nebo alespoň větší . možství požadovaného faktoru, často docMzí k tomu, že je . získán nový kmen, který produkuje nové antibioiium jako taková nebo ve směsi a látkami, produkovanými dříve známým kmenem.
Vyéá.ez se týká způsobu výroby nového faktoru antibiotika A-4696. Tento faktor se získá pěstováním nového kmene Actinoplanes вis80ouien8a8, který produkuje komppox antibiotika A-4696 - a individuiQní faktory A a B.
Vynález vznikl . z koamlevích snah při - výběru kmeeiů, jejich mutací s následnou celou řadou izolací, které byly zamÍěřenr.na pr&zkJU'-.íantЪlotika A-4696. f i (hrb]), 1 659 (intenzívní), 1 616 (slabé), 1 590 ' (slabé), 1 504 (intenzívní), 427 (středně silné), 1 289 (slabé),- 1 226 (dublet), 1 214 -(duuiet), 1 179 > (slabé), 1 060 (intenzívní,- 1 028 slabé, 1 015 (hrb]), 986 (slabé), 899
681 (velmi slabé), 815 (slabé), 801 (hrb]), . 769 (hrD, 751 (hrb) a 711 s . absorpčním maximem v ultrefiaoovém světle ve vodě při 279 nm Předmotem vynálezu . je způsob výroby antibiotika A-46960, které je geyi:opeptideí se dvěma aminoskupinami zásadité povahy, ve formě dihycfroclhLoridu jde . o bílou krystalickou sloučeninu, v-postatě . rozpustnou . ve vodě . a . nerozpustnou v organických rozpouštědlech jako . metaři alkoholu, acetonu, . chloroformu . a benzenu, . a přibližiým procentuálním prvkovým složením 52,90 .% uuíku, 4,29 % . vodíku, . 6,39 . % dusíku, 30,96 % kyslíku a 5,46 % chloru, s absorpčním. maximem. v Uetrаfiа0ovém světle v bromidu draselném při 3 384 (Široké), 2 924 (slabé), 1 . 730 1 488 (hrb]), 1 (slabé), 1 119 (velmi slabé), (slabé) cm , s . absorpčním maximem v ultiifiаlvvéí světle ve vodě při 279 nm . /«1% -53) v 1cnT s volnou formou,. kterou je . možno titrovat kontinuálně v rozmezí pH 3,5 až 13,5 při elektromottřické titraci v 6(56 vodném dimethylf při hyfrolýze po dobu 70 minut v 5% vodném roztoku kyseliny chlorovodíkové při vzorce varu pod zpětrým chladičem se vytváží - pseudoaglykon
jakož i . z farmaceutického hlediska přijatelných solí tohoto antibiotika, vyznač jící se t:m, . že se pěstuje mikroorganism» A^inoplanes пХавОшЧопа!^ ATCC 31681 ve vodném živném prostředí . s obsahem. využitelných zdrojů uhLíku, dusíku. a a^<^:rgmnických solí v submerszní kultuře za aerobních podmínek. při pH 6,0 až 7,5 a teplotě 20 . až 40 °C do . nahromadění . altiliotiia.
Sloučenina A-4696G nebo . její ediční soli s kyselinami, přijatelné z farmaceutického hlediska se připravuj tak, že se pěstuje mikroorganismus Atinoplanes m.ssoxuionsis ATCC 31681 ve vodném živném prostředí s obsahem využitelných zdrojů ulhLíku, dusíku a anorganíckých solí v submeerzní kultuře za aerobních podmínek do nahromadění antibiotika.
AitibiotiUm A-4696G nebo jeho adiční soli s kyselinami, přijatelné z farmaceutického hlediska zvyšují vyžití krmivá u přežvýkavců při perorálním podťání. Sloučeninu je možné podávat přežvýkavcům v krmivu nebo v doplňkovém krmivu, které obsahuje příslušné mwožtví antibiotika A-4696G nebo jeho adiční soli s kyselinami.
Anibiotikm A-4696G nebo jeho sůl s kyselinou, přijatelné z farmaceutického hlédiska může být rovněž použita ke zrychlení růstu u ktfat. V tomto případě se příslušné mnžitví této látky podává kuřatům v krmivu. nebo v pitné vodě.
Ainibiotikmi A-4696G ve formě dihydrochloridu je bílá krystalická látka. Při elementární analýze dihydroechLoridu bylo prokázáno následující přibližné procentuální složení: uhlík 52,90 %, vodík 4,29 %, dusík 6,39 %, kyslík 30,96 % (vypočítáno jako rozdíl), chlor 5,46 %. A^t^ibi^otkkim A-4696G má přibližnou molekulovou hmoonost 1 700.
Absorpční spektrum v infračervnném světle pro dihydroclhLorid antibiotika A-4696G v bromidu draselném je znázorněno na přiloženém výkresu. Abborpční maxima je možno pozorovat, při následujících íYekvenc^h v cm”^3 384 (široké . , 2 924 (slabé), 1 730 <tarb), 1 659 (intenzívní), 1 616 (slabé), 1 590 (slabé), 1 504 (intenzív^), 1 488 (ta-b), 1 427 (středně silné), 1 289 (slabé), 1 226 (dublet), 1 214 (dublet), 1 179 (slabé), 1 119 (slabé), . 1 060 (intenzívní), 1 028 (slabé), 1 015 (hrb), 986 (slabé), 899 (velmi slabé), 881 (velmi slabé), 815 (slabé), 801 (hrb), 769 (hrb), 751 (hrb) a 711 (slabé).
Při elektronetrické iitraci antibiotika A-4696G v 66% vodném dimetylhy!fornamidu při počátečním pH 7,89 se titruje stoupající množtví v rozmezí pH 3,5 až 13,5.
Absorpční spektrum dihydrochloridu antibiotika A-4696G v ultrffáaovvém světle ve vodě má absorpční maximum při 279 nm -k-n '1cm
Dihyroohlorid antibiotika A-4696G je rozpustný ve vodě, avšak nerozpustný v rozpouštědlech jako methanolu, acetonu, diethyletheru, chloroformu, benzenu a podobně.
Kromě volné látky a hydroechLoridů je možno tvořit i další adiční soli antiobiotika A-4696G s kyselinami, jejichž výroba rovněž tvoří součást vynálezu. Vhodnými solemi antibiotika A-4696G jsou soli, které je· možno získat standardními reakcemi s organickými i anorganickými kyselinami, jako jsou kyselina sírová, chlorovodíková, fosforečná, octová jantarová, citrónová, mléčná, . maaeinová, fumerová, palmitová, žlučová, pamoová-, muuinová, D-glutamová, d-kafrová, glutarová, glykolová, ftalová, vinná, mavenní, laurová, stearová, salicylová, methírnsulfonová, benzensulfonová, sorbinová, pikrová, benzoová, skořicová a podobně.
Zvváštní výhodnou skupinu solí tvoří adiční soli, přijatelné z farmaceutického hlediska. Pod tímto pojemem se rozumí soli, které nejsou nežádoucím způsobem toxické pro teplokrevné živočichy.
Annibiotilum A-4696G sfejně jako celý komplex tohoto antibiotika e jeho jednotlivé faktory podléhá hydrolýze v případě, že se zahřívá 79 minut na teplotu varu pod zpětným chladičem v 5% kyselině chlorovodíkové, takže vzniká pseudoaglykon, který je možno znázornit následujícím strukturním vzorcem:
Svrchu uvedený pseudoaglykon se při hydrolýze z reakční směsi vysnáií.
Jak je zřejmé ze svrchu uvedeného vzorce, obsahuje pseudoaglykon šest fenolových hydroxyskupin a volnou aminoskupinu kromě aminoskupiny na eminociuoru, kterým je ristosamin. Stejně jako v případě dalších faktorů tohoto antibiotika obsahuje faktor 0 neutrální cukry, vázané na pseudoaglykonové jádro přes jednu nebo větší počet fenolových skupin. Právě tyto cukry je možno odstranit hydrolýzou faktoru G v kyselém prostředí. Z neutrálních cukrů, které' byly identifioovátay v hyúrolyzátoru komplexu celého antibiotika je možno uvést meamózu, glukózu a rhamnózu.
Faktor G se od ostatních faktorů zřejmě liší typem a počtem neutrálních cukrů, vázaných na jádro a také místem·, v němž jsou tyto cukry vázány. V průběhu hydrolýzy se faktor G chová podobně jako faktory Bj a Ca*
Faktor G je možno oddlšit od známého faktoru A a od faktorů, popsaných v US patentové přihlášce č. 217 962 svým chováním při vysokotlaké kapalinové chrornaatorrfii. Dále jsou uvedeny retenční hodnoty K' pro některé faktory antibiotika A-4696 při použžtí vysokotlaké kapalinové chromatoorafie v reverzní fázi ·C^g (Waaers Assoc. /iBondapak C^q) při teplotě místnooti a při použžtí 2$ vodného roztoky kyseliny octové a aceeooiirilu v objemovém poměru 90:10 a 2 % vodného roztoku kyseliny octové a acetoonirilu v objemovém poměru 70:30 jsko·rozpouštědla.
A-4696 faktor K'
A 1,60
B1 1,99
B2 3,84
*3 2,50
C1a 2,92
C3 4,23
E1 0,38
G . 4,42
Mitaroorganimus
Nový mikroorganismu, při jehož pěstování se získává svrchu uvedené antibiotikum byl získán mutacemi pomocí nitrosoguanidtau z kmene Actinoplaneš missotkiensis ATCC 233-42, to znamená z kmene, který produkuje komplex antibiotika A-4696, popsaný v US patentu Č. 3 952 095. Nový mikroorganismus produkuje faktor G jako' hlavní faktor v možství přibližně 30 % celkové produkce antibiotika. Současně jsou produkovány diOLSí faktory antibiotika A-4696.
Nový mikroorganismus byl při stanovení svých vlastností srovnáván s původním kmenem ATCC 23342. Obě kultury produkci podobné substráty a primární m^celia. Sekundární mrceliím nebo míliům na vzduchu se netvoří. Nebylo možno pozorovat sporangia. Bylo užito třináct druhů živných prostředí, jejichž podkladem jsou agarové plotny a mimoto i pyl rostlin Liquidambba', Pinus a Passiflora ke sledování případné tvorby sponanU· V žádném případě nebylo možno světeliýfr mikroskopem ani llek0ronkov2fa mikroskopem tvorbu sporangí pozorovat .
D4ve byla pozorována sporangia v kultuře ATCC 23342. Sporan^a popsal Dr. John N. Coudi, z UnOvvezity of North CaroHna. šlo o malé útvary o velikosti 4 až 11 /m, přibližně kulovvté, zřídka přesně kuloví.té, obvykle s nepravidelnou stěnou, to znamená, že stěna byla na řezu nepravidelně zvlněna.
Zralé spory byly uspořádány ve sporangiu ve formě jedné nebo většího počtu nezřetelných spirál. Sporaingia jsou schopna bobtnání zejména v maaeeiálu ' mezi sporami, přičemž· se sporamgiím zvětší a nabyde téměř hladkého kulovitého tvaru. Přitom se uvolní spory, které jsou poltybbivé, velikosti 1 až 1,5 >m v průměru a maaí přibližně·kulovitý tvar.
&u.tura ATCC 23342 má buněčnou stěnu typu II, ve stěně je možno prokázat kyselinu meso-2,6-rimtnopimelovou i kyselinu hydroxydtamtmrptmelovou OBeeker B a další, DifflrllOtatiro between Noorsardia and Streptomyces by Páper Chromá tography of Wole CeH Hydrooysaaes”, Appl. Mic(^l^b(^l. 11421 až 423 (1964)3 .
Kuutura ATCC 23342 se od katrny ATCC 31681 liší hlavně pigmeertací primárního mycHa. Kuktkoa ATCC 23342 má щгееИгш oranžově zbarvené, a to mírně až Onёdroranžově do sytě oranžového až ŽlutoortnlžovéOo zbarvení v závislosti na živném proosředí. Kuutura ATCC 31681 nemá žádné vyjádřené zbarvení. M^eUum je obvykle žlutavě šedé. Tato kultura také neprodukuje žádný eOíarakieriaticiý rozpustný pigment. .
Ku.tura ATCC 23342 produkuje Červenavě hnědý rozpustný pigment na prostředí ISP 7· a na agaru s prot^kem z rajčat a ovesnou moučkou (TPO).
MeHbióza se využívá kulturou ATCC 23342, avšak nikoli kulturou ATCC 31681. V následující tabulce 1 jsou shrnuty shodné vlastnosti a rozdíly mezi kulturami ATCC 23342 a ATCC 31681.
Tabulka 1
Srovnávání vlastností kultur ATCC 31681 a ATCC 23342
Shodné vlastnosti Rozdíly
Citlivost na antibiotika
Biosyntéza faktorů antibiotika A-4696
Pooitivní reakce na katalázu
Růst na ěilmém agaru
Myeiuim na vzduchu se netvoří
Kultura není chromogenní
Sporaingia se nevysl^ují
Tolerance NaCl
Neggaivní redukce nitrátů
Optimální růst na Beimetově agaru
Rozmmzí pH pro růst
Pooitivní reakce na fosfatázu
Neeaaivní reakce s odstředěrým mlékem
Tolerance sacharózy
Teplotní rozmezí
Pooztivní reakce na ureázu
Vvdžtí UhLíku
Barva myccHa
Stupeň zkapalnění želatiny
Tvorba růstového prstence na m.éce
Stupeň hydrolýzy Škrobu
Růst na zvoleném vegetativním prostředí
Růstové vlastnosti na prostředí
USP 7 a na agaru s moleátem vápenatým
Rozpustný pigment
Tvorba faktoru antibiotika ' A-4696
Metody
Při stanovení vlastností kultur bylo užito metod, doporučených InternationaL Streptomyces Projet (ISP) pro sledování vlastností Streptomyces species Ce. B. Shirling, a D. Got^lleg, Methods of CCharcteelzation of Streptomyces Speeies. Internát. Journal of Systemmíic Bacteriologc, 16 (3):313 až 340 (1966)), byla rovněž provedena řada doplňkových zkoušek.
VydHtí UhLíku bylo stanoveno na základním prostředí ISP 9, k němuž byly přidány zdroje uhlíku, předem sterlizoované filtrací do stejné výsledné koncentrace 1,0 %. Plotny byly inkubovány při teplotě 30 °C a výsledky byly odečítány po 14 dnech.
Produkce mθeanэidníth pigmentů (chromooβgiitta) byla.stanovena v prostředí ISP 1 (živné prostředí s trypoonem a extraktem z kvasnic). KU-tura narostla po 7 dnech inkubace na prostředí ISP 6 (agar s peptonem, extraktem z kvasnic a železa) nebo ISP 7 (agar s tyrosinem). .
Hýdrolýza škrobu byla ·tánovana teaten na přítomnost škrobu pomocí Jodu na ISP prostředí δ. 4 (agar a anorganickými solemi e Škrobem)·
Teplotní roznezí, tolerance chloridu sodného a sacharózy, oblast pH a citlivost na antibiotika byly stanoveny při použití ploten prostředí ISP 2 (agar s extraktem ž kvasnic a sladovým extraktem)· Plotny byly inkubovány 14 dnů Dři teDlátě 30 °C. Růst byl zkoumán při teplotách 5, «0, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45, 50 a 55 °C.
Э·
Tolerance chloridu sodného byla měřena přidáním chloridu sodného к agaru v následující (^množstvích: 0, 2, 4, 6, 8, 10 a 12%· Tolerance eacharózy byla měřena přidáním sacharózy v následujících množstvích: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15 a 20 %. Rozmezí pH bylo stanoveno při použití následujících pufrů v koncentraci 0,05 M. Kyselina citrónová o pH 3, 4 a 5, kyselina 2-(N-morfolino)ethansulfonová o pH 6, kyselina 3-(N-morfolino)propansulfonová o pH 7, N-tris(hydroxymethyl)methylglycin o pH 8 a kyselina 2-(cyklohexylamino)ethansulfonová o pH 8,5, 9,0 a 9,5, kyselina 3-cyklohexylamino-1,1-propansulfonová o pH 10 a 11· Za správnou hodnotu bylo považováno pH na agaru po 14 dnech inkubace, protože některé pufry neudržely upravené pH. Byla také zkoumána toxicita pufrů její přípravou na pH 7,0 s následným sledováním růstu· Kultura ATCC 23342 byla citlivá na kyselinu citrónovou.
Při sledování vlivu enzymů bylo užívÓno metod Blazevice a Ederera [р· J. Blazevic a G. M. Ederer, Prineiples of Biochemicel Tests in Diagnostic Microbiology,,‘ John Wiley and Sons, New York, N.Y. 1975] · Jména barev byly volena podle ISCC-NBS Centrold Color Charta, standardní vzorek č. 2106 QC· L. Kelly a D. B. Judd, The ISCC-NBS Centroiď Color Standard Semple č. 2106, U.S. Dept. of Commerce, National Bureau of Standarde, Washington,
D. C. 20234] .
Citlivost na antibiotika byla stanovena při použití kotoučů, uložených na povrch naočkovaných agarových ploten. Byla užita následující antibiotika: Cefalotin ve formě sodné soli 30 yug, erythromycin (estolát) 15/ig, gentamycin 10 jug, linkomycin 2/ig, kyselina nalidixinová 30jug, penicilín 10 jug, polymixin G 300 jednotek, streptomycin 10<wg, tetracyklin 30 pgt vankomycin HC1 30 jug· Kultury ATCC 23342 a ATCC 31681 byly citlivé na všechna zkoumaná antibiotika.
Vlastnosti kultur kmene ATCC 23342 a ATCC 31681 jsou srovnány v následující tabulce 2.
Tabulka 2
Vlastnosti kultur1
Agar
ATCC 23342
ATCC 31681
ISP 2
G dobrý špatné
R 53. mírně oranžové
93« žlutošedá
Am žádné
AP žádný žádné žádný
I
Pokračování tabulky 2
2 Agar ATCC 23342 ATCC 31681
ISP 3 G Spatný Spatný
R 76. světle žlutohnědá 93. žlutošedá
Am Žádné žádné
SP žádný & Žádný
ISP 4 G bohatý průměrný
R 50. ailně oranžová 93. žlutošedá
Am žádné žádné
SP žádný Žádný
ISP 5 G průměrný dobrý
R 68. silně oranžová 93· žlutošedá
Am žádné žádné
SP žádný žádný
ISP 7 G Spatný žádný
R 54. hnědooranžová žádná
Am žádné Žádné
SP červenohnědý žádný
Bennetův agar G bohatý dobrý
R 53· mírně oranžová 93. žlutošedá (hladký povrch)
Am žádné žádné
SP žádný žádný
Agar s malátem
vápenatým G dobrý žádný
R 50. silně oranžová (lesklá) žádná
Am žádné žádné
SP žádný žádný
Czapkův agar G dobrý průměrný
R 71· mírně oranžovožlutá 93· žlutošesá
Am žádné žádné
SP žádný žádný
Pokračování tabulky 2
2 Agar ATCC 23342 ATCC 31681
S glukózou a
asparaginem G dobrý průměrný
R 71. mírně oranžovo žlutý 93. žlutošedý
Am žádné žádná
SP žádný žádný
TPO G dobrý špatný
R 55. silně hnědá 93· žlutošedá
Am žádné žádné
SP stopy červenohnědého pigmentu žádný
Aiio-Hensens G špatný průměrný
R 70. světle oranžově žlutá 93. žlutošedý
Am žádné žádná
SP žádný žádný
Prostředí 53H G průměrný průměrný -
R 54. hnědooranžová 79.1 .gy. žlutohnědá
Am žádné žádné
SP žádný žádná
Czapkův pepton G bohatý bohrnaý'
R 54. hnědooranžová 90. šedavé žlutá
Am žádné žádné ·
se žádný žádný
1/ G = růst, R = sadní nebo spodní strana kolonie, . Am = вдгсеНит na vzduchu, SP - rozpustný pigment
Čísla v tabulce jsou čísla barevných karet v soustavě ISCC-NBS Centroid Color Charta.
2/ ISP = agary International ' Streptomyces ftroject
TPO = agar s protlakem z rajčat a ovesnou moUkou
Prostředí 53H má následující složení:
extrakt z kvasnic 2 β
CaCO3 3 8
Na2S2Or5H2O 0,5 g
šťáva Vg 200 ml
agar 20 g
deionizovaná voda 800 ml
V následujících tabulkách 3 a 4 je v tabulce 3 uvedeno vyjití uhlíkových zdrojů a v tabulce 4 další fyziologické vlastnosti.
Tabulka _ 3 Vyujití uhlíkových zdrojů
Zdroj uhlíku ATCC 23342 ATCC 31681
kontrola bez uhLíku - -
D-glukóza ’ +
L-arabinóza +4· +
cellobióza 4-4· 4· .
D-fruktóza ++ 4-
D-galaktóza ( + )
i-inositol * ’ - -
D-mmanniol ++
meeibióza + -
raffinóza - -
D-rhamnoza 4-4· (+)
D-ribóza - -
salicin + ’ (t)
sacharóza . 4·
D-xUlóza ++ 4- .
++ =4 stejné nebo Větší nei kontrola s glukózou, pooitivní'vyižití + = mmnní než kontrola' s glukózou, avšak větší než kontrola bez uhlíkového zdroje, pozitivní vybití ( + ) = růst pochybý, vybití pochybné
- a iádný ' růst, negativní vybití
Tabulka 4
Daa.ší fyziologické vlastnosti
ATCC 23342 ATCC 31681
ISP 1 (chromooeenccta) - -
kataláza _ + +
fosfáza + (pomalu) + (pomalu)
rreáza + (pomalu) + (pomstu)
Teplotní rozmezí pro stů 15 až 37 °C 15 až 37 °C
tolerance NaCl < '2 % < 2 %
tolerance sacharózy 15 % 15 %
redukce nitrátu - -
hydrolý.za škrobu + (průměrné) + (slabě)
rozmezí pH pro růst 6 až 7 6 až 7
růstový prstenec na odstředěném m.éce + -
reakce s odstředěným mlékem - -
zkapalnění želatiny + (40 %) + (20 %)
rozpustný pigment +
Knen Actinoplanea missouriensis ATCC 31681, produloijící antibioiikm A--4696G je možno získat v čisté kultuře bez přítomnooti ostatních kmenů tai, že ae mikroorganismus pěstuje na šikmém agarr, agarových plotnách nebo ve sterinním vodném živném prostředí. Nový kmen, získaný mu raci je možno vytUžt pro výrobr antibiotika A-4696G. Způsobem podle vynálezu se tedy toto antibioiirum získává pěstováním čisté kultury Actinoplanes missotriensis kmen ATCC 31681.
Svrchr uvedený kmen Actinoplanes missotuiensis ATCC 31681 tedy produkuje faktor Ga další látky s entibioickým účinkem, přičemž faktor G tvoří přibližně 30 % antibiotik. Nový .kmen může růst na celé řadě živných prostředí, která obsahují využitelné zdroje rlťLíkr, dusíkr a anorganických solí. Vhodnými zdroji uhlíku jsor například rhlohydráty jako škrob, glukóza, dextrin a podobně. Glycerol je rovněž mikroorganismem využíván jako zdroj uhLíkr. Výhodným a levným zdrojem U^^Lí^ku je melasa, avšak výhodnější je škrob. Ze zdrojů dusíku je možno uvést aminolksseiny, peptony a kvasinky. Je také možno užít oleje, například sojový olej nebo arašídový olej jako zdroje dusíku. Nejvýhodnějším zdrojem dusíku jsou kvasinky, obvykle extrakt z kvasnic.
Stejně jako v případě dalších mikroorganimů, produlkijících antibiotika se včlenění do živného prostředí anorganické soli. Anorganické soli, které padají v .. úvahu jsor ty látky, které jsor zdrojem iontů sodíku, draslíku nebo vápníku a iontů amonných, fosforečna· nových, chloridových, síranových a podobně. Je také možno do živného prostředí přidávat stopové prvky, nutné pro růst mikroorganismů, a to jednotlivě nebo spolu s dalšími živinami. MaLá možžsví stopových prvků, dostatečná k uvedenému účelu se obvylkLe vy sletují jako nečistoty v ostatních složkách živného prostředí.
K dosažení vyšší produkce faktoru G v živném prostředí je možno do tohoto prostředí přidávat také zdroje růstových faktorů, například llhovarnické výpalky a extrakt z kvasnic.
Nový kmen, produlkjící faktor G je možno pěstovat v širokém rozmezí pH. Pro maximální produkci antibiotika je věak výhodné udržovat pH v rozmezí. 6 až 8,0, s výhodou v rozmezí 6,5 až 7. V průběhu růstu mikroorganismu se pH živného prostředí obvykle zvyšuje z výhodného rozmezí na pH 7,0 až 7,5·
Malá možssví antibiotika je možno získat při pěstování uvedeného kmene v třepacích lahvích o objemu · 250 až 2 000 ml. Pro produkci antibiotika ve velkém množství se užívá fermentorů o přibliniém objemu 10 000 až 200 000 litrů. Nee^hocdnSěí je pěstování v submerzní kuLtuře za aerobních podmínek, zejména v případě, že je nutno získat velké mužství faktóru G. Stejně jako při produkci jiných látek se v tomto případě užívá velkých sterilních fermentorů s obsahem živného prostředí, které se očkuje dost sečným mioostvím očkovacího materiálu pro růst a produkci i antibiotika v požadované době od naočkovali. Očkovací mteei.á:l pro velké tanky se získá tak, že se m^k^oo^gani^jmus nejprve pěstuje na šikmém agaru, odkud se přenese do třepacích lahví s obsahem živného prostředí. Veeeeativní prostředí v plném růstu se pak z třepací lehive přenese do většího objemu, který tvoří meeistupeň mezi třepací lahví a produkčním tankem. Jakmile růst v tomto meeistupni je optimmání, přenese se obsah do největšího tanku.
Kmen A. ATCC 31681 je možno pěstovat ve feríeoeaeníí prostředí při teplotách 20 až 40 °C. Výhodná teplota pro ío^í^l^í1i^:í produkci faktoru G je přibližně 30 °C.
V průběhu fermentace nového kmene se živným prostředím nechá procházet sterilní vzduch a současně se živné prostředí míchá. Přivádí se například 0,1 až 1,0 objemu vzduchu na 1 bbjem živného prostředí za minutu, výhodná rychlost provzduěňování živného prostředí však je alespoň 0,5 objemu vzduchu na 1 objem živného prostředí za minutu.
Při svrchu uvedených fermentačních podmínkách obvykle dochází k ^^í^í^i^íI^i^íí produkci · faktoru G v · průběhu 4 až 6 dnů. Průběh fermentace je možno sledovat tak, že se odeeírají vzorky, jejichž tntiíioeLLcká účinnost se sleduje. Vhodným mikroorganismem pro toto použití je Ba^llus subbtlis. Zkoušky se provádí standardním způsobem při pouužtí ploten s papírovými kotouči nebo miskami na agarových živných prostředích, naočkovaných zkoumaným mikroorganismem.
Di izolaci faktoru G do fermen tačního prostředí se s výhodou postupuje tak, že se živné prostředí chromá togrtаfj je na pryskyřici bez funkčních skupin. Pro teno účel je vhodní například pryskyřice . Diaion HP 20 Dalšími podobnými pryskyřicemi bez funkčních skupin jsou například ^merlite XAD-4 (Rohm a Haas Co.) a Duuoite SES 861 (Diamond Shamrock) tyto pryskyřice mohou být rovněž užity. Izolace faktoru G se obvylkLe provádí tak, že se živné prostředí zředí organickým rozpouštědlem, mísiteným s vodou, například acetonem a pH tohoto zředěného fnríβntaeoího prostředí se sníží na 1,5 až 2,0, načežs-se okyselené prostředí zfiltruje k oddělení mcceia· a dalšího nerozpustného podílu. K urychlení filtrace je možno pouuít pomoccých prostředků, například ifusoriové hlinky nebo dalších běžně dodávaných' . pomocrých prostředků pro filtraci
Nerozpustný podíl je možno odděěit také odstředěním. Dostředí se pak upraví na pH 3 až 4 a odpojí k odstranění organického, rozpouštěna. Prostředí se pak nechá prooit· prysk^lcí bez funkčních skupin a antibioiium se vymývá směsí vody a organického rozpouštědla, například směsí vody a mithanolu, vody a ethanolu nebo vody a acetonu. ObvylQe tvoří organické rozpouštědlo. 20 až 50 objemových % směsi. Frakce eluátu s obsahem antibiotika se zahuutí na malý objem a αntiíioiiUm se vysráží z konccnnrátu ve volné formě po úpravě pH na 6,5 až 7.
Je také možno postupovat tak, že se - po skončené fexmentaci faktor G izoluje z feimentačního prostředí běžnými izolační! postupy například adsorpcí na vhodnou iontoměničovou pryslQtfici a následrýfa chroaatogrefiicýfa dělenta· Vhodné pryskyřice jsou například kationtoměničová pryskyřice s malým počtem příčných můstků, například Anberllte IR-116·
Jak již bylo uvedeno, antibioidm A-4696 faktor G je zásaditá látka, která obsahuje dvě zásadité amino stopiny· Faktor G proto tvoří adični soli s anorganickými a organidými kyselinami· Soli faktoru G se připravují běžným způsobem, například dihydroclh.orid se připravuje tak, že se volná látka uvede v reakci s kyselinou chlorovodíkovou ve směsi vody a methioiolu· D^Jh^y^i^<^<^c^l<^o^:id se z roztoku vyax»áŽXv oddělí se filtrací a usuší, Sulfát je možno - získat tak, že se kyselina sírová přidá k roztoku faktoru G ve s^^t^ji vody a mmthanolu nebo ve směsi vody a ethanolu.
Faktor G a jeho netoxické adični soli s kyselinami, přijatelné z farmaceutického hlediska brzdí růst mikroorganismů, patogenních pro člověka a živočicha· Například minimální inUbiční koncentrace MIC faktoru G porobi Streptococus pneumooiee je 0,5 <g/ml· Proti Streptococcus pyogenes je MIC 0,25 ,/ug/rnl a proti Staptylococcus aureus je MIC pro faktor G 1,0 jug/ml·· MidLméájní inhibiční koncentrace byly stanoveny ředěním na agaru.
Faktor G má in vivo účinnost proti týmž miCroorgín^iшnůb, - například u mrSÍ byly zjištěny hodnoty EDjq po podání antibiotika ^ším, kterým byl injekčně podán uvedený mikroorganismus·
Mikroorganismus ED50 (mg/kg x 2, podkožně)
Streptococcus pneumoniae 0,39
Streptococcus pyogenes 0,57
Staplylžcocius aureus 0,78
Faktor G a jeho soli, přijatelné z farmaceutického hlediska je možno užít k potlačení infekcí u člověka i u zvířat při parenterálním podání v účinné dávce 1,5 až 100 m/kg· Toto minžství je možno podat v jediné denní ' - dávce nebo v několika dávkách denně· Trvání léčby a velikost dávek se mění v závislosti na pathogenním mikroorganismu, na závažnooti infekce a na celkovém stavu postiženého,
A10ibižtCUm je možno zpracovávat do vhodných lékových forem pro” píarenterální podání, například do ampuí pro nitrosvalovou injekci nebo je možno je podávat v nitrožilní infúzi ve formě roztoku ve vhodné kapalině, například v Ringrově roztoku, 5% dextróze nebo fyziologcckém roztoku·
Faktor G je také možno užít ke zrychlení hmotu osních přírůstků u - kuřat tak, ' že se tento faktor včlení do krmivá nebo pitné vody pro kuřata· Faktor G je možno včlenit do krmivá v konoen0raci 2,5 až 100 ppm, v tomto případě zvyšuje přírůstky a zlepšuje využžtí krmivá ve srovnání s kontrolními zvířaty· Při podávání do pitné vody se - obvykle užívá sůl faktoru G, přijatelná z farmaceutického hlediska. Vhodnou solí antibiotika A-4696G pro toto podání je dihydrocHorid· K€>žLOin0raie antibiotika A-4696G nebo jeho soli - v pitné vodě se obvykle užívá při hladinách 1,5 až 50<ug/mL, s výhodou - 10 až 20Yug/’ml· Je tedy možno uryclhlt růst kUřat tak, že se ' kuřatům podává účinné množ tví růstového faktoru G antibiotika A-4696 nebo některá - z jeho solí, přijatelných z farmaceutického hLediska.
Jak již bylo - uvedeno, je možno faktor G včlenit do krmivá nebo pitné vody kuřat. Kuřatům je možno podávat krmivo s obsahem antibiotika A-4696G ' v celém průběhu růstu až do dosažení maximálního přírůstku. '
Aitibiotkum A-4696G je možno včlenit do krmivá pro kuřata. K tomuto účelu js možno užít izolovaný a v poddtatě čistý faktor A-4696G. Vysoce hospodárná a - pohodlná formě faktoru G - pro uvedené pouužtí vSak spočívá V-tomže se ueuěí celé feimentační prostředí, - čímž se - získá faktor G ve směsi s mediem. Tato směs s obsahem mydla a antibiotika A-4696 G může být analyzována na obsah faktoru G, - aby bylo ' •^o do krmivá pro' kuřata přidat příslušné íoožsví tohoto faktoru. Tímto způsobem je rovněž možno zužitkovat myeluin s příměsí faktoru G jako krmivá, doppňující sacharidy a arninooksseiny do denní dávky kuřat.
Směs iyyceia a antibiotika A-4696G je možno získat tak, že se oddděí mydlím od živného prostředí a po odstranění faktoru G živného prostředí - svrchu uvedeným způsobem se zahuusí iIuIíc z chroimtcogiďických sloupců s obsahem faktoru G a - koncentráty se sBi^:í s odděieiým modiem před jeho usušení.
Aitibiotkum A-4696 faktor G a jeho sooi, přijatelné z farmaceutického hlediska jsou účinné látky, podpporujcí růst také u přežvýkavců, například - krav, koz a ovcí. Účinnost využžtí uhlohydrátů u přežvýkavců se zvyšuje v tom případě, že je í.Ií^c^o^í^I.ozí flóra - bachoru - podporována k tvorbě sloučenin typu propionátu a nikoli typu acetátu nebo butyrátu při - štěpení alifaticlých ícoUo, jak bylo uvedeno v publikaci Chtu^ch - a daaší, Dligetive Phyyiology snd Nuutition of - Riuummernsts, sv. 2, str. 622 . až 625 (1971)« - Aitibiotkum A-4696G ve volné formě nebo s výhodou ve formš soli, přijatelné z farmaceutického hlediska podporuje tvorbu propionátu ve srovnání s - tvorbou acstátů a butyrátů v bachorové šťávě.
Nappíklad při pokusech prováděných s bachorovov. šťávou ve fnmiaitačních lahvích, v nichž je možno naprav t činnost bachoru podporuje antibiotkum A-4696 tvorbou propionátu ve srovnání se všemi ostatními alifatí^^mi k^dincmi.
Pokusy jsou prováděny následující způsobem:
K pokusům bylo užito plynotěsných lahví, opatřených - vstupním otvorem pro kapaliny a pevné látky - a výstupním otvorem pro plyny, které byly^pojeny s - vaky pro shromažďování fermentačních plynů. Objem kappaim v lahvích byly udržovány - na 500 íL vedením, které směřovalo k odběrné nádobě. Obsah baněk byl - v průběhu zkoušek stále - míchán magnetickým mí^ad^m. Teplota v baňkách byla udržována v rozimzí 38 až 40 °C.
Do každé baňky bylo přidáno 500 íL šťávy z bachoru, odebrané od býků s píS^tělí, býkům byla podávána tatáž potrava, jaká byla použité ve zkoumané - kapp^ně. Bauky byly zataveny a ' byly připojeny vaky pro odběr plynu. Do baněk byl přidáván kapalný pufr o pH
6,8 - až 7,0, . - následujících složení rychlootí přibližúě 1 litr za den.
Složka g/litr
tydrogenfosforečnatn sodný 2,2
chlorid hořečnatý 0,036
hydrogennhhičitan sodný 5.9
chlorid draselný 0,34
chlorid sodný 0,28
mooovina 1,0 .
chlorid vápenatý 0,024
Dvakrát denně bylo do každé baňky přidáno 10 g krmivá. Po každém přidání byl uzavřen výstup pro plyn a baňka byla prosta kysličníkem uu.ičiým* Složení krmivá bylo 50 % sena z vojtěšky a 50 % krmivá následujícího složení:
Složka hmoonootní %
hrubě mletá kukuice 40,85
mleté kulkďičné stvoly 35
sójová mouka (50 % proteinu) 8,1
mouka z vojtěšky 4
melasa 10
mooovina 0,65
hydrogeirfoaforečnan vápenatý 0,6
uh-ičitan vápenatý 0,3
chlorid sodný 0,3
směs vitimínu A a Dg 0,07
doplňkové krmivo s vitmínem E 0,05
stopové prvky 0,04
Býci, jímž tyla odebírána bachorová šťáva, tyli krmeni tímtéž krmivém.
Každý den v průběhu zkoušek byla analyzována kapíú-ina i plyn. Fermentace .probíhá 4 dny před přidáním antibiotika do krmivá. Po 4 dnech a po dosažení relativně stálého složení odebíraného plynu a kapaliny bylo přidáváno do krmivá antibiotkUm A-4696G a feraentace pak byla prováděna ještě 7 dní.
Z kaidé - baňky byla odebírána kappaina, v níi byl plynovou chraimtoggrafí stanoven obsah acetátu, . propionátu a butyrátu. Údaa·, získané při přidávání antibiotika A-4696G jsou uvedeny v následnici tabulce 5.
Tib u lka 5
Vliv antibiotika A-4696G na sloiení Slávy z bachoru
Skupina Dávka 1) vug/rit C2 Tvorba VFA 2) C.lkea/VFA» Produkce Cj v mol. %
Λ C4
kontrola 0 43,6 15,2 5,4 64,2 23,7
antibiotiUιm
A-4696G 35 4 39,0 21,4 3.3 63,7 33,6
1) Konnentrace ve zkoumaném roztoku
2) Těkavé alifatické kyseliny v milimolech/den
3) A-4696G ve volné formě
Důleiiýfa využitím vynálezu je moonoot zvýšit vyhití krmivá u přeivýkavců s vyvinutou bachorovou funkcí tak, ie se tětato zvířatům. podává perorálně taková minoitví antibiotika A-4696G, které zvýší produkci propionátu·
Způsob podle vynálezu je tedy možno vyjít tak, ie se podává perorálně zvířaůiO alespoň takové minoitví antibiotika A-4696G, aby se zvýšila produkce propionátu v bachoru· Toto minoitví se pohybuje přibliině v rozmezí 0,1 mg/kg tělesné hmoonnoti denně ai 5 mg/kg denně. Výhodné rozmezí je 0,25 ai 3 mj/kg ' . den,
Anibiotium A-4696 faktor G a jeho sáli, přijatelné z farmaceutického hlediska, například síran, hydroohlorid nebo fosforečnan je možno podávat ve foímě doplňkového krmivá, ve formě krmivá'nebo ve formě bloků, popřípadě ve formě tablet, z nichi se antibiotkktm pomalu uvolňuje. Tento poslední způsob je nejvýhodnnjší pro zvířata, která se pasou. Tabbety uvedeného typu je možno připravit s obsahem polymeru, který zajiěťuje pomalé uvolňování antibiotika A-4696G po dobu několika dní. Tabbety muuí mít dostatečně vysokou specifickou hmotnost aby se nedostávalo zaiívacím ústrojím dále nei do bachoru. Tuto vysokou specifickou hmoonost je možno dosáhnout například přidáno částic kovu.
MinniTlní bloky s obsahem antibiotika A-4696G jsou rovněi velmi vhodným způsobem podávání tohoto antibiotika zvířaůům na pastvě. Tyto bloky obsahuj ve sHov vanám stavu soli, zejména anorganické a další iivné látky jako fosforečnany, úhičitany, vápenaté sooi, stopové prvky, například zinek, mangan a podobně, vitamíny, steroidy a popřípadě další sIožíu. Antibiotikum A-4696G je možno do těchto bloků včlenit v - - koncentraci 0,05 ai 5 %.
a
Dalším výhodným způsobem podávání antibiotika A-4696G je jako - doplňkové krmivo. Artibio^um A-4696G a jeho soli, přijatelné z farmaceutického hlediska je možno zpracovávat na celou řadu krmiv, která jsou nová a rovněi spadají do oboru vynálezu.
Krmivá pro hospodářská zvířata so obvyklo připravují v áěkolika stupních· Nejprve se účinná látka smísí a inertními složkami na předběžnou směs, která se dodává od původního výrobce do podniků, které připravují hotová krmivá pro hospodářská zvířata. Tyto předběžné směsi mohou být kapalné nebo pevné a mohou obsahovat 1 až 90 % účinné látky. Povaha inertních složek v předběžném krmivu není kritická, může jít o jakýkoli běžný užívaný nosič, přijatelný z fyziologického hlediska.
Kapalnými nosiči mohou být například glykály, jako póly®thylenglykoly o různé molekulové hmotnosti a propylenglykol, inertní oleje včetně rostlinných olejů a Čištěných minerálních olejů a alkoholy, přijatelné z fyziologického hlediska, například ethanol. Pevné směsi mohou obsahovat nosiče vermikulit, infusoriovou hlinku jiné hlinky přijatelné z fyziologického hlediska, například atapulgin nebo morilonit a granulované nebo práškované součásti krmivá jako hrubě mletou kukuřici, sójovou mouku, vojtěškovou mouku, rýžové plevy, drcenou kukuřici, drcenou pšenici nebo oves a další druhy odpadových materiálů při zpracování zrní. Tyto složky pevných předběžných krmivových směsí se často granulují, zpracovávají na pelety nebo se zpracovávají jinak к zajištění homogenity krmivá.
Dále budou uvedeny typické příklady předběžných krmiv, které obsahují antibiotikum A-4696G, vyrobené způsobem podle vynálezu:
I.
Mletý oves propylenglykol lignin A-4696G dihydrochlorid 84 % 2 3 11
II.
Žlutá kukuřice mletá kukuřice minerální olej A-4696G sulfát 24 % 25 1 50
III.
Sójová mouka A-4696G sulfát 10 % 90
IV.
pólye thylenglykol A-4696G dihydrochlorid pólyoxye thylene ster 90 % 9 1
v.
vermikulit olej z bavlníkových semen A-4696G 33 % 2 65
VI.
Rýžové plevy melasa A-4696G sulfát 22,5 % 2,5 75
га.
minerální olej polyglyc erole ster A-4696G %
VIII.
Metá kuklice 74 % sójový olej 1
A-4696G dihydrochlorid 25
Výhodná předběžná krmivá jsou taková, která obsahují 100 g antibiotika A-4696G nebo jeho soli v 1 kg až 200 g antibiotika A-4696G nebo jeho soli v 1 kg předběžné směsi.
Druhým stupněm výroby krmivá pro hospodářská zvířata je doplňkové krmivo nebo koncentrát. Taková doplňková krmivá obsahují sloučeninu, vyrobenou způsobem podle vynálezu ve směsi s . dalšími živinami, například anorganiclými látkemi, solemi, stopovými prvky a vitamíny. Doplňkové krmivo se často vyrábí tak, že se předběžná směs mísí a ředí s dalšími složkami ' a většinou se vyrábí ve velkém mnžžsví.
Doplňkové krmivo pak může být užito při výrobě výsledného krmivá s obsahem antibiotika A-4696G nebo je možno jej prostě smísit s krmivém bez ohledu óbsahu antibiotika při výsledném dávkování krmivá. Konecetrace antibiotik A-4696G v doplňkovém krmivu se může měnnt v rozmezí v závislosti na rninžžtví doplňkového krmivá, kteří má být podáno jednotlivým zvířatům. Obecně se může koncentrace v doplňkovém krmivu pohybovat v rozmezí 0,01 až 1 %, s výhodou 0,02 až 0,5 % Dále budou uvedeny příklady doplňkových krmiv _ s obsahem antibiotika vyrobených způsobem podle vynálezu.
I.
mleté kukuřičné stvoly 38,5 %
sójová mouka 25,0
mletá kuklice 20,0
mletý oves 10,0
mmlasa 2.5
stl 0,4
směs vitmínt 1.1
živočišný tuk 1,5
A-4696G fosfát 1,0
II.
Sojová mouka 64,49 9 biuret10,0 hydrogerrfosforečnan vápenatý4,2 tripolyfosfát sodný2,1 síra0,4 mmlasa6,0 stl12,8 směs anorganických stopových prvků 0,2 A-4696G0,01
III.
sójová mouka 49,59 %
vojtěšková mouka 24,8
močovina 12,4
hydrogenfenforečnan vápenatý 2,5
mletý vápenec 7,4
sH 2,5
směs vitmínl 0,8
A-4696G sulfát 0,01
IV.
sójová mouka hydregenfosfor·δnao vápenatý A-4696G dihydrodhorid 89,55 % 1.0,0 0,45
V.
sójová mouka 10,75 %
mooovina 20,0
hycdrogenfoEforečnan vápenatý 16,0
uhLičitan vápenatý 24,0
sůL 20,0
hydrogenoUhiδitjιo sodný 2,0
směs stopových prvků a vitamínů 7,2
A-4696G 0,05
Krmivá pro přežvýkavce jsou ' obvy]k.e a s výhodou založena na obilovinách vzhledem k pot^ebím těchto zvířat. Běžně 'krmivo pro přežvýkavce obsíaihjící pŠennci, oves, ječmen, kulkuici a podobně ' se mísí se sloučeninami, vyrobenými způsobem podle vynálezu běžným způsobem, tak jak tomu je při přidávání dalších účinných látek do krmiv.
Krmivo se tedy skládá obvykle ze svrchu uvedených základních součástí a doplňků, jako jsou vitamíny, stopové prvky, anorganické soli a daaší důležité živné složky,' které zajišlují správnou' výživu přežvýkavcl. Krmivo by mělo obsahovat přibližně 5 ppm až 500 ppm antibiotika A-4696G nebo jeho' soli, s výhodou 10 až 250 ppm'tohoto antibiotika. Dále budou uvedena typická krmivá s obsahem antibiotika nebo jeho solí.
I.
řezaná vojtěška 54,88 %
prosná 36,20
sójová mouka 4,10
směs moooviny a obilí, 70 % bílkoviny 3,60
hydrogerO*osforeδntn vápenatý 0,90
sll s obsahem stopových prvků 0,23
vitimíny 0,09
A-4696G 5 ppm
И,
mleté proso 60,0 %
mouka z vojtSiky 15,0
slupky z bavlníkových semen 1«,0
mouka z bavlníkových semen 8,0
sůl· 1,0
mletý vápenec 0,5
A-4696G fosfát 250 ppm
III.
Pěenice 44,54 %
kukuřičné stonky 45,00
melasa z třtiny 3ζ^ο
sójová mouka 6,40
hydrogeitfosforečnan vápenatý 0,65
vápenec 0,38
stopové prvky 0,03
A-4696G 50 ppm
IV.
mleté seno z jetele 15 %
mleté seno z vojtiiky 15
drcená kuhtfice 50
plnotučná sójová mouka 10
molasa 9
směs stopových prvků, vitmínů a soli 1
A-4696 sulfát Ю0 ppm
Antibiotikum A-4696 faktor G je možno užít jako látky, uryy chvící růst drůbeže a vepřů. K tomuto účelu se antibiotkuím A-4696G nebo některé z jeho solí, přijateliých z farmaceutického hlediska podává svrchu uvedeným zvířaůům v krmivu nebo v pitné vodě. S výhodou se podává dihydrochlorid antibiotika A-4696G nebo jiná ve vodě rozpustná sůl v·pitné vodě.
r- .
Vynález bude osvětlen následujícími,. příklady:
Příklad l
Způsob výroby antibiotika A-4696G
Pro naočkování kmene, produk^ícím antibiotkum A-4696G byl připraven Sikmý živný agar následujícího složení.
Složka Hnoonnosní %
cerelóza 0,5
dextrin z brambor 2,0
mouka Nuurisoy '.5
extrakt z kvasnic 0,25
Složka Hmtnnetní %
uhličitan vápenatý 0,1
agar 2,0
Šikmý agar se naočkuje kmenem ATCC 316Θ1, produkujícím antibiotikm A-4696G a pak < se tnkubuje 6 dní při teplotě 30 °C. Po inkubaci se mediím na šitaiém agaru překryje sterilní destilovanou vodou a uvolní sterilní tyčinkou nebo kličkou za vzniku vodné suspenze meclla.
w
Tato vodné suspenze se užije k naočkování 100 mL sterilního vegetativního živného prostředí, které má stejné složení jako svrchu uvedený šikmý agar. Takto naočkované živné prostředí se inkubuje 48 hodin při teplotě 30 °C. V průběhu inkubace se vegetativní živné prostředí míchá na rotační třepačce při 250 otáčkách za minutu. Po skončené inkubaci se 10 ml kultury odebere a užije jako očkovací mteei.áíl pro další stupeň, v němž má živné ppootředí následující složení.
Složka Hrnounosní %
cerelóza ’ 0,5
kvasnice mouka Nutrisoy 0,25 1 ,5
„ kukuřičný škrob 2,0
uhličitan vápenatý protipěnové činidlo (Sag 471)x 0,1 0,05
x Sag 471 = protipěnové činidlo silikonového typu (Union Ccahide).
Toto živné prostředí se inkubuje 24 hodin při teplotě 30 °C za stálého míchání na rotační třepačce při 250 otáčkách za minutu. Po skončené inkubaci se toto prostředí užije k naočkování sterilního produkčního prostředí pro anti-bicikum ' A-4696G následujícího složení. .
Složka ШюOnlsStní %
cerelóza 2,5
kvasnice 2,0
uhličitan vápenatý 0,2
síran amonný 0,025
hydrogartfosforečnan draselný 0,05
glycerin 1,5
v^lasa 1,5
kukuřičný škrob 3,5
protipěnové činidlo (Sag 471) 0,03
Fermentac· se provádí 143 hodin při teplotě 30 °C sa stálého míchání a provzdušňování sterilním vzduchem ryclhootí 1/2 objem vzduchu na 1 objem živného prostředí za minutu. V průběhu fermentaee se zvýěí pH živného prostředí z počátečního pH 6,5 na pH přibližně 8,0.
Část (30 litrů) feimentačního prostředí se zředí 30 litry acetonu a pH se upraví na 1,8 přidáním ^У^Ису chlorovodíkové o копсеШгас! 6N. Otyyelené živné' prostředí se zfiltruje při pmižití pomocného prostředku pro filtraci a nerozpustný - pcxlíl se promuje na filtru vodou. Filtrát se upraví na pH 3,5 přidáním 150 ml hydroxidu sodného o koncentraci 50 % a filtrát se zahuutí ve vakuu na objem 29 - litrů. Pak ae pH znovu Upraví z 2,2 na 3,1 hydroxidem sodným a směs se srncmi zfittuuje k odstranění nerozpustaého podílů· •
Filtrát s obsahem antibiotika se nechá projít sloupcem o průměru 7,5 cm s obsahem 5 li^trů pryskyřice bez funkčních skupin na styτdndivlrylldlnelnvvée podldadu (Mitaubbshi Dianion HP-20) po - předběžném zpracování mott^y-alkoholem a prostí vodou. RrykQoet průtoku je 250 mL zá minutu. Po adsorpci antibiotika na prysky lei se sloupec promyje 5 litry vody a pak se postupně vymývá 21 litry vodného - meethryalkoholu o korndntraci 20 β, 15 litry 50% vodného m^t^th^y^alkoho:lu a 15 litry 50% vodného acetonu.
Oeebíají se frakce o - objemu 4 litry. Frakce 8, 9 a 10 obsahuje většinu antibiotika a mimoto je prostá větších nečistot. Frakce 8, 9a 10 se slijí a odpadří na bbjem 6 litrů ve vakuu. Po úpravě koncentrátu na pH 6,8 přidáním vodného roztoku hydroxidu sodného se · koncentrát vlije do 60 litrů ieopropylalkoholu. Antibiotkkm А-4696Ю se z této emmel vysráží, oddělí se filtrací a usuěí. Tímto způsobem se získá 54,2 antibiotika A-4696G v podstatě v čisté formě.
Příklad 2
Výroba antibiotika A-4696G ve formě dihydroclh.oridu
Annibiotkkm A-4696G ve volné formě se rozpuutí ve vodném m^1^lhu^<^lu a získaný roztok se zředí kyselinou chlorovodíkovou o koncentraci 1N. Po -promíchání se okyselený roztok může zředit acetone», čímž ee vyaráží antibiotkkim A-4696G ve formě dihySroc]h.oridu.
Příklad 3
Další možný způsob výroby antibiotika A-4696G
Fermentačni prostředí, připravené stejrýfa způsobem jako v příkladu 1 se zfiltmije po přidání 5 % (hmoOnootní/obeemová·%) pomocného prostředku pro filtraci (Ceeite 545)· Filtrační koláč se znovu uvede v suspenzi ve, stejném objemu deionizované vody a pH takto získané· vodné suspenze se upraví na hodnotu 10,5 přidáním vodného roztoku hydroxidu sodného. Pevný podíl se ze suspenze oddělí filtrací a promyje se vodou.
Filtrát se slije s vodou, užitou k promýváni a takto získaný výsledný roztok se okyл selí přidáním 20% hmoonootní/obeemová % vodného roztoku kyseliny sírové na pH 4,5. Okyselený roztok se vyČeří filtrací při použití 1·% pomocného prostředku pro filtraci (Celit 545)· čirý roztok se nechá projit sloupcem, který obsahuje iontoměničovou pryskyřici Amberllte IR—116 · (Na* forma) a sloupec se promyje íb-ir'tzovsnou vodou. Pak se· iontoměni vyjme ze sloupce a po jednotlivých podílech se vymývá při pH 10,5 vodným roztokem hydroxidu sodného· Získaný elutát se n^i^t^jraiLizuje na pH 7 přidáním 20 % (hmoonootní/óbeemová %) vodného roztoku·kyseliny sírové, načež se promyje třemi podíly deionizované vody· Voda, užitá k prorvání se oe'..ltralizuje a slije s neutraizovamým eluátem. Výsledný roztok se k^j^c^c^r^t^iru^e a pak se lyoťilizuje· o získaný surový komplex se za energetického míchání pomalu přidává k ·deionizované· vod?. Výýledná suspenze se 20 minut míchá a pak se n^i^t^x^i^lizuje na pH 7 přidáváním O-fc vodného roztoku hydroxidu amooniéhc. Nerozpustné antibiotium A-4696G se oddělí filtrací ve vakuu, promyje se /.ovanou vodou a pak se lyofilizuje. ’
Takto získán · vysušené antibiotiUlm A-4696G, zbavené solí se uvede v suspenzi v deio.aizovlné vodě a pH suspenze se upraví na 2,7 přidáním 3N vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové. GOkyelený roztok se oďstřeáuje 40 minut při 2 500 otáčkách za minutu. Supeenatant se slije a nanese na vrcnol sloupce s obsahem pryskyřice k odbarvení. (Duuoit S761). Arn.ibiotíkum se vymývá de^n^c^anou vodou, rychlost průtoku je 30 ml/minuta. Eluce se sleduje chromaatogalií na tenké vrstvě. Frakce, s obsahem antibiotika A-4696G se zahnutí při teplot? 35 °C tlaku 400 Pa a pak se liofilizuje.
Usušené odbarvené lottbioiiUml A-4696G se pak rozpustí v deionizované vodě. Výsledný vodný roztok se zfiltruje a nanese na vrchol chromá^grafického sloupce s obsahem polyamidu (Maahery a Nsgel SC6). Sloupec se vymývá deionizovanou vodou. Eluce · se sleduje ultrafaaooýým světlem a chromalt)oгrlií na tenké vrstvě. Účinné frakce se sL^Ljí a lyofilizují. DbIší čištění se provádí opakovanou chromalooгraií.
* PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Claims (1)

1. Způsob výroby antibiotika A-4696G, který je glykopeptidem se dvěma aminoskuptnami zásadité povahy, ve formě dihydrochloridu jde o bílou krystalickou sloučeninu, v poddtatě rozpustnou ve vodě a neiOzpustnou v organických rozpouštědlech jako meUhy. alkoholu, acetonu, chloroformu a benzenu, s při blinám procentuálním prvkovým složením 52,90 % uhlíku, 4,29 vodíku, 6,39 % dusíku, 30,96 % kyslíku a 5,46 % chloru, s absorpčním maximem v ultrafiaoovém světle v bromidu draselném při 3 384 (široké), 2 924 (slabé), 1 730 (hrb), 1 659 (intenzivní), 1 616 (slabé), 1 590 (slabé), 1 504 (intenzivní), 1 488·(hrb), 1 427 (středně silné), 1 289 (slabé), 1 226 (dubbet), 1 214 ((dubbet), 1 · 179 (slabé'), 1 119 (slabé),
1 060 (intenzívni), 1 028 (slabé), 1 015 (hrb), 986 .slabé), 899 ^velmi slabé), 881 (velmi slabí), 815 (slabé), 801 .hrb), 769 (hrb), 751 (hrb) a 711
1¾ maximem v hlt.rafiilovém světle ve vodě při 279 nm _ • Псп “ je možno titrovat kontinuálně v rozmezí pH 3,5 až 13,5 při vodném di^methyi^f^orn^g^j^.dh, při hyfrolýze po dobu 70 minut v cm-', s absorpčním
53), s volnou formou, kterou eiektrometrické titraci v 66% 5% vodném roztoku kyseliny chlorovodíkové při varu pod zpětným chladičem se vytv^í pseudoaglykon vzorce jakož i . . fer-mavt-ického hlediska přijatelných solí tohoto antibiotika, vyznačujcího se tím, že se pěstuje mikroorganismus Actionoplanes mi^í^í^i^r^iei^i^is ATCC 31681 ve vodném živném prostředí s obsahem využitelných zdrojů uhlíku, dusíku a anorganických solí v subm^i*zní kultuře za aerobních podmínek, .oi pH 6,0 až 7,5 a teplotě 20 až 40 °C.
1 výkres
CS819461A 1980-12-18 1981-12-17 Production method of antibioticum a 4696 factor g CS227683B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS824512A CS227691B2 (cs) 1980-12-18 1982-06-17 Krmivo pro hospodářská zvířata, zvláště přežvýkavce

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21796080A 1980-12-18 1980-12-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS227683B2 true CS227683B2 (en) 1984-05-14

Family

ID=22813183

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS819461A CS227683B2 (en) 1980-12-18 1981-12-17 Production method of antibioticum a 4696 factor g

Country Status (22)

Country Link
EP (1) EP0055071B1 (cs)
JP (1) JPS57129693A (cs)
KR (1) KR830007831A (cs)
AR (1) AR228378A1 (cs)
AT (1) ATE16611T1 (cs)
AU (1) AU7860281A (cs)
CA (1) CA1172187A (cs)
CS (1) CS227683B2 (cs)
DD (1) DD211476A5 (cs)
DE (1) DE3173028D1 (cs)
DK (1) DK562181A (cs)
ES (1) ES508084A0 (cs)
FI (1) FI813957L (cs)
GB (1) GB2089815B (cs)
GR (1) GR76321B (cs)
IL (1) IL64486A (cs)
NZ (1) NZ199196A (cs)
PL (1) PL131763B1 (cs)
PT (1) PT74136B (cs)
RO (1) RO82474A (cs)
YU (1) YU292781A (cs)
ZA (1) ZA818631B (cs)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4479897A (en) * 1983-04-27 1984-10-30 Eli Lilly And Company Actaplanin antibiotics
US4587218A (en) * 1983-10-21 1986-05-06 Eli Lilly And Company Novel bioconverting microorganisms
GB8428619D0 (en) * 1984-11-13 1984-12-19 Lepetit Spa Derivatives of antibiotic l 17046
GR871488B (en) * 1986-10-10 1987-11-12 Lepetit Spa New antibiotics

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3952095A (en) * 1972-06-02 1976-04-20 Eli Lilly And Company Novel antibiotic and a process for the production thereof
US4064233A (en) * 1974-12-17 1977-12-20 Eli Lilly And Company Antibiotic A-4696
US4115552A (en) * 1976-04-19 1978-09-19 Eli Lilly And Company Factor A and B of antibiotic A-4696
GB1578480A (en) * 1977-05-19 1980-11-05 Lilly Co Eli Antibiotic a-35512 and process for production thereof
GB2045231B (en) * 1979-04-07 1983-08-03 Lepetit Spa Antibiotic a/16686 and its preparation from actinoplanes
CA1170598A (en) * 1979-12-13 1984-07-10 Bernard J. Abbott Process for the preparation of cyclic peptide nuclei

Also Published As

Publication number Publication date
GB2089815B (en) 1984-05-16
DD211476A5 (de) 1984-07-18
GB2089815A (en) 1982-06-30
EP0055071B1 (en) 1985-11-21
PL234310A1 (cs) 1982-08-16
NZ199196A (en) 1985-01-31
ATE16611T1 (de) 1985-12-15
FI813957L (fi) 1982-06-19
AR228378A1 (es) 1983-02-28
DE3173028D1 (en) 1986-01-02
RO82474A (ro) 1983-10-15
DK562181A (da) 1982-06-19
GR76321B (cs) 1984-08-04
YU292781A (en) 1983-10-31
AU7860281A (en) 1982-06-24
PT74136A (en) 1982-01-01
JPS57129693A (en) 1982-08-11
KR830007831A (ko) 1983-11-07
RO82474B (ro) 1983-09-30
PL131763B1 (en) 1984-12-31
IL64486A (en) 1985-01-31
IL64486A0 (en) 1982-03-31
ES8304205A1 (es) 1983-02-16
ES508084A0 (es) 1983-02-16
ZA818631B (en) 1982-10-27
EP0055071A1 (en) 1982-06-30
PT74136B (en) 1984-05-09
CA1172187A (en) 1984-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0055069B1 (en) Derivatives of actaplanin
EP0055070B1 (en) Antibiotic a-4696 factors b1,b2,b3,c1a,c3 and e1
KR840000750B1 (ko) 폴리에테르 화합물
EP0100605B1 (en) A47934 antibiotic and its production
US4548974A (en) Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum shearer
US4430328A (en) Ruminant lactation improvement
US4307194A (en) Inhibitors, obtained from bacilli, for glycoside hydrolases
CS227683B2 (en) Production method of antibioticum a 4696 factor g
HU199559B (en) Process for producing antibioticum a 10255 complex and factors and pharmaceutical compositions containing them
US4461723A (en) Antibiotic A-4696 factor G
EP0156193B1 (en) Compounds and compositions for treating protozoal infections with a novel antibiotic
EP0063491B1 (en) Ruminant lactation improvement
JPS61149096A (ja) 有機化合物、その微生物学的製造方法およびその使用
US4637981A (en) Antibiotic A-4696 factor G
US4672036A (en) Pure cultures of Kibdelsporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323 and mutants thereof
IE52407B1 (en) Polyether and glycopeptide antibiotic compositions for growth promotion in ruminants
IL44065A (en) Metabolite a-27106 and process for its preparation and its use as coccidiostatic agent and feed additive
CS227691B2 (cs) Krmivo pro hospodářská zvířata, zvláště přežvýkavce
US4797280A (en) Antibiotics produced by Kibdelosporangium aridum Shearer gen. nov., sp. nov. ATCC 39323
CS209848B2 (cs) Způsob přípravy polyetberických antibiotik A-28086
CS203115B2 (en) Process for preparing antibiotic
CS228936B2 (cs) Předběžné, respektive doplňkové krmivo pra vytvoření krmivá pro hospodářská zvířata, zvláště přežvýkavco
GB2243610A (en) Cyclic glycopeptides