DD210308A5 - Verfahren zur herstellung des antibiotikum-komplexes a41030, seiner faktoren a,b,c,d,e,f oderg oder pharmazeutisch unbedenklicher salze hiervon und hierzu geeignetes kulturmedium - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikum-Komplexes A41030, der Faktoren A, B, C, D, E, F, oder G hiervon oder der pharmazeutisch unbedenklichen Salze hiervon durch Zuechtung von Streptomyces virginiae NRRL 15156 oder NRRL 12525 oder einer das Antibiotikum A 41030 bikdenden Variante oder Mutante hiervon in einem Kulturm.das assimilierb.Quellen fuer Kohlenst.,Stickst.und anorganische Salze enthaelt,unter submersen aeroben Fermentationsbedingung bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an antibiotischerAktivitaet und durch anschliessende an sich bekannte Auftrennung des hierdurch erhaltenen Komplexes in die jeweiligen Faktoren oder uebliche ueberfuehrung in pharmazeutisch unbenkiche Salze. Diese Produkte sind wertvolle antimikrobielle Mittel.

Description

Aktenzeichen: AP C 12 Ρ/249 013/8 Χ-5984

Vertreter:

Patentanwaltsbüro Berlin

Titel der Erfindung:

" ^ Verfahren zur Herstellung·des Antibiotikum-Komplexes A4.1030/ seiner Faktoren A, B, G, D, E, F oder.G oder pharmazeutisch unbedenklicher Salze hiervon und hierzu geeignetes Kulturmedium

2Q Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikum-Komplexes A-41030, der Faktoren A, B, C, D, E, F und G öder der pharmazeutisch unbedenkliehen Salze hiervon durch Züchtung eines bisher unbekannten Mikroorganismus aus der.Familie der'Streptomyces, und auf ein hierzu geeignetes Kulturmedium. .

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen: 30

Aus üS-PS 4 322 343 und US-PS 4 322 406 sind bereits Antibiotika bekannt, die zu den erfindungsgemäß erhältlichen neuen Verbindungen ähnlich sind.

35

_7 ins

- 2 1 Aufgabe der Erfindung:

Es besteht ein großer Bedarf an der Enzwicklung neuer Antibiotika, da die Möglichkeit sehr groß und die Gefahr konstant ist, daß sich antibiotikaspezifische resistente Stämme pathogener Mikroorganismen entwickeln. Vor allem Krankheitserreger innerhalb der grampositiven Arten von Staphylococcus und Streptococcus sind häufig resistent gegenüber den normalerweise verwendeten Antibiotika, wie Penicillin und Erythromycin,und in diesem Zusammenhang wird beispielsweise hingeweisen auf W. 0. Foye, Principles of Medicinal Chemistry, Seiten 684 bis 686 (1974). Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung neuer Antibiotika mit verbesserter Wirksamkeit und ohne bereits bestehende Resistenz, wobei-zugleich auch ein'hierzu geeignetes-Kulturmedium: bereitgestellt werden soll.

Darlegung des Wesens der Erfindung.·:

Die obige Aufgabe wird beim eingangs genannten Verfahren e-rf indungsgemäß: mnv dadurch ,gelöst·/ daß: man-: Streptomyces virginiae NRRL 12525 oder NRRL 15156 oder eine das Antibiotikum A41030 bildende Variante oder Mutante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze, enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen züchtet.

Diese' Organismen; und- 'andere bilden einen Antibiotikum-Komplex aus mehreren antibiotischen Faktoren, zu denen auch die'Faktoren'-A,- By. C₇-. D, E, F und G gehören. Der. Einfachheit halber ist der gezüchtete Mikroorganismus Streptomyces virginiae NRRL 12525 im Labor der Patentinhaberin als Kultur A41030.4 bezeichnet worden. Streptomyces virginiae NRRL 15156 ist im Labor der Patentinhaberin als A4103 0 bezeichnet worden.

Die Infrarotabsorptionsspektren der einzelnen Faktoren gehen aus der Zeichnung wie folgt hervor:

Figur 1 = A41030 Faktor A (KBr-Pellet)

5 Figur 2 = A41030 Faktor B (KBr-Pellet)

Figur 3 = A41030 Faktor C (KBr-Pellet)

Figur .4 = A41030 Faktor D (KBr-Pellet)

Figur 5 = A41030 Faktor E (KBr-Pellet)

Figur 6 = A41030 Faktor F (KBr-Pellet)

10 Figur 7 = A41030 Faktor G (KBr-Pellet)

Unter einem Komplex wird in der Fermentationstechnik und der vorliegenden Beschreibung ein Gemisch aus gleichzeitig gebildeten einzelnen antibiotischen Faktoren verstanden. Anzahl und Verhältnis der gebildeten einzelnen Faktoren schwanken in einem.Antibiotikum-Komplex"in' Abhängigkeit von¹ den Fermentatiohsbediri'gurigen und dem' 'verwendeten'; Stamm, wie dies dem mit der Herstellung von Antibiotika durch Fermentation vertrauten-Fachmann bekannt ist..

20; ; .

Die'Kultur· A4 1030 . 4 , nämlich eine-chemisch "induzierte Mütante-eines/ ;. ' Stammender ' Kultur' Streptomybe5"'virgin'iaer (A4103Q), die ursprünglich aus einer in Indianapolis, Indiana, V.St-A., gesammelten Bodenprobe isoliert wurde, ist beim Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service,.Peoria, Illinois 61604, V.St.A-/. hinterlegt und Teil der dortigen Kulturensammlung, von der sie unter der Nummer NRRL 12525 frei bezogen'werden kann. Die den vorliegenden Antibioti-

^ küm-Komplex ebenfalls bildende Stammkuitur ist ebenfalls beim Northern Regional Research¹ Center hinterlegt und von dort unter der Nummer NRRL 15156 frei beziehbar..

Die Kultur A41030.4 ist erhältlich durch aufeinanderfol- . . . . .

gende Behandlung der Kultur A41030 mit Mitomycin C und dann

mit. N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin.

9 1 NlRL 133^Cm 2

ΐ Durch Behandlung der Kultur A41030 mit anderen mutagenen Mitteln lassen sich selbstverständlich weitere Stämme erzeugen, die praktisch zu den gleichen Biosynthesen befähigt sind wie Streptomyces virginiae NRRL 12525. Zu anderen mutagenen Mitteln außer Mitomycin C gehören Acriflavine, Acridinorange, Ethidiumbromid und ähnliche chemische Mittel, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosogüanidin ist zwar zusammen mit Mitomycin C zur Erzeugung von NRRL 12525 verwendet worden, doch lassen sich zur Einleitung einer ähnlichen Mutagenese auch andere bekannte mutagene Mittel einsetzen, wie Ultraviolettlicht, Hochfrequen'zstrahiung, radioaktive; Strahlung, Röntgenstrahlung oder sonstige chemische Mittel.

Die Kultur A41030 ist als ein Stamm von Streptomyces <3 virginiae klassifiziert worden, und die Kultur A41030.4 ist klassifiziert worden· als eine chemisch induzierte Mutante eines Stammes von Streptomyces virginiae, und zwar auf Basis einer gleichzeitigen Züchtung von Streptomyces avidinii ÄTCC 27419, Streptomyces coluinfoiensis ^zu ATCC- 27425, Streptoiayces goshiklensis. ATCC 23914, Streptomyces griseolavendus ATCC 254 57/ Streptomyces lavendulae ATCC 86 64",' Streptomyces" toxytricini ATGC 1 96-1.3 oder-Streptomyces virginiae, Grundy, Whitman, Rdzok, Hanes und Sylvester 1952, ATCC 19817. Hierzu sind die Methoden und

Medien gemäß der Empfehlung von Shirling und Gottlieb ("Methods of Characterization of Streptomyces Species", Int. J. Syst. Bacteriol. ίβ(3), 313 bis 340 (1966)} zusammen mit bestimmten ergänzenden Untersuchungen herangezogen worden. Die Kultur A41 030 .4 ist ferner '.-auch mit

30 .

veröffentlichten Beschreibungen der oben angegebenen Stämme verglichen worden; die enthalten sind in "Sergey's Manual of Determinative Bacteriology" (8. Aufl., Herausgeber R- E. Buchanan und N.E. Gibbons, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Maryland, und in Shirling und Gottlieb, "Cooperative Description of Type Strains .of Streptomyces", Int. J. Syst. Bacteriol. 18(2), 178 .(1968).

Die Kultur A41030.4 bildet auf irgendeinem Medium weder ein Luftmycel noch Sporen, und sie unterscheidet sich daher von allen,oben angegebenen Arten.

Charakterisierung der Kulturmorphologie von A41030 und A41030.4

A41030 bildet gut entwickelte Luftmyceüen und Sporophoren, ]Q die sowohl spiralförmig sind als auch Haken und" Schlaufen aufweisen. A41030 liegt im Spiralbereich (s) von Pudham et al-, "A Guide for the Classification of Streptomyces According to Selected Groups", Appl. Microbiol. 6, 52 bis 19 (1957) als vorwiegendem Morphologietyp und im Tetinaculum-Apertum-Bereich (RA) von Pridham et al. als sekundärem Morpholögaetyp .^:: A41 030 .4 bildet weder-Luft-^;· mycel noch Sporen.

20 ' KuItürcharakteri stiken.

^Wlv&ii&^^^^ KüliüiiesisMI 0.3Q.y··.·

A41030.4 und S. virginiae ATCC 19817 auf verschiedenen Medien gehen aus der folgenden Tabelle I hervor.

Die Zuordnung der' Farbnamen beruht auf ISCC-NBS Centroid Color"Charts Standard Sample -Nr.' 2106 (National Bureau of Standards, U.S. Department of Commerce, 1958) und auf Color Harmony Manual, 4. Aufl., (Color Standards Depart-

ment, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958} .

	Ln	Medium	G R. Am Sp	CO KD O Oi	Tabel	IO O	Oi	O Oi	—	I CTi I
		ISP Nr. 2	G R Am Sp	Kulturcharakteristiken von	le I				I
		ISP Nr. 3	G R Am Sp	A41030	A4 1030,	A41030.4 und ATCC	19817
	ISP Nr. 4	G R Am Sp	•Reichlich 72.d.OY Reichlich: 63.-1. brGY Keines		A41030.4	ATCC 19817
	ISP Nr. . 5	G R Am Sp	Gut 93.yGrau Gut:63.1.brGY Keines		Gut BO.gy.Y Keines Keines	Reichlich 75.tief yBr Reichlich:63.1.brGY Keines
	Czapek-Agar	G R Am Sp	Reichlich 89.p.Y Reichlich:63.1.brGY . Keines		Schlecht 93.yGrau Keines Keines	Genügend 9O.gy.Y Genügend:63.1.brGY Keines
	TPO	G = Wachstum	Reichlich 89.p.Y Reichlich:22.rGY Keines		Schlecht 89.p.Y Keines Keines	Gut 91.d.gy.Y Gut:63.1.brGY Keines
		Genügend 264.1.Grau Schlecht:1O.pKGY Keines		Schlecht 89.p.Y Keines Keines	Gut 89.p.Y Gut:63.1.brGY Keines
SS 3d l£> CO IO		Reichlich 72.d.OY Reichlich:64.1.brGY Keines		Nicht angewachsen	Schlecht 264.I.Grau Schlecht:1O.pKGY Keines
% O -3 ~3 to		R = Unterseite . Am = Luftmycel		Gut 54.brO Keines Keines	Reichlich 75.tief yBr Reichlich:63.1.brGY Keines
μ> CO		Sp = Lösliches Pigment

- 7 - - .

Die Kultur A41030.4 wurde bezüglich ausgewählter physiologischer Eigenschaften unter Anwendung üblicher Verfahren untersucht. Die dabei beobachteten Eigenschaften und gefundenen Charakteristiken gehen aus der folgenden Tabelle II hervor.

Tabelle II

10

Physiologische Eigenschaften von A4103 0.4

Bildung melanoidartiger Pigmente auf:

15

Tryptqn-Hefe-Extrakt-Brühe (ISP Nr. 1)

Pepton-Hefe-Extrakt-Eisen-Agarschräge: (ISP Nr. 6)

Melanoidartiges Pigment

Melanoidartiges

Pigment,,

20

3. Tyrosin-Agarschräge (ISP No. 7)

Nitrat-Reduktion Gelatine-Verf lüs's igung „ · NaCl-Verträglichkeit Stärke-Hydrolyse Magermilch Temperatur-Bedarf

Kein melanoidartiges Pigment

Negativ,e_v Re ak tion, Negative -'Reaktion 3 %

Negative Reaktion Teilhydrolyse 10 bis 34⁰C

Die Kulturen A41030,. A41030.4 und Streptomyces'virginiae .

3Q ATCC 19817 werden hinsichtlich ihrer Kohlenstoffverwertungsrauster: unter Verwendung von Grundmedium ISP Nr. 9 miteinander verglichen, dem bis zu einer gleichen-Endkonzentration von 1,0 %'filtersterilisierte Kohlenstoffquellen zugesetzt worden sind. Die Ablesung der Platten erfolgt nach 14-

35 tägiger Inkubation bei 3O⁰C. Die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle III hervor;

21MRL1383*0-77248

¹ . Tabelle III

Kohlenstoffverwertungsmuster von A41030, A4103 0.4 und

Streptomyces·virginiae ATCC 19817

5 ·

Kohlenstoffquelle . A41030 A41030.4 ATCC 19817

Natriumacetat -

D-Arabinose - -

•0 L-Arabinose - - -

Cellobiose ' . . ' + + +

D-Fructose +_ - .+_

D-Galactose +. + -

D-Glucose + + +

'^ Isoinosit - -

Lactose- . — -

D-Maltose + + +

•D-Mannit - -

Melibiose · - - -

Raffinose - - --

Ehamnose - - -

D-Ribo.se^; + - +

Salicin + _+_ +

Natriumsuccinat + + +

'""'·

Saccharose - - -

D-Xylose - -

Schlüssel: - = Keine Verwertung

+ = Verwertung · 30

+ = Teilverwertung

21 «1333 * 07 Ί 2

Unter Verwendung hydrolysierter Gesamtzellen des Organismus bestimmt man die Isomeren von Diaminopimelinsäure nach dem Verfahren von Becker et al., Appl. Microbiol. 11, 421 bis 423 (1964). Hierbei gelangt man zu folgenden

2 Ergebnissen

Versuch Ergebnis

Isomere von .2,β-Diaminopimelin-]0 säure ' LL-Isomer

Ein Vergleich der Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den Kulturen A4103O₇ A41030.4 und Streptomyces virginiae ATCC 19817 geht aus der folgenden Tabelle IV hervor.

Die,- Zuordnung d.er^;\FaEb;nä.meil· erfolgt/ in /der;;:oben bereits^ angegebenen Weise, und die morphologische Charakterisierung beruht auf der bereits angegebenen Literatur von Pudham et al. ...

GJ Ol

(O

KD O

Oi

cn

Tabelle IV Ähnlichkeiten und Unterschiede von A41030, A41030.4 und Streptomyces virginiae ATCC 19817

Charakter

Farbe der Luftsporen Kohlenstoffverwertung (Galactose) (Fructose) (Ribose)

Gelatineverflüssigung Melaninproduktion

ISP Nr.

ISP Nr.

ISP Nr. Morphologie NaCl-Verträglichkeit in % Nitratreduktion Optimales Wachstumsmedium Farbe der Unterseite Ma-germilch Lösliches Pigment Sporenform Sporenoberfläche Stärkehydrolyse Temperaturbereich ⁰C

A4 1030

GY

(RA)(S)

p.Y

länglich glatt

10 bis 37

A4 1030..4

keine

keine 3

p.Y

keine keine

bis

ATCC 19817

Gy

(RA)(S) 5

p.Y

länglich glatt

15 bis

] Der Komplex A4103.0 kann hergestellt werden, indem man den bisher nicht beschriebenen Mikroorganismus Streptomyces virginiae NRRL 15156, Streptomyces virginiae NRRL 12525 oder eine A41030-bildende Mutante oder Variante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für. Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen solange. züchtet, bis eine wesentliche Menge an antibiotischer Aktivität gebildet ist. Der Großteil der antibiotischen

]0 Aktivität ist in der Brühe zu finden,'während geringere

Mengen an antibiotischer Aktivität auch im Mycel vorkommen können. 'Der Komplex A41030 läßt sich aus dem Fermentations- f . gemisch am einfachsten abtrennen, indem man das Mycel, nämlich die Biomasse, durch Filtrieren entfernt. Das Mycel

]5 wird im allgemeinen verworfen. Der Antibiotikum-Komplex wird, dann aus_: der-filtrierten Fermentationsbrühe·'vorzugsweise durch Säulenchromatographie mit.einem geeigneten Adsorbens'unter Verwendung von beispielsweise einem Gemisch aus Methanol und Wasser (1:1) als Eluiermittel isoliert.

20

Zu ,.geeigneten Adsorbentien gehören Kohle, Aluminiumoxid, An ionen-'*" und ^s Kationenaustauscherhar zeV> Siliciuadiöxidgelv, Polyamid, Carboxymethylceilulosen, hochporöse Copolymerisate aus Styrol und Divinylbenzol, wie Diaion HP-20, die Amberlit XAD Harze und die Duolit-Harze, wie ES-865,und \\}, dergleichen, sowie Sephadex-Harze, die hydrophilen unlöslichen und. als /chromatographische Medien geeigneten Mole- kularsiebe, die durch Vernetzung von Dextran hergestellt werden, und auch' die'TSK-GeIe. Bei den Diaion-Harzen^: handelt es sich um Produkte von Mitsubishi Chemical Industries, Limited, Tokio, Japan. Die Amberlit XAD Harze werden von Rohm and Haas, Philadelphia, Pennsylvania, V.St.A., hergestellt. Die Duolit-Harze sind Produkte von Diamond Shamrock, Redwood City, California, V.St.A. Die Sephadex-Harze werden von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden, hergestellt. Die TSK-GeIe sind erhältlich von E. Merck", Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland, und von Bio-Rad, 2200 Wright Ave., Richmond/California 94804,

30

35

- - 12 -

Der Antibiotikum-Komplex A41030 kann durch Anwendung chromatographischer Techniken weiter gereinigt und in r seine einzelnen Faktoren aufgetrennt werden.

Der Komplex A410.3 0 läßt sich aus Streptomyces virginiae NRRL 12525 oder Streptomyces virginiae NRRL 15156 unter Verwendung einer Reihe verschiedener Medien herstellen.

]Q Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, optimalen Ausbeute und .leichten Isolierbarkeit des 'Produkts:sind jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Diese Medien sollen assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthalten. Zu geeigneten Kohlen-

]5 stoffquellen gehören Dextran, Stärke, Mannose,Glycerin und- Baumwollsaatöl. Die-¹ optimalen Mengen an Kohlenstoff- quellen betragen etwa 2 bis 3 Gewichtsprozent.

Zu bevorzugten Stickstoffquellen gehören- Sojabohnengrütze, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Fischmehl, Fleischpepton· und Schweineblutmehl·.

Die für das Wachstum und die Entwicklung der Mikroorganismen notwendigen essentiellen Spurenelemente können als Verunreinigungen in sonstigen Bestandteilen der Medien in Mengen vorkommen, dia für das Wachstum und den biosynthetischen Bedarf der. Organismen ausreichen. .Es kann jedoch von Vorteil sein, wenn man die Kulturmedien mit weiteren löslichen anorganischen Nährsalzen-versetzt, die- für Ionen '· an Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Carbonat, Phosphat, Sulfat, Nitrat und dergleichen sorgen.'

Durch Zusatz von Tween 8 0- {nämlich einem öligen flüssigen Polyoxyethylensorbitanmonooleat, wie es von ICI Americas, Inc., Wilmington, Del., V.St.A. erhältlich ist) in einer Menge von 2.bis 4 % zum Fermentatiohsmediurn läßt sich eine Erhöhung der Ausbeute um etwa 300 % erreichen, unter diesen Bedingungen treten jedoch Schwierigkeiten bei der Isolie-

1 rung des Antibiotikums A4103 0 auf.

Kleine Mengen an Antibiotikum A41030 lassen sich durch Schüttelkolbenkultur herstellen. Zur Bildung großer-Mengen des Antibiotikums A41030 wird jedoch eine submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Bei einer Tankfermentation wird vorzugsweise von einem vegetativen Inokulum Gebrauch gemacht. Zur Herstellung des vegetativen Inokulums beimpft man ein kleines Volumen des Kultur-

mediums mit der Sporenform oder mit Mycelfragmenten, wodürGh-man^: zu. einer frischen und aktiv wachsenden 'Kultur«- ' des Organismus gelangt. Das vegetative Inokulum wird dann in einen größeren Tank übertragen, in welchem das Antibiotikum A41030 nach geeigneter Inkubationszeit in optima-

15 ler Ausbeute erzeugt wird. ...

Ein anderes'- Verfahren^: zur Bildung· eines Inökülums für ^;das vegetative'Medium besteht im Ersatz der wässrigen;Sporensuspension durch ein lyophilisiertas Pellet. Lyophilisierte Pellets'werden " in bekannter¹ Weise hergestellt. Die.'Herstellung, der' Sporensuspension für die Lyophilisierung verläuft ähnlich' wie:? die ϊ He.tstel'luhg'^: der" wässrigen'" Spöreriäuspens-iQn/ mit der Ausnahme, daß man anstelle von streilem destilliertem Wasser hier ein steriles Kälberserum verwendet.

Der das Antibiotikum A410 30 bildende Mikroorganismus kann über einen breiten Temperaturbereich von etwa-10 bis 34°C wachsen. Zu einer optimalen 3ildung des Antibiotikum-' Komplexes Ά41030 scheint-es bei einer Temperatur von'etwa ° 30°C zu kommen. Genauso wie bei üblichen aeroben submersen Züchtungsverfahren'wird auch hier durch das Kulturmedium sterile Luft verteilt. Für ein ausreichendes Wachstum des Mikroorganismus arbeitet man bei einer Tankproduktion

- mit einem Luftvolumen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa

35 ' - -^:

0,5 Volumina Luft pro Volumen Kulturmedium und pro Minute iy/V/Min.) / v/obe.i man bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von etwa 100 bis 3000 U/min rührt. In einem 165 1 fassenden Tank, der 100 1 Fermentationsmedium enthält, beträgt

die optimale Luftmenge etwa 0,25 V/V/Min, wobei mit einem Flügelrührer unter einer Umdrehungsgeschwindigkeit von etwa 200 U/min gerührt wird.

Eine antibiotische Wirksamkeit ist im allgemeinen nach etwa 48 Stunden vorhanden und bleibt wenigstens i44 Stunden-während- der Fermentationszeit aufrechterhalten. Zu einer maximalen Bildung an Antibiotikum kommt es nach einer Fermentations zeit von etwa 9 6 bis 120 Stunden. .

Die Bildung des Antibiotikums_:A410 30 kann während der Fermentation entweder durch Agar-Diffusion unter Verwendung von Bacillus subtilis oder durch Turbidimetric unter Verwendung von Staphylococcus aureus ATCC 9114 verfolgt werden. . . ' . .

Der erfindungsgemäß - erhältliche. Antibiotikum-Komplex und die einzelnen Faktoren_:hiervon werden entweder von Straptom.yces virginiae NRRL 15.156 oder von Streptomyces.;'virginiae. NRRL 12525 unter Fermentationsbedingungen von Temperatur, Dauer- und Bestandteile- der Medien gebildet, die- praktisch vergleichbar' sind. Unter- solchen-' Bedingungen scheint-Streptomyces virginiae NRRL 12525 den Antibiotikum-Komplex jedoch in einer etwas höheren Ausbeute zu bilden,.

- 15 •j Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert.

5 '

Beispiel 1 Herstellung eines.Inokulums der ersten Stufe

..'.. . , : .'; . · . ' ' ' ' ' ' Dasv/folgende' Medium wird hergestellt und für _;eine Schrägagarkultur von Streptomyces virginiae NRRL 12525 und Streptomyces virginiae NRRL 15156 verwendet.

Bestandteile . Menge (g/l)

Dextrin 10,0

Hefeextrakt 1/0

' ' ' 2

Enzyrahydrolysiertes Casein .2,0

20 Rinderextrakt' 1 ,0

-OH₂O , . 0,0.1

; 20,0

Deionisiertes Wasser. q.s. auf 1 Liter

25. Matheson Coleman.& Bell, Norwood, Ohio 45212, V.St.A/

N-Z-Amin A (Hu-mko Sheffield Chemical Co., Memphis,

Tennessee,. _:V. St. A, .

Das Medium hat' unmittelbar nach seiner Herstellung einen 3¹-' pH-Wert von. 6,5, und dieser wird vor der Behandlung im Autoklav- unter. Verwendüiia.-^:von 5n wässrigem Natriumhydroxid auf 7,3 eingestellt. Nach'Behandlung im Autoklav beträgt der pH-Wert des Mediums 6,9.

°-^J Die Sporen eines jeden Mikroorganismus werden auf einer Ägar-Schräge .aas den oben angegebenen Bestandteilen beimpft, und diese Agar-Schräge wird etwa 6 Tage bei Raumtemperatur bei etwa 30⁰C bebrütet. Die reife- Schräg-

Π ''J 9. 4 il

lkultur.wird mit sterilem destilliertem wasser überdeckt, worauf man die Sporen und das Mycel mit einem sterilen Werkzeug abschabt- Unter Verwendung von 1 ml der hierdurch erhaltenen Sporensuspension beimpft man dann 50 ml 5vegetatives Medium- Ein anderes Verfahren zur Bildung eines Inokulums für das vegetative Medium besteht im Ersatz der wässrigen .Sporensuspension durch ein lyophilisiertes Pellet. Das vegetative Medium für NRRL 12525 ist wie folgt zusammengesetzt: 10

Zusammensetzung ' Menge (g/l)

Glucose 20,0

Sojabohnenschrot (oder Sojabohnenmehl) 15,0

1SMaisquellwasser 10,0

CaCO₃, 2,0

Leitungswasser q.s. auf 1 Liter

Das vegetative Medium für' NSSL 15156 ist wie folgt zusaiu-20mengesetzt: '

Bestandteile , ·	Menge (g/l)
Glucose ^Dextrin	15,0 20,0
Sojabohnenschrot (oder Sojabohnenmehl)	15,0
Maisquellwasser	10,0
CaCO3"	2,0
Leitungswasser; a.s: 30 . *:	auf 1 Liter

Das Medium hat in nichteingestelltem· Zustand-, einen pH-Wert von 5,5, den man vor der Behandlung im Autoklav mit 5n wässrigem Natriumhydroxid auf pH 6,5 einstellt. Nach der Behandlung im Autoklav beträgt der oH-Wert des Mediums ³⁵7,0.

91 Ml!7 -iq31*07724S

-17- ' _:

'] Jedes vegetative Inokulum inkubiert man in einem 200 ml Erlenmeyer-Weithalskolben, der 50 ml Medium enthält, bei etwa 30⁰C über eine Zeitdauer von etwa 48 Stunden auf

einem Rotationsschüttler, der unter einem Bogen mit einem Durchmesser von 5 cm und bei einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 250 U/min betrieben wird- Mit dem auf diese Weise inkubierten Medium' beimpft man dann entweder kleine Fermenter (unter Verwendung eines Inokulums von etwa 1 % pro Volumen des" Fermentermediums) oder ein Medium der ] Q zweiten Stufe mit der gleichen Zusammensetzung wie das vegetative Medium, um hierdurch ein größeres Volumen an Kultur zu bilden.

Fermentation von NRRL 15156

15 ' . .·

Män^beimpft' 50. ml·; eine'si Prbd'uktxon'sine'Siüiifis:. mlt,,1 %s (0,5\ ml) des obigen inkubierten vegetativen: Mediums. Das Produktionsmedium ist wie folgt' zusammengesetzt:

Bestandteile Menge;: :(g,/l)

Dextrlnt · 3|),₇ -0Ϊ

Sojabohnenschrot 6,0

K₂HPO₄ 1,0

25 FeSO₄,-7H₂O 0,005 .

MgSO₄-7H₂O 1,0

NaNO₃, 1,0;.

CaCO₃ . 2,O²

Deionisiertes Wasser q,s. auf 1 'Liter

Das;Dextrin-kann^entweder'Tapiocadextrin: oder Kartoffeldextrin sein.

Für die Fermentation von NRRL 12525 liegt die Konzen-

^5 tration an CaCO₃ bei 4,0 g/l.

21

] Man löst K HPO in Wasser, sterilisiert die Lösung

getrennt und gibt die jeweilige Menge an Lösung zu den anderen Bestandteilen des Mediums, die im Autoklav behandelt worden sind.

50 ml des inokulierten Fermentationsmediums bebrütet man in einem 200 ml Erlenmeyer-Kolben bei etwa 30⁰C über eine Zeitdauer von etwa 4 bis 5 Tagen auf einem Rotationsschüttler, der unter einem Bogen von 5 cm Durchmesser bei -jQ einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 250 U/min betrieben wird.

Streptomyces virginiae NRRL 1.2525 wird ferner auch in einer Fermentation inkubiert, die in einem großen Maßstab J5 in 165 1 und in 6060 1 Tanks unter Verwendung des unmit-, telbar. oben beschriebenen Produktionsmediums, durchgeführt wird. · ·

Man läßt das-inokulierte Produktionsmedium in einem;165 1 Fermentation stank, der 100. 1 Medium enthält, etwa 210 Stunden (8,75 Tage) bei einer Temperatur von etwa 32°C fermentieren. Das, Fermentationsmediuirt-wird, mit steriler- Luft-, in einer Menge von 0,25 V/V/Min belüftet und mit herkömm-. liehen Rührern bei einer Geschwindigkeit' von etwa 20 0 U/min gerührt.

Diese großtechnische Fermentation von NRRL 12525 ist die Quelle, aus der die Antibiotika A41.030.· in der im folgenden beschriebenen Weise, abgetrennt: werden. "

Beispiel - 2 '

Abtrennung der Antibiotika A410 30 •35 . . .

Die in der in Beispiel 1 beschriebenen' Weise' erhaltene gesamte Fermehtationsbrühe (4215 1) wird unter Verwendung einer Filterhilfe (Hyflosupercel), nämlich eine von

-..mi λ η -ι η , η i"r ' "? O Λ

-j Johns-Manville Products Corporation erhältliche Diatomeenerde} in einer Filterpresse filtriert. Die filtrierte Brühe wird unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 l/min in eine Säule gegeben, die 100 1 Diaion HP-20 s- enthält (nämlich ein hochporöses Copolymerisat aus Styrol und Diviny!benzol in Perlenform/ das von Mitsubishi Chemical Industries, Limited, Tokio, Japan, erhältlich ist). Die Säule wird der Reihe nach unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 l/min zuerst mit 3 00 1 Wasser und

IQ dann.mit 300 1 eines Gemisches aus Methanol und Wasser (1:3) gewaschen. Die Elution erfolgt unter Verwendung eines Gemisches aus Methanol und Wasser (1:1) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 l/min, wobei jeweils Fraktionen mit 100 1_: gesammelt werden. Jede Fraktion wird bezüglich ihrer biologischen Aktivität analysiert. Für diese Bioversuche.verwendet mah^; Papierscheiben auf.. Agar-^Platten, die mit Bacillus subtil-Is angeimpft ..sind.. Die Fraktion 1 wird verworfen. Die' Fraktionen' 2 bis" einschließlich 15 werden vereinigt, unter verringertem Druck eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zu 220-g rohem Antibiotikum-Komplex gelangt.

Man löst eine Teilmenge dieses Komplexes, nämlich 110g, in 5 1 eines Gemisches aus Methanol und Wasser (1:1) unter Einstellung des pH-Wertes mittels wässrigem Natriumhydroxid auf 10 und filtriert das erhaltene Gemisch. Das Filtrat wird mit' einer Geschwindigkeit von 50-rnl/min auf eine Säule (0,2 χ 1 m) aus 30 1 grobem Sephadex G-50 gegeben -(bei dem es sieh um ein hydrophiles unlösliches und als chromatographisches Medium dienendes Molekularsieb handelt, das durch. Quervernetzung von Dextran· hergestellt und von Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ 08854, V.St.Ä. erhältlich ist), wobei diese. Säule vorher .mit einem Gemisch aus'Methanol und Wasser. (1:1) äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit einem Gemisch aus Methanol und Wasser (1:1) unter einer Strörnungsgeschwindigkeit von 50 ml/min' eluiert,- wobei Fraktionen mit jeweils 3 1 gesammelt werden. Die Fraktionen 1 bis ein-

21WRl 1933*077248

] schließlich 12 werden verworfen. Die Fraktionen 13 bis einschließlich 24 sind gegenüber 3acillus subtilis aktiv, und sie werden daher vereinigt, unter verringertem Druck eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zu 35,7 g des

5 Antibiotikum-Komplexes A41030 gelangt.

Die erfindungsgemäß hergestellten antibiotischen Substanzen werden hierin willkürlich als Antibiotika A4103 0 bezeichnet. Der Antibiotikum-Komplex A41030 enthält mehrere

]Q einzelne Faktoren, die als A41030 Faktoren A, B, C, D, S, F und- G bezeichnet werden. Bei der Diskussion über die Brauchbarkeit wird' der Kürze halber einfach vom Antibiotikum A41030 gesprochen,, wobei dann irgendein Vertreter aus der Gruppe des Antibiotikum-Komplexes A4.1030 oder der

]5 Faktoren A, 3, C, D, E, F und G des Antibiotikums, A4103Ö darunter zu verstehen ist.

Es werden bis zu sieben antibiotische- Faktoren aus der Fermentation gewonnen und als Gemisch erhalten, nämlich als Antibiotikum-Komplex A41030. Das Verhältnis der Faktoren im, Antibiotikum-Komplex A4.1 0.3 0. kann natürlich in Abhängigkeit von den angewandten Fermentationsbedingungen schwanken. Die einzelnen Faktoren A, B, C, D, E, F und G werden in der später beschriebenen Weise abgetrennt und als einzelne Verbindungen isoliert. Der Antibiotikum-Komplex A41030 ist in Lösungsmitteln löslich, wie Wasser, verdünnter wässriger Säure, verdünnter wässriger Base, Gemischen aus Methanol und Wasser, Gemischen aus Ethanol und. Wasser, Dimethylformamid,.. Gemischen, aus·. Dimethylformamid und Wasser, Dimethylsulfoxid, Gemischen aus Dimethyisulf- oxid und Wasser,' Acetonitril, Aceton,. Ethylacetat, Tetrahydrofuran oder Methylenchlorid.

Die folgenden Abschnitte beschreiben die Abtrennung sowie ^ die physikalischen Eigenschaften und Spektraleigenschaften der bisher charakterisierten Faktoren des Antibiotikum-Komolexes A4 1030.

OJ :i r\ Ί J Λ ¹^ ^ ΓΛ '**"' ^ 'Π

1 Beispiel 3

Isolierung von A41030 Faktor A

c Man löst 8 g des Komplexes A41030 von Beispiel 2 in 200 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser, Acetonitril und Natriumchlorid (84:16:2 g/l) und filtriert die Lösung. Das Filtrat wird auf eine Säule aus rostfreiem Stahl (8x100 cm) gegeben,, die mit 4 1 LP-1/C₁₀ ümkehrphasensilicagel mit

IQ einer Korngröße von 10 bis 20 μ gefüllt ist, welches nach dem in den Beispielen 6 und 7 der US-PS 4 299 763 beschriebenen speziellen Verfahren zubereitet worden ist. Die Säule ist Teil einer Chromatospac Prep-100 Einheit (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal, 91160 Longjumeau, Frankreich). Die Säule wird bei einer Geschwindigkeit von SO ml/min mit einem Gemisch:aus Wasser, Acetonitril- und Natriumchlorid. (84:16:2- g/l) eluiert, wobei Fraktionen mitV jeweils: 480 ml aufgefangen werden. Das Eluat wird bei 254 nm unter" Verwendung eines ISCO Modell UA-5 UV Monitors mit einer optisehen Einheit vom Typ 6 überwacht (Instrumentation^ .

Specialties Co., Lincoln, HE,,_:68;5Q5;, ,y.. St,. A;,) .....Ausbezahlte * Frakt iorien,;- aiiälysi er,t, man;', hin sieht lieh-' der.., Anwes enheit,, des .., Faktors A durch analytische Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer 4,6 χ 250 mm Säule aus rostfreiem Stahl, die mit dem oben erwähnten LP-1/C.Q Ümkehrphasensilicagel mit einer Korngröße von. 10 μ .gefüllt ist, das nach dem oben angegebenen Spezial- . verfahren präpariert worden ist. Die Probe wird mit einem .Injektionsventil von Rheodyne, Modell 7120 (Rheodyne Inc.,.

Berkeley, CA 94710, V.StVA.) aufgebracht. Das,Lösungsmittel, das aus einem Gemisch-aus Wasser, Acetonitril und Natriumacetat (81:19:0,03 Mol) besteht, welches mit Eisessig auf pH 6 eingestellt ist, wird in einer Geschwindigkeit von 1 ml/min (83 bar) mit einer Miltön Roy Duplex Minipumpe (Laboratory Data Control, Division of Milton Roy Co., Riviera Beach, FL 33404, V.St.A.) zugeführt. Der Faktor A wird bei '254 nm unter Verwendung eines UV-Detektors von ISCO Modell UA-5 entdeckt. Die Fraktionen 1 bis

21 MRl 1933*077.24*8

— ΔΔ — . .

einschließlich 51 werden.verworfen. Die am Faktor A reichenFraktionen 52 bis einschließlich 79 werden vereinigt und unter verringertem Druck bis auf ein Volumen von 500 ml eingeengt. Das Konzentrat wird mit wässrigem Natrium- g. hydroxid auf pH 8,2 eingestellt und filtriert. Das Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/min auf 100 ml Diaion HP-20 Harz aufgegeben,.das sich in einer Säule (2,8 χ 22 cm) befindet, die vorher mit Wasser äquilibriert worden ist. Die Säule wird solange mit Wasser

- η (400 ml , das mit Ameisensäure auf pH 2,5 eingestellt ist) gewaschen, bis sich in der Waschflüssigkeit durch Fällung als Silberchlorid kein Chlorid mehr feststellen läßt. Zur Elution verwendet man ein Gemisch aus Wasser und Acetonitril (8:2) mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/min, wobei man Fraktionen mit jeweils 1 1 auffängt. Die Frak-. tionen v/erden bezüglich ihrer Aktivität gegenüber Bacillus'subtilis analysiert. Der sich nach Kühlung in der Fraktion 2 bildende kristalline Faktor A wird durch Filtrieren gewonnen (389,6 mg),. Durch Einengen der- Fraktion 1 und des Filtrats der Fraktion 2 unter verringertem Druck und anschließende Lypphilisierung gelangt man zu 731,8 mg bzw. zu 514 mg' des Faktors. A--

Das Antibiotikum A41030 Faktor A ist ein weißer kristalliner Feststoff. Eine Elementaranalyse von A41030 Faktor A ergibt folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung: .56,44 % Kohlenstoff, 3,58 % Wasserstoff, 8,11 % Stickstoff, 23,20 % Sauerstoff und-8,29 % Chlor. Aufgrund einer Bestimmung durch Felddesorptions- und Plasiriadesorptions-^! massenspektrometrie hat A41030 Faktor A ein Molekulargewicht von 1231 . Auf Basis der Slementaranalyse und des Molekulargewichts ergibt sich für den Faktor A die empirische Formel Cr-^H Cl NO _s. Eine elektrometrische Titration des Faktors A in einem Gemisch aus 6 6 % DimethyIformamid und Wasser zeigt die Gegenwart- von drei titrierbaren Gruppen mit pK -Werten von etwa 5,53, 7₇60 und 10,37 mit

möglichen weiteren pK -Werten -von über 10,5 (anfänglicher

pH-Wert = 7,83). Das Antibiotikum A41030 Faktor A hat

Wl07 HQ 3 Q * iV7^9 L

L Π

folgenden spezifischen Drehwert:[α] = -19,6° (c = 9,0

in Dimethylsulfoxid).

Das Infrarotabsorptionsspektrum von A41030 Faktor A in . einem K3r-Pellet geht aus Figur 1 der Zeichnung hervor. Es lassen sich folgende unterscheidbare Absorptionsmaxima beobachten: 3448 bis,3226. (stark, breit), 1653 (stark), 1610. (schwach), 1587 (mittel), 1515 (stark), 1488 (schwäch), 1429 (mittel) , 1227 (stark), 1139 ^(mittel) , 1064 (stark) und 1010 (stark) cm"¹.

Die Ultraviolettabsorptionsmaxima der Faktoren A bis G des Antibiotikums A41030 in einem Gemisch aus Methanol und Wasser (1:1) unter sauren, neutralen und basischen Bedin-' gungen gehen aus der folgenden Tabelle.V hervor.

Tabelle VV UV-Spektrophotometrie der Faktoren von A4103 0

20 ' ' ^Λ ' ' ' -- > ' - - ""^;" --:.· , - - ·;;--

Faktor säuer v-o-de'r--- neutral·- bä-sisGh

sr-i, niri---.-(Ve-;;)

A 278 (11100) 298 (17200)

3 · . 278 (9600) ' 298 (16800)

C- 278 (84-00) 298 (14000)

D , . 278 (iO6OO) 298 (19900)

E ' 278 (8500) 298 (15500)

F ' 278 (9300) . 298 (14500)

G 278 (15000) 298 (18000)

Das Antibiotikum A410 30 Faktor A ist löslich in Gemischen aus Alkohol und Wässer, in Dimethylsulfoxid, in Dimethylformamid, in Gemischen aus Dimethylsulfoxid und Wasser, in Gemischen aus Dimethylformamid und Wasser, in verdünnter wässriger Säure und in verdünnter wässriger- Base. Auf Basis' der''beobachteten phy'sikaXlscVh-chemischen Däterf ist dem Antibiotikum: A41030 Faktor A folgende Struktur

2.1MRl1983*077'24o

zugeordnet worden:

Durch einen Bioversuch, und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ergibt sich, daß der Faktor A etwa 94 2.5 his 96 Gewichtsprozent der durch die Kultur A41030:4 gebildeten antibiotischen Faktoren ausmacht, so daß sich für die Faktoren. B, C, O₁ E/ F und G als Rest etwa 4 bis 6 Gewichtsprozent der gebildeten Faktoren ergeben.

Beispiel 4 Isolierung von'A41030 Faktor B

Man löst 1,0 g des Antibiotikum-Komplexes A41030 in 35 ml eines Lösungsmittelgemisches, aus Wasser, Acetonitril und Natriumchlorid (85:15:2 g/l) und gibt die Lösung auf eine 4,7 χ 45 cm Glassäule von Michel-Miller zur Hochleistungs

] niederdruckf lüssigkeitschromatographie (HPLPi₁C) auf (Ace Glass, Inc., Vineland, NJ 08360, V-St.A.), die in den Laboratorien mit 25 bis 40 μ LiChroprep RP-18 gefüllt worden ist [Kohlenwasserstoffphase -(Cio), die chemisch an Siliciumdioxidgel gebunden worden ist, erhältlich von MC/B Manufacturing Chemists, Inc ., Cincinnati, OH, V.St.A.J Die Säule wird bei einer Geschwindigkeit von 21 ml/min (7 bar) mit einer ventillosen Kolbenpumpe von FMI (Fluid Metering Inc., Oyster Bay, NY 11771, V.St.A-) unter Ver-

] Q wendung der gleichen-Lösungsmittelkombination- eluiert, die auch zum Lösen der Probe verwendet worden ist, wobei Fraktionen mit jeweils 21 ml gesammelt werden. Das Eluat wird bei 280 nm unter Verwendung eines UV-Detektors von ISCO Modell UA-5 überwacht. Die Fraktionen 1 bis einschließlieh 183 werden verworfen. Die am Faktor. B reichen Fraktionen.: 184 bis" einschließlich 245 werden vereinigt- und un-. ter- ,verringerten. Druck,auf 2 5 ,ml eingeengt ... Jionzentrata aus sieben ähnlichen Reinigungen werden vereinigt,, mit Wasser auf 1,4 1 verdünnt und in einer Geschwindigkeit von 8 bis 10 ml/min auf eine mit 100 ml Diaion HP-20 Harz gef üllte,.Säule; aufgegeben, ,die .. yor_;her„mit -Wasser ,.äcjuilibriert-, wordah- ist;,-,· Die,. Säule... wird·.-, solang:e\,.mit^.Wäs.s^;'er_; (600 ml) gewaschen, bis sich in der Waschflüssigkeit durch Ausfällung als Silberchlorid kein Chlorid mehr feststellen läßt. Die Elution erfolgt unter Verwendung eines Gemisches aus Wasser und Methanol (1:1) bei einer Geschwindigkeit von 8 bis- 10 ml/min, wobie Fraktionen mit jeweils 300 ml^; aufgefangen werden. Die. Fraktionen werden bezüglich ihrer Aktivität gegenüber Bacillus subtilis'analysiert. Die

Ju Fraktionen 1 bis 5 werden vereinigt, unter verringertem Druck eingedampft und lyophilisiert ,- -.-wodurch man zu 523.mg rohem Faktor B gelangt. ,

5 50 mg der beiden vereinigten rohen Präparationen des

35 "

Faktors B löst man in 10 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser, Acetonitril und Dibutylamin (75:25:0,03 Mol), wobei dieses Lösungsmittel.mit Phosphorsäure auf pH' 7,8 eingestellt worden ist) unter solanger Zugabe von Tetra-

Oi

] butylammoniumhydroxid, bis alles in Lösung gegangen ist. Die Lösung wird auf eine 2,8 χ 29 cm Michel-Miller HPLPLC Glassäule gegeben, die mit 25 bis 40 μ LiChroprep RP-8 gefüllt ist [Kohlenwasserstoffphase (G₀), die chemisch

an Siliciumdioxidgel gebunden und von MC/B Manufacturing Chemists Inc., Cincinnati, OH, V.St.A. erhältlich ist]. Unter Verwendung einer FMI-Pumpe wird die Säule bei einer Geschwindigkeit von 5 ml/min (2,4 bar) mit der gleichen Lösungsmittelkombination eluiert, wie sie auch zum Auf-

"JO lösen der Probe verwendet worden ist. Das Eluat wird bei 254 nm unter Verwendung eines. UV-Detektors von ISCO Modell UA-5 überwacht. Ausgewählte 27 ml Fraktionen werden bezüglich der Gegenwart des. Faktors· B durch' analytische Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit einer 4,6 χ 250 .ml Säule aus rostfreiem Stahl analysiert,. die mit 10 μ LiChrosorb RP-18 gefüllt ist (nämlich einem im Handel erhältlichen Umkehrphasensilicagel von E. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland).. Die Probe wird unter Verwendung einer Einspritzdüse von Rheodyne-Modell 7120 aufgege-

.20 beil.- Das Lösungsmittel ,.das .aus einem. Gemisch aus Wasser, Acetonitril und Dibutylamin (82:18:0, 03 Mol) besteht, welches mit Phosphorsäure auf pH: 2,5 eingestellt ist, wird unter einer Geschwindigkeit von 1 ml/min (52 bar) mit einer Constametric III Pumpe zugeführt (LDC-Laboratory Data Control, Division of Milton Roy Co., Riviera Beach, FL 33404, V.St.A.) . Der Faktor B wird bei 225 nm unter Ver- ' wendung- -eines·- UV-Detektors-mit veränderbarer Wellenlänge mit der Bezeichnung LDC Spectro Monitor' III festgestellt. Der am^:Faktor 3 reiche Teil .des aus der RP-8:Säule bei ggg T₃-^₃ -j 2 9 β ml kommenden- Eluats wird auf ein Volumen von 200 ml eingeengt. Das-Konzentrat wird auf ein Volumen von 500 ml verdünnt, mit Phosphorsäure auf'pH 2,0 eingestellt' und mit Natriumchlorid (1 mg/ml) als Ionenmarker versetzt. Die Lösung wird dann unter einer Geschwindigkeit von

^⁵ 20 ml/min auf eine mit 100 ml Diaion HP-2 0 Harz gefüllte Säule (2,8 x.2 2 cm) gegeben, die vorher mit Wasser äquilibriert worden ist. Die Säule wird solange mit Wasser' (500 ml) gewaschen, das mit wässriger Ameisensäure auf

j pH 2,5 eingestellt worden ist, bis sich im Waschwasser durch Fällung als Silberchlorid kein Chlorid mehr feststellen läßt. Die Säule wird dann mit 1 1 eines Gemisches aus Wasser und Acetonitril (6:4) bei einer Geschwindigkeit von 3 0 ml/min eluiert. Das Eluat wird unter verringertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wodurch man zu 295,6 mg rohem Faktor B gelangt.

Man löst 285 mg dieser Präparation unter Erwärmen in IQ 30 ml- eines Gemisches aus Dimethylformamid und Wasser (4:6), kühlt dann auf Raumtemperatur ab und stellt die Lösung schließlich in den Kühlschrank, wodurch der Faktor B ausfällt. Der Niederschlag wird durch Filtrieren gewonnen, mit Aceton gewaschen und unter Vakuum getrocknet, ' wodurch man 84 mg Faktor B erhält.

Das Antibiotikum -Α4-ΤΌ3Ό Faktor- 3- ist ein weißer -Feststoff mit folgender ungefährer Elementaranalyse: 58"> 54 ^: % Kohlenstoff, 4,21 % Wasserstoff, 8,63 % Stickstoff,.5,96 %-Chlor '. und - 22 ,66 '% Sauerstoff . Eine ieiektrdmetrisctie" Titration:, des : Faktors 3 .in einem Gemisch,, aus 66 · .·% Dimethylf örm'aviSi'd , uii<ä.-).:Wa-,s-s-€ir'i zeigt; .die .-Anwesenheit./ von".: zwei/ titrierbaren Gruppen' mit pK -Werten von etwa 5,6 und 7,5 und mit

a .

möglichen weiteren pK -Werten von über 10 (anfänglicher

pH-Wert = 6,22). Durch schnelle Atombombardierungsmassenspektrometrie ergibt sich ein Molekulargewicht von etwa 1197. Auf, Basis" der^; Elementaranalyse und des'i-beobachteten Molekulargewichts hat der Faktor B die empirische Formel

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A41030 Faktor B in einem KBr-Pellet geht aus Figur 2 der Zeichnung hervor. Darin lassen sich die folgenden unter-.; scheidbaren Absorptionsmaxima feststellen: 3448 bis 3226-(stark, breit), 1653 (stark), 1610 (mittel), 1587 (schwach), 1515 (stark) ,. .1488 (schwach), 1429 (mittel), 1290 (schwach) , 122 und 1010 (stark) cm

1290 (schwach) , 1227 (stark), 1139 (mittel) , 1 θ'64(stark)

— "J '

Va:;

J Die Ultraviolettabsorptionsmaxima von A41030 Faktor B in einem neutralen, sauren oder basischen Gemisch aus Methanol und Wasser (1:1) gehen aus der bereits erwähnten Tabelle V hervor.

Das Antibiotikum A41030 Faktor B ist in den gleichen Lösungsmitteln löslich wie der Faktor A.

Auf Basis der beobachteten physikalisch-chemischen Daten ]0 hat das Antibiotikum A4103 0 Faktor B folgende Struktur:

O=C

HO-C-CH

] Beispiel 5

Isolierung von A4103 0 Faktor C .

Man löst-9,0 g des Komplexes von A41030 in 200 ml eines Lösungsmittels aus Wasser, Acetonitril und Natriumchlorid (83:1*7:2 g/l) und filtriert die Lösung. Das Filtrat wird auf eine 8 χ 100 cm Säule aus rostfreiem Stahl gegeben, die mit 4 1 LP-I/C,,-, Umkehrphasensilicagel mit einer Korn-

Io

größe von TO bis 2 0 μ gefüllt ist, das nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Spezialverfahren „zubereitet worden ist. Die Säule, die Teil einer Chromatospac Prep-100 Einheit darstellt, wird bei einer Geschwindigkeit von 60 ml/min mit der gleichen Lösungsmittelkombination,, die auch zur Bildung der Lösung verwendet worden ist, eluiert, wobei Fraktionen-'von» jeweils^480 ml gesammelt -werden'. Das-: Eluat wird·bei 254 nm unter Verwendung eines UV-Detektors von ISCO Modell UA-5 überwacht. Ausgewählte Fraktionen werden bezüglich der Gegenwart des Faktors C durch analytische

2t>; HPLPLC. in eaner 0,8- χ 30'; cm Michel-Miller-Glassäule-änälysiert, die mit 25 bis ,40 μ LiChroprep: -RP-8·· gefüllt ist. Dä-sa lÖsungsTifittelV- ,näml'ichf'ein/ Geftisoh^aus^Wasser-, Aoetö.-:>' nitril und Natriumchlorid (84:16:2 g/l), wird in einer Geschwindigkeit von 4.ml/min mit. einer'FMI-Pumpe zugeführt..

Der Faktor C wird bei 254 nm unter Verwendung eines UV-Detektors von ISCO Modell UA-5 festgestellt. -Die Fraktionen -1 bis -.:einschließlich 27 werden verworfen. Die am Faktor C reichen Fraktionen . 28 bis einschließlich 52

werden vereinigt und unter verringertem Druck auf ein

30 volumen von 50 0 ml eingeengt..

Konzentrate aus zwei ähnlichen Reinigungen werden vereinigt, filtriert und mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min in eine mit 100 ml Diaion HP-2 0 Harz gefüllte 3~> Säule (2,8 χ 22 cm) gegeben, die vorher mit Wasser äquilibriert worden,; ist. Die Säule' wird solange mit Wasser (2 1) gewaschen, bis sich in der Waschflüssigkeit durch Fällung als Silberchlorid kein Chlorid mehr fest-

] stellen läßt. Dia Elution wird unter Verwendung von 1 1 eines Gemisches aus Wasser und Acetonitril (6:4) bei einer Geschwindigkeit von 15 ml/min durchgeführt. Das Eluat wird unter verringertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wodurch man zu 2,75 g eines durch den Faktor C-angereicherten Faktorengemisches gelangt. 1,25 g dieses Gemisches löst man in 25 ml eines Lösungsmittels aus Wasser, Acetonitril und Dibutylamin (80:20:0,03 Mol, wobei dieses Lösungsmittel vorher mit Phosphorsäure auf pH

}Q 7,8 eingestellt worden ist) unter Zusatz von Tetrabutylammoniumhydroxid, bis alles in Lösung gegangen ist. Die Probe wird auf eine 2,8 χ 59 cm Michel-Miller-Glassäule gegeben, die mit 25 bis 40 μ LiChroprep RP-8 gefüllt ist, und die Säule wird bei einer Geschwindigkeit von 4 ml/min unter Verwendung einer FMI-Pumpe mit der gleichen Lösungsmittelkombination eluiext, die auch zur. Bildung der Lösung verwendet worden ist. Das Eluat wird bei 254 nm unter Verwendung' eines- UV-Detektors von ISCO Modell UA-5" überwacht. Ausgewählte 28 rni Fraktionen- werden .bezüglich' der Gegenwart des Faktors-C durch analytische HPLC in einer 4,6- χ 150 ml Säule aus rostfreiem Stahl analysiert, die.mit 10 μ Mucleosil C₁₀ .gefüllt ist (ein im Handel er-

I O

hältliches Umkehrphasensiliciumdioxidgel, das von Rainin Instrument Co., Inc., Woburn, MA 01801, V.St.A, hergestellt wird)'. Die Probe wird unter Verwendung einer Einspritzdüse von Rheodyne Modeil 7120 aufgegeben. Das Lösungsmittel, das aus einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril und Natriumacetat (31:19:2 g/l) besteht, welches mit-Eisessig auf pH 6 eingestellt worden.-ist-, wird in

30 einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit einer Duplex

Minipumpe von Milton Roy zugeführt. Der Faktor C wird bei 2 25 nm unter Verwendung eines UV-Detektors mit variabler Wellenlänge von ISCO Modell 1800 festgestellt. Der von 4,2 bis 5,1 1 reichende Anteil des Eiuats, der' reich am

⁰^ Faktor C ist, wird :unter verringertem Druck auf ein

Volumen von 500 ml eingeengt. Konzentrate aus drei ähnlichen Reinigungen werden vereinigt und durch Zugabe von ' Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 1,7 eingestellt.

oh Mm -<öQ

] Natriumchlorid (1 mg/ml) wird als Ionenmarker zugesetzt. Die Probe wird mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/min auf eine mit 100 ml Diaion HP-20 Harz gefüllte Säule (2,8 χ 22 cm) gegeben, die vorher mit Wasser äquilibriert worden ist. Die Säule'wird solange mit wässriger Ameisensäure, von pH 2,5 (30 0 ml) gewaschen, bis in der Waschflüssigkeit durch Fällung als Silberchlorid kein Chlorid mehr feststellbar ist. Die Säule wird mit 1 1 eines Gemisches aus. Wasser und Acetonitril (5:4) bei einer Geschwin-

"10 digkeit von 30 ml/min eluiert. Das Eluat wird gesammelt, unter verringertem Druck eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zu 0,87 g teilweise gereinigtem Faktor C gelangt. Diese Präparation wird in 20 ml.eines Lösungsmittels aus einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril und Dibutylamin (80 : 20 : 0 , 03 Mol, wobei man dieses Lösungs-

mittel,, vorher, mit. Pho-sphorsciure',; auf,. pH. 7 , 8 eingestellt, hät)^: geigst., wob.ei man- solange Tetrabutylammoniumhydroxid.,, zugibt, bis alles in Lösung gegangen ist. Die Probe wird in einer mit LiChroprep RP-8 mit einer Korngröße von '25 bis 40 μ gefüllten Glassäule (2,8 χ 59 cm) von Michel-Miller der oben bereits.beschriebenen Art chromatographiert. Der von. 2>4 5,^: bis. 3->-2.Q. 1, reichende. Teil des Elua-cs wird rr.ter verringertem Druck auf ein Volumen von 500 ml eingeengt.

Konzentrate aus zwei ähnlichen Reinigungen werden ver- einigt und in der vorher bereits beschriebenen Weise auf einer .'Säule entsalzt, 'die Diaion HP-20 Harz enthält. Das Eluat wird unter verringertem Druck eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zu 688 mg Faktor C gelangt'. .

678 mg dieser Präparation löst man unter Erwärmen in 60 ml eines Gemisches aus Wasser und Acetonitril (6:4). Die Lösung-wird abgekühlt, wobei nach weiterem Kühlen in einem Kühlschrank der Faktor C .ausfällt. Der Niederschlag wird durch Filtrieren gewonnen, mit Aceton gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 4 28 mg Faktor C gelangt.

η α A,i η 7 -inin u. η !"; ι**/ O L ^l

Das Antibiotikum A41030 Faktor C ist ein weißer Feststoff mit folgender ungefährer .Elementaranalyse: 48,87 % Kohlen stoff, 4,39 % Wasserstoff, 6,16 % Stickstoff, 6,96 % Chlor und 33,81 % Sauerstoff. Eine elektrometrische Titra tion des Faktors C in einem Gemisch aus 66 % Dimethylform amid und Wasser zeigt die Anwesenheit von zwei titrierbaren Gruppen mit pK -Werten von etwa 5,5 und 7,1 und mit ~ a

möglichen weiteren pK -Werten von über 10 (anfänglicher

pH-Wert = 6,6). Unter Anwendung einer schnellen Atombombardierungsmassenspektrometrie ergibt sich ein Molekulargewichtvon etwa 139 3. Auf- Basis der Elementaranalyse und des beobachteten Molekulargewichts ergibt sich für den Faktor C die empirische Formel Cg₄H₅₄ClJu O .

'^ Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A41030 Faktor C in. einem KBr-Pellet geht aus' Figur 3 der Zeichnung hervor. Hierbei lassen .sich die folgenden unterscheidbaren Absorptionsmaxima feststellen: 3448 bis 3226 -,(stark-, breit), 1653 (stark), 1610 (mittel)/ 1587

'(schwach), 1 504/ (stark) , 1481 (schwach), 1429 (mittel), 1220 (stark), 1136 (stark), 1064 (schwach), 1053 (mittel) und 10Ö^:5 (stark) cm .

Die Ultraviolettabsorptionsmaxima von A41030 Faktor C

95 ·' '

in einem neutralen, sauren und basischen Gemisch aus Wasser und Methanol (1:1) gehen aus der oben bereits erwähnten Tabelle V hervor.

Das Antibiotikums A410 30 Faktor C ist- in' den gleichen

30 '

Lösungsmitteln wie der Faktor A löslich.

Auf Basis der beobachteten physikalisch-chemischen Daten ergibt sich für das Antibiotikum A41030 Faktor C folgend?

Struktur:

25

HOCH

Beispiel 6

30 35

Isolierung von A4103 0 Faktor D . •

Man löst 6,0 g des Komplexes von. A41.03 0 in 200 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser, Acetonitril und Natriumchlorid {83:70:2 g/l) und filtriert die Lösung. Das Filtrat wird auf eine 8 χ 100 cm Säule aus rostfreiem Stahl gegeben, die mit 4 1 LP-1/C..n ümkehrphasensiliciumdioxidgel mit einer Korngröße von 10 bis 20 μ gefüllt ist, welches nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Spezialverfahren zubereitet worden ist. Die' Säule, welche' Teil einer Chromatospac Prep-100 Einheit ist, wird mit einer Geschwin-

n a ism

digkeit von 60 ml/min mit der gleichen'Lösungsmittelkombination eluiert, wie sie auch zur'Herstellung.der Lösung verwendet worden ist, wobei Fraktionen mit jeweils 480 ml gesammelt werden. Das Eluat wird bei 254 nm unter Verwendung eines üV-Detektors von ISCO Modell UA-5 überwacht. Ausgewählte Fraktionen werden durch analytische

ι HPLPLC in einer 0,8 χ 30 cm Glassäule von Michel-Miller

bezüglich der Anwesenheit des Faktors D analysiert, die mit LiChroprep RP-8 mit einer Korngröße von 25 bis 4Ou.

gefüllt ist. Das Lösungsmittel, 'welches ein Gemisch aus Wasser, Acetonitril und Natriumchlorid (84:16:2 g/l) darstellt, wird mit einer FMI-Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min zugeführt. Der Faktor D wird bei '254 nm mit einem UV-Detektor von ISCO Modell UA-5 festgestellt. Die Fraktionen 1 bis einschließlich 34 werden verworfen. Die am Faktor D reichen Fraktionen 35' bis einschließlich 5 3 werden vereinigt und unter verringertem Druck auf ein Volumen von etwa 500 ml eingeengt.

Konzentrate aus zwei ähnlichen Reinigungen werden vereinigt, mit Wasser auf 3 1 verdünnt und mit einer Geschwindigkeit von 8 bis 10 ml/min auf eine mit 100 ml Diaion HP-20 Harz gefüllte Säule (2,8 χ 22 cm) aufgegeben, die vorher mit Wasser äquilibriert worden ist. Die Säule wird solange mit Wasser (300 ml) gewaschen, bis in der Waschflüssigkeit durch Fällung als Silberchlorid kein Chlorid mehr feststellbar ist. Die Elution wird mit 1 1 eines Lösungsmittels aus Wasser und Acetonitril (6:4) bei einer Geschwindigkeit von 8 bis 10 ml/min durchgeführt. Das Eluat wird unter.verringertem Druck konzentriert und lyo-

philisiert, wodurch man zu 2,33 g eines' durch den Faktor D angereicherten Faktorengemisches gelangt.

Man löst 1,15 g dieses Gemisches in 25 ml eines Lösungs- ^⁰ mitte!gemisches aus Wasser, Acetonitril.und Dibutylamin (80:20:0,03 Mol ., wobei dieses Lösungsmittel mit Phosphorsäure auf pH 7,8 eingestellt worden ist) unter solanger Zugabe von' Tetrabutylammoniumhydroxid, bis alles in

λ mi Q 7 1Q 3 3*07 72 4 G

] Lösung gegangen ist. Die Probe wird auf eine 2,8 χ 59 cm Glassäule von Michel-Miller gegeben, die mit LiChroprep RP-8 mit einer Korngröße von 25 bis 40 μ gefüllt ist, und die Säule wird bei einer Geschwindigkeit von 5.ml/min c unter Verwendung einer FMI-Pumpe mit der gleichen 'Lö- sungsniittelkombination eluiert, die auch zur Bildung der Lösung verwendet worden ist. Das Eluat wird bei 254 nm unter Verwendung eines UV-Detektors von ISCO Modell UA-5 überwacht. Ausgewählte 25 ml Fraktionen werden hinsicht-]Q lieh der Gegenwart des Faktors D durch analytische HPLC auf einer 4,6 χ 25 mm Säule aus rostfreiem Stahl analysiert, die mit LiChrosorb RP-18 mit einer Korngröße von ,-^ 10 μ gefüllt ist (hierbei handelt es sich um ein handelsübliches Umkehrphasensiliciumdioxidgel, das von E. Merck, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland, hergestellt wird). Die Probe wird unter Verwendung· einer-.: Injektionsdüse von . Rheodyne. Modell 7120 aufgebracht;. Das Lösungsmittel, das

aus einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril und Dibutylamin (80:20:0,03 Mol) besteht, welches mit Phosphorsäure aufpH 2,5 angesäuert ist, wird unter Verwendung einer Duplex Minipumpe;von Milton Roy mit einer Geschwindigkeit von 0,75,. ml/min.zugeführt. Der Faktor D. wird, bei_;. 2.2.5.:- nm, unter Verwendung eines UV-Detektors mit varieerbarerWellenlänge von ISCO Modell 1800 festgestellt. Der von 2,6 bis 3_?4 1 reichende Teil des Eluats, der reich am Faktor D ist, '. :' ; wird unter verringertem Druck auf ein Volumen von 300 ml eingeengt. .

Konzentrate aus drei ähnlichen Reinigungen werden vereinigt und durch Zugabe von Phosphorsäure bis zu einem pH-Wert von 7,7 gelöst. Natriumchlorid (1 mg/ml) wird als Ionenmarker zugesetzt. Die Probe wird mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/min auf eine mit 100 ml Diaion HP-20 Harz' gefüllte Säule (2,8 χ 22 cm) gegeben,- die vorher mit ^ Wasser äquilibriert worden ist. Die Säule wird solange mit Wasser' (300 ml) , das mit wässriger Ameisensäure auf pH 2,5 eingestellt ist, gewaschen, bis sich in der Wäschflüssigkeit durch Fällung als Silberchlorid kein Chlorid

mehr feststellen läßt-. Die Säule wird mit- 1 1 eines Gemisches aus Wasser und Acetonitril (6:4) bei einer Geschwindigkeit von 3 0 ml/min eluiert. Das Eluat wird' unter verringertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wodurch man zu 0,63 g teilweise gereinigtem Faktor D gelangt. Diese Präparation wird in 15 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser, Acetonitril und Dibutylamin (80:20:0,03 Mol, wobei dieses Lösungsmittelgemisch mit Phosphorsäure auf pH 7,8 eingestellt worden ist) gelöst, wobei Tetrabutylammonium-

•0 hydroxid zugesetzt wird, bis alles in Lösung gegangen ist. Die Lösung wird in der bereits oben beschriebenen Weise in einer 2,8 χ 5 9 cm Glassäule von Michel-Miller chromatographiert, die mit LiChroprep RP-8 mit einer Korngröße von 25 bis 40 μ gefüllt ist- Der von 2,5 bis 3,0 1 reichen-

'^ de Teil des Eluats wird unter verringertem Druck auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Das, Konzentrat wird in der bereits beschriebenen Weise in einer mit Diaion HP-20 Har2 gefüllten Säule'entsalzt. Das Eluat wird unter verringertemDruck konzentriert und lyophilisiert, wodurch man zu- 193 mg teilweise gereinigtem Faktor D gelangt,

Man löst einen Anteil von 259 mg aus-zwei vereinigten' teilgereinigten Präparationen von Faktor- D in 6 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Wasser, Acetonitril und zwei-

basischem Natriumphosphat (82:18:0,-03 Mol, wobei dieses Lösungsmittel mit Phosphorsäure auf pH 7,8 eingestellt worden -ist) und stellt die Lösung durch Zugabe von wässrigem 5n Natriumhydroxid, auf pH 10 ein. Die Lösung wird auf: eine 2,8 χ 59 cm Glassäule von Michel-Miller

30 .

gegeben, die mit LiChroprep RP-8 mit einer Korngröße von 25 bis 40 μ gefüllt ist, und die Säule wird bei einer Geschwindigkeit von 4 ml/min mit einer FMI-Pumpe mit der gleichen Lösungsmittelkombination eluiert, die auch zur Bildung der Lösung verwendet worden ist.- Das Eluat wird bei 254 nm· unter Verwendung eines UV-Detektors von ISCG Modell UA-5 überwacht. Ausgewählte 27 ml Fraktionen werden bezüglich der Anwesenheit des Faktors D durch analytische HPLC in einer 4,6 χ 150 mm Säule aus rostfreiem Stahl

Ή1Μ17 -IQAQ* 07''724R

] analysiert, die mit Nucleosil C₁₈ mit einer Korngröße von 10 μ gefüllt ist. Die Probe wird mit einer Einspritzdüse von Rheodyne Modell 7120 aufgegeben. Die gleiche Lösungsmittelkombination, die auch für die präparativs Elution verwendet wird, wird mit einer Duplex Minipumpe von Milton Roy mit einer Geschwindigkeit von 0,6 ml/min zugeführt. Der Faktor D .wird bei 225 nm unter Verwendung eines UV-Detektors mit varieerbarer Wellenlänge von ISCO Modell 1800 festgestellt. Der bei 405 bis 1134 ml kommen-

]Q de Teil des Eluats wird unter verringertem Druck auf ein Volumen von 500 ml eingeengt und in der bereits beschriebenen Weise auf einer mit Diaion HP-20 Harz gefüllten Säule entsalzt. Das Eluat wird unter verringertem Druck eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zu 120 mg Faktor

15 D gelangt.

Das Antibiotikum A41030 Faktor D ist ein weißer._:.amorpher, Feststoff mit folgender ungefährer Elementaranalyse: 54,46 % Kohlenstoff, 4,35% Wasserstoff, 7,58 % -Stickstoff, 4,27 % Chlor und 29,3 4 % Sauerstoff. Eine elektrometrische Titration des Faktors D in einem Gemisch .aus; 6,6. .1 Dimethylformamid und Wasser zeigt die Anwesenheit ,von zwei., titrierbaren Gruppen mit pK -Werten von etwa"'5,5 und 7,6 und mög- *" a -

liehen weiteren pK -Werten von über.10 {anfänglicher pH-

* a ~

Wert = 6,83)". Unter Anwendung einer schnellen Atombombardierungsmassenspektrometrie ergibt sich ein Molekulargewicht von.etwa 1326.

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A41030 Faktor' D in einem KBr-Pellet geht aus Figur 4 der Zeichnung „hervor. Darin lassen sich folgende, unterscheidbare Absorptionsmaxima beobachten: 3448 bis 3226 (stark, breit), 2959 (schwach), 1661 (schwach), 1592. (stark)', 1511 (stark), 142 9 (schwach), 129 0 (schwach), 12 27 (schwach), 1212 (mittel), 1163 (schwach), 1143 (schwach), 1053 (mittel) und 1010 (stark) cm" .

Die Uitraviolettabsorptionsmaxima von A41030 Faktor D in einem neutralen, wässrigen und basischen Gemisch aus Methanol und Wasser (1:1) gehen aus der bereits erwähnten Tabelle V hervor.

Das Antibiotikum A41030 Faktor D ist in den gleichen Lösungsmitteln wie der Faktor A löslich.

Auf Basis der beobachteten physikalisch-chemischen Daten dürfte das Antibiotikum A41030 Faktor D folgende Struktur haben:

wobei.noch ein oder mehrere n-Butylgruppen vorhanden sein dürften.

1 Beispiel 7

Isolierung von A41030 Faktor E

Man löst.0,3 g des Komplexes A41030 in 30 ml eines Lösungsmittels aus Wasser, Acetonitril und Natriumchlorid (85:15:2 g/l) und gibt die Lösung auf eine 2,8 χ 59 cm Glassäule von Michel-Miller, die mit LiChroprep RP-8 mit einer Korngröße von 25 bis 40 μ gefüllt ist. Die

]Q Elution der Säule erfolgt mit einer FMI-.Pumpe bei einer Geschwindigkeit von 12 ml/min (3,9 bar) mit der gleichen Lösungsmittelkombination, die auch zur Bildung der Lösung verwendet worden ist, wobei man Fraktionen von jeweils 2 4 ml auffängt. Das Eluat wird bei 254 nm mit einem UV-.

Detektor von ISCO Modell, ü-5 überwacht. Die Fraktionen 1 bis,, einschließlich . 5.4 werden verworfen. DieFraktibheri'. 55.·, bis einschließlich 122 ,-.die reich am Faktpr, E sind, werden -vereinigt und unter- verringertem Druck auf ein Volumen von 50 ml eingeengt. ' . _:

Konzentrate aus dreizehn, ,ähnlichen .Reinigungen., werden., vereinigt ,,mit Wasserlauf 1 , 5. μ verdünnt .und, mit eUaes,., Geschwindigkeit von 5. ml/min auf eine mit 100 ml Diaion HP-20 Harz gefüllte Säule (2,8 χ 22 cm) gegeben, die vorher mit Wasser äquilibriert worden ist. Die Säule wird solange mit Wasser (900 ml) gewaschen, bis in der Waschflüssigkeit durch Fällung als .Silberchlorid, kein Chlorid mehr feststellbar ist. Die Elution wird mit einem Gemisch aus Wasser und Methanol (1:1) unter einer Geschwindigkeit von 10 ml/min durchgeführt, wobei Fraktionen von jeweils 300 ml gesammelt werden. Die Fraktionen werden hinsichtlieh ihrer Aktivität gegenüber Bacillus subtilis analysiert. Die Fraktionen 1 bis einschließlich 8 werden vereinigt, unter verringertem Druck eingeengt und lyophili-

^ siert, wodurch man zu 1,04 g eines am Faktor E angereicherten Faktorengemisches gelangt. 0,5' g dieses Ge-. misches löst man in 10 ml eines Lösungsmittels· aus Wasser, Acetonitril und Natriumchlorid (84:14:2 g/l) und

] gibt die Lösung auf eine 2,8 χ 5 9 cm Glassäule von Michel-Miller, die mit LiChroprep RP-8 mit einer Korngröße von 25 bis ,4 0 μ gefüllt ist. Die Säule wird unter Verwendung einer FMI-Pumpe bei einer Geschwindigkeit von 5 ml/min mit der gleichen Lösungsmittelkombination eluiert, die auch zur Bildung der Lösung verwendet worden ist, wobei Fraktionen von jeweils 25 ml gesammelt werden. Das Eluat wird bei 254 nm unter Verwendung eines UV-Detektors von ISCO Modell UA-5 überwacht. Ausgewählte Fraktionen werden

}Q bezüglich der Anwesenheit des Faktors E durch analytische HPLC auf einer 4,6 χ 150 mm Säule aus rostfreiem Stahl analysiert, die mit ODS-Hyperkügelchen mit einer Größe von 5 μ gefüllt ist (Shandon Southern Products, Ltd., Cheshire, Großbritannien). Die Probe wird unter Verwendung . einer Einspritzdüse von Rheodyne Modell 712 0 aufgebracht. Das Lösungsmittel, das aus Wasser, Acetonitril und Natriumacetat (81:19:2 g/i) besteht und mit Eisessig auf pH 6 eingestellt ist, wird mit einer Duplex Minipumpe von Milton Roy mit einer Geschwindigkeit von 0,56 ml/min züge-· führt- Der Faktor Ξ wird bei 225 nm unter Verwendung eines UV-Detektors mit varüerbarer Wellenlänge von ISCO Modell 1800' festgestellt. Der von 1520 bis 1780 ml reichende 'Teil des Eluats wird unter verringertem Druck auf ein Volumen von 5 0 ml eingeengt. . .

Konzentrate aus drei ähnlichen Reinigungen werden vereinigt, mit Wasser auf 1 1 verdünnt und mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min auf eine mit J00 ml Diaion HP-20 Harz gefüllte Säule {2,8- χ 22 cm) gegeben, die vorher mit Wasser äquilibriert. worden ist. Die Säule wird solange mit Wasser (200 ml),das mit wässriger Ameisensäure auf pH 2,5 eingestellt ist, gewaschen, bis in der Waschflüssigkeit durch Fällung als Silberchlorid- kein Chlorid mehr feststellbar ist. Die Elution wird mit 0,5 1 eines Gemisches

ι·} Γ* .

aus Wasser und Acetonitril (6:4) bei einer Geschwindigkeit von 15 ml/min durchgeführt. Das Eluat wird unter verringertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wodurch man zu 202 mg teilgereinigtem Faktor Ξ gelangt. Diese

9i MiJ

Präparation wird in 4 ml eines Lösungsmittels aus Wasser, Acetonitril und Natriumchlorid (86:14:2 g/l) gelöst und die Lösung bei einer Geschwindigkeit von 4 ml/min in einer 2,8 χ 59 cm Glassäule von Michel-Miller eluiert, die in der bereits beschriebenen Weise, mit LiChroprep RP-8 mit einer Korngröße von 25 bis 40 μ gefüllt ist. Der von 2060 bis. 2480 ml reichende Teil des Eluats, der reich am Faktor E ist, wird unter verringertem Druck auf ein Volumen von 50 ml eingeengt. Konzentrate aus drei ähnliehen Reinigungen werden vereinigt, und in der bereits . beschriebenen'Weise in einer mit 100'ml Diaion ΉΡ-20 Harz gefüllten Säule entsalzt. Das Eluat wird unter verringertem Druck konzentriert und lyophilisiert, wodurch

.

man zu 242.mg Faktor E gelangt.

Das, Antibiotikum A41030', Faktor E ist ein;we*ißer. Feststoff .mit ,folgender,, ungefährer Element ar ana Iy se : 56 , 0 6..,.%> Kohlenstoff, 4,06 %'' Wasserstoff, 8,53 % Stickstoff, 3,50-%' Chlor und 27,85 % Sauerstoff. Eine elektrometrische Titration des Faktors E in einem Gemisch aus 66 % Dimethylformamid und Wasser zeigt die Anwesenheit ypn zwei t.itrierbareh Gruppen... mit., pK -Werten von., etwa 5-,8.. bis? 7,7 und,.

möglichen weiteren pK -Werten von über 1.0 (anfänglicher

~ a

pH-Wert = 6,57). Unter Anwendung einer schnellen Atombombardierungsmassenspektrometrie ergibt sich ein Molekulargewicht von etwa 1163. Der Faktor Ξ dürfte demnach die empirische Formel C-,-,Η. ,ClN₇O₁ _ haben..

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A41030

^vU Faktor E in einem KBr-Pellet geht aus Figur 5 der

Zeichnung hervor. Darin : lassen sich folgende unterscheidbare Absorptionsmaxima feststellen: 3448 bis 3226 (stark, breit), 1653 (stark), 1600 (mittel), 1504 (stark), 1429 (schwach), 1290 (schwach), 1198 (mittel), 1136 (schwach), ^⁵ 1.0.64 (schwach) und 1010 (stark) cm"¹.

0 Λ M0 7 HQOO * Π ~i-7

] Die Ultraviolettabsorptionsmaxima von A41030 'Faktor E in einem- neutralen, sauren und basischen. Gemisch aus Methanol und Wasser (1:1) gehen aus der.bereits erwähnten Tabelle V hervor. . .

Das Antibiotikum A41030 Faktor Ξ ist in den gleichen Lösungsmitteln löslich wie· der Faktor A.

'Auf Basis der beobachteten- physikalisch-chemischen Daten ergibt sich für das Antibiotikum A41030 Faktor Ξ folgende Struktur:

HO

91

1 Beispiel 8 '

Isolierung von A41030 Faktor F

Man löst 9,0 g des Komplexes A41030 in 200 ml eines Lösungsmittels aus Wasser, Acetonitril und Natriumchlorid (83:17:2 g/l) und filtriert die Lösung. Das Filtrat wird auf eine 8 χ 100 cm Säule aus rostfreiem Stahl gegeben, die mit 4 1 LP-1/C,_O Umkehrphasensiliciumdioxidgel mit

IQ einer Korngröße von 10 bis 20 μ gefüllt ist, das nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Spezialverfahren zubereitet worden ist. Die Säule, die Teil einer Chromatospac. Prep-100 Einheit ist, wird bei einer Geschwindigkeit von 60 ml/min mit der gleichen Lösungsmittelkombination eluiert,

]5 die auch zur Herstellung der Lösung verwendet worden ist,· * wobei Fraktionen mit jeweils 480 ml gesammelt werden. Das_: Eluat wird bei 254 nirr unter' Verwendung eines UV~ß.e_t:tektors von ISCO Modell UA-5 überwacht. Ausgewählte Fraktionen werden bezüglich der Gegenwart des Faktors F durch analytische HPLPLC in einer 0,8 χ 30 cm Glassäule von Michel-Miller analysiert, die mit LiChroprep RP-8 mit.._;einer_r Korngröße von 25 bis 40 μ gefüllt ist. Das aus meinem, Ge'm,isch,_: aus Wasser, Acetonitril und Natriumchlorid (84:16:2 g/l) bestehende Lösungsmittel wird mit einer FMI-Pumpe mit einer Geschwindigkeit' von 4 ml/min zugeführt. Der Faktor F wird · mit einem UV-Detektor von ISCO Modell UA-5 bei 254 run festgestellt'.' Die Fraktionen 1 bis einschließlich 25 werden verworfen. Die Fraktionen. 26 bis einschließlich 36, die reich am Faktor F sind, werden vereinigt und unter verringertem Druck auf ein Volumen von etwa 500 ml eingeengt.

Konzentrate aus drei ähnlichen Reinigungen werden vereinigt, filtriert und mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min auf eine mit 100 ml Diaion HP-20 Harz gefüllte Säule

nc '

° (2,8 χ 22 cm) gegeben, die vorher mit Wasser äquilibriert

] worden ist. Die Säule wird solange mit Wasser (900 ml) gewaschen, bis sich in der Waschflüssigkeit durch Fällung als Silberchlorid kein Chlorid mehr feststellen läßt. Die • El-ution wird unter Verwendung von 1 1 eines Gemisches aus Wasser und Acetonitril (6:4) bei einer Geschwindigkeit von 15 ml/min durchgeführt. Das Eluat wird unter .verringertem Druck eingeengt und-lyophilisiert, wodurch man zu 2,6 g teilgereinigtem Faktor F gelangt. Man löst 50 0 mg dieser Präparation in 10 ml eines Lösungsmittels aus Wasser, Acetonitril'und Natriumchlorid (84:16:2 g/l) unter Einstellung' des pH-Werts mit wässrigem Natriumhydroxid auf .7,0. Die Lösung wird auf eine 4,7 χ 45 cm Glassäule von Michel-Miller gegeben, die mit LiChroprep RP-18 mit einer Korngröße von 25 bis 40 μ gefüllt ist. Die Säule wird unter. Verwendung einer FMI-Pumpe bei einer Geschwindigkeit von 6 ml/min mit der. gleichen Lösungsmittelkoinbination eluiert, die auch zur Bildung der Lösung verwendet worden ist;, wobei Fraktionen' mit jeweils 24, ml aufgefangen werden. Das Eluat wird bei.254 nm mit einem UV-Detektor von ISCO Modell UA-5' überwacht. Ausgewählte Fraktionenwerden bezüglich der Anwesenheit des Faktors F'unter Verwendung eines analytischen HPLPLC-Systems der, bereits· beschriebenen Art analysiert'. Der von 1940 bis 2520 ml reichende Anteil des Eluats, der reich am Faktor F ist, wird unter- verringertem Druck auf .ein Volumen von etwa 300 ml eingeengt.

Konzentrate aus zwei ähnlichen Reinigungen werden vereinigt und- mit einer". Geschwindigkeit von 1 0 ml/min in eine mit 100 ml Diaion HP-20 Harz gefüllte Säule (2,8 χ 22 cm) gegeben, die vorher mit Wasser äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit Wasser (300 ml)., das mit Ameisensäure auf pH 2,5 eingestellt worden ist, solange gewaschen, bis in der Waschflüssigkeit durch Fällung als Silberchlorid

kein Chlorid mehr feststellbar ist. Die Elution wird unter Verwendung von 0,75 1 eines Gemisches aus" Wasser und Acetonitril (6:4) durchgeführt, Das Eluat wird unter verringertem Druck eingeengt und lyophilisiert, wodurch

] man zu 299 ing Faktor F gelangt.

Das Antibiotikum A41030 Faktor F ist ein weißer Feststoff mit folgender ungefährer Elementaranalyse: 51,39 % Koh-5-lenstoff, 3,96 % Wasserstoff, 6,45 % Chlor, 6,45 % Stickstoff und 28,65 % Sauerstoff. Eine elektrometrische Titration des Faktors F in einem Gemisch aus 66 % Dimethylformamid und Wasser ergibt die Anwesenheit von zwei titrierbaren Gruppen mit pK -Werten, von etwa 5,4 und 7,1

]Q und mit möglichen weiteren pK -Werten von über 10 (anfäng-

3.

licher pH-Wert = 5,93). Unter Anwendung einer schnellen Atombombardierungsmassenspektrometrie ergibt sich ein Molekulargewicht von etwa 1550. Der Faktor F dürfte demnach die empirische Formel C_,_nH_r ,Cl_N_0„_o haben.

/U b 4 j / Ao

Die..,Mölekulärgewichtswerte legen nahe, daß sich der'- Faktor F vom-Faktor A. durch zusätzliche Anwesenheit von „zwei. Zuckerresten unterscheidet, und ein ungerades Molekulargewicht weist darauf hin, daß kein Aminozucker vorhanden ist. ·

Daay Inf razpfc absorptions. Spektrum,, des , Antibiotikums., &4tO3G. Faktor F in einem KBr-Pellet geht aus Figur 6 der Zeichnung hervor. Darin lassen sich die folgenden unterscheidbaren Absorptionsmaxama feststellen: 3448 bis 3226 (stark, breit), 1653 (stark), 1600 . (mittel) , 1504 (stark), 1429 (schwäch), 1258 (schwach), 122 7 (stark), 1136 (stark), 1075 (stark), 1053 (stark) und 1010 (stark) cm"¹.

^O Die ültraviolettabsorptionsmaxima von A41030 Faktor F in einem neutralen, wässrigen und basischen Gemisch aus Methanol und Wasser (1:1) gehen aus der bereits erwähnten Tabelle V hervor.

¹^⁰ Das Antibiotikum A41030 Faktor F löst sich in den gleichen Lösungsmitteln wie dar Faktor A. . ..

η j i.im j λ η η . Λί-'ίΐη /. ί"

] Auf Basis der beobachteten physikalisch-chemischen Daten .wird dem Antibiotikum A41030 Faktor F folgende Struktur zugeordnet:

HO-C

HC-C:

>ο

6-

jj

y^e

_#/ ^XC! Ga I actosy I-^a 1 actcoe-CT⁷' S₈/ CH-

NHa'

Beispiel 9 Isolierung von A41030 Faktor G

Man löst 8 g des Komplexes A41030 von Beispiel 2 in 200 m] eines Lösungsmittels aus Wasser, Acetonitril und Natriumchlorid (84:16:2 g/l), und filtriert die Lösung. Das FiI-trat wird auf eine Säule aus rostfreiem Stahl (8 χ 100 cm) gegeben, die mit 4 1 LP-I/C₁₀ ümkehrphasensiliciumdioxidgel mit einer Korngröße von 10 bis 20 μ gefüllt ist, das nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Spezialverfahren zu-

] bereitet worden ist. Die Säule ist Teil einer Chroraatospac Prep-100 Einheit (siehe- Beispiel 3). Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/min mit einem Gemisch aus Wasser, Acetonitril und Natriumchlorid (84:16:2 g/l) eluiert, wobei man Fraktionen von jeweils 48 0 ml auffängt. Das Eluat wird bei 28 4 nm in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise überwacht. Ausgewählte Fraktionen werden bezüglich der Anwesenheit des Faktors G durch die in den vorherigen Beispielen bereits beschriebene analytische ]Q Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert.

Die Fraktionen 22 bis einschließlich 35, die reich am Faktor G sind, werden vereinigt und unter verringertem Druck auf ein Volumen von 500 ml eingeengt. Konzentrate .

aus drei ähnlichen Reinigungen werden vereinigt, mit wässrigem Natriumhydroxid auf ,pH'.. 8 , 5 eingestellt und/filtriert. Das Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit;/γ^αη, 10 ml/min auf eine mit 100 ml Diaion HP-20 Harz gefüllte Säule (2,8 χ 22 cm) gegeben, die vorher mit Wasser äquilibriert worden ist. Die Säule wird solange mit Wasser (400 ml, das mit Ameisensäure auf pH 2,5 eingestellt ist) gewaschen, bis sich ...in der,- Waschf lüssigkeit ,durch-.. Ausfällung als Silberchlorid'kein Chlorid mehr feststellen läßt. Die Elution wird unter Verwendung eines Gemisches aus Wasser und Acetonitril (6:4) bei' einer Geschwindigkeit von T5 ml/min durchgeführt, wobei Fraktionen von jeweils 1 1 gesammelt werden. Die' Fraktionen werden bezüglich ihrer Aktivität gegenüber Bacillus subtilis analysiert. Die Fraktionen werden vereinigt, unter verringertem Druck

¹^O eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zu 2,85 g Material gelangt. .

0,5 g dieses Materials löst man in 10 ml eines Lösungsmittelsaus Wasser, Acetonitril und Dibutylamin (80:20:0,03 ^O-J Mol, wobei dieses Lösungsmittel mit Phosphorsäure auf pH 7,8 eingesteltl worden ist) unter solanger Zugabe;von Dibutylamin, bis alles' in Lösung"' gegangen; ist (End-pH~ Wert = 8,2), Die Lösung wird auf eine 2,8 χ 59 cm HPLPLC

21MRL-1933*Ö772*3

Glassäule von Michel-Miller gegeben, die mit. LiChroprep RP-8 mit einer Korngröße von 25 bis 40 μ gefüllt ist (erhältlich von MC/B Manufacturing Chemists, Inc., Cincinnati, OH, V.St.Α.).

5 . ·

Unter Verwendung einer FMI-Pumpe eluiert man die Säule bei einer Geschwindigkeit von 4 ml/min mit der gleichen . Lösungsmittelkombination, die auch zur Bildung der Lösung verwendet worden ist- Das Eluat wird mit einem UV-Detektor von ISCO Modell'UA-5 bei 254 nm überwacht. Ausgewählte Fraktionen von 10 ml-werden-bezüglich der Anwesenheit des Faktors G durch das in den vorherigen Beispielen beschriebene analytische HPLC-Verfahren analysiert.

Die Fraktionen 54 bis einschließlich 74, die reich am Faktor G sindy' werden- mit Fraktionen aus zwei ähnlichen Reinigungen vereinigt und mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min . auf eine mit 100 ml Diaion HP-20 Harz gefüllte. Säule (2,8 χ 22.cm) gegeben, die vorher mit Wasser äqui-

libr.iert worden ist. Die Säule wird solange mit Wasser (300 ml-, das mit Ameisensäure auf pH 2,5 eingestellt ist) gewaschen >, bis-;.· sich- im- Waschwasser durch Fällung als--Silberchlorid kein Chlorid mehr feststellen läßt. Zur Elution verwendet man 0,75 1 eines Gemisches aus Wasser und Acetonitril (6:4). Das Eluat wird unter verringertem Druck eingeengt und lyophilisiert, wodurch man zu 960 mg Faktor G gelangt. '

Das Antibiotikum A41030 Faktor G ist ein weißer' Feststoff

mit folgender ungefährer Elementaranalyse: 50,02 % Kohlenstoff, 4,61 % Wasserstoff, 4,74 % Chlor, 6,11 % Stickstoff und 30,70 % Sauerstoff. Eine elektrometrische Titration des Faktors G in einem Gemisch aus 6 6 % Dimethylformamid und Wasser ergibt die Anwesenheit von titrierbaren Gruppen

35

mit pK -Werten'.von etwa 5,4 und 7,0 und mit möglichen, a

weiteren pK -Werten von über 10,5 (anfänglicher pH-Wert

.= 6,32). Durch schnelle Atombömbardierungsmassenspektrometrie ergibt sich ein Molekularcewicht von etwa 168^!4.

21

] Das Infrarotabsorptionsspektrum des Antibiotikums A41030 Faktor G in einem KBr-Pellet geht aus Figur 7 der Zeichnung hervor. Darin lassen sich die folgenden unterscheidbaren Absorptionsmaxima feststellen: 3320 (sehr breit, stark), 2975 (scharf, schwach), 2920 (scharf, schwach), 1659 (normal, stark), 1594 (breit, stark), 1512 (scharf, stark), 1492 (Schulter), 1430 (scharf, schwach), 1386 (breit, schwach), 1337 (breit, schwach), 1308 (scharf, schwach), 1264 (scharf, schwach), 1230 (breit, mittel), 1145 (breit, mittel), 1077 (scharf, mittel), 1062 (scharf , mittel) , 1014 (scharf, mittel) und 846 (breit, mittel) cm

Die Ultraviolettabsorptionsmaxima von A41030 Faktor G in einem neutralen, sauren und basischen Gemisch aus Methanol und Wasser (1:1) gehen-aus'der bereits erwähnten Tabelle V hervor.

Das Antibiotikum A41 030 Faktor.. G löst sich in den gleichen Lösungsmitteln wie der Faktor A.

Die Faktoren A, B, C,- D, E,, F und,:G- des .Antibiotikums A41030'können durch Dünnschichtchromatographie mittels Siliciumdioxidgel und Papierchromatographie abgetrennt und voneinander unterschieden werden. Für die Bioauto-

K^j. . graphie wird als Organismus Bacillus subtilis. verwendet.

Das Bewegungsverhältnis (Rx) , bezogen auf A41030 Faktor A, dem der Wert 1,00 zugeordnet wird, geht aus folgender Tabelle VI hervor. . .

: 30

35

.21^11983*077240

- 50 ] Tabelle VI

Rx

Lösungsmittelsystem Faktor A B

5 '

A . 1,00 1,00

B . 0,76 0,75

C 0,68 0,44

D 0,65 0,91

10 E 0,49 0,63

F 0,21 0,25

G 0,21 0,25

System A 15 Papier: Whatman Nr. 1 (unbehandelt)

Lösungsmittel: Mit einem- Gemisch aus Wasser: und-Methanol

(1:1) gesättigtes n-Bütanol.

System B .

20 Absorbens: Siliciumdioxidgel 60 von Merck-Darmstadt Lösungsmittel: Gemisch aus Acetonitril, Ethanol und

Wasser _; (8 : 1:1,5.)-.'·

Die Verweilzeiten von A4103 0 Faktoren A bis G im Hochleistungsflüssigkeitschromatogramm (HPLG) werden in einer Säule aus rostfreiem Stahl bestimmt, die mit LiChrosorb RP-18 mit einer Korngröße von 10 μ gefüllt ist, wobei ein Lösungsmittel aus Wasser, Acetonitril und Dibutylamin (82:18:0,03 Mol) verwendet wird, das mit Phosphorsäure auf pH 2,5 eingestellt ist. Das Lösungsmittel wird unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,75 ml/min aufgegeben Das Eluat wird durch UV-Absorption bei 225 nm überwacht. Die relativen Verweilzeiten, bei denen es sich um das Verhältnis, der Verweilzeit für jeden Faktor in Bezug auf die Verweilzeit von A41030 Faktor A handelt, gehen aus der folgenden Tabelle VIl hervor.

2imi333*in^;'?2

A B	6,4 4,1	19,2 12,3
C	5,4	16,2
D	3,8	11,4
Ξ	2,7	8,1
F '	4>5;	13,5
G	4,5	13,5

- 51 -

Tabelle VII

Faktor cm min relative Verweilzeiten

1,00 0,64 0,84 0,59

E 2,7. 8,1 0,42

0,70 0,70

Mehrere Faktoren des Antibiotikums A41030.sind amphoter, da_: sie sowohl,, eine- Am in ο gruppe als auch eins - Cajbonsäure- •fun-k.ti.pn enthalten,, und sie. können daher. Salze mit geeigneten Säuren oder Basen bilden. Die so gebildeten pharmazeutisch unbedenklichen Salze gehören ebenfalls zur

^z® Erfindung. Unter pharmazeutisch unbedenklichen Salzen werden Salze verstanden', die,; bei der Chemotherapie/warmblütiger* Tiere",ve'rw:en'det warden ^ könnend Zu repräsentativen und geeigneten Salzen der Faktoren A, 3, C, D, E, F und G von A4103 0 gehören die Säureadditionssalze, die durch

nc .

^ übliche. Reaktion sowohl mit organischen als auch anorganischen Säuren gebildet werden, wie beispielsweise mit Schwefelsäure¹, Phosphorsäure, Chlorwasserstoffsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Milchsäure,

-. Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholsäure, Pamoa-

säure,Muconsäure, D-Glutaminsäure, d-Kampfersäure, Glutarsäure, Glykolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzol— sulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure und ähnliche Säuren, sowie auch die Salze, die von

der Carbonsäurerunktion mit Basen gebildet werden, wie Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Calciumhydroxid, Kaiiurahydroxid, Trimethylamin, Ammoniumhydroxid, Diethanol und ähnliche Basen.

] Der Antibiotikum-Komplex A41030 und seine Faktoren - sind wirksam gegenüber grampositiven Mikroorganismen unter Einschluß von Staphylococcen und Streptococcen. Weiter erhöhen diese Antibiotika das Wachstum und die Futteraus-

5 beute bei Geflügel, Schweinen und Rindern.

Die Wirksamkeit des Antibiotikum-Komplexes A41030 und seiner, einzelnen Faktoren zeigt sich an einer Reihe von Untersuchungen, die im folgenden beschrieben werden. ζ.

Beispiel 1 Q

Herstellung einer Probe für einen Bioversuch und quantitative Analyse von A41030 Faktor A in einer getrockneten

Gesamtbrühe^; _: ,

Zur Herstellung von 31,5 g getrockneter Gesamtbrühe wird 1 1 Gesamtbrühe auf ein Volumen von 200 ml eingeengt und lyophilisiert. 400 mg der getrockneten Gesamtbrühe extrahiert man dreimal mit jeweils 10 ml Wasser bei pH 8,5. Die Extrakte'Werdeia, vereinigt und-'auf ein Volumen von' TO ml eingeengt, wobei man Anteile dieses Konzentrats für Biountersuchungen verwendet. Der turbidimetrische Versuch wird in einem halbautomatischen System (Autoturb - mikrobiologisches Untersuchungssystem, Elanco) durchgeführt, das in J. Pharmaceut.. 'Sei. 60 (5) , 764 und 767 (1971) beschrieben ist. Für die Untersuchung des Komplexes A41030

verwendet man folgende - Versuchsparameter:' Staphylococcus on

aureus ATTC 9144 in einem Nährbrühemedium (pH 7), das vier Stunden bei 37°C bebrütet wird. Die Versuchsproben und der Standard werden, in einem Gemisch aus Methanol und Wasser' (1:1) gelöst. Der Standard, nämlich A410-30. Faktor A, wird in das Autoturb-Karussel in Konzentrationen von 0,4, 0,6, 0,9, 1,2. und 1,5 μg/ml vorgelegt.

η λ mi

1 nil des obigen Konzentrats wird unter Anwendung des folgenden Verfahrens gereinigt und dann zur Analyse durch HPLC verwendet. -

(a) Man wäscht eine C-18 SEP-PAK-Patrone (Siliciumdioxidgel-Patrone, Waters Associates, Inc.. ,. MiIford, Massachusetts, V.St.A.) mit 10 ml Methanol unter Verwendung einer 10 ml Spritze mit einer Luer-Fassung bekannter Art.

(b.) Man wäscht die gleiche Patrone mit 10 ml Wasser.

(c) Man gibt auf die Patrone mit einer Geschwindigkeit von etwa 1 ml/min 1 ml des obigen Konzentrats auf.

. .

(d) Man wäscht die Patrone mit 1 ml- Wasser :und 'blast, die Patrone trocken.

.(e) Man eluiert die Patrone mit 1 ml einer Lösung aus Tetrahydrofuran und Wasser (1:1) mit einer Geschwindigkeit .von etwa 0,5 ml/min.

(f) Man entfernt das Tetrahydrofuran vom Eluat unter Vakuum oder wahlweise auch unter einem Stickstoffstrom und rekonstituiert das Eluat mit Wasser auf ein Volumen von 1 ml.

(g) .Man analysiert die Lösung durch HPLC in der oben

beschriebenen Weise. 30

Die bei den obigen Versuchen zur Ermittlung der biologischen Aktivität und bei der Analyse durch HPLC der Gesamtbrühe erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden

Tabelle VIII hervor. 35

OH «rt 0 7 Λ Q Q Q * Pi O ^;Ί Ό L Π.

OJ GO RS KD —' —'

Oi O Ol O Oi O Oi

Tabelle VIII Biologische Aktivität und HPLC Analyse von A41030A in der Gesamtbrühe

Konzentrat von Gesamtgewicht Gesamtgewicht % an Probe Nr. Gewicht A41030A" an Aktivität* an A41030A A41030A~

1 106,8 kg 4,42 mg/g

2 146,5 kg 10,8 mg/g

* Gesamte biologische Aktivität von A41040 Faktoren A, B, C, D, E, F und G.

491	g	472	g	96	,1
1685	g	1582	g	93	,9

_i. Bestimmt durch HPLC.

- 5b 1 Agar-Verdünnungsversuch

Zur Bestimmung der Werte für die minimalen. Hernmkonzentrationen (MIC-Werte) verwendet man das von der International Collaborative Studiengruppe (ICS) beschriebene Agar-Verdünnungsverfahren.

Die bei Untersuchungen des Antibiotikums A4103 0 Faktor A im Agar-Verdünnungsversuch erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle IX hervor.

Tabelle IX 15 Wirksamkeit von A41030 Faktor A

Versuchsorganismus |ig/ml_:.

Staphylococcus aureus 3055* ^-0,5

20 Staphylococcus aureus 3074** 4.0-, 5

Streptococcus faecalis Χββ <10,5

* Empfindlich gegenüber Benzylpenicillin ** Resistent gegenüber Benzylpenicillin 25

Seheiben-Platten-Empfindlichkeitsverfahren

Es. werden mit dem jeweiligen Versuchsorganismus inokulierte Agarplatten verwendet. 6 mm große Scheiben (Fassungsvermögen 0,0 2 ml) werden mit Log 2 Verdünnungen der antibiotischen Lösungen gesättigt. Der Gehalt der Scheiben entspricht einem Fünftel oder einem Fünfzigstel der Konzentration der verwendeten Lösung, so daß, sich unter

^OJ Verwendung einer Lösung mit einer Konzentration von 500 mg/ml ein Scheibengehalt von 100 mg oder 10 mg ergibt. Die Größe der durch das Antibiotikum A41030 Faktor A bei jedem Scheibengehalt erzeugten Hemmzone geht aus der

n-t !i(n π α .2 Q * Π '7 '·Ί 9 4 P,

- 56 ] folgenden Tabelle X hervor.

Tabelle X Wirksamkeit von .A41030 Faktor A

Versuchsorganismus Zonendurchmesser (rom)

(bei μg/Scheibe) _100 10

Staphylococcus aureus 3055* Staphylococcus aureus 3074** Staphylococcus aureus 3130*** Streptococcus pyogenes C203

Streptococcus sp. (Gruppe D) 99 60 Streptococcus pneümoniae' Park I,17,0 Escherichia coli EC14

* Empfindlich gegenüber Benzylpenicillin 20 ** Resistant gegenüber Benzylpenicillin.

*** Resistant gegenüber Benzylpenicillin und

reslstent/gegenüber Methicillin'

Das Antibiotikum A41030 Faktor A zeigt aufgrund einer 25 Bestimmung durch die Agar-Verdünnungsmethode eine Wirksamkeit gegenüber einer Reihe von Stämmen von Hemophilus influenzae. Die- Ergebnisse 'dieser Untersuchungen gehen aus der folgenden Tabelle XI hervor.

20,8	17,2
19,8	16,7
21 ,4	17,4
15,0	12,0
20,5	16,4
,' 17,0 .	15,0
8,0	0

. Tabelle XI

Wirksamkeit von A41030 Faktor A gegenüber Stämmen von Hemophilus influenzae ____^

Hemophilus influenzae MIC-Werte

R251 T₆

..R272 ₁₆

R274 . ₁₆

4842 . ₈

75-90383 ' -[c

¹⁶

P. wylie _1S

G* Newton 3 2

Bruno ' ]_g

75-19300 . · ' ₁₆

^S· ^Ford ' 16

A. Sail. , _1β

C. S^rt-e^?e l'i' iß,,

Miller ]_g

Howard ' 16

75-312 ' ₈-

75-313 ig

75-364 _l6

75-465 32

] Das Antibiotikum A 41030 Faktor A ist aufgrund einer

Bestimmung durch die Agar-Verdünnungsmethode auch gegen- über Arten von Neisseria wirksam. Die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle XII hervor.

Tabelle XII

Wirksamkeit von A41030 Faktor A gegenüber Arten von Neisseria .

Neisseria-Art en MIC-Werte (iig/ml)

L. Nance 4,0

Woods 4,0

15 Schultz 8,0

Mitchell 4,0.

Sanders 1,0

Die-'Wirksamkeit des Antibiotikums' A4 1030 Faktor A gegenüber einer Reihe von Bakterien, bestimmt durch die Agar-Verdünnungsmethode, geht aus der folgenden.-Tabelle· XIII hervor.

25 ' ' Tabelle XIII

Wirksamkeit von- A41030 Faktor A gegenüber einer Reihe von-Bakterien ·. '

Bakterien · MIC-Werte (,ug/ml)

Staphylococcus aureus

30 55 0,13

3074* _ 0,06

3131** __0.,0 6

35 ₃₁₃4** _0_Λ0β

H43 . , ^0,06

V57* . 0-0,06

H290 _.0,06

(Fortsetzung) Bakterien . MIC-Werte

Streptococcus pyogenes 0,25

C203 0,25

9943 0,25

10389 0,5

12344 0,25 M-6517

Streptococcus pneumoniae

Park I 0,25

Typ 14 0,25

2764 0,25

6301 · . ' 0,25

BI-343. 0,25

Staphylococcus epiderinidis

Litton 0,13

Mencher., —0,06

Britton- . 0,13

Mobley £.0,06

Viridans streptococcus -

SM-1134 0,5

SSI-910 - · 0,25.

SSII-895 0,25

streptococcus-Arten (Gruppe D)

238 0,25

282 0,25

9901 0,25

12253F 0,25

Guze . 0,25

- bU -

Tabelle XIII (Fortsetzung)

Bakterien

5 Shigella flexneri SH-3 .SH-4

MIC-Werte

128

* Resistent gegenüber Penicillin'

IQ ** Resistent gegenüber Penicillin, Methicillin und. Erythromycin

Die Antibiotika A41030 Faktoren A, B und C sind auch wirksam gegenüber einer Art an anaeroben Bakterien, bei denen ]5 es sich um Arten von Bacteroides handelt, wie sich anhand von MIC-Werten ergibt, die über' eine Zeitdauer von 24 Stunden ,nach der Agar-Verdünnurigsmethode.,.bestimmt wurden und aus der folgenden Tabelle XIV hervorgehenO

30 35

211^11983*077240

Tabelle XIV

Wirksamkeit von A41030 Faktoren gegenüber Bacteroid.es-Arten

Versuchsorganismus MIC-Werte fug/ml)

—

EL_ fragilis 1877 B. fragilis 10 3 Ek₁ , fragilis 104 >. fragilis 106 B^ fragilis 107 B. fragilis 108 JL fragilis 110 B." fragilis IH;; 3_. fragiiis" .112' EL: fragilis- 113

JL· fragi

1451

1470

B. fragilis ;,:2" HL· fragilis 9 B. fracrilis 9032

£i

B. : corrodens 187

B. vulgatis 1563

B. thetaioraomicron 143

B. thetaiotaomicron 1900Ä

A	B	C
32	32	32
32	. 32	32
32	3 2	32
64	32	32
32	32	32
32	32	64
64	6 4	64
3 2;;	3 2:/	32 '
6 4	32'	3 2
32	32	32
6 4	64.;	64
64	.6 4..	64
"64"	3 2	32
64	3^:	3.2;..
64	32	32 .
32	32	32
32	32	32
6 4	32	32
128 '	128	123

21 ^11933*07-7 2 4 G

1 Die Faktoren·A, B und C des Antibiotikums A41030 haben sich aufgrund entsprechender Untersuchungen auch gegenüber einer Art an anaeroben Bakterien als wirksam erwiesen, nämlich gegenüber Propionibacterium acnes. Die durch die

2 Agar-Verdünnungsmethode nach 2 4 Stunden ermittelten MIC-Werte gehen aus der folgenden Tabelle XV hervor.

Tabelle XV

] ο,Wirksamkeit von A41Q30 Faktoren gegenüber Propionibacterium . ' acnes — '.· '^: . ; . ' , ....... "

Stamm von Propionibacterium acnes .

44

7 9' 101 103 "⁴. -·

105

106 107" 5292 ⁵¹⁷⁰

5176

5187 5191

5197 10.03 0.06 10.03

30 ⁵²²⁶ -0.5 0.5 0,125

5227 10.03 0.06 0.G6

522S 1.0 0.5 1.0

5229 0.5 0.25 0.5

5246 0.06 0.125 0.06

35 "

	MIC-Werte (	A	E	06	0.	μg/ml)
	.125	0.	06	0.	C
0	.125'	0.	06	0,	125
0	.125'	G.	06	0.	125';
.0	. 125	0.	25	0.	125"
0	.25	0.	0 6	Ö.	125
0	.125	0.	0 6'	0.	25.
0	. 125 '	0.	06	0.	125
0	.06.	ο.	06	0.	125
0	.06	0.	03	10-	125
0	.03 :	LO.	06	10.	06
10.	.03	0.	06	0.
10	.03	0.	06	0.	03
10	.125 .	0.		06
0		125

i NlRy

] Die Faktoren A, B, C, D, E, F und G das Antibiotikums A41030 haben sich bei entsprechenden Untersuchungen auch gegenüber einer Reihe anaerober Bakterien als wirksam erwiesen, wie die in der folgenden Tabelle XVI angegebenen und durch die Agar-Verdünnungsmethode ermittelten MIC-Werte zeigen.

U) tO K) Η⁴ V-»

ο- cn ο υι ο cn

Tabelle XVI

Wirksamkeit von Ä41030 Faktoren gegenüber anaeroben Bakterien

MIC-Werte· (ng/ml) Versuchsorganismus

Clostridium difficile 2994

Clostridium perfringens 81

Clostridium septicum 1128

Eubacterium aerofaciens 1235

Peptococcus asaccharolyticus 1302

Peptococcus prevoti 1201

Peptostreptococcus anaerobius 1428

Peptostreptococeus intermedius 1264

Propionibacterium acnes 79

ßact-eroides fragilis 111

Bacteroides fragilis 1877

Bacteroides" fragilis 1936B

Bacteroides thetaiotaomicron 1438

Bacteroides roelaninogenicus 1856/20 > ο Bacteroides ine lan i nogenicus 2736

L, Bacteroides vulgatis 1211

corrodens 1874

O Fiisobacterium symbiosum 1470

f" r*usobacterium necropliorum 6054A

A	B	C	D	E	F	G	I
32	32	16	0.5	0.5	1.0	2	ifc-
0.5	0.5	1.0	0.5	1.0	1.0	2	I
2	4	8	0.25	0.5	1.0	2
> 128 >	128	> 128 .	0.5	0.5	1.0	2
1 0.125	< 0.25	i °·25	< 0.125	<_0.25	<^ 0.25	1.0 .
< 0.25	'<_ 0.25	< 0.25	0.25	32	32	2
<_ 0.25	1 °·25	< 0.25	0.5	32	32	< 0.5
1.0	0.5	0.5	1.0	32	1.0	2
<^ 0.25	16	< 0.25	0.25	0.5	1.0	1.0
128	64	> 128	32	64	32	32
32	32	16	32	32	32	32
64	32	32	32	64	32	64
64	32	64	32	64	64	64
> 128 >	128	> 128	>64	>128	>128	>128
4	4	4	0.5	32	1.0	64
32	32	32	32	32	32	64
64	64	32	32	64	32	32
1,0	1.0	1.0	0.5	1.0	1.0	2
8	8	16	< 0.125	0.5	1.0	2

1 Die Faktoren A, B und C des Antibiotikums A41030 haben sich auch gegenüber einer Reihe von Vertretern aus zwei Arten anaerober Coccen als wirksam erwiesen, nämlich gegenüber Peptococcus und Peptostreptococcus. Die durch die

5 Agar-Verdünnungsmethode hierbei ermittelten MIC-Werte gehen aus der folgenden Tabelle XVII hervor.

10

15

20

25

30

35

21MRl1983*0?724tö

Ui O

tv)

K3 O

Ui

Tabelle XVIl

Wirksamkeit von. A41030 Faktoren gegenüber Peptococcus-und Peptostreptococcus-Ärten

MIC-Werte (μg/rαl)

Versuchsorganismus Pc. asaccharolyticus 1302 Po^ asaccharolyticus 1344 Pc. constellat.ua 1468 Pc. magnus 1401 Pc. magnus 1421 Pc. magnus 1477 Pc. prevoti 1281 Pc. ßrevoti 1293 Pc. prevoti 1407

2 Ps. anaerobivis 8

Ps. anaerohius 52 Ps. anaerobius 59 Ps. anaerobius 1418 Ps. anaerobius 1451 Ps^ anaero))ius 1428 Ps^ anaerobius 1477 B 1264

Ps. inhertnedj.us 1524 Ps. intermedius 1624

_c -~ Peptococcus Ps ~ Peptostreptoccx^cus

Λ _	B	C
< 0.03	0.125	0.125
0.5	0.5	1.0
0.5	0.5	0.5
0.125	0.125	0.25
0.125	0.125	0.25
0.5	0.25	0.5
0.5	0.5	1.0
1.0	0.25	0.5
1.0	0.5	1.0
0.5	0.25	0.5
0.5	0.5	0.25
0.5 .	0.25	0.25
< 0.03	0.06	< 0.03
0.5	0.25	0.25
0.5	0.25	0.25
0.5	0.125	0.25
0.03 <	0.03	<_ 0.03
0.5	0.25	0.5
1.0	0.5	1.0

— οι—.

Die Faktoren A, B, C, D, E, F und G des Antibiotikums A41030 sind auch wirksam gegenüber einer Anzahl an Stämmen von Clostridium difficile, und die bei entsprechenden Agar-Verdünnungsversuchen erhaltenen Ergebnisse gehen

2 aus der folgenden Tabelle XVIII hervor.

Tabelle XVIII

Wirksamkeit von A41030 Faktoren gegenüber Stämmen von

Clostridium difficile , .

10 -.'

Clostridium MIC-Werte (iig/ml)

difficile

A B C DE F G 15

8484	.1.0	1.0	1.	0	10.25	9«	5	1.	0	1.0
6890	1-0	1.0	2		0.5	0.	5:.	1.	0	1.0
2634	1.0	1.0	2		0.5	1.	0 '	2		1-0
78	1.0	0.5	1.	0	10.25	0.	5	1.	0	1.0
A-194	i.o	• l.o	2		10.2 5	0.	5	1.	σ	1.0
A-195	1.0	1.0	1.	0	10.2 5	0.	5	1.	0	1.0
	1.0	1.0	2		0.5	1.	0	2		1.0
K-21 ^ -	1.0	1.0	2		10.25;,	o'..	.5 ,.	1.	0	1.0
A-280	1.0	0.5	1.	0	10.25	0,	5	1.	0	1.0
A-281	1.0	1.0	2		0.5	T -L .	0	2		1.0
WAL-2112	1.0	1.0	2		10.25	0.	—1	1.	0	1.0
WAL-3 6-5 7	1.0	1.0	2		10.25	0.	5	1.	0	1.0
WAL-4 2 68	1.0	0.5	1.	0	10.25	0.	5	1.	0	1.0
107B	1.0	0.5	1.	0	10 . 25	0.	5	1.	.0	1.0
HlF	1.0	1.0	2		10,25	0,	5			1.0
1153	1.0	1..0	' 2		1.0	1.	0.	2		1.0
3424-53	1.0	1.0	1.	0	0.5	0.	5		0	1.0
3816	l.o	1.0	2		0.5	0.	5	1,	0	1.0
3950D	1.0	1.0	2		0.5	η	5	T X .	0	1.0

21«1833*07724'G

. - 68 -

] Die Faktoren A, B₇ C₇ D, Έ, F und G. des Antibiotikums A41030 haben sich in vitro auch als wirksam gegenüber einer Anzahl aerober Bakterien erwiesen, und die bei üblichen Agar-Verdünnungsversuchen nach 2 4 Stunden erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle XIX hervor.

21NIRl19d3*ü^l7'72i3

OJ K> Kl H* . . »-*

o Un ο in ο cn

Tabelle' XIX Wirksamkeit von A41030 Faktoren gegenüber: aeroben Bakterien

' ^: MIC-Werte. (ug/ml)

Versuchsorganismus a B

•.-Staphylococcus aureus 3055 0.125 0.125

Staphylococcus aureus V41 0.125 0.125

Staphylococcus aureus X400 0.5 0.25

Staphylococcus aureus S13E 0.25 0.125

Staphylococcus epidermidis EPIl 0.125 0.125

Staphylococcus epidermidis EPI2 1 0.5

Streptococcus pyogenes C203 0.5 0.25

Streptococcus pneunoniae Park I 0.5 0.5

?Streptococcus sjx_ Group D X66 1 1

Streptococcus sp. Group D 9960 2 1

HaeuYDphi lus influenzae Drun 8 8 ilb — —

-j- ilaemophilus influenzae 251 2 2 ^4

So Haeinophilus influenzae CL. ·— —— . — 8 8

r—' :—^:——j-——— — ——————-—-

co jHaemophilus influenzae 76 — — — 8 8 co

D	E	F	5	G	I (Ti
0.25	0.125	0.	5	0.5
0.25	0.25	0.		1
0.25	0.25	1.		2
0.25	0.25	1	25	1
0.25	0.25	0.		0.5
1	2	2		0.5
0.5	0.25	2		2
0.5	0.25	2		2
1 1	1 1	4 4	4 4

⁰³ >Shiqella sonnei IM9 >128 128 > Ϊ28 > 128 > 128

X- ^Escherichia coll NlO >128 128 · > 128 > 128 > 128

—] Escherichia coli BCI4 ' 128 128 ' > 128 > 128 >128

iC Esclierichia coil· TEM >128-- 42Ski > 128 64 > 128

^' Klebsiel la pneuimniae X26 >128 > 128 > .128 128 > .128

CO .· "" ·' -· " ,; '"'·

Leila )>neumoniae KAE >128 χ 128; > 128 > 128 > 128

32	32
32	32
> 128	>128
> 128	>12ß
> 128	>128
> 128	>128
> 128	64
> 128	> 128

bJ

K) Ln

K) O

Ve r such sorgani sinus Klebsiella pneumonias X68 Enterobacter aerogenes C32 Enterobacter aerogenes FBI? Enterobacter cloacae EB 5 Enterotoacter cloacae 265A Salironella

X514

Salmonella typhi 1335 Pseudoinonas aeruginosa X528 Pseudomonas aeruginosa X239 Pseudononas aeruginosa Ps18 Pseudanonas aeruginosa Ps72 Serratia marcescens_ X99 Serratia marcescens SE3. Proteus roorganii PRl5

s PR33

Proteus rettqeri PR7 Probeus £2ttcjeri_ C24 Citrobacter freundii CF17 Borde I: el la bronchiseptica Acinetobacter caleoacetious 2\C12

	Tabelle	XIX (FOi
Λ	B	C
128	128	. > 128
128	64	>128
128	>128	>128
128	128	>128
128	128	> 128
128	>128	>128
128	>128	> 128
128	>128	> 128
128	> 1.28	> 128
128	>128	> 128
128	128	> 128
128	>128	> 128
128	> 128	> 128
128	> 128	> 128
128	> 128	> *Ϊ28
128	> 128	> 128
128	128	> 128
128	> 128	> 128

>128	> 128	> 128	>128	ι
>128	> 128	> 128	. >128	ο
>128	> 128	> 128	>128	ι
> 128	> 128	> 128	>128
> 128	> 128	- > 128	>128
> 128	> 128	> 128	>128
> 128	> 128	> 128	>128
> 128	> 128	> 128	>128
> 128	> 128	> 128	>128
> 128	> 128	> 128	> 120
> 128	> 128	> 128	>128
> 128	> 120	> 128	>128
> 128	> 128	> 128	> 128
> 128	> 128	> 128	> 128
> 120	> 128	> 128	> 128
> 128	> 128	> 128	> 128
> 128	> 128	> 128	> 128

> 128

> 128

> 128

> 128

nicht untersucht

] Die Faktoren A und B des Antibiotikums A41030 haben sich in vitro auch als wirksam gegenüber einer Anzahl^;typischer aerober grampositiver- Bakterien erwiesen, zu denen auch Streptococcen aus der Gruppe D gehören, und die unter An-Wendung üblicher Agar-Verdünnungsversuche nach 2 4 Stunden erhaltenen Ergebnisse gehen aus. Tabelle XX hervor.

Tabelle XX

Wirksamkeit von A41030 Faktoren A und Bgegenüber aeroben Bakterien ' ' -^r'' ^:; -.;,.' ;.. . ..,.." .-/w-, - Λ. ' ' '

Versuchsorganismus

MIC-Werte (nq/ml)

a'ureus

StsOhvlococcus emaerraicis

285 219 269

Streptococcus pyrogenes C2C3 Streptococcus· sp / ATCC 10389 Streptococcus . sp . Gruppe 3

14

0.	125
o«	06
0.	125
V.	125
Q-.	123
0.	06
0.	06
0.	06
0.	06
0.	25
0,	12 5
1
0.	0 6

0	. 06 :
Ö;	. 12S
0	.06
0	.. 125
0	,125:
G	. 1'2S
0	.06.
0	.03
0	.0.3
0	.03
0	.125
0	.25

0.125

Versuchsorganismus Tabelle XX (Fortsetzung) MIC-Werte

Streptococcus sp. Gruppe D

X66 9960 2041 8043 9901 12253F. Mx'161 2053

Streptococcus pneumoniae Park I Streptococcus pneumoniae Bl-438 Haemophilus parainfluenzae 7901 Haemophilus parainfluenzae 97 9 Haemophilus influenzae CL.

Mx371

Bond 16836 4842

312

0.25	0.25
0.5	0.5
0.5	0.5
0.25	0.25
1	1
0.25	0.5
0.25	0.25
0.5	0.5
0.125	0.125
0.25	0.5
16	16
16	16
4	S
2	. 4
2	4
4	4
2	4
4	4
2	4
2	4

2181Rl 1933 "

7T 2*3-

Die Wirksamkeit des Antibiotikum-Komplexes A41030 gegenüber einer Anzahl, von Krankheitserregern bei Tieren wird ermittelt durch einen üblichen in vitro durchgeführten Mikrotiterversuch mit einer antimikrobiellen Brühe, und • 5 die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle XXI hervor.

Tabelle XXI

Wirksamkeit von A41030-Komplex gegenüber mehreren Krankheitserregern von Tieren

\ ··.· .' · VersuchsOrganismus	MIC-Werte (ug/ml)	)	< 0	.73
Staphylococcus sp. 1130			< 0	.'78'1
Streptococcus . sa. 80		( Schweizer)	3	.12'
Pasteürella' mültocida {Rind		6	.25
Pasteurella hemolvtica		50	..00 .
Bordetella bronchiseptica		50	.00'
Escherichia coli		50"	-0Ö'
Mycop1asma svnoviae		50	.00
.MvcoD'lasisa - hvorhinis~	< 0	.78
Pseüdomonas -Fisch	50	.00
Aeromonas licuefaciens

Alle untersuchten Faktoren des Antibiotikums A41030. .zeigen· in vivo eine antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber experi-

_n .menteil hervorgerufenen Bakterieninfektionen. Verabreicht man zwei Dosen der zu untersuchenden Verbindung subkutan " Mäusen, mit dan angegebenen Infektionen, dann wird die . beobachtete Wirksamkeit als ED,_ -Wert gemessen [wirksame Dosis in mg/kg, die für einen Schutz von 50 % der Versuchs-

rt.r tiere ausreicht: siehe_: Warren Wick et al., J. Bacteriol- 81, 233 bis 235 (1961)]. Die bei diesen Versuchen für die Faktoren A, B₇ C, D, E und F des Antibiotikums A410 30 ermittelten ED₁-Q-Werte gehen aus der folgenden Tabelle XXII hervor.

- 7 4 Tabelle XXII

Staph. aureus

ovroaenes

Antibiotikum A410 30A A41030B Ä41030C A41030D A4103OE A41030F

ED50	3	1
\ 1.4	3	1
< 0.4	0.339
< 0.4	< 0.3
	< 0.3

pneumomae

^ΞΡ50 1.68

1.4 6.7

2.21 3.11 > 5.0

Bei einer intraperitonealen Verabreichung ergibt sich für ..,. die Faktoren A, B und C des Antibiotikums A4103 0 jeweils eine akute Toxizität an der Maus von über 300 rag/kg.

Bei intraperitonealer Verabreichung ergibt sich für die Faktoren A, B und C des Antibiotikums· A4103.0 an der Maus jeweils ein LD- »-Wert¹ von über' 3 00 rag/kg..

Die in vivo ermittelte orale Wirksamkeit der Faktoren A, B und C des Antibiotikums A41030 gegenüber S. pyogenes

an der Maus beträgt über 300 mg/kg χ 2.

Die Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Behandlung von Infektionen bei einem warmblütigen Tier gerichtet, das darin besteht, daß man einem solchen Tier eine chemotherapeutisch wirksame . Menge.,. beispielsweise eine Menge von etwa 25 bis- 2000. mg,, des Antibiotikum-Komplexes A41030, eines Faktors hiervon oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon verabreicht.

Der Faktor A oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon kann auch zur Behandlung von Infektionen beim Menschen verwendet werden. Im allgemeinen sind der Antibiotikum-Komplex / seine anderen Faktoren oder seine Salze jedoch aiii besten geeignet zur Behandlung von Infektionen

j bei anderen warmblütigen Tieren.

Zur Behandlung von Infektionen beim Menschen wird der antibiotische Faktor, vorzugsweise der Faktor A, auf parenteralem Weg verabreicht, beispielsweise durch intramuskuläre Injektion oder durch intravenöse Infusion. Zur Injektion wird das Antibiotikum oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon in einem physiologisch unbedenklichen Verdünnungsmittel in der gewünschten-Konzen- tration gelöst und verabreicht. Zu geeigneten Verdünnungsmitteln gehören beispielsweise Wasser zur Injektion, 0,9%-ige Kochsalzlösung, 5%-ige Dextroselösung, Ringer-Lösung oder sonstige herkömmliche Verdünnungsmittel. Für eine Verabreichung durch intravenöse Infusion wird das Antibiotikum oder Salz hiervon in einer physiologischen Flüssigkeit oder verdünnten.- Nährlösung, mit- eUnör. geeigneten-: .,Konzentrat ion,, zubereitet, beispielsweise einer. Konzentration zwischen etwa''-5 und Ί0 %", und langsam mit. der Flüssigkeit infundiert. Wahlweise kann das Antibiotikum

20 auch durch die sogenannte Huckepack-Methöde-verab reicht

Der Gesamtkomplex aus den Faktoren, die Einzelfaktoren oder Faktorenkombinationen und die pharmazeutisch unbedenklichen Salze hiervon lassen sich in hermetisch verschlossenen Ampullen, sterilen und mit Gummistopfen verschlossenen Fläschchen oder Kunststoffsäcken in Einheitsdosierungen formulieren. Solche Einheitsdosierungsformen enthalten Hilfsstoffe, wie Antioxidationsmittel, Löslich-

~Q keitsvermittler, Dispergiermittel, Puffer und dergleichen. Eine -solche ^ Dosierungseinheitsformulierung enthält 100 mg des Faktors A oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon in einem mit einem Kautschukstopfen (Butylkautschuk) verschlossenen Fläschchen. Eine andere

° Dosierungseinheitsformulierung enthält 250 mg des Faktors A oder eines Salzes hiervon in einer.sterilen verschlossenen Ampulle. Eine' zur intravenösen Infusion geeignete' erfindungsgemäße. Dosierungseinheitsformulierung kann

ο λ h>\öl iQ P. "3 * ί W Ί 2 ⁴I Ό

-Ib-

] 5 g des Faktors A oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon in einem Plastikbeutel, enthalten.

Bei Verwendung als antibakterielles Mittel kann man den Antibiotikum-Komplex A41030 oder einen Faktor von A41030 entweder oraloder parenteral verabreichen· Selbstverständlich, wird der Antibiotikum-Komplex A41030 oder der jeweilige Faktor normalerweise zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht. Die Dosis des Antibiotikum-Komplexes A41030 oder des entsprechenden Faktors ist abhängig von einer Reihe von Überlegungen, wie der Art und Schwere der jeweils zu behandelnden Infektion. Für eine Verabreichung geeignete Dosierungsbereiche und/oder Dosierungseinheiten lassen sich vom Fachmann ohne weiteres anhand der hierin enthaltenen. MIC-Werte und ED-«-Werte: sowie-Toxizitätswerte zusammen mit Faktoren bestimmen, wie dem Patienten oder Wirt und dem infizierenden Organismus.

^ Die Antibiotika A41030 eignen sich unter anderem zur Unterdrückung des Wachstums.von Organismen von Staphylococcus, Streptococcus- und' Propiönibacterium acnes , und" diese Antibiotika können daher beispielsweise zur Behandlung von Akne verwendet v/erden. Die einzelnen Faktoren von A4103 0 oder Gemische hiervon können für eine topische Anwendung in pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln formuliert werden, wie Isopropylalkohol. Solche Lösungen können Antibiotikakonzentrationen von etwa 1 bis 15

Gewichtsprozent pro Volumen haben. Wahlweise kann man die .'

Antibiotika zur Behandlung der Haut auch zu Cremes oder

Lotionen formulieren.

Die Antibiotika A41030 eignen sich auch zur Unterdrückung

des Wachstums von Organismen von Clostridium difficile, 35

die im Intestinum Pseudomembranous colitis hervorrufen.

Die einzelnen Faktoren von A41030 oder Gemische hiervon können zur Behandlung von Pseudomembranous colitis durch orale Verabreichung einer wirksamen Dosis dieser Antibio-

tika oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hier-.von in Form einer pharmazeutisch unbedenklichen Dosierungsform verwendet werden.'Hierzu läßt sich das Antibiotikum, in Gelatinekapseln oder flüssiger Suspension verwenden.

Die erfindungsgemäßen Antibiotika können weiter auch in der Veterinärmedizin zur Behandlung von Infektionskrankheiten bei Haustieren und landwirtschaftlichen Nutztieren eingesetzt werden. Sie eignen sich ferner auch in der

]q Tierhaltung, beispielsweise zur Verbesserung des Wachstums 'von Rindern und sonstigen Wiederkäuern. Eine besonders brauchbare Anwendung der erfindungsgemäßen Antibiotika liegt in ihrer Fähigkeit zur Erhöhung der Produktion von Milch bei Milchvieh. Diese Anwendungsmöglichkeiten stellen weitere Gesichtspunkte der Erfindung dar, die in den f öl.gerideri.. Abschnitten/-.näher ..beschrieben werden.

Der Komplex A410 30 hat sich gegenüber infektiösem Hunde-' hepatitisvirus in vitro in einer Konzentration von 40, μg/ml als wirksam erwiesen. Der-Komplex A41030 hat'sich ferner'auch als wirksam erwiesen,- in vitro gegenüber Bseudotollwut: bei einer. Konzentration.-., von,20,-p.'g/mi* und., der Faktor A von A41030 hat sich in vitro gegenüber Pseudotollwut bei einer Dosis von 20 μg/ml als "v/irksam

25 erwiesen.

Der.. Antibiotikum-Komplex A4 1030 ist ein wirksamer Wachstumspromotor bei Hühnchen, wie folgende Versuche zeigen.

30 versuch 1

Für diesen Versuch verwendet man '8 Tage alte Bräthühnchen (Penobscot Brathühnchen). Insgesamt 560 Hühnchen werden in Gruppen mit jeweils 7 Tieren unterteilt. 3 5 Gruppen dienen als Kontrollen, und 5 Gruppen werden mit dem Antibiotikum behandelt, das man dem üblichen Hühnchenfuttei in einer Menge von 20 σ Äntlbiotik'um-Komplex^: A41030 pro Tonne Futter zusetzt. Futter und Wasser erhalten alle

ο λ y 07 Λo P. Q * 0 7 Ί 2 h. b

I Q

Tiergruppen über eine Zeitdauer von 21 Tagen ad libitum. Es werden zwei Zeitversuche mit folgenden Kriterien für die Wirksamkeit durchgeführt. 3%-ige Erhöhung der Gewichtszunahmeund/oder 2%-ige Verbesserung der Futterverwertung in einem oder beiden Zeitversuchen. Die bei diesen Versuchen erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle XXIII hervor.

Tabelle XXIIX

10	Behandlung	Konzentration g/Tonne	Gewichtszunahme	prozentuale Verbesserung	Futterverwertung	prozentuale Verbesserung
	Kontrolle	—	g	—	F/G	—
	A41030	'20	433	4,16	1,671	4,19
15	Kontrolle	-	451	-	1,601	-
	A41030	20	451	2,88	1,673-	1,32
		464	1,651

F/G = Gesamter Futterverbrauch dividiert durch- gesamte

20 -^; ' " ' Gewichtszunahme

Erfindungsgemäß-wird' somit auch ein Verfahren zur Verbesserung des Wachstums von Hühnchen geschaffen, das darin besteht, daß man den Hühnchen zusammen mit ihrem Futter

etwa 20 bis 30 g eines Faktors des Antibiotikums A41030

oder des Antibiotikum-Komplexes-A41030 oder eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes hiervon-pro' Tonne Futter verabreicht. Wahlweise kann man die antibiotischen Faktoren oder den Koaolex in Form "eines pharmazeutisch unbe-30

denklichen nichttoxischen Salzes auch im ..,Trinkwasser der

Hühnchen-verabfolgen.

Das Antibiotikum A4103 0 wirkt ferner auch als Wachstumspromotor, wenn es entwöhnten Ferkeln verabreicht' wird. Das Antibiotikum ist in der später beschriebenen Weise in mehreren Dosierungsmengen bei jungen Schweinen untersucht v/o r den.

0 -i MOl -i Q P, '1 * 07 '7 '2 ¹X Ό

] Versuch 2

Der Antibiotikum-Komplex A4103 0 wird in Mengen von 5, 20, 50 und 100 ppm im Futter von Ferkeln untersucht, die zu Beginn etwa 9,5 kg wiegen (Alter 5 bis 7 Wochen). Diese Versuche, werden in einer gegenüber der Umwelt eingestellten Aufzuchtanlage in Pferchen durchgeführt, die Drahtböden aufweisen. Jede Behandlung wird fünfmal wiederholt, und es werden jeweils 5 Schweine pro Versuch während der ]Q 27-tägigen Versuchsdauer verwendet. Die bei diesen Versuchen erhaltenen Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle XXIV hervor.

co cn	Menge ppm	co O	IO Lh	(O O	prozentuale Erhöhung	F/G	prozentuale Verbesserung
				Tabelle XXIV		1,87
Behandlung	5	ADG kg	prozentuale Erhöhung	ADF kg	6,4	1,89	-1,0
Grundfutter	20	0,304		0,567	0,0	1,93	-3,2
A41030	50	0,318	+4,5	0,604	0,0	1,78	4,8
Α4Ί030	100	0,304	0,0	0,567	7,2	1,74	7,4
A41030	0,322	+6,0	0,567
A41030	0,349	+14,9	0,608

ADG = Mittlere Gewichtszunahme ADF = Mittlerer täglicher Futterverbrauch F/G = Verhältnis von Futterverbrauch zu Gewichtszunahme

- οι -

Bei diesem Versuch ruft das Antibiotikum anscheinend eine dosisabhängige Verbesserung im Wachstumsverhalten entwöhnter Ferkel hervor, wie sich der Wirkung bei 5 ppm und bei 100 ppm entnehmen läßt.

Versuch 3

Der Antibiotikum-Komplex A41030 wird an entwöhnten Ferkeln (7,7 kg, Alter 4 bis 6 Wochen) weiter auch in ]0 Mengen von 25, 50 und 100 g/Tonne Futter über eine Zeitdauer von 35 Tagen untersucht. Jeder Versuch wird viermal unter Verwendung von sechs Ferkeln pro Behandlung wiederholt.

Der Antibiotikum-Komplex A41030 ergibt bei Verabreichung an die'sö' entwöhnten Ferkel -in den'angegebenen Mengen- eine Erhöhung der Gewichtszunahme um 5,6 %.,. 8,5 % und -7,0 % und eine Verbesserung der Futterverwertung um'.6 ,.6 %, 9,2 % und 3,1 %, wenn man ihn dem Futter in Mengen von 25, 50 und 100 g/Tonne zusetzt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse gehen aus,der folgenden Tabelle XXV hervor.

CO CX->

co Ui	co ο	ADG kg	KD ΟΊ	to O	, ADF kg	Ol	1	F/G	O
		0,322	Tabelle XXV	0,631		1	,96
Behandlung	Menge ppm	0,340	prozentuale Erhöhung	0,627	prozentuale Erhöhung	1	,83	prozentuale Verbesserung
Grundfutter		0,349		0,627		1	,78
A41030	25	0,345	5,6	0,654	-0,7		,90	6,6
A41030	50	8,5	-0,7		9,2
A41030	100	7,0	3,6	3,1

Zur Erfindung gehört daher auch ein Verfahren zur Wachstumsverbesserung entwöhnter Ferkel, das darin besteht,, daß man den Ferkeln zusammen mit ihrem Futter etwa 5 bis 100 ppm Antibiotikum-Komplex A41030 oder eines Faktors von A4 1030 oder eines pharmazeutisch unbedenklichen.nichttoxischen Salzes hiervon verabreicht, und weiter auch ein Verfahren zur Wachstunisverbesserung der· entwöhnten Ferkel, das darin besteht, daß man den Ferkeln zwischen etwa 25 und 100 g Antibiotikum-Komplex A41030 oder eines pharmazeutisch unbedenklichen nichttoxischen Salzes hiervon pro Tonne ,Futter verabfolgt. Der. Antibiotikum-Komplex A41030 kann in Form eines pharmazeutisch unbedenklichen nichttoxischen Salzes den Ferkeln auch im Trinkwasser verabreicht werden.

.15 .

Die Antibiotika A41030·eignen sich ferner auch zur·Verbesserung der Futterverwertung von Wiederkäuern. Bekanntlich nimmt die Effizienz der Kohlennydratverwertung bei Wiederkäuern durch Behandlungen zu, die die Pansenflora des jeweiligen Tieres so stimulieren, daß anstelle von Acetatoder. Butyratverbindungen Propionatverbindungen.produziert werden (bezüglich einet· vollständigeren Diskussion⁷ dieser Zusammenhänge wird hingewiesen auf Church et al.-, in. "Digestive' Physiology and Nutrition of Ruminants", .

25 Band 2, 1971, Seiten 622 und 625).

Die Wirksamkeit ' des Antibiotikum-Komplexes A41030 und. des Faktors A von A41030 zur Veränderung des Verhältnisses

an im Pansen gebildeten flüchtigen Fettsäuren wird anhand ^Q von in vitro Versuchen gezeigt, die nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren durchgeführt werden,

21 JARl 1-93 3* 07 7 2 48-

-j Versuch 4

Man entnimmt einem Stier, in. dessen Pansen chirurgisch eine Kanüle eingesetzt worden ist, die Pansenflüssigkeit. c Der Stier'wird mit einem Futter mit hohem Maisgehalt gefüttert, das folgende Zusammensetzung hat:

69,95 % Geschroteter Mais

10 % Gemahlene Maiskolben

IQ. 8 % . Sojabohnenmehl (50 % Protein)

5 ' % ' Luzernemehl

5 % Melasse

'0,6 % Harnstoff

0,5 % Dicalciumphosphat

]5 0,5 % Calciumcarbonat

0,3 % "' Salz

.0,0-7 % Vitamin A. und D-_;Vorgemisch

0,05' % Vitamin Ξ Vorgemisch

0,03 % Spurenmineralienvorgemisch

Eine:Probe, der Pansenflüssigkeit wird durch vier Schichten aus... einem. Seihtuch filtriert und., das Fiitrat in einem... Vakuuinkolben gesammelt. Das vom Seihtuch zurückgehaltene Material wird wieder in soviel physiologischem Puffer 25 suspendiert, daß sich-das ursprüngliche Volumen der ^: Pansenflüssigkeit ergibt, und die Suspension wird erneut durch das Seihtuch filtriert. Es wird mit.folgendem Puffer gearbeitet:

.0,31 6- g/l . Na₇HPO₄

0,152 g/l ^KH2^PO4

2,260 g/l , NaHCO₃ -

0,3 75 g/l KCl '

0,375 g/l NaCl '

0,112 g/l MgSO₄

0,038 g/l CaCl₀

21 &19d3*ö7^;7248

]. 0,008 g/1 FeSO₄-7H₂O

0,0 04 g/l MnSO₄

0,004 g/l ZnSO₄.7H₂O ' '

0,002 g/l . CuSO₄-5H₂O

5 0,001 g/l CoCl₂

, J. Dairy Sei. 38, 1225 (1955)

Die zwei Filtrate werden in einem Scheidetrichter zusammengefaßt, in dem man sie solange stehenläßt, bis das

darin enthaltene feste Material nach oben gestiegen ist. Die klare Schicht wird hierauf abgetrennt, mit dem gleichen Puffer auf 1:1 verdünnt und auf pH 7,0 eingestellt. 15

10- ml- der' so hergestellter! .verdünnten. Panse'nxlüssigkeit' gibt man zusammen mit 90 mg; feinpulverisiertem Futter mit hohem Maisgehalt mit der oben beschriebenen -Zusammen- ' ; setzung in einen 2 5 ml Kolben. Die zu untersuchende Verbindung wird abgewogen und in dem gleichen' oben erwähnten Lösungsmittel gelöst.- Die Lösung gibt man auf das in jedem Versuchskolben- b'tefin-dliche-.-f einpuiverig'e_:- Futter ^:und trocknet das Ganze dann.

Es werden'jeweils auch zwei Sätze aus vier unbehandelten Kontrollkolben zubereitet. Ein Satz aus vier unbehandel-

. ·_· ·... ·. . \

' ..... ·

ten Kontrollkolben wird 16 Stunden bei 38⁰C mit dem Versuchskolben inkubiert. Der andere Satz aus vier unbehandelten Kontrollkolben stellt Nullzeitkontrollen dar, •3V dessen Fermentation gestoppt wird, sobald die Kolben durch Zusatz von 2 ml 25%-iger Metaphcsphörsäure zu jedem Kolben zubereitet sind.

Die Fermentation in den inkubierten Versuchskolben und den Kontrollkolben wird nach 16 Stunden durch Zugabe von 2 ml 25%-iger Metaphosphorsäure zu jedem Kolben gestoppt.

21

] Man läßt alle Proben absetzen und analysiert die überstehende 'Flüssigkeit dann durch Gaschromatographie bezüglich ihres Gehalts an Acetat, Propionat.und Butyrat.

ς Der Analysenwert einer jeden in den Nullzeitkontrollen gefundenen flüchtigen Fettsäure, wird von den Analysenwerten der unbehandelten Kontrollen und der Versuchskolben abgezogen. Die hierbei erhaltenen Werte reflektieren die Menge einer jeden flüchtigen Fettsäure, die während der ] 0 16-stündigen Fermentation gebildet wird.

Die in der folgenden Tabelle XXVI angegebenen Versuchswerte stellen das Verhältnis aus den in den behandelten Kolben gebildeten freien Fettsäuren und den in den unbe-

]5 handelten Kontrollkolben gebildeten freien Fettsäuren dar. Diese Art der Angabe- der Versuchsdaten; macht die Ergebnisse:· der Veränderung in der chemischen Zusammensetzung des-Pansens besonders deutlich, die durch aas¹ vorliegende neue Verfahren zur Verbesserung der Futterverwer-

20 tung bewerkstelligt wird.

Tabelle"' XXVI

	Verbindung	.Menge	Acetat	Propionat	Butyrat
25	A41030	5 iig/xül	0,94	1,23	0,72
	A41030	5 μ9/πύ.	1,03	1,33	0,59
	A41030 .	5 μg/Inl	0,94	1,51	0,54
	A41030	2 pg/ml	1,03	1,33	0,94
	A41030	1 ng/ml-	1,01	1,31	0,66
30

Die in obiger Tabelle angegebenen Daten zeigen, daß sich mit den vorliegenden Antibiotika' die Bildung von Propionat

im Pansen wirksam erhöhen läßt. 35

t Durch Verabreichung der erfindungsgemäßen Antibiotika

läßt sich nicht nur die Futterverwertung verbessern, sondern auch eine Ketose verhindern oder behandeln. Der eine Ketose verursachende Mechanismus beruht auf einer mangeln- c den Produktion von Propionatverbindungen. Eine der gegenwärtig empfohlenen Behandlungsmethoden besteht in einer Verabreichung von Propionsäure oder einem Futter, das bevorzugt Propionate bildet. Das vorliegende Verfahren regt offensichtlich die Bildung von Propionat aus' normalem ig Futter an und verringert die Gefahr einer Ketose.

Es hat sich gezeigt, daß die vorliegenden antibiotischen Verbindungen die Effizienz der Futterverwertung bei Wiederkäuern verbessern, wenn sie in einer propionater- höhenden Dosis verabreicht werden. Die Antibiotika werden einzeln oder. als. 'Gesamtkomplex' oder als wirtschaftlicher wenig ger-e.ini.gter Gesamtkomplex zweckmäßigerweise, durch Zusatz zum Futter des Tieres verabreicht. Die antibiotischen Verbindungen lassen sich gewöhnlich jedoch auch nach anderen Wegen verabfolgen. Sie können beispielsweise in Tabletten, Tränken, BoIi oder Kapseln eingearbeitet, und-den. Tieren., dosiert gegeben werden. Formulierungen, der Antibiotika in solchen Dosierungsformen können nach Methoden hergestellt werden, wie sie in der Veterinärmedizin wohl bekannt sind. Jede-einzelne Dosierungseinheit soll eine Menge der die Futtereffizienz verbessernden Verbindung enthalten, die in direkter Beziehung zur geeigneten Tagesdosis für das jeweils zu behandelnde Tier steht.

Kapseln lassen sich am einfachsten herstellen, indem man Gelatinekapseln mit irgendeiner gewünschten Form des ; jeweils gewünschten Antibiotikums füllt. Das Antibiotikum kann gewünschtenfalls mit einem inerten pulverförmigen' Verdünnungsmittel, wie einem Zucker, einer Stärke oder einer gereinigten kristallinen Cellulose, verdünnt sein, wodurch es sich unter Erhöhung seines Volumens besser in die' Hanseln" abfüllen läßt.

Tabletten der.Antibiotika werden unter Anwendung herkömmlicher pharmazeutischer Verfahren hergestellt. Die Herstellung von Tabletten ist eine wohl bekannte und hochfortgeschrittene Technik.·Zusätzlich zum Wirkstoff ent- hält eine Tablette gewöhnlich eine Grundlage, einen Zerfallhilf sstoff , ein Absorbens, ein Bindemittel und ein Gleitmittel. Zu typischen Grundlagen gehören Lactose, feiner Staubzucker, Natriumchlorid, Stärke und Mannit. Stärke ist auch ein guter Zerfallhilfsstoff und gleiches

gilt auch für Alginsäure. Es können auch oberflächenaktive Mittel verwendet werden, wie 'Na tr iumlaury !sulfat und Dioctylnatriumsulfosuccinat. Zu herkömmlich verwendeten Absorptionsmitteln gehören wiederum Stärke und Lactose, wobei für ölige Substanzen auch Magnesiumcarbonat geeignet

' -^> ist.- Häufig verwendete Bindemittel sind Gelatine,

Guramen, Stärke, Dextrin^:und verschiedene Cellulosederivat=. Als Gleitmittel verwendet man gewöhnlich Magnesiümstearat, Talkum, Paraffinwachs, verschiedene Metallseifen und

Polyethylenglvkol. 20

Die antibiotische Verbindung kann-auch in Form eines Bolus mit verzögerter Wirkstoffreigabe- verabreicht"· werden'. Solche BoIi werden genauso hergestellt wie Tabletten, mit Ausnahme der zusätzlichen Verwendung eines Mittels

zur Verzögerung der Auflösung. BoIi werden so zubereitet, daß sie eine Wirkstoffreigabe über eine lange. Zeitdauer ergeben.' Die langsame Auflösung wird durch Auswahl einer in Wasser in hohem Ausmaß unlöslichen Form des Antibiotikums unterstützt . Um'die Dichte des Bolus zu erhöhen und

ihn ruhig am Boden des-Pansen zu halten, setzt man Substanzen ''zu, wie Eisehspäne.

Die Auflösung des Antibiotikums läßt sich durch Anwendung einer Matrix aus unlöslichen Materialien verzögern, -

in denen der Wirkstoff eingebettet ist. Brauchbar sind hierzu beispielsweise Substanzen, wie, Pflanzenwachse,' gereinigte. Mineralwachse und wasserunlösliche polymere Materialien.

21 MRL1933* 077

Tränken der Antibiotika lassen sich am einfachsten durch Auswahl einer wasserlöslichen Form des Antibiotikums herstellen. Möchte man aus 'irgendeinem Grund eine unlösliche Form haben, dann kann man hierzu eine Suspension herstellen. Wahlweise läßt sich eine Tränke auch als Lösung in einem physiologisch unbedenklichen Lösungsmittel formulieren, wie einem Polyethy lenglykol .·'

Suspensionen unlöslicher Formen der Antibiotika können hergestellt werden in Nichtlösungsmitteln, beispielsweise Pflanzenölen, wie Erdnußöl, Maisöl oder. Sesamöl, in einem Glykol, wie Propylenglykol oder Polyethylenglykol, oder in Wasser, und zwar je nach der Form des gewählten Antibiotikums

'

Geeignete- physiologisch unbedenkliche' Hilf sstöffe;: sind erforderlich/ um das Antibiotikum suspendiert zu halten-. Solche Hilfsstoffe können unter anderem aus der Gruppe der Verdickungsmittel ausgewählt werden, wie Carboxy^zu methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine oder den Alginaten. Zur Suspendierung von Antibiotika lassen sich auch rrranche^ Klas servr an'- oberflächenaktiven:" Mitteln vef-'-" wenden. Zur Herstellung von Suspensionen in flüssigen Nichtlösungsmitteln eignen sich beispielsweise Lecithin,

Addukte aus Alkylphenolen und Polyethylenoxid, Naphthalinsulf onate , Alkylbenzolsulfonate und Polyoxyethylensorbi-' tanester.

Die Herstellung von Susoensionen läßt sich in einzelnen

Fällen zusätzlich auch noch durch Substanzen unterstützen, die die Hydrophilie, Dichte und Oberflächenspannung der Flüssigkeit beeinflussen. So eignen sich als Suspendiermittel beispielsweise auch Antischaummmittel auf Siliconbasis, Glykole, Sorbit und Zucker. .

Das suspendierbare Antibiotikum kann'dem Tierfutter'als

Suspension oder als Trockengemisch aus dem Antibiotikum und Hilfsstoffen angeboten werden, welches vor seiner

21

1 Verwendung verdünnt werden muß.

Die Antibiotika können ferner auch zusammen mit dem Trinkwasser der Wiederkäuer verabreicht werden. Zur Einarbeitung in das Trinkwasser gibt man eine wasserlösliche oder in Wasser suspendierbare Form des ' gewünschten Antibiotikums in der geeigneten Menge zum Wasser. Bei der Formulierung des Antibiotikums als Zusatz zu Trinkwasser geht man genauso.vor wie bei der Formulierung von Tränken. 10

Die einfachste Art und Weise zur Behandlung von Tierenmit den-erfindungsgemäßen Antibiotika besteht in einem Zusatz zum Futter der Tiere. Jede Futterart kann mit den antibiotischen Verbindungen versetzt werden, wie Trocken-'5 futter, Flüssigfutter und Pelletfutter.

Die Methoden zur Einarbeitung von Wirkstoffen in Tierfutter sind wohl- bekannt. Gewöhnlich bildet man ein konzentriertes Wirkstoffvorgemisch als Rohmaterial für ein

^zu wirkstoffhaltiges Futter. Typische Wirkstoffvorgemische enthalten beispielsweise etwa 2 bis 900 g Wirkstoff pro- kg^:. Vor gemisch. 'Dar "breite - Bereich¹- ergibt: sich-ausdem breiten' Bereich der Wirkstoffkonzentration, die man beim fertigen Futter haben möchte. Vorgemische können

entweder flüssig oder fest sein.

Die Formulierung von Tierfuttern/ die die für'eine Behandlung geeigneten. Mengen an antibiotischen' Verbindungen enthalten, ist in erster Linie eine Fraae der Arithmetik.

Man muß nur die Menge an Verbindung errechnen, die man jedem Tier verabreichen möchte. Hierbei ist die Menge an Futter pro Tag, die das jeweilige Tier frißt, und die Konzentration an antibiotischer. Verbindung im zu verwendenden Vorgemisch in Betracht zu ziehen, und auf dieser Basis läßt sich dann die geeignete -Konzentration an antibiotischer Verbindung im Futter berechnen.

91 Μ

Alle Methoden zur Formulierung, Vermischung und Pelletisierung von Futter, die normalerweise bei der Herstellung von Futter für Wiederkäuer oder Nichtwiederkäuer verwendet werden, sind auch zur Herstellung von Futter geeignet, das die beim vorliegenden Verfahren verwendbaren antibiotischen Verbindungen enthält.

Es hat sich ferner gezeigt, daß der Antibiotikum-Komplex A41030 nicht nur die Effizienz der Futterverwertung bei Säugetieren, die zur Milchproduktion verwendet werden, erhöht (wie dies-oben beschrieben worden ist), sondern daß dieses Antibiotikum überraschenderweise auch eine Verbesserung der Milchproduktion ergibt, ohne daß hierdurch die Qualität der Milch beeinträchtigt wird, wenn man es ..

milchgebenden Tieren verabreicht, die über eine entwickelte' Pahsenf unkt ion .verfügen..

Die Bedürfnisse und Ziele der Futterverwertung von.milch-. gebenden Wiederkäuern,, wie Milchkühen, unterscheiden sich ziemii-ch stark von Wiederkäuern, ' die zur Fleischprodukt ion gezüchtet, werden. Die Bildung flüchtiger .,Fettsäuren, im, Pahserf:^:-i,si?; risttür'l±.ch> in erster" 'Linie' wichtig'/ da·?-sie'.; indirekter Beziehung steht < zur normalen Haltung der Tiere und auch zur Qualität und Menge der vom Tier erzeugten Milch. Beim milchgebenden Wiederkäuer ist die zur Lactation benötigte Energie jedoch der am stärksten beschränkende Faktor bei der Milchproduktio'n. Acetat ist · für eine rasche Milchsynthese erforderlich, während Propionat für die Bildung von Glucose benötigt wird, die wiederum zur Synthese von Lactose gebraucht wird, und Propionat ferner eine untergeordnete Rolle bei der Bildung von Milchfett hat. Butyrat ist stärker glykogen als. lipogen, wobei der lipogene Gesichtspunkt indirekt ist, da Butyrat erst zu Acetateinheiten abgebaut sein muß, bevor es sich zur

^ Synthese langkettiger Fettsäuren, wie Miichfett, verwenden läßt.

T Für eine Erhöhung der Milchproduktion bei lactierenden Wiederkäuern ist daher eine Erhöhung der Propionatbildung erforderlich, was jedoch, nicht zu sehr auf Kosten der Bildung von Acetat und Butyrat ablaufen darf. Stark erniedrigte Acetat- und Butyratspiegel führen zu einem drastisch herabgesetzten Milchfettgehalt, und somit zu einer Milch, mit schlechterer Qualität und geringerem Wert, da der Milchpreis zum Teil vom Milchfettgehalt bestimmt wird. »

Die vorliegende Verbesserung in der Milchproduktion, äußert sich in einem erhöhten Proteingehalt der Milch ohne merkliche Veränderung ihres Fettgehalts. Das Verfahren zur Erzielung einer solchen Verbesserung besteht in einer oralen Verabreichung einer propionaterhöhenden Menge des Antibiotikum-Komplexes A41 030 air einen·.-.milchgebenden Wiederkäuer.

Der Antibiotikum-Komplex A41030 wird hierzu so formuliert,.

daß er sich einem Wiederkäuer leicht oral verabreichen läßt, und hierzu geeignete Formulierungen sind beispielsweise Futtervorgemische, . Futter zusätze , Leckste-ine ; - Wasser-' zusätze oder auch Formulierungen des Antibiotikum-Komplexes A41030/ die in Form einer einzigen Verabreichung

25 eine ' langsame Freisetzung über eine lange Zeitdauer

ergeben. , . ·

Die Tatsache, daß eine Verabreichung einer propionatarhohenden'Menge des Antibiotikum-Komplexes A4103 0 an einen

^ou milchgebenden Wiederkäuer mit entwickelter Pansenfunktion eine Verbesserung der Milchproduktion ohne Beeinträchtigung der Zusammensetzung der Milch ergibt, wird durch in vivo Untersuchungen belegt,

35

21 MRl 19 33*

- 93 Versuch 5

Es werden zwei Versuche unter Verwendung von Holstein-Kühen durchgeführt, die gerade gekalbt haben, 5

Beim ersten Versuch verwendet man zwölf Kühe, die in zwei Gruppen aus sechs Kühen unterteilt sind.

Zwei Wochen nach dein'Kalben, beginnt für die Versuchstiere 10 eine einwöchige Vorperiode, während der alle Tiere eine Tagesration aus Futter und Wasser ohne Verabreichung von Antibiotikum erhalten. Alle Kühe erhalten eine Standard-Futterration aus 50 % Maissilage, 20 % Luzerneheu und 3 0 % eines Konzentrats folgender Zusammensetzung: 15

Konzentrat Bestandteil

Gelber gemahlener Mais Dicalciumphosphat Kalkstein

Melasse (Dehy)

Mononatriumphosphat " Sojabohnenölmehl.

Vitamin Ä+D., Vorgemisch (Ca-01) (1) Vitamin Ξ Vorgemisch (2) Selen Vorgemisch (3) Salz

Natriumbicarbonat Getrocknete Maisschlempe

^ - 100,00 1000,0

(1) Auf je 450 g Vitamin A und D_ Voraemisch sind

^:

2 000 000 USP-Einheiten an Vitamin A und 225 750 US.P-Einheiten an Vitamin D₀ . vorhanden.

Prozent	kg/Tonne
23,50	335,0
1 ,50'	Ί'5',Ο
1,25".	12,5
2,15	21 ,5
Q-, 10..	1,0
47,0	•47,0
0,35	3,5
0,10	1 ,0
0,05	0,5
1 ,00	10,0
1 ,00 .	10,0
22,00	220,0

.91 ^?

] (2) Je 450 g Vitamin E Vorgemisch sind 20 000 IE an . Vitamin E enthalten.

(3) Je kg Selen Vorgemisch sind 200 mg Selen als Natriumselenit enthalten. Die berechnete Analyse für das Selen bezieht sich nur auf das Vorgemisch..

Alle Kühe werden mit der Standard-Ration in einer Menge von 2,95 % pro Körpergewicht (das Körpergewicht ist zu Beginn j Q der einwöchigen Vorperiode bestimmt worden) und mit 900 g einer Formulierung gefüttert, die als Topfutter bezeichnet wird und folgende Zusammensetzung hat:

Topfutter . .

Bestandteil

Gelber gemahlener Mais

Gemahlene Maiskolben 20 Rohrzuckermelasse Hafer- · So j abohnenölmehl,-Vitamin A+D Vorgemisch (Ca-01) (1)

Salz 25 Tierfett

100,00 1000,0

(1) Auf je 450 g Vitamin A und D^ Vorgemisch sind 3Q ' 2 000 000 USP-Einheiten an Vitamin A und 2 25 75 0 - USP-Einheiten an Vitamin D^ vorhanden.

Während der einwöchigen Vorperiode erhalten alle Kühe ein als Kontrolle dienendes Topfutter. Ab Beginn der Behandlungsperiode füttert man die Tiere zur.Behandlung über eine Zeitdauer von acht Wochen mit einem Gemisch aus dem Antibiotikum-Komplex A41030 (der zu untersuchenden Verbindung) und dem Topfutter. 'Den Kontrolltieren gibt man

Prozent	kg/Tonne
20,00	20 0,0
38,00	380,0
2,50	25,0
11 ,00	110,0
25,00	2 50,0
1 ,10	11 ,0
0,40	·· 4,0
2,00	20,0

.21 MRL 1983*077248

weiterhin nur nicht mit Wirkstoff versetztes Topfutter, das identisch ist mit dem während der Vorperiode gegebenen Topfutter. Man gibt den Versuchskühen das Kontrolltopfutter und das den Antibiotikum-Komplex A4103 0 enthaltende Topfutter täglich in einer Menge von 90 0 g innerhalb· einer Stunde während der Morgenfütterung mit der oben beschriebenen Standard-Futterration. Die behandelte Gruppe erhält 600 mg des Antibiotikums pro Kopf und Tag.

Der obige Versuch wird unter Anwendung des oben beschriebenen allgemeinen Verfahrens wiederholt und dann als Versuch 2 bezeichnet.

Die mittlere tägliche Milchproduktion, Milchzusammensetzung und Beständigkeit der Milchproduktion wird bei beiden Versuchen analysiert, und-die dabei erhaltenen¹ Ergebnisse gehen aus der.folgenden.Tabelle XXVII hervor. Die Werte für die Beständigkeit errechnen sich durch Dividieren der mittleren Milchproduktion während der achtwöchigen Versuchsperiode durch die mittlere Milchproduktion während der ohne Behandlung mit Wirkstoff, ablaufenden Vorperiode. Die Werte für die Persisteriz-.: sind Ausdruck für die gute Leistung der Behandlungsgruppe nach Beginn der Behandlung im Vergleich zur Leistung ^ vor Beginn der Behandlung. Normalerweise ist für die Versuche eine Persistenz von etwa 94 bis 96 % zu erwarten. Kühe, die den Komplex A4 TO 30 erhalten haben, zeigen dagegen bei diesem Versuch höhere Persistenzwerte. Dies belegt die beobachtete Reaktion auf die Behandlung,

wonach die Milchproduktion während der Vorperiode höher.

bleibt als bei den Kontrollkühen.

Die in der Tabelle XXVII ebenfalls angegebene Analyse der

Milchzusammensetzung zeigt, daß es keinen Unterschied

im Milchfett zwischen den behandelten, Kühen und den nicht behandelten Kontrollkühen gibt, während'der Proteingehalt erhöht ist. Eine Erhöhung des Proteingehalts der Milch ist jedoch ein besonders wünschenswertes Ergebnis,

Oi MQ?

da sogar eine nur geringe Erhöhung zu einer beachtlichen' Erhöhung der Menge an Käse führt, die aus einer solchen Milch hergestellt werden kann.

21-MRl 1933*077243

CJ Ln

CO O

KJ

Ln

ro O

Tabelle XXVlI

Milch (kg/Tag)

Behandlung	η	Vorgemisch	Behandlungs- periode
Versuch 1
Kontrolle	6	61 ,2	58,2
A4103 0	6	52,0	53,3
Versuch 2
Kontrolle	7	50,6	48,5
A41030	8	54,0	5 2,9

Milch Beständigkeit Fett Protein Feststoffe

95,6 103,9

95,9 98,3

3,52 3,50

3,92

3,36

I 1 ,57

II ,63

CO CO CO

η = Anzahl der Tiere

a = Die Beständigkeit berechnet sich durch Dividieren der mittleren Milchproduktion während der Behandlungsperiode durch die Milchproduktion während der Vorperiode, Die eingegebenen Werte für die Beständigkeit sind das Ergebnis der Verwendung von Versuchdaten aus einzelnen Kühen und stellen Mittelwerte deir.

b und c = Diese Werte sind unterschiedlich (P<0,05).

- - nicht verfügbar

Der Antibiotikum-Komplex A41030 und seine Faktoren A, B, C, D, E, F und G lassen sich für eine Verwendung in Tierfuttern unter Anwendung der in den früheren Beispielen beschriebenen Methoden, isolieren. Gewünschtenfalls kann man nach Bildung der antibiotischen Aktivität von A41030 die gesamte Fermentationsbrühe auch einfach trocknen und das erhaltene getrocknete Medium direkt in das Futter oder Vorfutter einmischen.

Man kann den vorliegenden Antibiotikum-Komplex A41030 oder seine Faktoren ferner auch mit einem synthetischen Gerbstoff vereinigen, bei dem es sich um ein sulfitiertes Syntan aus Phenol und Formaldehyd handelt, das von A. J. & 0. J. Pilar Inc., Newark, N.J., V.St.A. unter der

"55 Warenbezeichnung TruTan RT Regular erhältlich ist. Die . Kombination aus dem-Antibiotikum und dem synthetischeil Gerbstoff, nämlich der Komplex aus Antibiotikum und Syntan, kann ohne Abtrennung der Bestandteile beim oben

beschriebenen Futterzusatz für Tiere verwendet werden. 20

Normalerweise werden Nutztiere unter Einschluß von Wiederkäuern mit"den. verschiedensten wachstumsfördernden-Mitteln, vorbeugenden Mitteln gegen Krankheiten und Mitteln zur

Behandlung von Krankheiten während ihres ganzen Lebens nc

behandelt. Wirkstoffe dieser Art werden oft, in Kombination angewandt. Auch das vorliegende Verfahren kann in Kombination mit' anderen Behandlungen' angewandt' werden.-

Der Antibiotikum-Komt>lex A41030 und der Faktor A von

A4.1030 bewirkt - wie gezeigt - eine günstige Veränderung der Produktion'an Propionate^- im Verhältnis zur Produktion an Acetaten im Pansen.'Die gleiche Behandlung wirkt sich auch günstig bei monogastrischen Tieren aus, die faserartiges pflanzliches Material im Caecum fermentieren. ."- -

Hierunter werden Tiere verstanden, die faserartiges

pflanzliches Futter verbrauchen und wenigstens teilweise durch mikrobiologische Fermentation im Caecum verdauen. Die caecale Fermentation folgt einem chemischen Ablauf,

21 WRl 1933 * 07 .'7 24G

1 der der Fermentation im Pansen ähnlich ist.

Pferde, Schweine und Hasen sind Beispiele für Tiere, die einen Teil ihres Futters durch caecale Fermentation verdauen. Die gesamte Futterverwertung solcher Tiere läßt sich ebenfalls durch orale Verabreichung der vorliegenden Antibiotika verbessern, die eine günstige Veränderung des Verhältnisses von Propionat zu Acetat verursachen. Pferde und Hasen sind Beispiele für Tiere,

]0 bei denen die caecale Fermentation der überwiegende Teil des gesamten Verdauungsverfahrens ist und bei denen die vorliegenden Antibiotika daher mit besonderem Erfolg eingesetzt werden können.

21 ί#

Claims (13)

1. -1 (scharf, mittel) und 846 (breit, mittel) cm ,

   (d) über Ultraviolettabsorptionsspektren mit einem Absorptions maximum in einem sauren oder neutralen Gemisch aus Wasser und Methanol (1:1) von 278 nm (£=15000) und in einem basischen Gemisch aus Wasser und Methanol (1:1) von 298 nm (£=18000) verfügt,

   (e) in 6 6%-igem wässrigem Dimethylformamid zwei titrierbare G:
   zeigt,

   bare Gruppen mit pK -Werten von etwa 5,5 und 7,6

   (f) in Gemischen aus Alkohol und Wasser, in Dimethyl-.sulfoxid, in Dimethylformamid, in Gemischen aus Dimethylsulzoxid und Wasser, in Gemischen aus Dimethylformamid· und. Wasser, in verdünnter wässriger Säure oder in verdünnter'wässriger Base löslich ist,, oder

   (g) bei dem es sich um pharmazeutisch unbedenkliche

   nichttoxische Salze des Antibiotikums A41030 Faktor

   · \ ' '

   G handelt. . '

   1 H

   O:

   ¹M

   ''S

   /IK

   ^Ncy

   Λ·.

   T ir χ«

   'CI Ga I aciosy I —3a I actose--

   oder· ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon', -herstellt.

   1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikum-Komplexes A41030, seiner Faktoren A, B, C, D, E,. F oder G oder der ,pharmazeutisch unbedenklichen Salze hiervon, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces virginiae NRRL 15156 oder 12525 oder eine das Antibiotikum A41030 bildende Variante oder Mutante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen züchtet.

   1 ErfindungsanSprüche
2. 2.. ' Verfahren nach Punkt 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man den gebildeten Antibiotikum-Komplex aus dem KuItürmedium abtrennt.
3. 3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Faktoren A, B, C, D, E-, F oder G aus dem Antibiotikum-Komplex isoliert.
4. 4. Verfahren nach-Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man" das Antibiotikum A4,1030 Faktor A,..der Struktur.-

   HO-CH

   21 SlRl1933* 07Ti ib

   j oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon herstellt. .
5. 5. Verfahren nach ^Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum A41030 Faktor B der Struktur

   oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon herstellt;
6. 6. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum A41030 Faktor C der Struktur

   - 1Ό2 -

   HO-CH

   Γ f

   HO-Ji-JlH

   CH

   er

   ΛΉ

   CX 1

   Ga I actose-σ

   ode'r ein pharmazeutisch unbdenkliches Salz hiervon'"' herstellt.

   25
7. 7. Verfahren, nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum A41030 Faktor D herstellt, bei dem

   es sich um einen weißen amorphen Fest

   stoff

   handelt, der

   (a) eine ungefähre Elementaranalyse von 34,46 % Kohlen-30 stoff, 4,35 % Wasserstoff, 7,58 % Stickstoff, 4,27 %

   Chlor und 29,34 % Sauerstoff hat,

   (b) ein beobachtetes Molekulargewicht'von etwa 1326 aufweist, bestimmt durch schnelle Atombombardierungs-

   35 massenspektrometrie,

   (c) über ein Infrarotabsorptionsspektrum mit folgenden

   unterscheidbaren Maxima verfügt: 3448 bis 3226 (stark, breit), 2959 (schwach)., 1661 (stark), 1592 (stark), 1511 (stark), 1429 (schwach), 1290 (schwach), 1227 (schwach)-, 1212 (mittel), 1163 (schwach), 1143 (schwach) , 1 053 (mittel) und 1010 (stark) cm ,

   (d) über Ultraabsorptionsspektren mit einem Absorptions-' ]0 maximum in einem sauren oder neutralen Gemisch aus Wasser und Methanol (1:1) von 278 nm (<£ = 10600) und in einem basischen Gemisch aus Wasser und "~\ Methanol (1:1.) von 29 8 nm ( <f = 19 900) verfügt,

   (e) in 66%-igem wässrigem Dimethylformamid zwei titrierbare Gruppen mit pK -Werten von etwa 5,5 und'^;7,6

   zeigt,

   (f) in Gemischen aus Alkohol und'Wasser, in Dimethyl-' sulfoxid, in Dimethylformamid, in Gemischen aus

   Dimethyj.suIfoxid und Wasser, in Gemischen aus Dimethylf orirfaxriid-und-Wassei", irr verdünnter wä^:ssr:igery: Säiara.._i:. oder in verdünnter wässriger Base löslich ist, oder

   (g) bei dem es sich um'pharmazeutisch unbedenkliche '' —.-- nichttoxische Salze des Antibiotikums A41030 Faktor

   D handelt.
8. 8. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum A41030 Faktor E der Struktur

   HO-OH

   H(ZV/

   oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz hiervon herstelit.
9. 9. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum A41030 Faktor F der Struktur

   21 »1933*0772*3

   HO-CH-

   NH Ή

   -CH

   /V

   β β
10. 10. Verfahren nach Punkt 3/ dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum A410 30 Faktor G herstellt, bei dem es sich um einen weißen amorphen Feststoff handelt, der

    (a) eine ungefähre Elemehtaranalyse von 50,02 % Kohlenstoff, 4,61 %' Wasserstoff, 4,74 % Chlor, 6,11% Stickstoff und 30,70 % Sauerstoff hat,

    (b) ein beobachtetes Molekulargewicht von etwa 1684 aufweist, bestimmt durch schnelle Atoiftbombardierungsmassenspektrometrie,

    (c). über ein Infrarotabsorptionsspektrum mit folgenden unterscheidbaren Maxima verfügt: 3 32 0 (sehr breit, stark), 2975 (schärf, schwach), 2920 (scharf, schwach), 1659 (normal, stark), 1594. (breit, stark), 1512

    21 N

    (scharf, stark), 1492 (Schulter), 1430 (scharf, schwach), 1386 (breit, schwach), 1337 (breit, schwach), 1308 (scharf, schwach), 1264 (scharf, schwach), 1230 (breit, mittel), 1145 (breit, mittel), 1077 (scharf, mittel), 1062 (scharf, mittel), 1014
11. 11. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces virginiae NRRL 12525

    30 züchtet.
12. 12. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 10, dadurch .gekennzeichnet, daß man Streptomyces virginiae NRHL 15156

    züchtet.
13. 13. Kulturmedium zur Durchführung des Verfahrens nach Punkt 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet/ daß es die Mikroorganismen Streptomyces virginiae NRRL 12525 oder Streptomyces virginiae NRRL 15156 und assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält.