FI75190B - Foerfarande foer framstaellning av ett antibiotikum a41030-komplex eller dess faktorer a, b, c, d, e, f och g. - Google Patents

Description

75190

Menetelmä antibiootti A41030-kompleksin tai sen tekijöiden A, B, C, D, E, F ja G valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää A41030-kompleksin tai 5 tekijän A, jolla on kaava:

OH

HO-CH—\ I l X

10 I ^-^ci ^ C1>^>-CH2 0=c^C\h °^CHx /c? I K c NH 0-^ ' \ NH \^° NH V° ^ '

C, /H \ NH NH

2 ^CH^ \ / \ ηr HO-C-CH CH ' 15 I 9=0 A CHs.

____________ui Xl ^ ™2 | ho^ | ho^\^^oh qH ho"^^^ 20 B, jolla on kaava

OH

M C1^XCH

I i 2 _ Χξ 0^ 0 P\

0 9 NH . NH 'c |H

30 O F1 C^° NH \^° / H c=0

HO-C-CH 'CHX \ X CHX

I CH NH2 1 Λ Λ ^ fVr ΛΛ /T\ 35 HCX^x^OH OH H0 ^°HC)^^ 75190 C, jolla on kaava:

OH

^/0''γίί^'ΧΧΤΐ

ho-chL M kJJ LI

5 Cl Y Cl ^^XCH2 o=f^L ^ o Γ\Ά r \ n I n,h °-^c i 0 Γ* \*° J*B c=o

in ” I \ s' I

1U HO-C-CH v / \ CH

fH CH / V NH, rkN 1 if l) r^n ^ rjl li5>ci k Jj X^\

15 HO-kv^-OH °H HO^/Xo^l^J

Galaktoosi-0 D, joka on valkoinen amorfinen kiinteä aine, jonka: (a) keskimääräinen alkuaineanalyysi on 54,46 % hiiltä, 4,35 % vetyä, 7,58 % typpeä, 4,27 % klooria ja 20 erotuksena laskettuna 29,34 % happea; (b) huomioitu molekyylipaino on noin 1326 määritettynä nopea-atomipommitusmassaspektrometrisesti; (c) infrapuna-absorptiospektrissä on seuraavat erottuvat maksimit: 3448-3226 (voimakas, leveä), 2959 25 (heikko), 1661 (voimakas), 1592 (voimakas), 1511 (voi makas) , 1429 (heikko), 1290 (heikko), 1227 (heikko), 1212 (keskinkertainen), 1163 (heikko), 1143 (heikko), 1053 (keskinkertainen) ja 1010 (voimakas) cm (d) ultraviolettiabsorptiospektrissä on absorptio-30 maksimi happamassa tai neutraalissa metanoli:vedessä (1:1) kohdalla 278 nm (£10600) ja emäksisessä metano-li:vedessä (1:1) kohdalla 298 nm (£19900); (e) molekyylissä on kaksi titrauskelpoista ryhmää 66-%:isessa dimetyyliformamidin vesiliuoksessa pK - di 35 arvoilla noin 5,5 ja 7,6; ja (f) joka on liukoinen alkoholi-vesiseoksiin, di-metyylisulfoksidiin, dimetyyliformamidiin, dimetyyli-

II

75190 sulfoksidi-vesiseoksiin, dimetyyliformamidi-vesiseoksiin, hapon laimeisiin vesiliuoksiin tai emäksen laimeisiin vesiliuoksiin; E, jolla on kaava:

5 OH

HO-CH i^sjXcl x\jJ ^J\h2 CH CH. /CHk 10 0xV Nm <VC \ 0=9 NH l \ . \ ' Y^° NH c( ™ nh O \:h ^ CH^ \ π I c=o HO-C-CH ' ” Ar-Φ HO \^OH °H H0 20 F, jolla on kaava:

OH

-Cif tV “ jf) ^ HO-CH -k^Acl C1'^>NCH2 c=c Ah 0^ c-^\ °-c \h V^° \ n NH \ O NH C/ NH \^0 \m0 3o H°-C-CH 'ch^ Vh/ ch^ | | nh2 lii rl

ΗΟ-'^Α.Η OH Galaktosyyli- AV

galaktoosi-0 3 5 751 90 4 tai G joka on valkoinen kiinteä aine, jonka (a) keskimääräinen alkuaineanalyysi on 50,02 % hiiltä, 4,61 % vetyä, 4,74 % klooria, 6,11 % typpeä, ja 30,70 % happea; 5 (b) huomioitu molekyylipaine on noin 1688 määri tettynä nopea-atomipommitusmassaspektrometrisesti; (c) infrapuna-absorptiospektrissä on seuraavat erotettavat absorptiomaksimit: 3320 (hyvin leveä, voimakas) , 2975 (terävä, heikko), 2920 (terävä, heikko), 10 1659 (normaali, voimakas), 1492 (olka), 1430 (terävä), heikko), 1386 (leveä, heikko), 1337 (leveä, heikko), 1308 (terävä, heikko), 1264 (terävä, heikko), 1230 (leveä, keskinkertainen), 1145 (leveä, keskinkertainen), 1077 (terävä, keskinkertainen), 1062 (terävä, keskin-15 kertainen), 1014 (terävä, keskinkertainen), ja 846 (leveä, keskinkertainen) cm (d) ultraviolettiabsorptiospektrissä on absorp-tiomaksimi happamssa tai neutraalissa metanoli;vedessä (1:1) kohdalla 278 nm (£ 15000) ja emäksisessä metano- 20 li:vedessä (1:1) kohdalla 298 nm (£ 18000); (e) kahden titrauskelpoisen ryhmän pK -arvot cl 66-%:isessa dimetyyliformamidin vesiliuoksessa ovat noin 5,4 ja 7,0; ja (f) joka liukenee alkoholi-vesiseoksiin, dimetyy-25 lisulfoksidiin, dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfoksi- di-vesiseoksiin, dimetyyliformamidi-vesiseoksiin, laimeisiin hapon vesiliuoksiin tai laimeisiin emäksen vesi-liuoksiin , tai näiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen val-30 mistamiseksi. Näillä uusilla yhdisteillä on antimikrobi-sia ominaisuuksia, ja ne valmistetaan kasvattamalla aikaisemmin tuntemattomia Streptomyces virginiae -kantoja.

Uudet yhdisteet ovat samankaltaisia kuin US-pa-tenttijulkaisuissa 4 322 343 ja 4 322 406 kuvatut anti-35 biootit.

Il 5 75190

Uusien antibiottien kehittämiseen on suuri tarve, koska antibiootille spesifisesti resitenttien patogeenisten mikro-organismikantojen ilmaantuminen on hyvin mahdollista ja jatkuva uhka. Erikoisesti patogeenit gram-5 positiiviset Staphylococcous- ja Streptococcus-lajit ovat usein resitentteja yleisesti käytetyille antibiooteille kuten penisilliinille ja erytromysiinille; katso esim. W.O. Foye, Principles of Medicinal Chemistry, s. 684-684 (1974).

10 Keksinnön mukaisesti A41030 kompleksin ja sen te kijöiden A, B, C, D, E, F ja G tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen on keksitty olevan tehokkaita antimikrobisia aineita.

Nämä uudet antibiootit voidaan valmistaa aerobi-15 sesti käyttämällä aikaisemmin kuvaamatonta mikro-organismia Streptomyces virginiae NRRL 12525 tai sen emä-kantaa Streptomyces virginiae NRRL 15156 kasvualustassa, joka sisältää yhteyttämiskelpoiset hiili-, typpi- ja epäorgaanisten suolojen lähteet. Nämä organismit tuottavat 20 antibioottikompleksin, joka sisältää useita antibioottisia tekijöitä, joihin sisältyvät tekijöiksi A, B, C, D, E, F ja G nimetyt. Mukavuussyistä viljelty mikro-organismi Streptomyces virginiae NRRL 12525 on nimetty laboratoriossamme viljelmäksi A41030, 4. Streptomyces virginiae 25 NRRL 15156 on nimetty laboratoriossamme A41030:ksi.

Yksittäisten tekijöiden infrapuna-absorptiospektrit on esitetty oheisissa kuvioissa seuraavasti:

Kuvio 1 - A41030 tekijä A (KBr-tabletissa) kuvio 2 - A41030 tekijä B (KBr-tabletissa) 30 kuvio 3 - A41030 tekijä C (KBr-tabletissa) kuvio 4 - A41030 tekijä D (KBr-tabletissa) kuvio 5 - A41030 tekijä E (KBr-tabletissa) kuvio 6 - A41030 tekijä F (KBr-tabletissa) kuvio 7 - A41030 tekijä G (KBr-tabletissa) 35 Termillä "kompleksi" käytettynä käymisalalla ja tässä julkaisussa tarkoitetaan samanaikaisesti valmistettujen erillisten antibiooottitekijoiden seosta. Kuten an- 6 75190 tibioottien valmistukseen käymisen avulla tutustuneet ymmärtävät, antibioottikompleksissa valmistuneiden erillisten tekijöiden lukumäärä ja suhde vaihtelevat riippuen käymisolosuhteista ja käytetystä kannasta.

5 Viljelmä A41030,4, Streptomyces virginiae (A41030)- kannan kemiallisesti indusoitu mutantti, joka alunperin eristettiin maaperänäytteestä, joka oli otettu talteen Indianapolisissa, Indianassa, on talletettu laitokseen Northern Regional Research Center, U.S. Department of 10 Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria,

Illinois 61604, jossa siitä on tehty osa talletusviljel-mäkokoelmasta, josta se on yleisön saatavissa numerolla NRRL 12525. Kompleksin tuottava emäviljelmä Streptomyces virginiae (A41030) on myöskin talletettu laitokseen 15 Northern Regional Research Center ja on yleisesti saatavissa numerolla NRRL 15156.

Viljelmä A41030,4 saatiin käsittelemällä viljelmää A41030 jaksottain mitomysiinillä C ja sitten N-me-tyyli-N1-nitro-N-nitrosoguanidiinilla.

20 Alan ammattimiehet ymmärtävät, että on mahdol lista kehittää muita kantoja, joilla on oleellisesti samat biosynteettiset kyvyt kuin kannalla Streptomyces virginiae NRRL 12525, suorittamalla viljelmälle A41030 muita mutageenisiä käsittelyjä. Mitomysiinin C lisäksi 25 sopiviin aineisiin kuuluvat akriflaviinit, akridiiniorans-si, etidiumbromidi ja vastaavanlaiset kemialliset aineet. Vaikkakin käytettiin N-metyyli-N1-nitro-N-nitroso-guanidiinia yhdessä mitomysiinin C kanssa NRRL 12525:n saamiseksi, muita tunnettuja mutageenejä kuten ultravio-30 lettiä, suuritaajuksista ja radioaktiivista säteilyä, röntgensäteitä ja muita kemiallisia aineita voitaisiin käyttää samanlaisen mutageneesin aiheuttamiseksi.

A41030 on luokiteltu Streptomyces virginiae -kannaksi ja viljelmä A41030,4 on luokiteltu Streptomyces 35 virginiae -kannan kemiallisesti indusoiduksi mutantiksi perustuen viljelmien Sterptomyces avidinii ATCC 27419;

II

7 75190

Streptomyces columbiensis ATCC 2745; Streptomyces goshikiensis ATCC 23914; Streptomyces griseolavendus ATCC 25457; Streptomyces lavendulae ATCC 8664; Streptomyces toxytricini ATCC 19813; ja Streptomyces virginiae 5 ATCC 19817 samanaikaiseen viljelyyn. Käytettiin menetelmiä ja elatusaineita, joita suosittelivat Shirling ja Gottlieb ("Methods of Characterization of Streptomyces Species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16 (1966) !3, 313-340), yhdessä tiettyjen täydentävien kokeitten kanssa. Vil-10 jelmää A41030,4 verrattin myös yllä lueteltujen kantojen julkaistuihin kuvauksiin, jotka esiintyvät julkaisussa Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8. painos, toimittaneet R.E. Buchanan ja N.E. Gibbons, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, Maryland); ja 15 Shirling ja Gottlieb, "Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces", Int. J. Syst. Bacteriol. 18 (1968) 2, 178.

Viljelmä A41030,4 ei muodosta ilmarihmastoa eikä itiöitä missään elatusaineessa, ja eroaa siten kaikista 20 yllä luetelluista lajeista.

A41030 tuottaa hyvin kehittyneitä ilmarihmastoja ja itiökoteloita, jotka ovat sekä kierteisiä että koukkuja ja silmukoita sisältäviä. A41030 kuuluu julkaisun Pudham et ai., "A Guide for Classification of Strepto-25 mycetes Accorging to Selected Groups", Appi. Microbiol.

6 (1957) 52-79 spiraalit (s)-osaan primaarisena morfologisena tyyppinä ja julkaisun Pridham et ai. Tetina-culum-Apertum (RA)-osaan sekundaarisena morfologisena tyyppinä. A41030,4 ei tuota ilmarihmastoa eikä itiöitä. 30 Viljelmien A41030, A41030,4 ja S. virginiae ATCC

19817 kasvuominaisuudet eri elatusaineissa on esitetty taulukossa 1.

Värien nimet annettiin julkaisujen ISCC-NBS Centroid Color Charts Standard Sample no. 2106 (National 35 Bureau of Standards, U.S. Department of Commerce, 1958) ja Color Harmony Manual, 4. painos (Color Standrads Department, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, 1958) mukaan.

I __ 8 751 90 § 1 X3 ro Ö Ö ^ * VO H H >-< Ή XI X) 6 ·

^ · ·· * * H rH

x> r- m m :ra :ra ^ η h m · JU rH >1 vx> > > in · · ns · >ιΓΟ TS oo :n5 :n) · ro ro ho vo 3 m di ·· -P >π -P >hvo vo 0 h ft·· p h tn a) tn ij.jj tn >n ... m a) en tn ns Φ ns · ·· * ·· oho nS ö ns 2 B S · I %*·% S-B S1?! G F· 3 in p -h So S-h >n—i Si ·η >*,σν ϊη-h p vo p ·η 3 m 3 -h •g < « r·· H <D -p αν -p Ο) χσ\ £ (1) (I) XJcnxjqj H r~ H qj

*—I

(1)

•I— -H

H -P

•H -P

> G

H lv

00 -H

av ft

rH

nS

O >

S H

< s h ns p

-ro nS -H

OH Si 3 iH

Λί - - S· ns > 3 h o · H in >< m on

3 - r> >, O <3 O· O· nS H

H o o :nj fr C>i C ft Gft M :n) Xl ft p ro h i> · o· O· O· > Ui ns o h So -h -h p ro -h -h p av -h -h 3 σν -h -h -h Sh -h -h

Eh .h C x: av a) a) xsovqsq) Xooqjo) x: oo a) a) <l)l l l G m m (!)

S

<

- O

o -P

m tn o ra f—4 g ^ £

*H

|j xl Ö xl _ _ ^ h rH · H · >H S jq 0) H X5 H C) fr -Il

O · · · H iX H

rH m >h n · :ni >1 ft · G

•H vd · vo (N > nS · ro < > Sm m * ijo vo

>< .· nS vo ·· ·· 4J u H Sh ·. -H

o ω o tn m ra S m ra S ra -P · ·· mora rH

ro ns · ns fr ·· ns · ns ns · rä Sh o ns · ns 0 o tn ts W :n3 S :n5 tn ft tn tn ft tn TS · G «Ό rä 5 iHC'C ?·? G · G G · G SH O G * G ft

h 3 ch 3 -h Sm Sh 3 av 3 h pop-h So p h 3 cg p h :Q

< «r^aaj x σν X o pooSia) HooHO) +J m X ra fin ii ra h

II

O OS J| CO* O PS li tX* O PS H CO* O PS tO* ϋ « | fr (X if CO* OS

a c g •H -H > ns -ui

tn 3 nS

3 cn ro h ld ju ,ν;

rt ft . A · A · A · ra nl O II

r-j ω o w o tn o tn o n tj> a W h Z hz HZ hz u ns h o 75190

Viljelmän A41030,4 valikoituja fysiologisia ominaisuuksia tutkittiin vakiomenetelmien mukaan. Ominaisuudet ja tuntomerkit on lueteltu taulukossa 2.

5 Taulukko 2 A41030,4 fysiologiset ominaisuudet

Melanoidityyppisen pigmentin tuotto elatusaineessa:_ 1. Tyrptoni-hiivauutelihaliemsi Melanoidityyppinen (ISP -ff 1) pigmentti 10 2. Peptoni-hiivatuute Melanoidityyppinen rauta-agar (ISP 6) pigmentti 3. Tyrosiiniagar Ei melanoidityyppistä (ISP 7) pigmenttiä

Nitraatin pelkistys Negatiivinen reaktio 15 Gelatiinin nesteytys Negatiivinen reaktio

NaCl-sieto 3 % Tärkkelyshydrolyysi Negatiivinen reaktio

Kuorittu maito Osittainen hydrolyysi Lämpötilavaatimukset 10-34°C.

20

Viljelmien A41030, A41030,4 ja Streptomyces virginiae ATCC 19817 vertailu hiilenkäytön suhteen suoritettiin käyttämällä ISP No. 9 peruselatusainetta, johon lisättiin suodatussteriloituja hiililähteitä lo-25 pulliseen väkevyyteen 1,0 %. Maljat luetaan 14 päivän inkuboinnin jälkeen 30°C:ssa. Tulokset on esitetty taulukossa 3.

10 751 90

Taulukko 3

Viljelmien A41030, A41030,4 ja Streptomyces virginiae ATCC 19819 hiilen käyttö Hiilen lähde A41030 A41030.4 ATCC 19817 5 Asetaatti-Na - - D-arabinoosi - L-arabinoosi -

Sellobioosi + + + D-fruktoosi + + 10 D-galaktoosi + + D-glukoosi + + + i-inositoli - -

Laktoosi - D-maltoosi + + + 15 D-mannitoli - -

Melibioosi -

Raffinoosi -

Ramnoosi - D-riboosi + - + 20 Salisiini + + +

Sukkinaatti-Na + + +

Sakkaroosi - D-ksyloosi -

Avain: - = ei käyttöä 25 + = käyttö + = osittainen käyttö 11 75190 Käyttämällä organismin hydrolysoituja kokonaisia soluja määritettiin diaminopimeliinihappoisomeerit julkaisun Becker et ai. Appi. Microbiol. 11 (1964) 421-424 menetelmän mukaan. Tämän tutkimuksen tulokset on esitet- 5 ty alla.

Koe Havaittu tulos 2,6-diaminopimeliinihapon LL-isomeeri isomeerit 10 Viljelmien A41030, A41030,4 ja Streptomyces virginiae ATCC 19817 välisten samankaltaisuuksien ja eroavaisuuksien vertailu on esitetty taulukossa 4.

Värien nimet on annettu edellä kuvatulla tavalla ja morfologia kuten on kuvattu julkaisussa Pudham et ai.

15 (supra).

12 751 90 r-·

rH

OO

td n r-H —^ (Ö to φ :to r-~ -P U — i (i n Φ g . >H g rH | •O tn >i — · O -H m

3 < Ö+i+ + + +l + igju">i+ci+itninii-H

w

•H

m tn 4-1 8 ^ •rH O ^ r-H ΓΟ ro

:r0 o 5η I

J> r-H *H *H · -H *H O

φ + + I I I + + + I <D ro I I Q|+ I (IHI I H

0 Φ < -¾ 10 1 t ιΗ ·Η 3 S’ > ω te

•ro O

ro rfl O <D :«d ro « rH —. · x φ i O >+ >i en >1 HH o ro < 0+ + + + + + + +1^-^1 + · + I O *H I i—l o ^ a tn tn "d· f£ c « o m o

rH

TT +j

δ S

B-3 Λ to c Φ > Φ Z? S ·§ •H H Es

> <D >1 W -H -H

£o 4-1 -3 -H +J >iO

B B B 3 & S S° r4— tn O O Φ

4-> :¾ :S tn -H ^H 8 B dP Φ ^ G -H -H r-H

$ >^,8 8 » c <d Ο κίΆ 8 a3B£? a G :td -P O O -H -n · ••-ri.pCtdO td O G tn to 5 OÄi4JOddooogiii-Hi23 3>3-H>iH tn ·η to x rq ·η ·η 2 2 ζ ο ·η 4-ι 5.4J ω g απ ·η •Η 4-1 C Ή Ρ ·Ρ ·|Η ·γ4 <-Η U) (0 -Η :0 4-> G _ φ 4-1 ♦H Es *H r—I rH H H H M O *P -P O P ·Η *H H g g äa aa asäa-sadäasa 13 751 90 A41030-kompleksi valmistetaan keksinnön mukaisesti viljelemällä mikro-organismia Streptomyces virginiae NRRL 515156 tai Streptomyces virginiae NRRL 12525 kasvualustassa, joka sisältää yhteyttämiskelpoisia hiili-, typpi- ja epä-5 orgaanisten suolojen lähteitä aerobisissa submerssikäy-misolosuhteissa, kunnes riittävä antibioottinen aktiivi-suustaso on saavutettu. Suurin osa antibioottisesta aktiivisuudesta löytyy viljelyliemestä, kun taas pienempää antibioottista aktiivisuutta voidaan osoittaa rihmastossa.

10 A41030-kompleksi on helposti eristettävissä käymisseok-sesta poistamalla rihmasto, s.o. biomassa suodattamalla. Rihmasto heitetään yleensä pois. Antibioottikompleksi eristetään sitten suodatetusta käymisliemestä edullisesti pylväskromatografisesti sopivan adsorbentin läpi käyt-15 täen eluoivana aineena esimerkiksi metanoli : vettä (1:1).

Sopiviin adsorbentteihin kuuluvat hiili, alumiinioksidi, anionin- ja kationinvaihtohartsit, silikagee-li, polyamidi, karboksimetyyliselluloosat, styreenin ja divinyylibentseenin erittäin huokoiset kopolymeerit kuten 20 Diaion HP-20, Amberlite XAD-hartsit ja Duolite-hartsit kuten ES-865 ja vastaavat, samoin kuin Sephadex-hartsit, hydrofiiliset liukenemattomat kromatografiset molekyyli-seulaväliaineet, jotka on valmistettu dekstraania verkkout-tamalla ja myös TSK-geelit. Diaion-hartsien valmistaja 25 on Mitsubishi Chemical Industries, Limited Tokyo, Japan. Amberlite XAD-hartsit tuottavat Rohm and Haas, Philadelphia, Pennsylvania. Duolite-hartsit tuottaa Diamond Shamrock, Redwood City, California. Sephadex-hartsi tuottaa Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden. TSK-geelejä on 30 saatavana yhtiöltä E. Merck, Darmstadt ja Bio-Rad, 2200 Wright Ave., Richmond, California, 94804.

A41030-antibioottikompleksi voidaan puhdistaa edelleen ja erottaa yksittäisiin tekijöihinsä kromatografisilla menetelmillä.

35 Joukkoa erilaisia elatusaineita voidaan käyttää kannan Streptomyces virginiae NRRL 12525 tai S. virginiae 14 751 90 NRRL 15156 kanssa A41030-kompleksin tuottamiseksi. Tuotannon taloudellisuuden, optimisaannon ja tuotteen eristämisen helppouden vuoksi ovat tietyt viljelyalustat kuitenkin edullisia. Näiden elatusaineitten tulisi sisältää 5 yhteyttämiskelpoisia hiili-, typpi- ja epäorgaanisten suolojen lähteitä. Sopiviin hiililähteisiin kuuluvat dekstriini, tärkkelys, mannoosi, glyseroli ja puuvillan-siemenöljy. Hiililähteiden optimitasot ovat noin 2 - noin 3 painoprosenttia.

]_o Edullisiin typpilähteisiin kuuluvat soijapapurou- heet, soijapapujauho, maapähkinäjauhe, kalajauhe, liha-peptoni ja sianverijauhe.

Organismin kasvulle ja kehitykselle välttämättömät hivenaineet voivat esiintyä epäpuhtauksina muissa alustan 15 aineosissa riittävissä määrin kohtaamaan organismin kasvu- ja biosynteettiset vaatimukset. Kuitenkin voi olla edullista sisällyttää viljelyalustaan lisäksi liukenevia epäorgaanisia suolaravinteita, jotka pystyvät antamaan käytettäväksi natrium-,kalium-, magnesium-, kalsium-, am-20 monium-, kloridi-, karbonaatti-, fosfaatti-, sulfaatti-, nitraatti- ja vastaavia ioneja.

Tween 80:n (öljymäinen nestemäinen polyoksiety-leenisorbitaanimono-oleaatti, ICI Americas Inc., Wilmington, Del.) lisääminen määränä 2-4 % käymisalustaan auttaa 25 nostamaan saannon noin 300 %:lla. Kuitenkin näissä olosuhteissa koetaan vaikeuksia eristettäessä A41030-anti-biootti.

Vaikka pieniä määriä A41030-antibioottia voidaan saada ravistelukolviviljelmällä, on aerobinen submerssi-30 käyminen tankeissa edullista huomattavien antibiotti A41030-määrien tuottamiseksi. Tankkikäymisessä on edullista käyttää vegatatiivista ymppiä. Vegetatiivinen ymp-pi valmistetaan ymppäämällä itiöitä tai rihmasto-osia pieneen tilavuuteen viljelyalustaa tuoreen, aktiivisesti 35 kasvavan viljelmän saamiseksi. Vegetatiivinen ymppi siirretään sitten suurempaan tankkiin, jossa sopivan inkuboin-tiajan jälkeen A41030-antibioottia tuotetaan optimisaan-nolla.

Il 15 751 90

Vaihtoehtoisen menetelmän vegetatiivisen kasvualustan ympin tuottamiseksi muodostaa itiöiden vesisuspension korvaaminen lyofilisoidulla pelletillä. Lyofi-lisoidut pelletit valmistetaan alalla tunnetulla menetel-5 mällä. Itiösuspension valmistus lyofilisointiin on samanlainen kuin itiöiden vesisuspension valmistus, paitsi että steriilin tislatun veden asemesta käytetään steriiliä vasikan seerumia.

A41030 -tuottava organismi voidaan kasvattaa laa-10 jalla lämpötila-alueella noin 10 - noin 34°C. A-41030-antibioottikompleksin optimituotanto näyttää tapahtuvan lämpötilassa noin 30°C.

Kuten aerobisissa submerssiviljelymenetelmissä on tavanomaista, steriiliä ilmaa dispergoidaan kautta vil-15 jelyalustan. Organismin tehokasta kasvua silmällä pitäen tankkituotannossa käytetyn ilman tilavuus on alueella noin 0,1 - noin 0,5 tilavuutta ilmaa viljelyalustan tilavuutta kohti minuutissa (til/til/min) sekoitettaessa noin 100 - noin 300 r/min. Optiminopues 165 litran as-20 tiassa, joka sisältää 100 litraa käymisalustaa, on noin 0,25 til/til/min, jolloin sekoitus suoritetaan juoksu-pyörällä, joka pyörii noin 200 r/min.

Antibioottinen aktiivisuus ilmenee yleensä noin 48 tunnin kuluttua ja säilyy vähintään 144 tuntia käy-25 misen aikana. Antibioottituotannon huippu ilmenee noin 96 - noin 120 tunnin käymisen jälkeen.

A41030-antibiootin tuotantoa voidaan seurata käymisen aikana jokoagardiffuusion avulla käyttäen B. subti-lis, tai turbidometrisellä menetelmällä käyttäen Staphy-30 loccus aureus ATCC 9114.

Uusi antibioottikompleksi ja sen yksittäiset tekijät tuotetaan joko käyttäen S. virginiae NRRL 15156 tai S. virginiae NRRL 12525 käymisolosuhteissa, jotka lämpötilalta, kestolta ja alusta-aineosilta ovat olennaisesti 35 samat. Kuitenkin tällaisissa olosuhteissa S. virginiae NRRL 12525 näyttää tuottavan antibioottikompleksia jonkin verran runsaammin.

“ 75190

Keksintöä kuvataan täydellisemmin seuraavien esimerkkien avulla.

Esimerkki 1

Ensimmäisessä vaiheessa käytetyn siirrostuksen 5 valmistaminen

Seuraava alusta valmistettiin käytettäväksi Streptomyces virginiae NRRL 12525 ja Streptomyces virgi-niae NRRL 15156 agarviljelyssä:

Aineosa Määrä (g/1) 10 Dekstroosi^ 10,0

Hiivauute 1,0 2

Entsyymillä hydrolysoitu kaseiini 2,0

Lihauute 1,0

CoC12'6H20 0,01 15 Agar 20,0

Ioninvaihtovesi g.s. 1 litraksi 1Matheson Coleman & Bell, Norwood, Ohio 45212 2 N-Z-amine A (Humko Sheffield Chemical Co., Memphis, 20 Tenn.).

Valmiin alustan pH oli 6,5 ja se säädettiin 7,3:ksi käyttämällä 5 N natriumhydroksidin vesiliuosta ennen autoklavointia. Autoklavoinnin jälkeen alustan pH oli 6,9.

25 Kummankin mikro-organismin itiöitä ympättiin aga- rille, joka oli tehty edellä luetelluista aineosista, ja tätä alustaa inkuboitiin noin 6 vrk noin 30°C:ssa. Kypsä viljelmä peitettiin sitten steriilillä tislatulla vedellä ja raaputettiin steriilillä työkalulla itiöiden 30 ja rihmaston irroittamiseksi. Yksi millilitra saatua itiösuspensiota käytettiin 50 ml:n vegetatiivista alustaa ymppäämiseen. Vaihtoehtoinen menetelmä vegetatiivi-sen alustan ympin saamiseksi muodostui itiöiden vesi-suspension korvaamisesta lyofilisoidulla pelletillä.

35 NRRL 12525:lie tarkoitetun vegetatiivisen alustan koostumus oli seuraava:

II

17 751 90

Aineosa Määrä (g/1)

Glukoosi 20,0

Soijapapurouhetta (tai soijajauhoja) 15,0 5 Maissin liotusliemi 10,0

CaC03 2,0

Vesijohtovettä q.s. 1 litraksi NRRL 15156:lle tarkoitetun vegetatiivisen alus-10 tan koostumus oli seuraava:

Aineosa Määrä (g/1)

Glukoosi 15,0

Dekstriini 20,0

Soijapapurouhetta (tai soijajau-15 hoja) 15,0

Maissin liotusliemi 10,0

CaC03 2,0

Vesijohtovettä q.s. 1 litraksi 20 Alustan säätämätön pH oli 5,5, joka säädettiin pH-arvoon 6,5 5N natriumhydroksidin vesiliuoksella ennen autoklavointia. Alustan pH autoklavoinnin jälkeen oli 7,0.

Kumpikin vegetatiivinen alusta inkuboitiin 25 250 ml:n laajuisessa Erlenmeyer-kolvissa, joka sisälsi 50 ml alustaa, noin 30°C:ssa noin 48 tuntia ravistelu-laitteessa, joka kiersi läpimitaltaan 5 cm kaarta 250 r/min. Tätä inkuboitua alustaa käytetään joko pienten fermentoreiden ymppäämiseen (ymppiä on noin 1 % fer-30 mentorin alustatilavuutta kohti) tai toisen vaiheen kasvualustan ymppäämiseen, jolla on sama koostumus kuin vegetatiivisella alustalla, suuremman viljelytilavuu-den tuottamiseen.

NRRL 15156:n käyminen 35 50 millilitraa tuotantoalustaa ympättiin 1 %:lla (0,5 ml) inkuboitua vegetatiivista edellä valmistettua alustaa. Tuotantoalustan koostumus oli seuraava: 18 751 90

Aineosa Määrä (g/1)

Dekstriini^ 30,0

Soijapapurouhetta 6,0 k2hpo4 1,0 5 FeS04‘7H20 0,005

MgS04’7H20 1,0

NaN03 1,0

CaC03 2,O2

Ioninvaihtovesi g.s. 1 litraksi 10 1Desktriini voi olla joko tapioka- tai perunadekstriiniä. 2 NRRL 12525 :n käymisessä CaCC>3-väkevyys oli 4,0 g/1. K2HPC>4 liuotettiin veteen, liuos steriloitiin erillään ja tarvittava määrä liuosta lisättiin toisiin alustan aineosiin, jotka oli autoklavoitu.

15 Ympätty käymisalusta, 50 ml, inkuboitiin 250 ml:n

Erlenmeyer-kolvissa noin 30°C:ssa noin 4-5 vrk raviste-lulaitteessa, joka kiersi läpimitaltaan 5 cm kaarta 250 r/min.

Streptomyces virginiae NRRL 12525 inkuboitiin 20 myös käymisessä, joka suoritettiin suuremmassa mittakaavassa 165 1 ja 6400 1 tankeissa käyttäen edellä kuvattua tuotantoalustaa.

Ympätyn tuotantoalustan annettiin käydä 165 litran fermentorissa, joka sisälsi 100 litraa alustaa, noin 25 210 tunnin ajan (8,75 vrk) lämpötilassa noin 32°C. Käy- misalustaa ilmastettiin steriilillä ilmalla nopeudella 0,25 til/til/min ja sitä sekoitettiin tavanomaisilla sekoittimilla noin 200 r/min nopeudella.

Tämä suurimittakaavainen NRRL 12525:n käyminen 30 oli lähde, josta A41030 antibiootit eristettiin alla kuvatulla tavalla.

Esimerkki 2 A41030-antibioottinen eristys

Koko käymisliemi (4215 litraa), joka oli saatu· 35 esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, suodatettiin käyttämällä suodatusapuainetta (Hyflo Supercel, piimää, Johns-

II

19 751 90

Manville Products Corporation) suodatuspuristimessa. Suodatettu liemi siirrettiin pylvääseen, joka sisälsi 100 1 Diaion HP-20 (erittäin huokoinen styreeni-divinyy-libentseenikopolymeeri helmimuodossa, Mitsubishi Chemical 5 Industries, Limited, Tokyo, Japan) 4 1/min virtausnopeudella. Pylväs pestiin peräkkäin 300 1:11a vettä ja 1000 1:11a metanoli:vettä (1:3) nopeudella 4 1/min. Eluointi suoritettiin metanoli : vedellä (1:1) nopeudella 6 1/min keräten 100 1 fraktioita. Jokaisen fraktion bio-10 loginen aktiivisuus tutkittiin. Biokoe suoritettiin pa-perikiekkokokeena agarlevyillä, jotka oli ympätty Bacillus subtilis'ilia. Fraktio 1 heitettiin pois. Fraktiot 2-15 yhdistettiin, väkevöitiin alennetussa paineessa ja väkevöite lyofilisoitiin, jolloin saatiin 220 g 15 raakaa antibioottikompleksia.

Erä tätä kompleksia, 110 g, liuotettiin 5 l:aan metanoli:vettä (1:1) säätämällä pH 10:ksi natriumhydrok-sidin vesiliuoksella ja seos suodatettiin. Suodos siirrettiin 50 ml/min nopeudella 30 l:n karkeaan Sephadex 20 G-50 (hydrofiilinen, liukenematon, kromatografinen mole- kyyliseulaväliaine, valmistettu dekstraania verkkouttamal-la, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ 08854 pylvääseen (0,2 x 1 m), joka oli aikaisemmin tasapainotettu metanoli:vedellä (1:1). Pylväs eluoitiin metanoli:vedel-25 la (1:1) 50 ml/min nopeudella keräten 3 1 fraktioita. Fraktiot 1-12 heitettiin pois. Fraktiot 13-24, jotka osoittivat aktiivisuutta B. substilis'ta vastaan, yhdistettiin, väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofi-lisoitiin, jolloin saatiin 35,7 g A41030-antibiootti-30 kompleksia.

Tämän keksinnön mukaisesti tuotetut antibioottiset aineet nimitetään tässä mielivaltaisesti A41030-antibiooteiksi. A41030-kompleksi sisältää useita tekijöitä, jotka nimitetään A41030-tekijöiksi A, B, C, D, 35 E, F ja G. Termiä "A41030-antibiootti" käytetään lyhyyden vuoksi merkitsemään A41030-kompleksin muodostavasta 20 751 90 joukosta valittua jäsentä ja A41030-tekijöitä A, B, C, D, E, F ja G.

Käymisestä saadaan talteen kaikkiaan seitsemän antibioottista tekijää, ja ne saadaan seoksena, A41030-5 kompleksina. On huomattava, että tekijöiden suhde A41030-kopleksissa voi vaihdella riippuen käytetyistä käymisolosuhteista. Yksittäiset tekijät A, B, C, D, E, F ja G eristetään ja erotetaan erillisiksi yhdisteiksi myöhemmin kuvatulla tavalla. A41030-kompleksi liukenee 10 liuottimiin kuten veteen, laimeaan hapon vesiliuokseen, laimeaan emäksen vesiliuokseen, metanoli-vesiseoksiin, etanoli-vesiseoksiin, dimetyyliformamidiin ja dimetyy-liformamidi-vesiseoksiin, dimetyylisulfoksidiin, dime-tyylisulfoksidi-vesiseoksiin, asetonitriiliin, aseto-15 niin, etyyliasetaattiin, tetrahvdrofuraaniin tai mety-leenikloridiin.

Seuraavassa kuvataan A41030-tekijöiden eristystä samoin kuin niiden fysikaalisia ja spektraaliominaisuuk-sia.

20 Esimerkki 3 A41030 tekijän A eristäminen 8 g:n erä A41030-kompleksia esimerkistä 2 liuotettiin 200 ml:aan liuotinta, jonka muodostivat vesiiase-tonitriili:natriumkloridi (84:16:2 g/1), ja suodatettiin. 25 Suodos siirrettiin ruostumattomaan teräspylvääseen (8x100 cm), joka oli täytetty 4 1:11a 10-20 mikronin LP-l/C.Q-käänteisfaasisilikageeliä, joka oli valmistet-lo tu laboratorioissamme erikoismenetelmällä, joka on kuvattu US-patentin 4 299 763 esimerkeissä 6 ja 7. Pylväs 30 oli osa Chromatospac Prep-100-yksikköä (Jobin Yvon, 16-18 Rue du Canal 91160 Longjumeau, France). Pylväs eluoitiin nopeudella 60 ml/min vesi:asetonitriili:natriumkloridilla (84:16:2 g/1) ottaen talteen 480 ml fraktioita. Eluaat-tia tarkkailtiin 254 nm:llä käyttäen ISCO Model UA-5 UV-35 laitetta Type 6 optisella yksiköllä varustettuna (Instrumentation Specialities Co., Lincoln, Ne 68505). Valituis- 21 75190 ta fraktioista tutkittiin niiden sisältämä tekijä A analyyttisellä suuren suorituskyvyn nestekromatografiällä (HPLC) 4,6 x 250 mm ruostumattomassa teräspylväässä, joka oli täytetty laboratorioissamme 10 mikronin LP-l/C^g-lla, 5 joka oli valmistettu laboratorioissamme edellä kuvatulla erikoismenetelmällä. Näyte injisoitiin Rheodyne Model 7120 suihkuventtiilin läpi (Rheodyne Inc., Berkeley, CA 94710). Liuotin, joka koostui vesirasetonitriilitnatrium-asetaatista (81:19:0,03M) säädettynä pH-arvoon 6 jääeti-10 kalla, tuotettiin 1 ml/min nopeudella (8400 kPa) Milton Roy Duplex Minipum-laitteella (Laboratory Data Control, Division of Milton Roy Co., Riviera Beach, FL 33404).

Tekijä A havaittiin kohdalla 254 nm käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Fraktiot 1-51 heitettiin pois. Frak-15 tiot 52-79, jotka sisälsivät runsaasti tekijää A, yhdistettiin ja väkevöitiin alennetussa paineessa 500 ml tilavuuteen. Väkevöite säädettiin pH-arvoon 8,2 natrium-hydroksidin vesiliuoksella ja suodatettiin. Suodos siirrettiin 15 ml/min nopeudella 100 ml:lie diaion HP-20-20 hartsia pylväässä (2,8 x 22 cm), joka aikaisemmin oli tasapainotettu vedellä. Pylväs pestiin vedellä (400 ml, säädettynä pH-arvoon 2,5 muurahaishapolla), kunnes kloridia ei enää havaittu pesunesteessä hopeakloridiksi saostamalla. Eluointi suoritettiin vesi:asetonitriilil-25 lä (8:2) 15 ml/min keräten 1 1 fraktioita. Fraktioista analysoitiin niiden aktiivisuus B. substilis'ta vastaan. Kiteinen tekijä A, joka muodostui fraktiossa 2 jäähdytettäessä, otettiin talteen suodattamalla (389,6 mg). Fraktio 1 ja suodos fraktiosta 2 väkevöitiin molemmat 30 alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 731,8 mg ja 514 mg tekijää A vastaavasti.

Antibiootti A41030 tekijä A on valkoinen kiteinen kiinteä aine. A41030:n alkuaineanalyysi osoittaa, että sen summittainen prosentuaalinen koostumus on seu-35 raava: 56,44 % hiiltä, 3,58 % vetyä, 8,11 % typpeä, 23,20 % happea ja 8,29 % klooria. Kenttädesorptio- ja plasmadesorptiomassaspektrometrisesti määritettynä 22 751 90 A41030 tekijä A:n molekyylipaino on 1231. Alkuaineanalyysiin ja molekyylipainoon perustuen tekijälle A annetaan empiirinen kaava C58H44C13N7°i8. Tekijän A elektro-metrinen titraus 66-%:isessa dimetyyliformamidissa ve-5 dessä viittaa kolmen titrauskelpoisen ryhmän läsnäoloon, joiden pK -arvot ovat noin 5,53, 7,60 ja 10,37, lisäksi a mahdolliset pK :t >10,5 (lähtö pH 7,83). Antibiootin a 2 5 o A41030 tekijän A ominaiskierto on seuraava: ^ -19,6 (c, 9,0 dimetyylisulfoksidissa).

10 A41030 tekijän A infrapuna-absorptiospektri KBr- tabletissa on esitetty liitteenä olevassa kuviossa 1. Huomioidaan seuraavat erotettavat absorptiomaksimit: 3448-3226 (voimakas, leveä), 1653 (voimakas), 1610 (heikko) , 1587 (keskinkertainen), 1515 (voimakas), 1488 (heik-15 ko), 1429 (keskinkertainen), 1227 (voimakas), 1139 (keskinkertainen) , 1064 (voimakas) ja 1010 (voimakas) cm A41030 tekijöiden A-G ultravioletit absorptio-maksimit metanoli : vedessä (1:1) happamissa, neutraaleissa ja emäksisissä olosuhteissa on esitetty taulukossa 5.

20

Taulukko 5 A41030 tekijät UV-spektrofotometrisesti Tekijä Hapan tai neutraali Emäksinen max nm (£) max nm (£) 25 A 278 (11,100) 298 (17,200) B 278 (9,600) 298 (16,800) C 278 (8,400) 298 (14,000) D 278 (10,600) 298 (19,900) E 278 (8,500) 298 (15,500) 30 F 278 (9,300) 298 (14,500) G 278 (15,000) 298 (18,000)

Antibioottinen A41030 tekijä A liukenee alkoholi-vesiseoksiin, dimetyylisulfoksidiin, dimetyyliformami-35 diin, dimetyylisulfoksidivesiseoksiin, dimetyyliformami-di-vesiseoksiin, laimeaan hapon vesiliuokseen ja laimeaan emäksen vesiliuokseen.

23 7 5 1 9 0

Havaittujen fysikaalisten ja kemiallisten tietojen perusteella A41030 tekijälle A on määritelty seu-raava rakenne:

5 OH

/yoyV°T1 ho-ch-L^c1 kyJ clA^iH2

* CH

10 0=C NH °^C NH \

\^° 1 c^° ilH NH

0NH \ /NH \ κ \ » CH XCH £=0

HO-C-CH I

l CHX

X xnh is r 0 Π ^ 2

HO ''^/'"OH 0H HO

20 Biologista analyysiä ja suuren suorituskyvyn nestekromatografista analyysiä käyttäen on todettu, että tekijä A kattaa noin 94 - noin 96 paino-% A41030,4-viljelmän tuotetuista antibioottisista tekijöistä tekijöiden B, C, D, E, F ja G kattaessa loput noin 4 - 25 noin 6 paino-% tuotetuista tekijöistä.

Esimerkki 4 A41030 tekijän B eristäminen 1,0 g:n erä A41030-kompleksia liuotettiin 35 ml:aan liuotinta, jonka muodostivat vesi:asetonitriili:natrium- 30 kloridi (85:15:2 g/1), ja liuos siirrettiin 4,7 x 45 cm Michel-Miller suuren suorituskyvynmatalapainenestekro-matografia (HPLPLC)-lasipylvääseen (Ace Glass, Inc., Vineland, NJ 08360), joka oli täytetty laboratorioissamme 25-40 mikronin LiChroprep RP-18:lla (hiilivetyfaa- 35 si (C^g) kemiallisesti silikageeliin sidottu, yhtiöltä MC/B Manufacturing Chemists, Inc., Cincinnati, OH), 24 7 5 1 90 FMI venttiilitöntä mäntäpumppua (Fluid Metering Inc., Oyster Bay, NY 11771) käytettiin pylvään eluoimiseen nopeudella 21 ml/min (700 kPa) samalla liuotinyhdistel-mällä, jota käytettiin näytteen liuottamiseen, keräten 5 21 ml fraktioita. Eluaattia tarkkailtiin 280 nm:llä käyt täen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Fraktiot 1-183 heitettiin pois. Fraktiot 184-245, jotka sisälsivät runsaasti tekijää B, yhdistettiin ja väkevöitiin alennetussa paineessa 25 ml:ksi. Väkevöitteet seitsemästä samanlai-10 sesta puhdistuksesta yhdistettiin, laimennettiin 1,4 l:ksi vedellä ja siirrettiin 8-10 ml/min 100 mlrlle Diaion HP-20-hartsia pylväässä, joka aikaisemmin oli tasapainotettu vedellä. Pylvästä pestiin vedellä (600 ml), kunnes kloridia ei enää havaittu pesunesteessä hopeakloridina saos-15 tamalla. Eluointi suoritettiin vesi:metanolilla (1:1) 8-10 ml/min keräten 300 ml fraktioita. Fraktioitten aktiivisuus B. substilis'ta vastaan analysoitiin. Fraktiot 1-5 yhdistettiin, väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 523 mg raakaa tekijää B.

20 Tekijän B kahden yhdistetyn raakavalmisteen muo dostama 550 mg:n erä liuotettiin 10 ml:aan liuotinta, jonka muodostivat vesi:asetonitriili: dibutyyliamiini (75:25:0,03M), joka liuotin oli säädetty pH-arvoon 7,8 fosforihapolla lisäämällä tetrabutyyliammoniumhydroksi-25 dia, kunnes liukeneminen oli tapahtunut. Liuos siirrettiin 2,8 x 59 cm Michel-Miller HPLPLC-lasipylvääseen, joka oli täytetty 25-40 mikronin LiChroprep RP-8:lla (hiilivetyfaasi (Cg) kemiallisesti sidottu silikagee-liin, yhtiöltä MC/B Manufacturing Chemists, Inc., Cin-30 cinnati, OH). Käyttämällä FMI-pumppua eluoitiin pylväs nopeudella 5 ml/min (245 kPa) samalla liuotinyhdistelmäl-lä, jota käytettiin näytteen liuottamiseen. Eluaattia tarkkailtiin 254 nmrllä käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Valikoidut 27 ml fraktiot analysoitiin teki-35 jän B esiintymisen suhteen analyyttisellä HPLC:llä 4,6 x 250 mm ruostumattomassa teräspylväässä, joka oli täytet-

II

75190 ty 10 mikronin LiChrosorb RP-18:lla (kaupallisesti saatava, käänteisfaasi-silikageeli, valmistaja E. Merck, Darmstadt, Germany). Näyte injisoitiin käyttämällä Rheodyne Model 7120 suihkuventtiiliä. Liuotin, jonka muodostivat vesi: 5 asetonitriili:dibutyyliamiini (82:18:0,03M) säädettynä pH-arvoon 2,5 fosforihapolla, tuotettiin 1 ml/min nopeudella (5250 kPa) pumpulla Constametric lii (LDC-laborato-ry Data Control, Division of Milton Roy Co., Riviera Beach, FL 33404). Tekijä B havaittiin kohdalla 225 nm käyttäen 10 LDC Spectro Monitor III muuntuvan aallonpituuden UV-ilmai-sinta. RP-8-pylvään eluaattierä 999-1296 ml, runsaasti tekijää B sisältävä, väkevöitiin 200 ml tilavuuteen. Väkevöi-te laimennettiin 500 ml tilavuuteen, säädettiin pH-arvoon 2,0 fosforihapolla ja natriumkloridia (1 mg/ml) lisättiin 15 ionimerkiksi. Tämä liuos siirrettiin 20 ml/min nopeudella 100 ml:lle Diaion HP-20-hartsia pylväässä (2,8 x 22 cm), joka aikaisemmin oli tasapainotettu vedellä. Pylvästä pestiin vedellä (500 ml), joka oli säädetty pH-arvoon 2,5 muurahaishapon vesiliuoksella, kunnes kloridia ei enää 20 havaittu pesunesteessä hopeakloridina saostamalla. Sitten pylväs eluoitiin 1 1:11a vesi:asetonitriiliä (6:4) 30 ml/min nopeudella. Eluaatti väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 195,6 mg raakaa tekijää B.

25 285 mg:n erä tätä valmistetta liuotettiin 30 ml:aan dimetyyliformamidi:vettä (4:6) lämmittäen, jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja jäähdytettiin edelleen, jolloin tekijä B saostui. Sakka otettiin talteen suodattamalla, pestiin asetonilla ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saa-30 tiin 84 mg tekijää B.

Antibiootti A41030 tekijä B on valkoinen kiinteä aine, jonka summittainen alkuaineanalyysi on seuraava: 58,54 % hiiltä, 4,21 % vetyä, 8,63 % typpeä, 5,96 % klooria, ja erotuksen mukaan 22,66 % happea. Tekijän B elek-35 trometrinen titraus 66-%:isessa dimetyyliformamidissa vedessä osoittaa kahden titrauskelpoisen ryhmän läsnäolon 26 7 5 1 90 pK -arvoilla noin 5,6 ja 7,5, vastaavasti, lisäksi mah- cl elolliset pK :t >10 (lähtö-pH 6,22). Huomioitu molekyy- d lipaino noin 1197 saatiin käyttämällä nopea-atomipommi-tusmassaspektrometriaa. Alkuaineanalyysiin ja havaittuun 5 molekyylipainoon perustuen tekijälle B on määritelty empiiriseksi kaavaksi CggH^C^N^O^g.

Antibiootin A41030 tekijän B infrapuna-absorptio-spektri KBr-tabletissa on esitetty liitteenä olevassa kuviossa 2. Huomioidaan seuraavat erottuvat absorptio-10 maksimit: 3448-3226 (voimakas, leveä), 1653 (voimakas), 1610 (keskinkertainen), 1587 (heikko), 1515 (voimakas), 1488 (heikko), 1429 (keskinkertainen), 1290 (heikko), 1227 (voimakas), 1139 (keskinkertainen), 1064 (voimakas) , ja 1010 (voimakas) cm 15 A41030 tekijän B ultravioletti-absorptiomaksimit neutraalissa, happamassa ja emäksisessä metanoli:vedessä (1:1) on esitetty taulukossa 5.

Antibiootti A41030 tekijä B liukenee samoihin liuottimiin kuin tekijä A.

20 Havaittujen fysikaalisten ja kemiallisten tieto jen perusteella A41030 tekijä B:lle on määritelty seu-raava rakenne:

OH

25

Ho-CH—JA A JA 4

Cl y ci^aaACH2

CH JZ H CH

o=c^\ °^C \ ^

I N,H . | NH NH

“ . f- YJ. \ . i- L

HO-C-CH 'CH/ \ CH

l” οι \nh2 35 ArV Ail HO OH OH H°

II

75190

Esimerkki 5 A41030 tekijän C eristäminen 9,0 g:n erä A41030-kompleksia liuotettiin 200 ml:aan liuotinta, jonka muodostivat vesi:asetonitriili:natrium-5 kloridi (83:17:2 g/1) ja liuos suodatettiin. Suodos siirrettiin 8 x 100 cm ruostumattomalle teräspylväälle, joka oli täytetty 4 1:11a 10-20 mikronin LP-l/C^g-käänteis-faasi-silikageeliä, joka oli valmistettu laboratorioissamme esimerkissä 3 kuvatulla erikoismenetelmällä. Pylväs, 10 osa Chromatospac Prep-100 -yksiköstä, eluoitiin nopeudella 60 ml/min samalla liuotinyhdistelmällä, jota käytettiin näytteen liuottamiseen, ja 480 ml fraktioita kerättiin. Eluaattia tarkkailtiin 254 nm:llä käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Valikoidut fraktiot ana-15 lysoitiin niissä esiintyvä tekijän C suhteen analyyttisellä HPLPLC:llä 0,8 x 30 cm Michel-Miller-lasipylvääl-lä, joka oli täytetty laboratorioissamme 25-40 mikronin LiChroprep RP-8:lla. Liuotin, vesi:asetonitriilinatrium-kloridi (84:16:2 g/1) toimitettiin nopeudella 4 ml/min 20 FMI pumpulla. Tekijä C todettiin 254 nm:llä käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Fraktiot 28-52, jotka sisältävät runsaasti tekijää C, yhdistettiin ja väke-vöitiin alennetussa paineessa 500 ml:n tilavuuteen.

Väkevöitteet kahdesta samanlaisesta puhdistukses-25 ta yhdistettiin, suodatettiin ja siirrettiin nopeudella 10 ml/min 100 ml:lle Diaion HP-20-hartsia pylväässä (2,8 x 22 cm), joka oli aikaisemmin tasapainotettu vedellä. Pylväs pestiin vedellä (21), kunnes kloridia ei enää todettu pesunesteessä hopeakloridina saostamal-30 la. Eluointi suoritettiin 1 1:11a vesi:asetonitriiliä (6:4) nopeudella 15 ml/min. Eluaatti väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 2,75 g tekijän C suhteen rikastettua tekijöiden seosta.

1,25 g:n erä tätä seosta liuotettiin 25 ml:aan liuo-35 tinta, joka koostui vesi:asetonitriili:dibutyyliamii-nista (80:20:0,03M, joka liuotin oli säädetty pH-ar- __ -· i.

28 751 90 voon 7,8 fosforihapolla) lisäämällä tetrabutyyliammonium-hydroksidia, kunnes liukeneminen oli tapahtunut. Näyte siirrettiin 2,8 x 59 mikronin LiChroprep RP-8:lle ja pylväs eluoitiin 4 ml/min nopeudella käyttäen FMI-pump-5 pua samalla liuotinyhdistelmällä, jota käytettiin näytteen liuottamiseen. Eluaattia tarkkailtiin 254 nm:llä käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Valitut 28 ml:n fraktiot analysoitiin niiden sisältämän tekijän C suhteen analyyttisellä HPLC:llä 4,6 x 150 mm ruostumatto-10 massa teräspylväässä, joka oli täytetty laboratoriossamme 10 mikronin Nucleosil Chiliä (kaupallisesti saatava käänteisfaasisilikageeli, valmistaja Rainin Instrument Co., Inc., Woburn, MA 01801). Näyte injisoitiin käyttäen Rheodyne Model 7120 suihkuventtiiliä. Liuotin, jonka muo-15 dostavat vesi:asetonitriili:natriumasetaatti (81:19:2 g/1) säädettynä pH-arvoon 6 jääetikalla, toimitettiin 1 ml/min nopeudella Milton Roy Duplex Minipump -pumpulla. Tekijä C todettiin kohdalla 225 nm käyttäen ISCO Model 1800 muuttuvan aallonpituuden UV-ilmaisinta. Osa eluaatista, 20 4,2-5,1 1, joka sisälsi runsaasti tekijää C, väkevöitiin alennetussa paineessa 500 ml tilavuuteen.

Väkevöitteet kolmesta samanlaisesta puhdistuksesta yhdistettiin ja liuotettiin lisäämällä fosforihappoa pH-arvoon 1,7. Natriumkloridia (1 mg/1) lisättiin ioni-25 merkiksi. Näyte siirrettiin nopeudella 20 ml/min 100 ml:lle Diaion HP-20-hartsia pylvääseen (2,8 x 22 cm), joka oli aikaisemmin tasapainotettu vedellä. Pylväs pestiin muurahaishapon vesiliuoksella, pH 2,5 (300 ml), kunnes kloridia ei enää todettu pesunesteessä hopeakloridina 30 saostamalla. Pylväs eluoitiin 1 1:11a vesi:asetonitrii-liä (6:4) nopeudella 30 ml/min. Eluaatti kerättiin, väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 0,87 g osittain puhdistettua tekijää C. Tämä valmiste liuotettiin 20 mlraan liuotinta, jonka muo-35 dosti vesi:asetonitriili:dibutyyliamiini (80:20:0,03M, joka liuotin oli säädetty pH-arvoon 7,8 fosforihapolla) 29 751 90 lisäämällä tetrabutyyliammoniumhydroksidia, kunnes liukeneminen oli tapahtunut. Näyte kromatografoitiin 25-40 mikronin LiChroprep RP-8:lla 2,8 x 59 cm Michel-Miller-lasipylväässä, kuten edellä on kuvattu. Osa 2,4 5-5 3,20 l:n eluaatista väkevöitiin alennetussa paineessa 500 ml:n tilavuuteen.

Väkevöitteet kahdesta samanlaisesta puhdistuksesta yhdistettiin ja niistä poistettiin suolat pylväässä, joka sisälsi Diaion HP-20-hartsia, edellä kuvatulla melo netelmällä. Eluaatti väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 688 mg tekijää C.

678 mg:n erä tätä valmistetta liuotettiin 60 mitään vesitasetonitriiliä (6:4) lämmittäen. Liuos jäähdytettiin ja tekijä C saostettiin edelleen jäähdyttämällä.

15 Sakka otettiin talteen suodattamalla, pestiin asetonilla ja kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 428 mg tekijää C.

Antibioottinen A41030 tekijä C on valkoinen kiinteä aine, jonka summittainen alkuaineanalyysi on seuraa-20 va: 48,87 % hiiltä, 4,39 % vetyä, 6,16 % typpeä, 6,96 % klooria ja 33,81 % happea. Tekijän C elektrometrinen titraus 66-%:isessa dimetyyliformamidissa vedessä osoitti kahden titrauskelpoisen ryhmän läsnäoloa pK -arvoilla noin 5,5 ja 7,1 vastaavasti, lisäksi mahdolliset pK :t cl 25 >10 (lähtö-pH 6,6). Havaittu molekyylipaino noin 1393 saatiin käyttämällä nopea-atomipommitusmassaspektromet-riaa. Alkuaineanalyysiin ja havaittuun molekyylipainoon perustuen tekijälle C annetaan empiirinen kaava C64H54C13N7°23· 30 Antibiottisen A41030 tekijän C infrapuna-absorp- tiospektri KBr-tabletissa on esitetty liitteenä olevassa kuviossa 3. Huomataan seuraavat erotettavat absorptiomak-simit: 3448-3226 (voimakas, leveä), 1653 (voimakas), 1610 (keskinkertainen), 1587 (heikko), 1504 (voimakas), 1481 35 (heikko), 1429 (keskinkertainen), 1220 (voimakas), 1136 (voimakas), 1064 (heikko), 1053 (keskinkertainen) ja 1005 (voimakas) cm 30 751 90 A41030 tekijän C ultravioletti-absorptiomaksimit neutraalissa, happamassa ja emäksisessä metanoli:vedes— sä (1:1) on esitetty taulukossa 5.

Antibioottinen A41030 tekijä C liukenee samoihin 5 liuottimiin kuin tekijä A.

Havaittujen fysikaaliskemiallisten tietojen perusteella A41030 tekijän C rakenne on seuraava:

OH

fY0Yu °r*\c

10 Η°-^^Λι V

o=c^' CHn °^r^CH\ C'H

| \H | \H \

n i c, v NH NH

15 " ^CH' \ / \ 15 HO-C-CH CIT \ I Λ Λ s° X I 'NH,

20 ,Αν L

OH Galaktoosi-0

Esimerkki 6 A41030 tekijän D eristäminen 25 6/0 g:n erä A41030-kompleksia liuotettiin 200 ml:aan liuotinta, jonka muodostivat vesirasetonitriili:natrium-kloridi (83:17:2 g/1) ja liuos suodatettiin. Suodos siirrettiin 8 x 100 cm ruostumattomalle teräspylväälle, joka oli täytetty 4 1:11a 10-20 mikronin LP-l/C^-käänteis- 30 faasi-silikageeliä, joka oli valmistettu laboratorioissamme esimerkissä 3 kuvatulla erikoismenetelmällä. Pylväs, osa Chromatospac Prep-100 -yksikköä, eluoitiin nopeudella 60 ml/min samalla liuotinyhdistelmällä, jota käytettiin näytteen liuottamiseen ja 480 ml:n fraktioi- 35 ta kerättiin. Eluaattia tarkkailtiin 254 nm:llä käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Valitut fraktiot analysoi-

II

31 75190 tiin niiden sisältämän tekijän D suhteen analyyttisellä HPLPLC:lla 0,8 x 30 cm Michel-Miller-lasipylväällä, joka oli täytetty laboratorioissamme 25-40 mikronin LiChroprep RP-8:lla. Liuotin, vesisasetonitriili:natriumkloridi 5 (84:16:2 g/1) toimitettiin nopeudella 4 ml/min käyttäen FMI-pumppua. Tekijä D todettiin kohdalla 254 nm käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Fraktiot 1-34 heitettiin pois. Fraktiot 35-53, jotka sisältävät runsaasti tekijää D yhdistettiin ja väkevöitiin alennetussa paineessa noin 10 500 ml tilavuuteen.

Väkevöitteet kahdesta samanlaisesta puhdistuksesta yhdistettiin, laimennettiin 3 l:ksi vedellä ja siirrettiin nopeudella 8-10 ml/min 100 ml:lle Diaion HP-20-hartsia pylvääseen (2,8 x 22 cm), joka aikaisemmin oli 15 tasapainotettu vedellä. Pylväs pestiin vedellä (300 ml), kunnes kloridia ei enää todettu pesunesteessä hopeaklo-ridina saostamalla. Eluointi suoritettiin 1 1:11a liuotinta, jonka muodostivat vesi:asetonitriili (6:4) nopeudella 8-10 ml/min. Eluaatti väkevöitiin alennetussa pai-20 neessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 2,33 g tekijän D suhteen rikastettua tekijäseosta.

1,15 g:n erä tätä seosta liuotettiin 25 ml:aan liuotinta, jonka muodostivat vesi:asetonitriili:dibu-tyyliamiini (80:20:0,03M, joka liuotin oli säädetty pH-25 arvoon 7,8 fosforihapolla) lisäämällä tetrabutyyliam-moniumhydroksidia, kunnes liukeneminen tapahtui. Näyte siirrettiin 2,8 x 59 cm Michel-Miller-lasipylvääseen, joka oli täytetty 25-40 mikronin LiChroprep RP-8:lla, ja pylväs eluoitiin nopeudella 5 ml/min käyttäen FMI-30 pumppua samalla liuotinyhdistelmällä, jota käytettiin näytteen liuottamiseen. Eluaattia tarkkailtiin kohdalla 254 nm käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Valitut 25 ml:n fraktiot analysoitiin niiden sisältämän tekijän D suhteen analyyttisellä HPLC:llä 4,6 x 25 mm ruostu-35 mattomassa teräspylväässä, joka oli täytetty 10 mikronin LiChrosorb RP-18:lla (kaupallisesti saatava käänteis- 32 7 5 1 9 0 faasi-silikageeli, valmistaja E. Merck, Darmstadt,

Germany). Näyte injisoitiin käyttämällä Rheodyne Model 7120 suihkuventtiiliä. Liuotin, jonka muodostivat vesi :asetonitriili:dibutyyliamiini (80:20:0,3M) säädettynä 5 pH-arvoon 2,5 fosforihapolla, toimitettiin 0,75 ml/min nopeudella käyttäen Milton Roy Duplex Minipump -pumppua. Tekijä D todettiin kohdalla 225 nm käyttäen ISCO Model 1800 muuttuvan aallonpituuden UV-ilmaisintä. Osa 2,6- 3,14 l:n eluaatista, runsaasti tekijää D sisältävä, vä-10 kevöitiin alennetussa paineessa 300 ml:n tilavuuteen.

Väkevöitteet kolmesta samanlaisesta puhdistuksesta yhdistettiin ja liuotettiin lisäämällä fosforihappoa pH-arvoon 7,7. Natriumkloridia (1 mg/ml) lisättiin ioni-merkiksi. Näyte siirrettiin nopeudella 20 ml/min 100 ml:lie 15 Diaion HP-20-hartsia pylvääseen (2,8 x 22 cm),joka aikaisemmin oli tasapainotettu vedellä. Pylväs pestiin vedellä (300 ml), säädettiin pH-arvoon 2,5 muurahaishapon vesiliuoksella, kunnes kloridia ei enää todettu pesunesteessä hopeakloridina saostamalla. Pylväs eluoitiin 1 20 1:11a vesi:asetonitriiliä (6:4) nopeudella 30 ml/min.

Eluaatti väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoi-tiin, jolloin saatiin 0,63 g osittain puhdistettua tekijää D. Tämä valmiste liuotettiin 15 ml:aan liuotinta, jonka muodostivat vesi:asetonitriili:dibutyyliamiini 25 (80:20:0,03M, joka liuotin oli säädetty pH-arvoon 7,8 fosforihapolla) lisäämällä tetrabutyyliammoniumhydroksi-dia, kunnes liukeneminen tapahtui. Liuos kromatografoi-tiin 25-40 mikronin LiChroprep RP-8:lla 2,8 x 59 cm Michel-Miller-lasipylväässä edellä kuvatulla tavalla.

30 2,5-3,0 l:n erä eluaatista väkevöitiin alennetussa pai neessa noin 200 ml:n tilavuuteen. Tästä väkevöitteestä poistettiin suolat pylväässä, joka sisälsi Diaion HP-20-hartsia, edellä kuvatulla tavalla. Eluaatti väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin 35 saatiin 193 mg osittain puhdistettua tekijää D.

Il 33 751 90 259 mg:n erä kahta yhdistettyä osittain puhdistettua tekijä D-valmistetta liuotettiin 6 ml:aan liuotinta, jonka muodostivat vesi:asetonitriiliikaksiemäksinen nat-riumfosfaatti (82:18:0,03M, joka liuotin oli säädetty 5 pH-arvoon 7,8 fosforihapolla) ja säädettiin pH-arvoon 10 lisäämällä 5N NaOH:n vesiliuosta. Liuos siirrettiin 2,8 x 59 mikronin Michel-Miller-lasipylväälle, joka oli täytetty 25-40 mikronin LiChroprep RP-8:lla, ja pylväs eluoitiin nopeudella 4 ml/min käyttäen FMI-pumppua samal-10 la liuotinyhdistelmällä, jota käytettiin näytteen liuottamiseen. Eluaattia tarkkailtiin kohdalla 254 nm käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Valitut 2 7ml:n fraktiot analysoitiin niiden sisältämän tekijän D suhteen analyyttisellä HPLC:llä 4,6 x 150 mm ruostumattomassa te-15 räspylväässä, joka oli täytetty laboratorioissamme 10 mikronin Nucleosil Carlia. Näyte injisoitiin käyttäen Rheodyne Model 7120 suihkuventtiiliä. Samaa liuotinyh-distelmää, jota käytettiin preparatiivisessä eluoinnis-sa lisättiin nopeudella 0,6 ml/min Milton Roy Duplex 20 Minipump-pumpulla. Tekijä D todettiin kohdalla 225 nm käyttäen ISCO Model 1800 muuttuvan aallonpituuden UV-ilmaisinta. 405-1134 ml:n erä eluaatista väkevöitiin alennetussa paineessa 500 ml:n tilavuuteen ja suola poistettiin pylväässä, joka sisälsi Diaion HP-20-hartsia, 25 edellä kuvatulla tavalla. Eluaatti väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 120 mg tekijää D.

Antibioottinen A41030 tekijä D on valkoinen amorfinen kiinteä aine, jonka summittainen alkuaineanalyysi 30 on seuraava: 54,46 % hiiltä, 4,35 % vetyä, 7,58 % typpeä, 4,27 % klooria ja erotuksen mukaan 29,34 % happea. Tekijän D elektrometrinen titraus 66-%:isessa dimetyyli-formamidissa vedessä osoittaa kahden titrauskelpoisen ryhmän läsnäoloa pH -arvoilla noin 5,5 ja 7,6, vastaavas- d 35 ti, lisäksi mahdolliset pK :t >10 (lähtö-pH 6,83). Ha- a vaittu molekyylipaino noin 1326 saatiin käyttämällä nopea-atomipommi tusma s saspektrometriaa .

34 7 5 1 90

Antibioottisen A41030 tekijän D infrapuna-absorp-tiospektri KBr-tabletissa on esitetty liitteenä olevassa kuviossa 4. Huomataan seuraavat erotettavat absorptiomak-simit: 3448-3226 (voimakas, leveä) 2959 (heikko), 1661 5 (voimakas), 1592 (voimakas), 1511 (voimakas), 1429 (heikko) , 1290 (heikko), 1227 (heikko), 1212 (keskinkertainen), 1163 (heikko), 1143 (heikko), 1052 (keskinkertainen) ja 1010 (voimakas) cm ^.

A41030 tekijän D ultravioletti-absorptiomaksimit 10 neutraalissa, happamassa ja emäksisessä metanoli:vedessä (1:1) on esitetty taulukossa 5.

Antibioottinen A41030 tekijä D liukenee samoihin liuottimiin kuin tekijä A.

Havaittujen fysikaaliskemiallisten tietojen pe-15 rusteella A41030 tekijän D rakenteen uskotaan olevan seu-raava: 0H

rrrVri 20 CH ' ί

0=c ^° XH CH

C NH ^H O ^ / \ ^NH ^ ^ o 1 '

. C ^ NH C' NH

H n* / \ch/h \ HO-C-CH | _o A— HO^^^^OH OH HO''' 30 ynnä yksi tai useampia n-butyyliryhmiä.

35 751 90

Esimerkki 7 A41030 tekijän E eristäminen 0,3 g:n erä A41030-kompleksia liuotettiin 30 ml:aan liuotinta, jonka muodostivat vesi:asetonitriilirnatrium-5 kloridi (85:15:2 g/1), ja siirrettiin 2,8 x 59 cm Michel-Miller-lasipylvääseen, joka oli täytetty laboratorioissamme 25-40 mikronin LiChroprep RP-8:lla. FMI-pumppua käytettiin pylvään eluoimiseksi nopeudella 12 ml/min (595 kPa) samalla liuotinyhdistelmällä, jota käytettiin 10 näytteen liuottamiseen keräten 24 ml:n fraktioita. Eluaat-tia tarkkailtiin kohdalla 254 nm käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Fraktiot 1-54 heitettiin pois. Fraktiot 55-122, jotka sisältävät runsaasti tekijää E yhdistettiin ja väkevöitiin alennetussa paineessa 50 ml:n ti-15 lavuuteen.

Väkevöitteet 13 samanlaisesta puhdistuksesta yhdistettiin, laimennettiin 1,5 l:ksi vedellä ja siirrettiin nopeudella 5 ml/min 100 ml:lie Diaion HP-20-hart-sia pylvääseen (2,8 x 22 cm), joka aikaisemmin oli ta-20 sapainotettu vedellä. Pylväs pestiin vedellä (900 ml), kunnes kloridia ei enää todettu hopeakloridina saosta-malla. Sitten eluointi suoritettiin vesi:metanolilla (1:1) nopeudella 10 ml/min keräten 300 ml:n fraktioita. Fraktioitten aktiivisuus B. substilis'ta vastaan analy-25 soitiin. Fraktiot 1-8 yhdistettiin, väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 1,04 g tekijän suhteen rikastettua tekijäseosta. 0,5 g:n erä tätä seosta liuotettiin 10 ml:aan liuotinta, jonka muodostivat vesi:asetonitriili:natriumkloridi (84:14:2 g/1) 30 ja siirrettiin 2,8 x 59 cm Michel-Miller-lasipylvääseen, joka oli täytetty 25-40 mikronin LiChroprep RP-8:lla. FMI-pumppua käytettiin pylvään eluoimiseksi nopeudella 5 ml/min käyttäen samaa liuotinyhdistelmää, jota käytettiin näytteen liuottamiseen, ja 25 ml:n fraktioita kerät-35 tiin. Eluaattia tarkkailtiin kohdalla 254 nm käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Valitut fraktiot analy- 36 751 9 0 soitiin niiden sisältämän tekijän E suhteen analyyttisellä HPLCrllä 4,6 x 150 mm ruostumattomassa teräspyl-väässä, joka oli täytetty laboratorioissamme 5 mikronin ODS-Hyperspheres-valmisteella (Shandon Southern Products, 5 Ltd., Cheshire, England). Näyte injisoitiin käyttäen

Rheodyne Model 7120 suihkuventtiiliä. Liuotin, jonka muodostivat vesi:asetonitriili:natriumasetaatti (81:19:2 g/1) säädettynä pH-arvoon 6 jääetikalla lisättiin nopeudella 0,65 ml/min Milton Roy Duplex Minipump-pumpulla. Tekijä 10 E todettiin kohdalla 225 nm käyttäen ISCO Model 1800 muuttuvan aallonpituuden UV-ilmaisinta. 1520-1780 ml:n erä eluaatista väkevöitiin alennetussa paineessa 50 ml:n tilavuuteen.

Väkevöitteet kolmesta samanlaisesta puhdistukses-15 ta yhdistettiin, laimennettiin 1 l:ksi vedellä ja siirrettiin nopeudella 10 ml/min 100 ml:lie Diaion HP-20-hartsia pylvääseen (2,8 x 22 cm), joka aikaisemmin oli tasapainotettu vedellä. Pylväs pestiin vedellä (200 ml), säädettiin muurahaishapon vesiliuoksella pH-arvoon 2,5, 20 kunnes kloridia ei enää todettu hopeakloridina saosta-malla pesunesteessä. Eluointi suoritettiin 0,5 1:11a vesi:asetonitriiliä (6:4) nopeudella 15 ml/min. Eluaat-ti väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 202,2 mg osittain puhdistettua tekijää 25 E. Tämä valmiste liuotettiin 4 ml:aan liotinta, jonka muodostivat vesi:asetonitriili:natriumkloridi (86:14:2 g/1), ja kromatografoitiin nopeudella 4 ml/min 2,8 x 59 cm Michel-Miller-lasipylväässä, joka oli täytetty 25-40 mikronin LiChroprep RP-8:lla, kuten aikaisemmin oli kuvattu. 30 2060-2480 ml:n erä eluaatista, runsaasti tekijää E si sältävä, väkevöitiin alennetussa paineessa 50 ml:n tila-vuteen. Väkevöitteet kolmesta samanlaisesta puhdistuksesta yhdistettiin ja suolat poistettiin 100 ml :11a Diaion HP-20-hartsia pylväässä, kuten edellä on kuvattu. Eluaat-35 ti väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 242 mg tekijää E.

37 751 90

Antibioottinen A41030 tekijä E on valkea kiinteä aine, jonka summittainen alkuaineanalyysi on seuraava: 56,06 % hiiltä, 4,06 % vetyä, 8,53 % typpeä, 3,50 % klooria ja erotuksen mukaan 27,85 % happea. Tekijän E elek-5 trometrinen titraus 66-%:isessa dimetyyliformamidissa vedessä osoitti kahden titrauskelpoisen ryhmän läsnäoloa pK -arvoilla noin 5,8 ja 7,7, vastaavasti, lisäksi mahdol-liset pK st >10 (lähtö-pH 6,57). Havaittu molekyylipaino cl noin 1163 saatiin käyttämällä nopea-atomipommitusmassa-10 spektrometriaa. Tekijälle E annetaan kokeellinen empiirinen kaava C58H46C^N7°18’

Antibioottisen A41030 tekijän E infrapuna-absorp-tiospektri KBr-tabletissa on esitetty liiteeenä olevassa kuviossa 5. Huomataan seuraavat erotettavat absorptiomak-15 simit: 3448-3226 (voimakas, leveä), 1653 (voimakas), 1600 (keskinkertainen), 1504 (voimakas), 1429 (heikko), 1290 (heikko), 1198 (keskinkertainen), 1136 (heikko), 1064 (heikko) ja 1010 (voimakas) cm A41030 tekijän E ultravioletti-absorptiomaksimit 20 neutraalissa, happamassa ja emäksisessä metanoli:vedessä (1:1) on esitetty taulukossa 5.

Antibioottinen A41030 tekijä E liukenee samoihin liuottimiin kuin tekijä A.

Havaittujen fysikaaliskemiallisten tietojen pe-25 rusteella A41030 tekijälle E on määritelty seuraava rakenne :

OH

30 i 1 CH

o-c^Nh °^c" C\ °*cf \ m v-i c;° NH \ o i xcir nch ' n 1 i j k. sj 35 HO-C-CH ! ' Λ—o FO'k/^,Η CH H0 ^ 38 751 90

Esimerkki 8 A41030 tekijän F eristäminen 9,0 g:n erä A41030-kompleksia liuotettiin 200 ml:aan liuotinta, jonka muodostivat vesi:asetonitriili:natrium-5 kloridi (83:17:2 g/1) ja liuos suodatettiin. Suodos siirrettiin 8 x 100 cm ruostumattomaan teräspylvääseen, joka oli täytetty 4 1:11a 10-20 mikronin LP-l/C^g-käänteis-faasi-silikageeliä, joka valmistettiin laboratorioissamme esimerkissä 3 kuvatulla erikoismenetelmällä. Pylväs, 10 osa Chromatospac Prep-100 -yksiköstä, eluoitiin nopeudella 60 ml/min samalla liuotinyhdistelmällä, jota käytettiin näytteen liuottamiseen, ja 480 ml:n fraktioita otettiin talteen. Eluaattia tarkkailtiin kohdalla 254 nm käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Valitut fraktiot 15 analysoitiin niiden sisältämän tekijän F suhteen analyyttisellä HPLPLC:llä 0,8 x 30 cm Michel-Miller-lasipylvääs-sä, joka oli täytetty laboratorioissamme 25-40 mikronin LiChroprep RP-8 :1.1a. Liuotin, vesi :asetonitriilinatrium-kloridi (84:16:2 g/1) lisättiin nopeudella 4 ml/min FMI-20 pumpulla. Tekijä F todettiin kohdalla 254 nm käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Fraktiot 26-36, jjDtka sisältävät runsaasti tekijää F, yhdistettiin ja väkevöitiin alennetussa paineessa noin 500 ml:n tilavuuteen.

Väkevöitteet kolmesta samanlaisesta puhdistukses-25 ta yhdistettiin, suodatettiin ja suodos siirrettiin nopeudella 10 ml/min 100 ml:lle Diaion HP-20-hartsia pylvääseen (2,8 x 22 cm), joka aikaisemmin oli tasapainotettu vedellä. Pylväs pestiin vedessä (900 ml), kunnes kloridia ei enää todettu pesunesteessä hopeakloridina 30 saostamalla. Eluointi suoritettiin 1 1:11a vesiiaseto-nitriiliä (6:4) nopeudella 15 ml/min. Eluaatti väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 2,6 g osittain puhdistettua tekijää F. 500 mg:n erä tätä valmistetta liuotettiin 10 ml:aan liuotinta, 35 jonka muodostivat vesi:asetonitriili:natriumkloridi (84:16:2 g/1) säätämällä pH 7,0:ksi natriumhydroksidin

II

39 7 5 1 90 vesiliuoksella. Liuos siirrettiin 4,7 x 45 cm Michel-Miller-lasipylvääseen, joka oli täytetty laboratorioissamme 25-40 mikronin LiChroprep RP-18:lla. FMI-pumppua käytettiin pylvään eluoimiseksi nopeudella 6 ml/min 5 samalla liuotinyhdistelmällä, jota käytettiin näytteen liuottamiseen, ja 24 ml:n fraktioita otettiin talteen. Eluaattia tarkkailtiin kohdalla 254 nm käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisinta. Valitut fraktiot analysoitiin niiden sisältämän tekijän F suhteen käyttäen analyyttis-10 tä HPLPLC-järjestelmää. 1940-2520 ml :n eluaatin erä, runsaasti tekijää F sisältävä, väkevöitiin alennetussa pai-nessa noin 300 ml:n tilavuuteen.

Väkevöitteet kahdesta samanlaisesta puhdistuksesta yhdistettiin ja siirrettiin nopeudella 10 ml/min 15 100 mlrlle Diaion HP-20-hartsia pylvääseen (2,8 x 22 cm), joka aikaisemmin oli tasapainotettu vedellä. Pylväs pestiin vedellä (300 ml) säädettynä pH-arvoon 2,5 muurahaishapolla, kunnes kloridia ei enää todettu pesunesteessä hopeakloridina saostamalla. Eluointi suoritet-20 tiin 0,75 1:11a vesirasetonitriiliä (6:4). Eluaatti väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 299 mg tekijää F.

Antibioottinen A41030 tekijä F on valkoinen kiinteä aine, jonka summittainen alkuaineanalyysi on seuraa-25 va: 51,39 % hiiltä, 3,96 % vetyä, 6,45 % klooria, 6,45 % typpeä ja 28,65 % happea. Tekijän F elektrometrinen titraus 66-%:isessa dimetyyliformamidissa vedessä osoitti kahden titrauskelpoisen ryhmän läsnäolon pK -arvoil- et la noin 5,4 ja 7,1 vastaavasti, lisäksi mahdolliset 30 pK :t >10 (lähtö-pH 5,93), Havaittu molekyylipaino d noin 1555 saatiin käyttäen nopea-atomipommitusmassa-spektrometriaa. Tekijälle F määritellään kokeellinen empiirinen kaava C-^Hg^Cl^N^C^g ·

Molekyylipainotietojen perusteella tekijä F 35 eroaa tekijästä A kahden sokeriryhmän lisäyksellä. Pariton molekyylipaino osoittaa, ettei aminosokeria ole läsnä.

40 751 90

Antibioottisen A41030 tekijän F infrapuna-absorp-tiospektri KBr-tabletissa on esitetty liitteenä olevassa kuviossa 6. Seuraavat erottuvat absorptiomaksimit huomataan: 3448-3226 (voimakas, leveä), 1653 (voimakas), 5 1600 (keskinkertainen), 1504 (voimakas), 1429 (heikko), 1258 (heikko), 1227 (voimakas), 1136 (voimakas), 1075 (voimakas), 1053 (voimakas) ja 1010 (voimakas) cm A41030 tekijän F ultravioletti-absorptiomaksimit neutraalissa, happamassa ja emäksisessä metanoli:vedes-10 sä (1:1) on esitetty taulukossa 5.

Antibioottinen A41030 tekijä F liukenee samoihin liuottimiin kuin tekijä A.

Havaittujen fysikaaliskemiallisten tietojen perusteella A41030 tekijälle F määritellään seuraava ra-15 kenne:

OH

20

. 0 yc\ CH

0=C V Y NH \

ta X'C'S O tJH c"° NH NH

° I ^ CH ^ \CH ^ \ 25 Η°τ X X k f I]....... O1— Ν"2

HO ^ OH

30 OH

Galaktosyy1igalaktoosi-0

II

41 751 90

Esimerkki 9 A41030 tekijän G eristäminen 8 g:n erä A41030-kompleksia esimerkistä 2 liuotettiin 200 ml saan liuotinta, jonka muodostivat vesisase-5 tonitriilisnatriumkloridi (84:16:2 g/1) ja suodatettiin. Suodos siirrettiin ruostumattomaan teräspylvääseen (8 x 100 cm), joka oli täytetty 4 1:11a 10-20 mikronin LP-l/C^g-käänteisfaasi-silikageeliä, joka oli valmistettu laboratorioissamme esimerkissä 3 kuvatulla eri-10 koismenetelmällä. Pylväs oli osa Chromatospac Prep-100-yksikköä (katso esimerkki 3). Pylväs eluoitiin nopeudella 60 ml/min vesi:asetonitriilisnatriumkloridilla (84:16:2 g/1) ottaen talteen 480 ml:n fraktioita. Elu-aattia tarkkailtiin kohdalla 254 nm esimerkissä 3 kuva-15 tulla tavalla. Valitut fraktiot analysoitiin niiden sisältämän tekijän G suhteen analyyttisellä suuren suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) -menetelmällä, joka on kuvattu edeltävissä esimerkeissä.

Fraktiot 22-35, jotka sisältävät runsaasti teki-20 jää G, yhdistettiin ja väkevöitiin alennetussa paineessa 500 ml:n tilavuuteen. Väkevöitteet kolmesta samanlaisesta puhdistuksesta yhdistettiin, pH säädettiin arvoon 8,5 natriumhydroksidin vesiliuoksella ja suodatettiin. Suodos siirrettiin nopeudella 10 ml/min 25 100 ml:lle Diaion HP-20-hartsia pylvääseen (2,8 x 22 cm), joka aikaisemmin oli tasapainotettu vedellä. Pylväs pestiin vedellä (400 ml, säädetty pH-arvoon 2,5 muurahaishapolla) , kunnes kloridia ei enää todettu pesunesteessä hopeakloridina saostamalla. Eluointi suoritet-30 tiin vesi:asetonitriilillä (6:4) nopeudella 15 ml/min keräten 1 l:n fraktioita. Fraktioitten aktiivisuus B. substilis'ta vastaan analysoitiin. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin, väkevöitiin alennetussa paineessa ja lyo-filisoitiin, jolloin saatiin 2,85 g ainetta.

35 0,5 g:n erä tätä ainetta liuotettiin 10 ml:aan liuotinta, jonka muodostivat vesi:asetonitriili:dibutyy- 751 90 42 liamiini (80:20:0,30M, joka liuotin on säädetty pH-ar-voon 7,8 fosforihapolla) lisäämällä dibutyyliamiinia, kunnes liukeneminen oli tapahtunut (lopullinen pH 8,2). Liuos siirrettiin 2,8 x 59 cm Michel-Miller HPLPLC-la-5 sipylväälle, joka oli täytetty 25-40 mikronin LiChroprep RP-8:lla (yhtiöltä MC/B Manufacturing Chemist, Inc., Cincinnati, OH).

Käyttäen FMI-pumppua pylväs eluoitiin nopeudella 4 ml/min samalla liuotinyhdistelmällä, jota käytet-10 tiin näytteen liuottamiseen. Eluaattia tarkkailtiin kohdalla 254 nm käyttäen ISCO Model UA-5 UV-ilmaisin-ta. Valitut 10 ml:n fraktiot analysoitiin niiden sisältämän tekijän G suhteen analyyttisellä HPLC-mene-telmällä, joka on kuvattu edeltävissä esimerkeissä.

15 Fraktiot 54-74, jotka sisältävät runsaasti teki jää G, yhdistettiin kahdesta samanlaisesta puhdistuksesta saatuihin fraktioihin ja siirrettiin nopeudella 10 ml/min 100 ml:lie Diaion HP-20-hartsia pylvääseen (2,8 x 22 cm), joka aikaisemmin oli tasapainotettu ve-20 dellä. Pylväs pestiin vedellä (300 ml), pH säädettiin arvoon 2,5 muurahaishapolla, kunnes kloridia ei enää todettu pesunesteessä hopeakloridina saostamalla. Elu-ointi suoritettiin 0,75 1:11a vesi:asetonitriiliä (6:4). Eluaatti väkevöitiin alennetussa paineessa ja 25 lyofilisoitiin, jolloin saatiin 960 mg tekijää G.

Antibioottinen A41030 tekijä G on valkoinen kiinteä aine, jonka summittainen alkuaineanalyysi on seu-raava: 50,02 % hiiltä, 4,61 % vetyä, 4,74 % klooria, 6,11 % typpeä ja 30,70 % happea. Tekijän G elektromet-30 rinen titraus 66-%:isessa dimetyyliformamidissa vedessä osoitti titrauskelpoisten ryhmien läsnäolon pK -ar-voilla noin 5,4 ja 7,0 vastaavasti, lisäksi mahdolliset pK :t >10,5 (lähtö-pH 6,32). Havaittu molekyylipaino ä noin 1684 saatiin käyttämällä nopea-atomipommitusmas-35 saspektrometriaa.

43 751 90

Antibioottisen A41030 tekijän G infrapuna-ab-sorptiospektri KBr-tabletissa on esitetty liitteenä olevassa kuviossa 7. Seuraavat erottuvat absorptiomaksi-mit huomataan: 3320 (hyvin leveä, voimakas), 2975 5 (terävä, heikko), 2920 (terävä, heikko), 1659 (normaali, voimakas), 1594 (leveä, voimakas), 1512 (terävä, voimakas), 1492 (olka), 1430 (terävä, heikko), 1386 (leveä, heikko), 1337 (leveä, heikko), 1308 (terävä, heikko), 1264 (terävä, heikko), 1230 (leveä, 10 keskinkertainen), 1145 (leveä, keskinkertainen), 1077 (terävä, keskinkertainen), 1062 (terävä, keskinkertainen) , 1014 (terävä, keskinkertainen) ja 846 (leveä, keskinkertainen) cm \ A41030 tekijän G ultravioletti-absorptiomaksi-15 mit neutraalissa, happamassa ja emäksisessä metanoli:vedessä (1:1) on esitetty taulukossa 5.

Antibioottinen A41030 tekijä G liukenee samoihin liuottimiin kuin tekijä A.

A41030-kompleksin tekijät A, B, C, D, E, F, ja 20 G voidaan erottaa toisistaan käyttämällä silikageeli-ohutkerroskromatografiaa (TLC) ja paperikromatogra-fiaa. Bacillus subtilis'ta käytettiin bioautografiaan. Suhteellinen liike (Rx) ilmaistuna A41030 tekijän A suhteen, jolle annettiin arvo 1,00, on esitetty taulu-25 kossa 6.

751 90 44

Taulukko 6

Rx

Liuotinjärjestelmä

Tekijä A B

5 A 1,00 1,00 B 0,76 0,75 C 0,68 0,44 D 0,65 0,91 E 0,49 0,63 10 F 0,21 0,25 G 0,21 0,25

Järjestelmä A

Paperi: Whatman no. 1 (käsittelemätön) 15 liuotin: n-butanoli, kyllästetty vesi:metanolilla (1:1)

Järjestelmä B

sorboiva aine: Merck-Darmstadt-Silicageeli 60 liuotin: asetonitriili:etanoli:vesi (8:1:1,5).

20 A41030 tekijöitten A-G suuren suorituskyvyn nes- tekromatografisest (HPLC) retentioajat määritettiin käyttäen ruostumatonta teräspylvästä, jonka täytteenä oli 10 mikronin LiChrosorb RP-18, liuottimena, jonka muodostivat vesi:asetonitriili:dibutyyliamiini 25 (82:18:0,03M) säädettynä pH-arvoon 2,5 fosforihapolla.

Liuotin pumpattiin virtausnopeudella 0,75 ml/min. Elu-aattia tarkkailtiin UV-absorptiolla kohdalla 225 nm. Suhteelliset retentioarvot, jotka ovat kunkin tekijän suhteellinen retentioaika verrattuna A41030 tekijän A 30 retentioaikaan, on esitetty taulukossa 7.

Il 45 751 90

Taulukko 7

Suhteellinen m-r. · ·« __ _. retentio

Tekijä cm min - A 6,4 19,2 1,00 5 B 4,1 12,3 0,64 C 5,4 16,2 0,84 D 3,8 11,4 0,59 E 2,7 8,1 0,42 F 4,5 13,5 0,70 10 G 4,5 13,5 0,70

Koska useat antibiootti A41030-tekijät ovat am-foteerisiä sisältäen sekä aminoryhmä- että karboksyyli-happoryhmäfunktiot, ne pystyvät muodostamaan suoloja 15 sopivien happojen ja emästen kanssa. Näin muodostetut "farmaseuttisesti hyväksyttävät" suolat ovat suoloja, jotka ovat käyttökelpoisia lämminveristen eläinten kemoterapiassa. Edustaviin ja sopiviin A41030 tekijöitten A, B, C, D, E, F ja G suoloihin kuuluvat ne 20 happoadditiosuolat, jotka on muodostettu normaalireak-tiossa sekä orgaanisten että epäorgaanisten happojen kanssa, kuten rikki-, fosfori-, kloorivety-, etikka-, meripihka-, sitruuna-, maito-, maleiini-, fumaari-, palmitiini-, kooli-, pamoiini-, lima-, D-glutamiini-, 25 d-kamferi-, glutaari-, glykoli-, ftaali-, viini-, lau- riini-, steariini-, salisyyli-, metaanisulfoni-, bentsee-nisulfoni-, sorbiini-, pikriini-, bentsoe-, kaneli-ja vastaavien happojen kanssa, samoin kuin suolat, jotka on muodostettu karboksyylihapon toimiessa sellaisten 30 emästen kuten natriumhydroksidin, natriumkarbonaatin, kaliumkarbonaatin, kalsiumhydroksidin, kaliumhydroksi-din, trimetyyliamiinin, ammoniumhydroksidin, dietanoli-amiinin ja vastaavien emästen kanssa.

Antibiootti A41030-kompleksi ja sen tekijät ovat 35 aktiivisia gram-positiivisia mikro-organismeja vastaan, 46 75190 mukaan lukien Staphylococcus ja Streptococcus -lajit.

Nämä antibiootit osoittavat myös aktiivisuutta kasvun edistäjinä ja syötön tehokkuuden parantajina siipikarjassa, sioissa ja karjassa.

5 A41030-kompleksin ja yksittäisten tekijöiden ak tiivisuutta on osoitettu joukolla kokeita, jotka on kuvattu alla.

Esimerkki 10 Näytteen valmistaminen biologiseen kokeeseen 10 ja A41030 tekijän A kvantitatiivinen analyysi kuivatussa kokolihaliemessä

Yksi litra kokolihalientä väkevöitiin 200 ml:n tilavuuteen ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin 31,5 g kuivattua kokolihalientä. 400 mg:n näyte kuivattua ko-15 kolihalientä uutettiin 3 kertaa 10 ml:n annoksilla vettä pH-.ssa 8,5. Uutteet yhdistettiin, väkevöitiin 10 ml:n tilavuuteen ja eriä tästä väkevöitteestä käytettiin biologiseen kokeeseen. Turbidometrinen koe suoritettiin puoliautomaattisella järjestelmällä (Autoturb -mikrobio-20 loginen koejärjestelmä, Elanco), jonka on kuvannut N.R. Kuzel ja F.W. Kavanaugh julkaisussa J. Pharmaceut.

Sei. 60 (1971) 5, 764 ja 767. Tutkittaessa A41030-komp-leksia käytettiin seuraavia koeparametreja: Staphylococcus aureus ATCC 9144 ravintolihaliemielatusaineessa (pH 7), 25 inkuboitu neljän tunnin ajan 37°C:ssa. Koenäytteet ja vertailut liuotettiin metanoli:veteen (1:1). Vertailu, A41030 tekijä A sijoitettiin Autoturb -karuselliin väkevyyksissä 0,4, 0,6, 0,9, 1,2 ja 1,5 pg/ml.

Yksi millilitra yllä valmistettua väkevöitettä 30 puhdistettiin seuraavalla menetelmällä käytettäväksi HPLC-analyysissä.

(a) Yksi C-18 SEP-PAKR-patruuna (silikageeli-patruuna, Waters Associates, Inc., Milford, Mass.) pestiin 10 ml :11a metanolia käyttäen 10 ml:n käsiruiskua 35 varustettuna Luer-liittimellä alalla tunnetulla tavalla.

li 47 751 9 0 (b) Sama patruuna pestään 10 ml:11a vettä.

(c) 1 ml väkevöitettä siirretään ylhäältä käsin patruunaan nopeudella suunnilleen 1 ml/min.

(d) Patruuna pestään 1 ml :11a vettä ja puhalle-5 taan kuivaksi.

(e) Patruuna eluoidaan 1 ml :11a tetrahydrofuraa-ni:vesi (1:1) -liuosta nopeudella suunnilleen 0,5 ml/min.

(f) Tetrahydrofuraani poistetaan eluaatista tyhjössä tai vaihtoehtoisesti typpivirrassa ja eluaatin 10 tilavuus saatetaan 1 ml:ksi veden avulla.

(g) Liuos analysoidaan HPLC-menetelmällä edellä kuvatulla tavalla.

Kokoiihaliemen biologisen aktiivisuuden koetulokset ja HPLC-analyysi on esitetty taulukossa 8.

48 751 90 o

<C T~I

:ro o »H σι en oo * »· ti en o vd ro rn dP rH CTi CTi ' a "5 w s < •H **

r—I O

1 s u'

Id, " ” en tp ly ' C -H <

•H O (¾ (N (N

en ro e r-~ oo -P

> o O v m rt >i rH ,y i—i o—> i—I *3* O ·Η s -s 00 I ** o a s ^ §1 i °

3 -H O

f—I (TO -H "K rH

3 -n -P Q "5T

iä M S <

E-ι en ro -H

3 en ro -P

3 -H ö. CP Cn ro w ro en > h e 3 ή m ro

> O 3 cp oo -P

h M en h* eo en

H Q *H rH O

ti * > $ ro 3 C e § e en ^

s tr + en cp '-v O

S g s g g ·° O 00 > (N v •h o a) oo en X! .h M k » 3 _ h; ira h* o 3 C < > rH en

·· -H

O -H

ro -H

5; t7> CP "rä &

<C M Λί en -P

-H 4-J

Q oo m ro Q)

G * * e -P

•H CO Ό O -H

ro O H· M M

(¾ rH Ό :ra

M :ro C

ω :ro

C iH

•H i—I

n & 9 S o | ro m tii Ή <N -K +

S

II

49 75190

Agarlaimennuskoemenetelmä MIC-arvojen määrittämiseksi käytettiin agarlai-mennusmenetelmää, jonka on kuvannut International Collaborative study (ICS) -ryhmä.

5 Antibioottiselle A41030-tekijälle A agarlai- mennusmenetelmällä tehdyistä kokeista saadut tulokset on esitetty taulukossa 9.

Taulukko 9 10 A41030 tekijän A aktiivisuus

Koeorganismi_(^iq/ml·)_

Stpahylococcus aureus 3055* <0,5

Staphylococcus aureus 3074** <0,5

Streptococcus faecalis X66 <0,5 15 *bentsyylipenisilliinille herkkä ** bentsyylipenisilliinille resistentti

Levyma1j aherkkyy smenetelmä Käytettiin agarmaljoja, joihin oli ympätty koe-20 organismia; 6 mm maljat (vetoisuus 0,02 ml) kyllästettiin antibioottiliuoksen log 2-laimennuksilla. Maljan pitoisuudeksi saatiin 1/5 tai 1/50 käytetyn liuoksen väkevyydestä, s.o. maljan pitoisuus oli 100 mg tai 10 mg saatuna 500 mg/ml väkevyisestä liuoksesta. A41030 te-25 kijä A-antibiootin tuottaman ehkäisyvyöhykkeen koko kussakin maljassa on esitetty taulukossa 10.

50 75190

Taulukko 10 A41030 tekijän A aktiivisuus

Vyöhykehalkaisija (mm) (tasolla |ig/malja) 5 Koeorganismi_100_10_

Staphylococcus aureus 3055* 20,8 17,2

Staphylococcus aureus 3074** 19,8 16,7

Staphylococcus aureus 3130*** 21,4 17,4

Streptococcus pyogenes C203 15,0 12,0 10 Streptococcus sp. (ryhmä D) 9960 20,5 16,4

Streptococcus pneumoniae

Park I 17,0 15,0

Escherichia coli EC14 8,0 0 15 * bentsyylipenisilliinille herkkä ** bentsyylipenisiilliniresistentti *** bentsyylipensilliiniresistentti, metisilliiniresistentti 20

Antibioottinen A41030 tekijä A on osoittanut aktiivisuutta useita Hemophilus influenzae-kantoja vastaan, kuten on määritetty agarlaimennusmenetelmällä. Koetulokset on esitetty taulukossa 11.

Il 51 751 90

Taulukko 11 A41030 tekijän A aktiivisuus Hemophilus influenzae-kantoja vastaan

5 Hemophilus MIC

influenzae (jig/ml) R251 16 R259 16 R27 2 16 10 R27 4 16 4842 8 75-90383 16 P. Wylie 16 G. Newton 32 15 Bruno 16 75-19300 16 S. Ford 16 A. Hall 16 C. Steele 16 20 Miller 16

Howard 16 75-312 8 75-313 16 75-364 16 25 75-465 32 ___ — __ 52 751 90

Antibioottinen A41Q30 tekijä A ση aktiivinen Neisseria sp. vastaan kuten on määritetty agarlaimen-nusmenetelmällä. Koetulokset on esitetty taulukossa 12.

5

Taulukko 12

A41030 tekijän A aktiivisuus Neisseria sp. vastaan Neisseria sp. MIC

10 (jig/ml) L. Nance 4,0

Woods 4,0

Schultz 8,0

Mitchell 4,0 15 Sanders 1,0

Antibioottisen A41030 tekijän A aktiivisuus joukkoa eri bakteereita vastaan agarlaimennusmenetelmällä määritettynä on esitetty taulukossa 13.

75190 53

Taulukko 13 A41030 tekijä A:n aktiivisuus joukkoa eri bakteereita vastaan____

Bakteerit 5 Staphylococcus aureus MIC (|ag/ml) 3055 0,13 3074* 1 0,06 3131** 1 0,06 3134** 1 0,06 10 1 H43 * 1 0,06 V57* I 0,06 H290 1 0,06

Streptococcus pyogenes 15 C203 0,25 9943 0,25 10389 0,25 12344 0,5 M-6517 0,25 20 Streptococcus pneumoniae

Park I 0,25

Tyyppi 14 0,25 2764 0,25 6301 0,25 25 BI-343 0 f 25 __ - τ' 54 751 90

Staphylococcus epidermidis

Litton 0,13

Mencher ^ 0,06

Britton 0,13 ^ Mobley 0, 06

Viridans streptococcus SM-1134 0,5 SSI-910 0, 25 1Q SSII-895 0, 25

Streptococcus sp. (ryhmä D) 238 0,,25 282 0 ,25 9901 0,25 15 12253F 0,25

Guze 0,25

Shigella flexneri SH-3 128 SH-4 64 20 * Penisilliiniresistentti ** Penisilliini-, metisilliini- ja erytroraysiini-resistentti 751 90 55 A41030-antibiootit, tekijät A, B ja C ovat aktiivisia anaerobista bakteerisukua vastaan, joka tunnetaan nimellä Bacteroides sp.; 24 tunnin MIC-arvot on määritetty agarlaimennusmenetelmällä ja ne on esitet-5 ty taulukossa 14.

Taulukko 14 A41030 tekijöiden aktiivisuus Bacteroides SP. vastaan___ i Λ „ . . . . MIC (uq/ml) 10 Testiorganismi —^^— fraqilis 1877 32 32 32 B_j_ fraqilis 103 32 32 32 fraqilis 104 32 32 32 B. fraqilis 106 6.4 32 32 15 B^ fraqilis 107 32 32 32 B fraqilis 108 32 32 64 B. fraqilis 110 64 64 64

Ek fraqilis 111 32 32 32

Ik fraqilis 112 _ 64 32 32 20 Ik fraqilis 113 32 32 32 B. fraqilis 1451 64 64 64 B. fraqilis 1470 64 64 64

Ik fraqilis 2 64 32 32 B. fraqilis 9 64 32 32 25 Ik fraqilis 9032 64 32 32 B. corrodens 1874 32 32 32

Ik vulgatis 1563 32 32 32 B, thetaiotaomicron 1438 64 32 32 B. thetaiotaomicron 1900A 128 128 128 30 56 75190

Antibioottiset A41030 tekijät A, B ja C on myös tutkittu ja todettu aktiivisiksi anaerobista bakteeri-sukua vastaan, joka tunnetaan nimellä Propionibacterium acnes. MIC-arvot määritettiin 24 tunnin agarlaimennus-5 menetelmällä ja ne on esitetty taulukossa 15.

Taulukko 15 A41030 tekijöiden aktiivisuus Propioni-bacterium acnes1 ta vastaan _ 10 MIC (ug/ml)___

P. acnes-kanta C

44 0,125 0,06 0,125 79 0,125 0,06 0,125 101 0,125 0,06 0,125 15 103 0,125 0,06 0,125 104 0,25 0,25 0,25 105 0,125 0,06 0,125 106 0,125 0,06 0,125 107 0,06 0,06 0,125 20 5292 0,06 0,06 0,06 5170 10,03 10,03 10,03 5176 10,03 0,06 10,03 5187 10,03 0,06 0,06 519*1 0,125 0,06 0,125 25 5197 10,03 0,06 10,03 5226 0,5 0,5 0,125 5227 10,03 0,06 0,06 5228 1,0 0,5 1,0 5229 0,5 0,25 0,5 30 5246 0 ,06 0 ,125 0 ,06 75190

Antibioottiset A41030 tekijät A, B, C, D, E, F ja G on tutkittu ja todettu aktiivisiksi joukkoa anaerobisia bakteereita vastaan taulukossa 16 esitetyllä tavalla; MIC-arvot määritettiin agarlaimennusmenetelmällä.

58 751 90 o m o

O <N fN (N CN f-H (N O, CM rH CN CN 00 ^ OJ M (N

G v| rorovovocN^koro <d rr1 15 Ln Λ

•P CM

tn flj ooooo o o o oo

^ rH rH rH rH CMCMrHrHCMCMCM-^OO rH CM CM rH rH

Pm mm m m m id cm nm

nJ rH

-P Λ •rl 0) m m

CM

d) 4j m o tn m o m öin kj *. «. - - v | » - -

rl O rH O O ΓΜΓΜΟΜΟΗ’ΓΜΗ'Η’ΟΟ CM CM rH O

2 W mmm id m id id cm m m 10

Λ .H

A

<d ^ m Q m m , E cm m m cm

h \ rH cm m o cm m m rH

Q tj" LO v v v «k s «. - ^ O 5-- minfMLnoooiHocMfMfMfM^r o (M cm o o <, -—· «. ·. v s V] m m m m id mm v

Q o o o o A

2} U

“ S

td rn in m in m 1-1 ™ o CM cm cm m cm o p k K K K ^ K ^ 0 3 id i—i oo oo o o o, o o oo 10 cm m· oo m* cm cm rH id

X U) O i—i cm v | v | v | v | cm r-1 m id cm mm rH

V -H Ή I—I I—I

3 > A AA

rH *H

3 -h ui 4J m m m mcMCMCMin o ^ ·“} >k «. k. V · »k

"j CM O ^J· CO O, O, O, O ID ^3* CM CM CM 00 M* CN M1 H CO

m cm v I v I v r-tiDmmmcM m to

G « rH rH

a) A A

Ό

•H

:0 in •I— m cm m m m

-rt * rH CM CM O CM O

V CM O CM 00 vv^v·. - 7Π <m CM O O O rH O 00 tM M* M1 00 <t (Ί M1 rl 00

" rH VI VI VI VI CM m ID ID CM m ID

P A rH rH

A

O H*

CO OO ID

rH CM CM CM 00

~ O H> rH m VD

Ή m rH m r< H1 rH tn rH C' ·<* <C tn 3 cm m m tn 3 -h S o o md-HTj o tn tn γ-id H- rH CM O Ό äj tJl CQMd P H* H1

OH 00 00 rH -H Q E Γ- t^mou O rH rH E

OH CM -P rH £j C rH Γ- ID -H Ή H rH 00 _ 9 CMtOrHtO>~OOa)<lJtnrHOOOHgC C CM rH §

SrHCrHCMm-PPrHrHrHq® SrH 30 k e 3 8 rt s i S « » · J ί ? «, g 8 £

•h e 3 o 3 -h rd h h -h 0 q H -p ϋ -p P

0-rlÖfe.G-PCnin_rHrHrH-H-H Η-Ρ'ΟΛΙη

•rlJH-HlMOOpPE-H-rj-rHCdC S & P TP S

>tHMH-P0P>pp3cnO'Cr-pid S & fi ? ί <HPQ,VH(d<UUU-H(tJ(dtd<UrH rH rH U tn c ^tutDOtnyOOVHVHPPiJSU <u 3 0 _ _ 'dQitatdtdOjögöjiiHMHMH+JS S > o g g eESEgtntn-P-POtntntntntn tn tn to h h -h-h-hh-hB3S‘&5,S,S'S,S,S 8 8 -8 0 oj S Ϊ unt S ί ΦοοοΛααααρρυυυυιηυυυΚΛ Q rH rH rH 3 0) 0) 59 751 90

Antibioottiset A41030 tekijät A, B ja C ovat osoittaneet aktiivisuutta joukkoa kahden eri anaerobisen kokkisuvun lajeja vastaan, jotka tunnetaan nimellä Peptococcus ja Peptostreptococcus, vastaavasti. MIC-5 arvot määritettiin agarlaimennusmenetelmällä ja ne on esitetty taulukossa 17.

751 90 60 m I (n mm m m ro m m m ro tn tHom<Nrvjmomom(Nrgo(N(N(Nomo 3 O O O t—I O O O O i—lOrHOOOOOOOOOt—l υ v | v | o o o -p a 0)

P

-P

en ι-h m m m m 0 E <n n n m m m m vo m m (N ro m +j \ ^tmmrHiH(Nm<Nm(Nm<No<N<NrHOCNm a tjiCQ ------------------- Q) a _ ooooooooooooooooooo

Oj v|

<0 U

TO M

s tn 3 υ

O

O mm u m ΓΗ tN ro m O < o m m i—irHmmoommmommmomo r- -P - - rH D OOOOOOOt—ti—IOOOOOOOOOi—i Φ v| v| v | O (¾ λ: M tn 3 3 H 3 3 tn td -H H > Ή

•H

-P

Λ! 3 tn C 3 Φ υ Ό u •h e (N o .'O 3 O *3* ϋ

•ro tö co O

•H -P rH CO tn -P

Λί tn rH 3 Oi φ te tn oo o φ -P > 3 tn m

U 3 ^ oo-Hoor^-m<N<N O-P

ote -H o ή cTir-tmcNr-cNmvn u tn

ro -ro -P-H cotNm^Trr^r^iHr—tr—i o O

o cd >- -P tn >—t co Γ' m i-h <—t »-h i-h -P-P

γΗ·γο rH^SHrHr-cotyiotn tn tn tn tn a 04 tj* to OrH-Po<Nr~cNtN'3,3tn3tntntntn333(l)a) rij rH P O ΙΐΗ'Η'Ί'ΗΗΗΗ 3 Ή 3 3 3 3 H H H (¾ ft •H (d P .H rH rH rH Λ -H Λ Ή -rl -H -H Ό Ό Ό

S XX (0 rH -H -rt -H o Λ O Λ Λ Λ Λ <1> Φ Φ II H

tn οχίΦΐηωω-Ρ-Ρ-ΡΡΟΡΟΟΟΟεεε -H ϋθ-Ρ333000ΦΡΦΡΡΡΡΡΡΡϋϋ> e (0υΦ333>>>(0ΦΐθΦΦΦΦΦΦΦα<αι (0 Ιη(0301&|3ιφφφβί03<0(0ι0ι0-Ρ-Ρ-Ρ.-ΙΟΜ

en (OtnOiOiO(OPPP(OC3CCCCCCC

μ 3o£S6dJdJdJ to tO lO lO 10 H H H

O rH CN

Φ ...................

o oi oi oi ui oi o| o| o| o| o| tn| tn| tn| tn| tn| enI enI tn tn| « chI Oj| Oj| cul cu) cuI cu) tul cu| tul tul cu| cul cut cu| t^| cuI cuI cu| 61 75190 A41030 antibioottitekijät A, B, C, D, E, F ja G ovat myös aktiivisia joukkoa Clostridium difficile-kantoja vastaan määritettynä agarlaimennusmenetelmäl-lä. Koetulokset on esitetty taulukossa 18.

5

Taulukko 18 A41030 tekijöiden aktiivisuus Clostridium difficile-kantoja vastaan__ 10 Clostridium MIC (ug/ml)

A B~ C D E F G

8484 1,0 lr0 1,0 10,25 0,5 1^0 1,0 6890 1,0 1,0 2 0,5 0,5 1,0 1,0 2634 1,0 1,0 2 0,5 1,0 2 1,0 78 1,0 0,5 1,0 10,25 0,5 1,0 1,0 A-194 1,0 1,0 2 10,25 0^5 1,0 1,0 A-195 1,0 1,0 1,0 10,25 0,5 1,0 1,0 A-196 1,0 1,0 2 0,5 1,0 2 1,0 20 A-279 1,0 1,0 2 10,25 0,5 lf0 lf0 A-280 1,0 0,5 1,0 10,25 0,5 1,0 1,0 A-281 1,0 1,0 2 0,5 1,0 2 1,0 WAL-2112 1,0 1,0 2 10,25 0,5 1,0 1,0 WAL-3657 1,0 1,0 2 10,25 0,5 1,0 1,0 25 WAL-4 268 1,0 0,5 1,0 10,25 0, 5 1,-0 1,0 107B 1,0 0,5 1,0 10,25 0f5 1,0 1,0 111F 1,0 1,0 2 10,25 0,5 2 1,0 1153 1,0 1,0 2 1,0 1,0 2 1,0 3424-5B 1,0 1,0 1,0 0,5 0,5 1,0 1,0 30 3816 1,0 1,0 2 0^5 0,5 1,0 1,0 3950D 1,0 1,0 2 0,5 0,5 1,0 1,0 62 7 5 1 9 0

Antibioottisten A41030 tekijöiden A, B, C, D, E, F ja G in vitro aktiivisuus joukkoa eri aerobisia bakteereita vastaan on määritetty käyttäen tavallista agar-laimennuskoetta. Tulokset loppupisteen lukemisen jäl-5 keen 24 tunnin kuluttua on esitetty taulukossa 19.

Il 751 90 63 e m m in (rt - - - Il

^ Oi-ICMt-IOOeNCMn'rt' I ICMCMOOCOOOOOM'OO

cncnCMCMCMCMIDCM

P M) I—I r~H i—I i—I i—I

CO A A A A A

CÖ > rt ^

<u in m (N

-P - - l I

-H CnOOiHrHOCMCNCM'n'rt' I 1 CMCMOOOOOOOOOOOO

(!) cncnCMCMCMCMCMCM

i i—I f—| i—I f—I r—I i—I

" Λ A A A A A

0) Φ

-P

rt in 5 m m m m in mm

P rl M N M (N CM CM

M » r « » >. >· * I I

lö OOOOOCMOOi-Hi-ll I OOCOOOOOOOCOCOOO

.rt CM CM CM <N CM CM

rn —. (—I i—li—I r—C f—I i—I

™ r-j A A A A A A

Λ O Oi u ä — n, ^ m m m m m

Ui cm cm cm cm cm mm flnQ - -

H OOOOOiHOOrHrH I I CDCOCDCOCO^OOOO

J) S II CM CM CM ID CM CM

rt i—I i—I r—I >—I i—I

^ A A A A

CO

m m mm en t> » » » » Il _j -rl O O ι—lOOCNi—li—ICN^lDrt' I I CO 00 CO 00 00 00

rtU 1—I CM CM CM CM CM CM

'J ι—I ι—I ι—I ι—I ι—I i—I

O-P A A A A A A

λ: x X (0 rt m m m m jLr· cm cm m cm cm m 3 5 rH-HCMMi-McnCMm te Tl o OOOOOOOi—li—ICOCM I I 00 CO 00 00 00 00

tH-HOD CM CM CM CM CM CM

•A l—I I—I ι—I i—I ι—I i—I

Λ A

•H

Ai <D mm m

jJ cm cm m CM

rHrHmcMr-i mm ° ΟΟΟΟΟι—ΙΟΟι—ICMCOCM I CO CO OO CO 00 00

en I I CM CM CM CM CM CM

O <C li—li—I r—I i—I i—li—I

^ AA A A A

rH

<

H H

H CM O

Pj H X ID ID

W Pj H m en w en id X en C · o w tn o Pi 9 i—i i—ί ri m i—i o en -H en cm Q Q S m · id id ω m^M-HO^U H! oQ cm u cm

o > X en -H -e ro afl :cfl X X

en εεω-Ηεεφωωω tntncnHHÖJG.G.SniflJÄJÄJ 03¾ tn co en tn cdddQjoooqp tndtnödptnmtntn-H-H-H-HcuooSd ä 8ö3oBBBB33tntntntnBrororo

w QuoupoQöuu3dd3tn-H-H-HronJ

(3 γΗγΗγΗγΗ-ΗγΗ Q Q Q ö 0 D £ e rj -rl -rl -H d) 0)

S 2j 2} © S S

« tnwwi/ii/iiiitnciitiioiSSiiSSMMwSS

751 90 64 UOOOOCOOOOOOOCOOOOOCOOOOOOOOOOO I OOOO I 00

CNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCN I (N(N I CN

r~· Ή rH rH rH rH rH t—I i—I i—I r—I I—I rH rH rH rH rH rH

ΛΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ A A A

P-||COOOOOCOOOCOCOOOOOOOCOCOOOOOOO CO 00 I 00

|CNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCN(N(N I CN CN I (N

' I rH rH rH I—i rH f—1 t—1 rH I—I I—t I—1 rH I—1 rH I i—I i—ϊ I—I

ΑΑΑΑΑΑΑΑΛΛΑΑΑΑΑ AA A

MOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCOOO 00 00 00

CNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCNCN I (N(N I CN

rH t—I I—I I—I rH r—I r—I rH rH I—I rH r—I I—I t—I rH I rH I—I I I—I

AAAAAAAAAAAAAAA AA A

rO

Pqoooooooocooocoooooooooooooooco 00 00 00

-fi M(N(N(NP)(NOI(N(M(N(N(N(NOI(N I CN CN I CN

*P r—IrHrHtHrHrHi—tl—li—IrHtHrHrHrHrH I rHrH I rH

(¾ AAAAAAAAAAAAAAA AA A

-m ^Ucoaoooooooooooooooco oooooooooooooooo i

rH CNCNCNCNCNCNCNCNCNCN I CNCNCNCNCNCNCNCN

•—I rH rH rH rH rH I—I rH rH I—1 I rH rH rH rH rH rH rH rH

q ΑΑΑΑΑΑΑΑΛΑ ΑΛΑΑΑΑΑΑ

Ai "3

•—I

3 I

P CQ oOH-OOOOOOOOOOOOOOOO I oooooooooooooooo H IMVONNNINNNNM I CNCNCNCNCNCNCNCN I

I—I rH rH rH rH rH rH rH rH *H t—I rH I—I r—I rH rH r—I I

A A A A A A A A A A A A

<00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 oooooooooooooooo

(NO)(N(N(N(MN(NM(N I CNCNCNCNCNCNCNCN I

rH rH I—I rH rH rH i—I i—I rH t—I I t—I r—I rH rH rH f—I i—I —I |

ΑΛΑΑΑΑΑΑΑΑ AAAAAAAA

<N

H

« Γ' oo σι cn vo m CN rH CNnoOr" rl j) 00 00 0Q < ΙΠ CN rH 0) vouwmin χ χ oi 1¼ ,η cd -h .μ

Xffl CO 04 σν n n Dj O H 4-> oii/iHcn m cd m σ W ro 0-ΗΦ cd α)Φ(ΐ) tn en rj oi x en m « -Po -p f'5SS¾ω,^o^ooo5o h ft ^ t -h a te tn -HfflScöcOmncqOC03MP5 « cn -H m o a) ss8§!*rH3§s-sss°‘go,'j,g.a.3 "

ω(β(0ϋυΏ.Ώδω03<ϋα)5α)φδ>-ιο , G . , . , II

•HuPPi-lJ-l-P-P Π} HHcTÖ-P-P .£} <D

s _ δ δ a) <d _ 0)01 oiääMy+J-PM -p 1 l»l||liSs||l|33§S33|5l

881333553313¾¾¾¾¾¾¾¾.S

65 751 90

Antibioottisten A41030 tekijöiden A ja B in vitro-aktiivisuus joukkoa edustavia aerobisia, gram-positii-visia bakteereita, mukaan lukien Streptococcus sp.

Ryhmä D, vastaan on määritetty käyttämällä tavallista 5 agarlaimennuskoetta. Tulokset määritettynä lukemalla loppupiste 24 tunnin kuluttua on esitetty taulukossa 20.

Taulukko 20 A41030 tekijöiden A ja B aktiivisuus aerobisia bakteereita vastaan_ 10 „ . . _lilS.AlI)_

Koeorqamsmi - 1

-- A B

Staphylococcus aureus 3055 0,06 0 f 06 15 X400 0 f 125 0 f125 V138 0T06 0,06 V140 0,125 0,125 V102 0,125 0,125

Staphylococcus epidermidis 20 222 0,125 0,125 270 0,06 0,06 285 0,06 0,03 219 0,06 0,03 269 0,06 0,03 25 Streptococcus pyrogenes C203 0,25 0,125

Streptococcus sp. ATCC. 10389 0,125 0,25

Streptococcus sp. ryhmä B

5 11 14 0 ,06 0,125 30 66 7 5 1 90

Streptococcus sp. ryhmä D

X66 0,25 0,25 9960 0,5 0f5 2041 0,5 0,5 5 8043 0,25 0,25 9901 1 1 12253F 0,25 0,5

Mxl61 0,25 0,25 2058 0,5 0,5

Streptococcus pneumoniae Park I 0,125 0,125

Streptococcus pneumoniae Bl-438 0,25 0,5

Haemophilus parainfluenzae 7901 16 16

Haemophilus parainfluenzae 9796 16 16

Haemophilus influenzae 15 C.L. 4 8

Mx366 2 4

Mx371 2 4 76 4 4

Bond 2 4 20 16836 4 4 4842 2 4 212 2 4

Antibiootti A4103G-kompleksin aktiivisuus jouk-25 koa eläinten patogeenejä vastaan määritettiin tavalli sella in vitro-antibakteerisella lihaliemen mikrotiit-terikokeella, ja tulokset on esitetty taulukossa 21.

75190 67

Taulukko 21 A41030~kompleksin aktiivisuus useita eläinten patogeenejä vastaan_ 5

Koeorganismi M.ieM^g/riil)-

Staphylococcus sp. 1130 < 0,78

Streptococcus sp. 80 < 0,78 10 Pasteurella multocida (sarvikarja) 3,12

Pasteurella hemolytica 6,25

Bordetella bronchiseptica (Switzer) 50,00

Escherichia coli 50^00

Mycoplasma synoviae 50,00 15 Mycoplasma hyorhinis 50,00

Pseudomonas - kala < 0,78

Aeromonas liquefaciens 50,00 20 Kaikki tutkitut A41030 tekijät ovat osoittaneet in vivo-antimikrobista aktiivisuutta kokeellisia bakteeri-infektioita vastaan. Kun kaksi annosta kokeiltavaa yhdistettä, annettiin hiirille ihon alaisesti kuvaavissa infektioissa, huomattu aktiivisuus on mitattu 25 ED50-arvona (tehokas annos mg/kg suojaamaan 50 % koe- eläimistä: katso Warren Wick et ai., J. Bacteriol. 81 (1961) 233-235. A41030 tekijöille A, B, C, D, E ja F havaitut ED5Q-arvot on esitetty taulukossa 22.

30 68 751 90

Taulukko 22

Staph. aureus S. pyroqenes S. pneumoniae

Antibiootti ED,.. EDC_ ED--.

- 50 50 50 5 A41030A 1,4 2,8 1,68 A41030B <0,43 1,4 1,4 A41030C <0,43 10,4 6,7 A41030D 0,339 3,24 2,21 10 A41030E <0,31 3,54 3,11 A41030F <0,31 >5,0 >5,0

Antibioottisten A41030 tekijöiden A, B ja C akuutti toksisuus on määritetty hiirillä olevan >300 mg/kg 15 vatsakalvon sisään annettuna.

Antibioottisten A41030 tekijöiden A, B ja C LD,-q on määritetty hiirillä olevan >300 mg/kg annettuna vatsakalvon sisään.

Antibioottisten A410303 tekijöiden A, B ja C 20 in vivo aktiivisuus suun kautta annettuna ja määritettynä S.pyrogenes'tä vastaan hiirillä on >300 mg/kg X 2.

Uudet antibiootit ovat käyttökelpoisia infektioit-ten hoitoon lämminverisessä eläimessä, jolloin eläimelle annetaan kemoterapeuttisesti tehokas määrä, esimerkiksi 25 noin 25 mg-2000 mg A41030-antibioottikompleksia tai sen tekijää tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa.

Tekijää A tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa voidaan käyttää tulehdusten hoidossa ihmisellä, mutta yleensä kompleksi ja muut tekijät ja sen suolat 30 sopivat parhaiten infektioitten hoitoon muissa lämminverisissä eläimissä.

Infektioitten hoidossa ihmisellä antibioottite-kijä, edullisesti tekijä A, voidaan antaa parenteraalis-ta tietä, esim. ruiskeena lihaksensisäisesti tai infuu-35 siona laskimonsisäisesti. Ruiskutettavaksi antibiootti tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola liuotetaan

II

75190 69 fysiologisesti hyväksyttävään laimentimeen halutussa väkevyydessä ja annetaan. Sopiviin laimentimiin kuuluvat esimerkiksi ruiskeisiin tarkoitettu vesi, 0,9 % suolaliuos, 5 % dekstroosi, Ringerin liuos, tai muu yleises-5 ti käytetty laimennin. Annettavaksi laskimonsisäisellä infuusiolla antibiootti tai sen suola voidaan yhdistää fysiologiseen nesteeseen tai laimeaan ravintoliuokseen sopivassa väkevyydessä; esimerkiksi väkevyydessä noin 5 % - 10 %, ja infusoida hitaasti nesteen mukana. Vaih-10 toehtoisesti antibiootti voidaan antaa "piggy-back"-menetelmällä .

Erilliset tekijät, tekijöitten yhdistelmät tai koko tekijäkompleksi ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat voidaan saattaa annosyksikkövalmis-15 teitten muotoon hermeettisesti suljettuihin lääkepul-loihin, steriileihin, kumikorkkisiin lääkepulloihin tai muovipusseihin. Tällaiset annosyksikkömuodot voivat sisältää apuaineita kuten hapetuksen estoaineita, liu-kenemisapuaineita, dispergoimisaineita, puskureita ja 20 vastaavia. Eräs tällainen annosyksikkövalmiste käsittää 100 mg tekijää A tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa kumikorkkisessa (butyylikumi) lääkepullossa. Toinen annosyksikkövalmiste sisältää 250 mg tekijää A tai sen suolaa steriilissä, sinetöidyssä lääkepullossa.

25 Laskimon sisäistä infuusiota varten tämän keksinnön mukainen annosyksikkövalmiste voi sisältää 5 g tekijää A tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa muovipussissa .

Antibakteerisena aineena käytettynä A41030-komp-30 leksi tai A41030-tekijä voidaan antaa joko suun kautta tai parenteraalisesti. Kuten alan asiantuntija toteaa, A41030-kompleksi tai tekijä annetaan yleisesti yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja-aineen tai laimen-timen kanssa. A41030-kompleksi- tai tekijäännös riippuu 35 joukosta eri asianhaaroja, kuten tietyn käsiteltävän infektion luonteesta ja vakavuudesta.

75190 70

Antibiootit A41030 ovat hyöydyllisiä muun muassa estämään organismien Staphylococcus, Streptococcus ja Propionibacterium acnes kasvun ja antibiootteja voidaan sen vuoksi käyttää esimerkiksi acnen käsittelyssä.

5 A41030 yksittäiset tekijät tai niiden seokset puhdistetus sa tilassa voidaan muotoilla farmaseuttisesti hyväksyttäviin laimentimiin kuten isopropyylialkoholiin iholle käytettäviksi. Tällaiset liuokset voidaan tehdä antibioottiset väkevyydet välillä noin 1 - noin 15 paino-% 10 tilavuutta kohti sisältäviksi. Vaihtoehtoisesti antibiootit voidaan valmistaa voiteiksi tai vesiksi iholle käytettäviksi.

Antibiootit A41030 ovat myös hyödyllisiä estämään Clostridium difficile -organismien kasvun, joka 15 aiheuttaa Pseudomembranous colitis'in suolistoon.

A41030 yksittäisiä tekijöitä tai niiden seoksia voidaan käyttää Pseudomembranous colitis'in käsittelyssä antamalla suullisesti tehokas annos näitä antibiootteja tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa valmistet-20 tuna farmaseuttisesti hyväksyttävään annosmuotoon. Tällaiseen käyttöön antibiootti voidaan antaa gelatiinikap-seleissa tai nestesuspensioissa.

Antibiootteja voidaan myös käyttää eläinlääketieteessä tulehdussairauksien käsittelyssä koti- ja karja-25 eläimissä. Ne ovat myös hyödyllisiä karjataloudessa, esim. edistämässä lihakarjan ja muiden märehtijöiden kasvua. Erikoisen arvokas käyttö antibiooteille on niiden kyvyssä lisätä maidon tuotantoa lypsykarjalla.

A41030-kompleksi on osoittanut aktiivisuutta 30 tarttuvaa koiran hepatitisvirusta vastaan in vitro tasolla 40 jjg/ml. A41030-kompleksi on myös osoittanut aktiivisuutta valevesikauhua vastaan in vitro tasolla 20 yig/ml: ja A41030 tekijä A on osoittanut aktiivisuutta valevesikauhua vastaan in vitro tasolla 20 ug/ml.

35 Antibioottinen A41030-kompleksi on osoittanut ak tiivisuutta kasvun edistäjänä kananpojissa, jolloin koe suoritetaan seuraavasti: 751 90 71

Koe 1

Kananpoikia, 8 päivän ikäisiä Penobscot broile-reita käytettiin tässä kokeessa. Kaikkiaan käytettiin 560 kananpoikaa jaettuina aina 7 linnun ryhmiin. 35 ryh-5 mää toimi vertailuina ja 5 ryhmää käsiteltiin antibiootilla, joka lisättiin kananpojan vakioannokseen suhteessa 20 g antibiootti A41030-kompleksia tonnia ravintoa kohti. Ruokaa ja juomaa oli kaikille ryhmille käytettävissä mielin määrin 21 päivän ajan. Toisto suoritettiin kaksi 10 kertaa. Aktiivisuuskriteerit: 3 % lisäys painon nousussa ja/tai 2 % parannus syötön tehokkuudessa toisessa tai kummankin kerran toistoissa. Tulokset on esitetty taulukossa 23.

15 Taulukko 23

Painon lisäys Syötön tehokkuus Käsittely Väkevyys c[ % Parannus F/G % parannus

q/T

Vertailu - 433 - 1,671 20 A41030 20 451 4,16 1,601 4,19

Vertailu - 451 - 1,673 A41030 20 464 2,88 1,651 1,32 F/G = nautitun ravinnon kokonaismäärä jaettuna pai-25 non kokonaislisäyksellä.

Antibiootteja voidaan siis käyttää kasvun edistämiseksi kananpojilla, jolloin kananpojille annetaan niiden ruokavaliossa välillä noin 20 ja noin 30 g A41030 anti-30 bioottitekijää tai A41030 antibioottikompleksia tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa tonnia kohti ravintoa .

Antibiootti A41030 toimii myös kasvun edistäjänä vieroitetuissa porsaissa. Antibiootti kokeiltiin 35 nuorissa porsaissa useilla annostasoilla seuraavalla tavalla : 751 90 72

Koe 2

Antibiootti A41030-kompleksia tutkittiin tasoilla 2, 20, 50 ja 100 ppm ruokavaliossa porsailla, jotka alunperin painoivat noin 10 kg (5-7 viikon ikäiset). Koe suo-5 ritettiin valvotuissa ympäristöolosuhteissa porsaille tarkoitetussa tilassa, jossa lättien lattiat olivat va-nunkiverkkoa. Käsittelyä kohti oli viisi toistoa ja viisi porsasta toistoa kohti 27-päiväisessä kokeessa. Kokeen tulokset ilmenevät taulukosta 24.

751 90 73 (Ο 3

C

C

<#> nj o eg oo 'S'

^ ^ S V

its r-ι m r~

CM I I

h (J> Μ OO 'ί O oo oo <Ti r- r- '—s ^ ^ ^ ^

{j^ I—I I—I I—I rH I—I

to to > 3

:itJ -P

to tj< o o <N 3

Ol <#> -H ---- rH

►3 vo o o r- 3 0 ,* Λί X cc 3 Ο φ rH to C φ S h r- m e— r- oo >i C to

(ÖQtTivoovovoo :t0 -H M

E-isC invoininvo to > >i -h to :<o Ή M to

•H

C C rH

Φ Φ e e Φ to H H fl >nj *nJ v3 :nj tr o o ον -P -P 3 c*> to » - - - -P -P to •H T* O VO H1 -rl -rl

d + + rH > > C

+ -H -H φ :iö :<0 to cu α λ; 3

e C -P

Φ Φ 3 O oo τι* οι σν C C >h Q tn o -h o oi 'f -H -H 3

< m ro ro ro ro :r<3 :c0 M

P P

:tO :«J C

:ctJ :<TJ O

O £ g C

to £ I -H H C

<Ö QJ I ΙΛ O O O Ji ϋ H

EhCJ OI LO O (0 tfl > rH φ φ (0 λ: m p

Il II II

* 9 rH “ O &H a φ Φ Q Q \ -P P O O O O <<En •p t0 fr, fr, cr) ro H 3 o o o o

CO P rH rH I—I rH

:<T3 tl) h* h1 h* h* « Oi < < < < 74 75190 Tässä kokeessa antibiootti näytti paljastavan annokseen liittyvän kasvukäyttäytymisen parantumisen vieroitetuissa porsaissa, jota osoitti reaktio tasoilla 5 ppm ja 100 ppm.

5 Koe 3

Antibiootti A41030-kompleksia kokeiltiin edelleen vieroitetuissa porsaissa (8 kg, 4-6 viikon ikäisiä) tasoilla 25, 50 ja 100 g/t ravintoa 35 päivän ajan. Käsittelyä kohti oli neljä kuuden porsaan tois-10 toa.

Antibiootti A41030-kompleksi annettuna näille vieroitetuille porsaille esitetyillä tasoilla lisäsi painon nousuvauhtia 5,6 %:lla, 8,5 %:lla, ja 7,0 %:lla; ja paransi ravinnon muuttumistehokkuutta 6,6 %:lla, 15 9,2 %:lla ja 3,1 %:lla lisättynä ruokavalioon tasoilla 25, 50 ja 100 g/t, vastaavasti. Tulokset on esitetty taulukossa 25.

li 75190 75 tn 3

G

G lO CM .H

rö I vv*.

<#> !-i to m n rt

Cp

VD ΓΟ 00 O

O m oo h m \ v v v v

pL| rH i—I r—I rH

tn >1 Γ" Γ" ^ dp :ttj v v v m tn i o o ro

(N -H II

G)

O

λ: λ:

G

r—H

G

nj Pm rH io o ro

Eh D tP ro cm (N in < io io vo io tn >1 :rd vo m o dp tn i v v v •h m oo r~ G1 O tN o σ< in q Cn n ^ t ^ <C ro ro ro ro

O

tn e nJ a I m o o

Eh Qj cg in o

rH

>1 o rH tn tl) rt +> 4-> o o o gJ tn ro ro ro

•rl 3000 tn G rH rH rH

:rO (D o· o* rr « CP < < < 76 751 90

Antibiootteja voidaan siis myös käyttää vieroitettujen porsaitten kasvun edistämiseksi, jolloin porsaille annetaan niiden ruokavaliossa noin 5-100 ppm A41030 anti-bioottikompleksia tai A41030 antibioottitekijää ja sen 5 farmaseuttisesti hyväksyttävää myrkytöntä suolaa, ravintoon voidaan lisätä 25 g - 100 g A41030 antibioottikomp-leksia tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää myrkytöntä suolaa tonnia ravintoa kohti.

A41030-antibiootit ovat myös hyödyllisiä lisää-10 mässä ravinnon hyväksi käytön tehokkuutta märehtijöillä. On tunnettua, että hiilihydraattien hyväksikäyttö märehtijöillä lisääntyy käsittelyissä, jotka ärsyttävät eläimen pötsin kasvustoa tuottamaan propionaattiyh-disteitä mieluummin kuin asetaatti- tai butyraattiyh-15 disteitä Church et ai. "Digestive Physiology and Nutrition of Ruminants" 2. painos, 1971, s. 622 ja 625).

Antibiootti A41030-kompleksin ja A41030 tekijän A tehokkuus pötsissä kehittyvien haihtuvien rasvahappojen suhteen muuntamisessa on esitetty in vitro-kokeitten 20 avulla alla esitetyn menetelmän mukaan.

Koe 4 Pötsinestettä saatiin härältä, jolla on kirurgisesti asennettu fisteliaukko pötsiin. Härkää pidettiin viljapitoisella ruokavaliolla, jonka koostumus oli seu-25 raava:

II

77 7 5 1 90 .69,95 % karkeajauhettu maissi 10 % jauhetut maissintähkät 8 % soijapapujauho (50 % proteiinia) 5 % sinimailasjauho 5 5 % melassi 0,6 % urea 0,5 % dikalsiumfosfaatti 0,5 % kalsiumkarbonaatti 0,3 % suola 10 0,07 % vitamiinia A ja D2-esisekoite 0,05 % vitamiini E-esisekoite 0,03 % hivenaine-mineraali esisekoite Pötsinestenäyte suodatettiin 4 juustokangasker-roksen läpi ja suodos otettiin talteen tyhjöpulloon.

15 Hiukkasmainen aine, joka jäi juustokankaaseen, suspen- doitiin uudelleen riittävään määrään fysiologista puskuria sen palauttamiseksi alkuperäiseen pötsinesteen tilavuuteen ja suspensio suodatettiin jälleen juustokankaan läpi. Käytetty puskuri on kuvattu alla: 20 0,316 g/litra Na2HP04 0,152 g/litra KH2P04 2,260 g/litra NaHCO-j 0,375 g/litra KC1 0,375 g/litra NaCl 25 0,112 g/litra MgSO^ 0,038 g/litra CaCl2 0,008 g/litra FeS04*7H20 0,004 g/litra MnS04 0,004 g/litra ZnS04*7H20 30 0,002 g/litra CuS04*5H20 0,001 g/litra CoCl2

Cheng et ai., J. Dairy Sei. 38 (1955) 1225.

Nämä kaksi suodosta yhdistettiin erotussuppilos-sa ja annettiin seistä, kunnes hiukkasaines nousi pinnal-35 le. Kirkas kerros erotettiin sitten ja laimennettiin 1:1 ______ - i.

78 751 90 samalla purskurilla ja pH säädettiin arvoon 7,0.

10 ml laimennettua näin valmistettua pötsines-tettä sijoitettiin 25 ml kolviin yhdessä 90 mg:n kanssa hienoksi jauhettua viljapitoista ruokavaliota, jonka 5 koostumus on annettu edellä. Kokeiltava yhdiste punnittiin ja se liuotettiin sopivaan liuottimeen, kuten edellä. Liuos sijoitettiin hienoksi jauhetulle ruokavaliolle kussakin koekolvissa ja kuivattiin.

Kaksi sarjaa neljä käsittelemätöntä vertailukol-10 via kussakin valmistettiin myös. Toista neljän käsittelemättömän vertailukolvin sarjaa inkuboitiin 16 tunnin ajan 38°C:ssa yhdessä koekolvien kanssa. Toinen neljän käsittelemättömän vertailukolvin sarja oli nolla-aikavertailut, joiden käyminen pysäytettiin heti kun kolvit 15 oli valmistettu lisäämällä 2 ml 25 % metafosforihappoa kuhunkin kolviin.

Käyminen inkuboiduissa koe- ja vertailukolveissa lopetettiin 16 tunnin lopussa lisäämällä kuhunkin kolviin 2 ml 25 % metafosforihappoa.

20 Kaikkien näytteiden annettiin laskeutua ja nestees tä analysoitiin kaasukromatografisilla menetelmillä ase-taatti, propionaatti ja butyraatti.

Nolla-aikavertailuissa löytyneitten kunkin haihtuvan rasvahapon analyysi vähennettiin käsittelemättömien 25 vertailuitten ja koekolvien analyyseistä. Saadut arvot heijastavat kunkin 16 tunnin käymisjakson aikana muodostuneen VFA:n määrää.

Taulukon 26 tiedot on esitetty käsitellyissä kolveissa tuotetun VFA:n ja käsittelemättömissä vertailu-30 kolveissa tuotetun VFA:n suhteena. Tämä osoittaa erittäin selvästi ravinnon hyväksikäyttömenetelmän parantumisen aiheuttamat muutokset pötsin kemiassa.

751 90 79

H

•μ

-M

Iti

(O (M CT» TT Ί" VO

μ r~- m tn σι >43 > ·- ·* - ·“ *-

4J O O O O O

3

PQ

h; 4J,

til ro m r—i m rH

52 rs ro m n ro (o t — V *" —

,-. O r—I rH rH H H

VO qI

^ -H

n (¾ 5 2 ·

r-H

3 (0

^ -H

4J 4J

5 τ ro o· ro i—i ‘«σι o en o o 4-* «*. * ·- » -

Q) O H O H rH

W

<3

r~j I—I rH I—I

^ ε ε ε ε K N S. \ \ O1 θ' ίΓ tJ1 •H O’ 0 3 3 0 4> 3— N \ \ N.

Λ in in in in >—i > ^ < «

In o o o o o “i ro ro <o ro ro '"j c o o o o

Φ f-H rH rH rH

XX *T <? ^ >H < < < < < 80 751 90

Yllä taulukoidut tiedot osoittavat, että antibiootit ovat tehokkaita propionaatin tuotannon lisäämisessä pötsissä.

Uusien antibioottiyhdisteiden antaminen estää ja 5 hoitaa ketoosia sekä parantaa ravinnon hyväksikäyttöä.

Ketoosin syymekanismi on puutteellinen propionaattiyhdis-teiden tuotanto. Hiljattain suositeltu hoito on propioni-hapon antaminen tai ravinnon antaminen, joka edullisesti tuottaa propionaatteja. Ilmeisesti tässä esitetty melo netelmä edistää propionaatin tuotantoa tavallisista ravinnoista vähentäen ketoosin esiintymistä.

On huomattu, että uudet antibioottiyhdisteet lisäävät ravinnon hyväksikäytön tehokkuutta märehtijöillä annettuina propionaattia lisäävänä annoksena. Antibiootit, 15 erillisinä tai koko kompleksina annetaan sopivasti sisällyttämällä ne eläimen ravintoon. Antibioottiyhdisteet voidaan kuitenkin käyttökelpoisesti antaa muilla tavoin. Ne voidaan esimerkiksi sisällyttää tabletteihin, lääke-juomiin, isoihin pillereihin tai kapseleihin ja annostel-20 la eläimille. Antibioottiyhdisteiden muotoileminen tällaisiin annosmuotoihin voidaan suorittaa eläinfarmasian alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä. Jokaisen yksittäisen annosyksikön tulisi sisältää ravinnon hyväksikäyttöä parantavaa yhdistettä sellainen määrä, jolla on suo-25 ra suhde käsiteltävän eläimen sopivaan päivittäiseen annokseen .

Kapselit valmistetaan helposti täyttämällä gela-tiinikapselit millä tahansa halutun antibiootin halutulla muodolla. Haluttaessa antibiootti voidaan laimentaa 30 inertillä jauhemaisella laimentimella, kuten sokerilla, tärkkelyksellä tai puhdistetulla kiteisellä selluloosalla sen tilavuuden lisäämiseksi kapseleitten täyttämisen helpottamiseksi.

Antibioottitabletit tehdään tavanomaisilla farma-35 seuttisilla menetelmillä. Tablettien valmistus on hyvin li 81 75190 tunnettu ja pitkälle kehittynyt taito. Aktiivisen aineosan lisäksi tabletti yleensä sisältää perustan, hajottavan aineen, absorbentin, sideaineen ja luistoai-neen. Tyypillisiin perustoihin kuuluvat laktoosi, hieno 5 pölysokeri, natriumkloridi, tärkkelys ja mannitoli.

Tärkkelys on myös hyvä hajottava aine samoin kuin levä-happo. Pinta-aktiivisia aineita kuten natriumlauryylisul-faattia ja dioktyylinatriumsulfosukkinaattia voidaan myös käyttää. Yleisesti käytettyihin absorbentteihin taas 10 kuuluvat tärkkelys ja laktoosi, kun taas magnesiumkarbonaatti on myös käyttökelpoinen öljymäisten aineiden kanssa. Toistuvasti käytettyjä sideaineita ovat gelatiini, kumit, tärkkelys, dekstriini ja erilaiset selluloosajohdannaiset. Yleisesti käytettyjen luistoaineitten joukos-15 sa ovat magnesiumstearaatti, talkki, paraffiinivaha, erilaiset metallisaippuat ja polyetyleeniglykoli.

Antibioottiyhdistettä voidaan antaa myös hitaasti vaikuttavina pillereinä. Tällaiset pillerit tehdään kuten tabletit, paitsi että ne varustetaan kyvyllä viivyt-20 tää antibiootin liukenemista. Pillerit tehdään hajoamaan pitkinä ajanjaksoina. Hidasta liukenemista edesautetaan valitsemalla antibiootin erittäin veteeen liukenematon muoto. Aine, kuten rautarouhe lisätään pillerin tiheyttä nostamaan ja pitämään sen paikallaan pötsin pohjalla. 25 Antibiootin liukenemista viivyttää liukenematto man ainematriisin käyttö, johon lääke on upotettu. Esimerkiksi aineet kuten kasvivahat, puhdistetut mineraali-vahat, ja veteen liukenemattomat polymeeriset aineet ovat käyttökelpoisia.

30 Antibioottilääkejuomat valmistetaan helpoimmin valitsemalla antibiootin vesiliukoinen muoto. Jos jostain syystä halutaan liukenematon muoto, voidaan tehdä suspensio. Vaihtoehtoisesti lääkejuoma voidaan muotoilla liuokseksi fysiologisesti hyväksyttävään liuottimeen 35 kuten polyetyleeniglykoliin.

o o 751 90

Antibioottien liukenemattomien muotojen suspensiot voidaan valmistaa ei-luottimiin kuten kasvisöljyi-hin kuten maapähkinä-, maissi- tai seesamiöljyyn; glykoliin kuten propyleeniglykoli tai polyetyleeniglykoli; 5 tai veteen riippuen valitun antibiootin muodosta.

Sopivat fysiologisesti hyväksyttävät apuaineet ovat tarpeellisia pitämässä antibiootin suspendoitunee-na. Apuaineet voidaan valita paksuntimien joukosta, kuten karboksimetyyliselluloosa , polyvinyylipyrrolidoni, 10 gelatiini ja alginaatit. Monet pinta-aktiivisten aineitten luokat toimivat myös antibioottien suspendoijina. Esimerkiksi lesitiini, alkyylifenoli-polyetyleenioksi-diadduktit, naftaleenisulfonaatit, alkyylibentseenisul-fonaatit ja polyoksietyleenisorbitaaniesterit ovat käyt-15 tökelpoisia suspensioitten tekemisessä nestemäisiin ei-liuottimiin.

Lisäksi monet aineet, jotka vaikuttavat nesteen hydrofiilisyyteen, tiheyteen ja pintajännitykseen, voivat auttaa suspensioitten tekemisessä yksityisissä ta-20 pauksissa. Esimerkiksi silikonivaahdonestoaineet glykolit, sorbitoli ja sokerit voivat olla käyttökelpoisia suspendointiaineita.

Suspendoituva antibiootti voidaan tarjota eläimen kasvattajalle suspensiona tai kuivana antibiootin 25 ja apuaineitten seoksena, joka on laimenenttava ennen käyttöä.

Antibiootit voidaan myös antaa märehtijoitten juomavedessä. Sisällyttäminen juomaveteen suoritetaan lisäämällä veteen liukeneva tai veteen suspendoituva 30 halutun antibiootin muoto veteen sopivassa määrin. Antibiootin muotoileminen juomaveteen lisättäväksi seuraa samoja periaatteita kuin lääkejuomien muotoileminen.

Käytännöllisin tapa käsitellä eläimet näillä antiboottiyhdisteillä on yhdisteiden muotoilu ravinto-35 annokseen. Minkä tahansa tyyppinen ravinto voidaan

II

751 90 83 täydentää antibioottiyhdisteillä mukaan lukien yleiset kuivaruoat, nesteruoat ja pelletoidut ruoat.

Lääkkeiden eläinten ruokaan muotoilumenetelmät ovat hyvin tunnettuja. On yleistä tehdä väkevöity lää-5 ke-esisekoite raaka-aineeksi täydennetylle ruoalle. Esimerkiksi tyypilliset lääke-esisekoitteet voivat sisältää noin 1 - noin 400 g lääkettä noin 500 g esisekoitet-ta kohti. Laaja alue johtuu laajasta lääkkeen väkevyys-alueesta, joka voidaan haluta lopullisessa ravinnossa.

10 Esisekoitteet voivat olla joko nestemäisiä tai kiinteitä .

Sopivat määrät hyödyllistä käsittelyä varten antibioottiyhdisteitä sisältävien eläinten ravintojen muotoilu on pääasiassa aritmeettinen tehtävä. On tarpeen 15 vain laskea se yhdisteen määrä, joka tarvitaan jokaiselle eläimelle annettavaksi, ottaa huomioon eläimen päivää kohti syömän ravinnon määrä ja esisekoitteessa käytettävä antibioottiyhdisteen väkevyys ja laskettava sopiva antibioottisen yhdisteen väkevyys ravintoon.

20 Kaikki menetelmät, joilla ravintoa muotoillaan, sekoitetaan ja pelletoidaan normaalisti märehtijöiden tai märehtimättömien ruokinnan alalla, ovat täysin sopivia tässä menetelmässä käytettäviä antibioottiyhdisteitä sisältäviä ruokia valmistettaessa.

25 On todettu, että antibiootti A41030-kompleksi ei vain lisää ravinnon hyväksikäyttöä märehtijöille, joita käytetään lihan tuotantoon (kuten edellä on kuvattu) vaan se aiheuttaa myös hämmästyttävää parannusta maidon tuotannossa ilman haitallista vaikutusta maidon laa-30 tuun annettaessa maitoa tuottaville eläimille, joilla on kehittynyt pötsin toiminta.

Maitoa tuottavien märehtijoitten kuten lypsylehmien ravinnon käytön vaatimukset ja kohteet poikkeavat huomattavasti lihan tuotantoon kasvatettujen märehti-35 joitten vaatimuksista. Märehtijän haihtuvan rasvahapon (VFA) tuotanto on tietysti ensiarvoisen tärkeä, koska 84 751 90 se on suorassa suhteessa eläimen normaaliin ylläpitoon, samoin kuin eläimen tuottaman maidon laatuun ja määrään. Maitoa tuottavassa märehtijässä kuitenkin maidontuotan-toenergia on rajoittavin tekijä maidon tuotannossa. Ase-5 taattia tarvitaan maidon rasvasynteesissä, kun taas propio-naattia käytetään glukoosin tuottamiseen, jota puolestaan tarvitaan laktoosisynteesissä ja jolla myös on pienehkö osa maidon rasvan tuotannossa. Butyraatti on enemmän gly-kogeeninen kuin lipogeeninen, lipogeenisen aspektin ol-10 lessa epäsuora, koska butyraatti on ensin hajotettava asetaattiyksiköiksi ennen kuin sitä voidaan käyttää pit-käketjuisen rasvahapon synteesissä, so. maidon rasvassa.

Sen mukaisesti maidon tuotannon lisäämiseksi maitoa erittävillä märehtijöillä on tarpeen lisätä propio-15 naatin tuotantoa, mutta ei suuresti asetaatti- ja buty-raattituotannon kustannuksella. Merkittävästi pienentyneet asetaatti- ja butyraattitasot johtavat voimakkaasti alentuneeseen maidon rasvapitoisuuteen tehden täten maidon tuotannon vähemmän tehokkaaksi sekä laadun suh-20 teen että taloudellisesti (maidon tuotantohinnat määritellään osittain maidon rasvapitoisuuden mukaan).

Parannus maidon tuotannossa näkyy lisääntyneenä proteiinipitoisuutena maidossa ilman huomattavaa muutosta rasvapitoisuudessa. Parannus saadaan aikaan antamalla an-25 tibiootti A41030-kompleksia suun kautta maitoa erittävälle märehtijälle propinaattia lisäävässä määrin.

Antibiootti A41030-kompleksi voidaan muotoilla märhetijälle mukavasti suun kautta annettavaksi valmisteen ollessa ravinnon esisekoitteena, ravinnon lisäai-30 neena, nuolukivenä, veden lisäaineena tai haluttaessa antibiootti A41030-kompleksi voidaan muotoilla kerta-annokseksi, joka hitaasti liukenee pitkän ajanjakson kuluessa.

Se, että propionaattia lisäävän määrän antibioot-35 ti A41030-kompleksia antaminen maitoa erittävälle märehtijälle, jolla on kehittynyt pötsin toiminta, paran-

II

85 751 90 taa maidon tuotantoa vaikuttamatta haitallisesti maidon koostumukseen, on osoitettu in vivo-tutkimuksissa.

Koe 5

Suoritettiin kaksi koetta käyttäen juuri poiki-5 neita Holstein-lehmiä.

Ensimmäisessä kokeessa käytettiin 12 lehmää jaettuna kahteen kuuden lehmän ryhmään.

Kaksi viikkoa poikimisen jälkeen koe-eläimet aloittivat yhden viikon esijakson, jonka aikana kaikki eläi-10 met saivat päivittäisen ruoka- ja vesiannoksen ilman antibioottia. Kaikki lehmät saivat tavallisen ruoka-annoksen, joka sisälsi 50 % maissisäilörehua, 20 % sinimailas-heinää ja 30 % väkevöitettä, jonka koostumus oli seu-raava: 86 751 90 Väkevöite

Aineosa Prosentti Kg/t_

Jauhettu maissi, keltainen 23,50 213,2

Dikalsiumfosfaatti 1,50 13,6 5 Kalkkikivi 1,25 11,3

Melassi (Dehy) 2,15 19,5 xMono-Na-fosf aatti 0,10 0,9

Soijapapuöljyjauho 47,00 426,4

Vitamiini A+D3-esisekoite 10 (Ca-01) (1) 0,35 3,2

Vitamiini E-esisekoite (2) 0,10 0,9

Seleeni-esisekoite (3) 0,05 0,5

Suola 1,00 9,1

Natriumbikarbonaatti 1,00 9,1 15 Distillers Dried Solubles (maissi) 22,00 199,6 100,00 2000,0 (1) 453,6 g:ssa vitamiini A ja D3-esisekoitetta on 2 000 000 USP-yksikköä vitamiinia A ja 225750 yksikköä vitamiinia D3.

(2) 453,6 g;ssa vitamiini E·esisekoitetta on 20 000 IU vitamiinia E.

(3) Kg:ssa seleeni-esisekoitetta on 200 mg seleeniä natriumseleniittinä. Laskettu seleenianalyysi on 25 vain esisexoitteesta.

Kaikille lehmille syötettiin vakioannos suhteessa 2,95 % ruumiin painosta (ruumiin paino oli määritetty yhden viikon esijakson alussa) sekä 2 x 453,6 g valmistetta, jota kutsutaan nimellä "top-dress", jonka koos- 30 tumus on seuraava: li 751 90 87

Topdress

Aineosa Prosentti kg/t

Jauhettu maissi, keltainen 20,00 182,5 5 Grit-O-Cobs 38,00 346,8

Ruokomelassi 2,50 22,8

Kaura 11,00 100,4

Soijapapuöljyjauho 25,00 228,2

Vitamiini A+D3-esisekoite 10 (CA-01) (1) 1,10 lo,3

Suola 0,40 3,7

Eläinrasva 2,00 18,3 100,00 2000,0 15 (1) 453,6 g:ssa vitamiini Aja D3-esisekoitetta on 2 000 000 USP-yksikköä vitamiinia A ja 225750 USP-yksik-köä vitamiinia D3.

Yhden viikon esijakson aikana kaikki lehmät saivat vertailu-topdress-valmisteen. Käsittelyjaksosta 20 alkaen koe-eläimet saivat vastaavat hoitonsa kahdeksan viikon ajan antibiootti A410303-kompleksilla (kokeiltava yhdiste) sekoitettuna topdress-valmisteeseen. Vertailu-lehmät saivat jatkuvasti topdress-valmistetta, joka ei sisältänyt lääkettä ja oli samanlainen kuin esijaksolla 25 syötetty topdress. Vertailu-topdress ja topdress, joka sisälsi antibiooti A41030-kompleksin, syötettiin koe-lehmille annoksena 2 x 456,3 g päivässä yhden tunnin kuluessa yllä kuvatun tavallisen ruoka-annoksen aamu-ruokinnasta. Käsitelty ryhmä sai 600 mg/eläin/päivä 30 antibioottia.

Tämä koe toistettiin seuraten yllä kuvattua yleistä menetelmää ja merkittiin kokeeksi 2.

Keskimääräinen päivittäinen maidon tuotanto, maidon koostumus ja maidon tuotannon jatkuminen molem-35 missä kokeissa analysoitiin ja tiedot esitettiin taulukossa 27. Jatkuvuusarvot laskettiin jakamalla keskimääräinen maidon tuotanto kahdeksan viikon käsittelyjak- 88 7 5 1 90 son aikana keskimääräisellä tuotannolla esijakson aikana, jolloin käsittelyä ei suoritettu. Jatkuvuusarvot ilmaisevat kuinka hyvin käsittelyryhmät käyttäytyivät käsittelyn aloittamisen jälkeen verrattuna käyttäytymiseen 5 ennen käsittelyn alkua. Tavallisen jatkuvuuden kokeeseen odotettiin olevan noin 94-96 %. Jokaisessa kokeessa lehmillä, joille syötettiin A41030-kompleksia, oli suuremmat jatkuvuudet. Tämä osoittaa huomattavaa reaktiota käsittelyyn (so. esijakson maitotuotannon pysyminen kor-10 keammalla tasolla kuin vertailulehmillä).

Maidon taulukossa 27 esitetyn koostumuksen analyysi osoittaa, ettei maidon rasva ole erilaista käsitellyillä lehmillä ja käsittelemättömillä vertailulehmillä, kun taas proteiinipitoisuus on parantunut. Maidon 15 proteiinin lisääntyminen on erikoisen haluttava reaktio, koska vain pienikin lisäys lisäisi huomattavasti maidosta saatavan juuston määrää.

Il 751 90 89 (0

G

td λ; g M Q) (0 -n

G

G -P O (0 CO td

d) * CO

G (0 •H -n :td

rO r" ro >i -P

l in to H M

td op - - li <D -h

> mm -PE

M MM -P X

G -H 01 x tn m :td

X :td -P

O tn

m -P M

G G tn

•H (d M

m υ ja -p >i

o σ> to o -P

O -P dP (NM II G -H

-p o - - -P tn r- m M ro ro x (N td Cm G >\

S O

O 13 -P

λ: m td x td td > g > «N o e o m tn dp tn tn

G td - Il G -P

id 01 ro ro 0) O

E-ι G > HM · — tn :td td td m G M tn o o G tdtd tdtd :tdG>" > dp to ο σ ro : td G M o G ' - E > td v X uo ro tn oo -H G -H Λ -P σο σσ j* j* j* ^ td m tn -P tn »n qj td QJ td

Ji b j< ή tn

• M cm o o td · -P -H

tn - - — m to td td

:td to (N m m G > M

X (N (N (N (N Id Id Id rl

:<d E a; -P U

> m h ra ai

H X id G

:td td Ό -P

O CM -ro G 0) td 4-i \ · oo to öin O >

•h ο>·η - - v ctntdO

td * tn r~- ro ro m· :id td Ji -n 2 W (N (N (N (N M td td 4-»

:id 4-· -ro (0 O

:<d 0) -H -H >

G| toto r-~ oo E Λί tn tn M

G tn οι X td to X td O tn G m <d m :td tn M M G E Ή tn m 4-> :td > G G O G td Φ G G G 4-> j > G id n td >J e G td -m td M G G M Λί 4J O U 10 0) M M :id 4-i O >

4J MO M O M td G M td M

4-> Mldro (Ntdro φ-η4-><0·η0)

M 4-10 4-1 O

tn 0) M M tl) M M II II II II

:td O 0) O 0) m

**><«>< ctd Λ I

90 751 90

Antibiootti A41030-kompleksi ja tekijät A, B, C, D, E, F ja G voidaan eristää käytettäväksi eläinten ravinnossa menetelmillä, jotka on esitetty edellä olevissa esimerkeissä. On myös mahdollista haluttaessa 5 A14030 antibioottisen aktiivisuuden tuotannon jälkeen yksinkertaisesti kuivata koko käymisliemi ja sekoittaa kuiva elatusaine suoraan ravintoon tai ravintoesiseok-seen.

Edelleen on mahdollista, että tässä esitetty 10 A41030 antibioottikompleksi ja tekijät voidaan yhdis tää synteettiseen parkitusaineeseen, joka on sulfitoi-tu fenoliformaldehydi syntan, jollaista myy A.J. & O.J. Pilar Inc. Newark, N. J. kauppanimellä TruTan RT Regular. Antibiootin ja synteettisen parkitusaineen yh-15 distelmää, antibiootti-syntan-kompleksia voidaan käyttää aineosia erottamatta eläinten ravinnon täydennys-seoksissa yllä kuvatulla tavalla.

On tavallista käsitellä talouseläimiä märehtijät mukaan lukien erilaisilla kasvua edistävillä aineil-20 la, tauteja ehkäisevillä aineilla ja tautien hoidoilla koko niiden elämän ajan. Tällaisia lääkkeitä käytetään usein yhdistelminä. Tässä kuvattuja menetelmiä voidaan käyttää muiden hoitojen yhteydessä.

Antibiootti A4103C-kcnpleksi jaA41030 tekijä A muut-25 tavat, kuten on osoitettu, suotuisasti propionaattien tuotantoa suhteessa asetaattien tuotantoon pötsissä. Sama käsittely suosii myös yksimahaisia eläimiä, jotka käyttävät kuitumaista kasvisainesta umpisuolessa. Yksi-mahaiset eläimet,joihin tässä viitataan, ovat sellai-30 set, jotka kuluttavat kuitumaista kasvisruokaa ja sulattavat vähintään osan siitä mikrobiologisesti käyttämällä umpisuolessa. Umpisuolikäyminen seuraa kemiallista tietä, joka on samanlainen kuin käymisellä pötsissä.

Hevoset, siat ja kanit ovat esimerkkieläimiä, 35 jotka sulattavat osan ravinnostaan umpisuolikäymisellä. Ravinnon hyväksikäyttö kaikkiaan tällaisilla eläimillä ti 91 75190 paranee annettaessa suullisesti näitä uusia antibiootteja, jotka aiheuttavat suotuisan muutoksen propionaat-ti/asetaattisuhteessa. Hevoset ja kanit ovat esimerkki-eläimiä, joilla umpisuolikäyminen on suurehko osa koko-5 naisruoansulatusmenetelmästä ja joissa nämä antibiootit ovat sen mukaisesti erikoisen suotuisia.

Claims (10)

75190

1. Menetelmä A4l030-kompleksin tai tekijän A, jolla on kaava:

5 OH ^ΧχΥττΟί 10. yc\ /'CH °=c ' NH NC \h / \ 1 \ /O I \ o \ NH C\ NH \ NH NH O \ / \ / \ HO-C-CH CH ' — L/ fx o-fi HO^^X"^ OH ^ OH HO

20 D , B, jolla on kaava OH τ-ο:ψ:χχ ,C,H o ,CH CH °*C \H ^ \ O / \ I \ NH XC NH O iNH C ^ NH \ £ , NH \ HO-C-CH \ C\ ^=0 30 f \ / CH I CH \ rW ά ^ ηο^ΛοηΧ

35 HO 75190 C/ jolla on kaava: OH f^Y°y HO-CH-J^s. il liv J

5 I ^~^ri ci xch2 CH I .CH o. .'\ CH 0=C XNH \ O^/ \

0 NH \-i>° (Ih \^o NH \ .. ! \ / c=o

10 HO-C-CH / \ / tn I CH \ ίιΐ X NH2 jfV'1 ho-OA /fA

15 Galaktoosi-0 D, joka on valkoinen amorfinen kiinteä aine, jonka: (a) keskimääräinen alkuaineanalyysi on 54,46 % hiiltä, 4,35 % vetyä, 7,58 % typpeä, 4,27 % klooria ja 20 erotuksena laskettuna 29,34 % happea; (b) huomioitu molekyylipaino on noin 1326 määritettynä nopea-atomipommitusmassaspektrometrisesti; (c) infrapuna-absorptiospektrissä on seuraavat erottuvat maksimit: 3448-3226 (voimakas, leveä), 2959 25 (heikko), 1661 (voimakas), 1592 (voimakas), 1511 (voimakas), 1429 (heikko), 1290 (heikko), 1227 (heikko), 1212 (keskinkertainen) , 1163 (heikko), 1143 (heikko), 1053 (keskinkertainen) ja 1010 (voimakas) cm A (d) ultraviolettiabsorptiospektrissä on absorptio-30 maksimi happamassa tai neutraalissa metanoli:vedessä (1:1) kohdalla 278 nm (£ 10600) ja emäksisessä metanoli: vedessä (1:1) kohdalla 298 nm (f 19900); (e) molekyylissä on kaksi titrauskelpoista ryhmää 66-%:isessa dimetyyliformamidin vesiliuoksessa pK -arvoil- cl 35 la noin 5,5 ja 7,6; ja 751 90 (f) joka on liukoinen alkoholi-vesiseoksiin, di-metyylisulfoksidiin, dimetyyliformamidiin, dimetyyli-sulfoksidi-vesiseoksiin, dimetyyliformamidi-vesiseoksiin, hapon laimeisiin vesiliuoksiin tai emäksen laimeisiin 5 vesiliuoksiin; E, jolla on kaava: OH „ ·°-ρθχ ό" XX, ήυ i J\ 0 PH °t^\n - ^ N» °V\ L V L Y m 15 ?! \Y \ HO-C-CH C=0 Λ—0

20 I OH OH HO F, jolla on kaava: OH h°]hXxx|XiX\;H2 CH O - CH CH °=C^iSH \ I \ o I N,H · »«

30. NH NH \^0 NH \ HO-a-tH C- / ά, CH / \ fil X T^C1 OH OH Galaktosyyli- galaktoosi-o II 95 751 9 0 tai G joka on valkoinen kiinteä aine, jonka (a) keskimääräinen alkuaineanalyysi on 50,02 % hiiltä, 4,61 % vetyä, 4,74 % klooria, 6,11 % typpeä, ja 30,70 % happea; 5 (b) huomioitu molekyylipaino on noin 1688 määri tettynä nopea-atomipommitusmassaspektrometrisesti; (c) infrapuna-absorptiospektrissä on seuraavat erotettavat absorptiomaksimit: 3320 (hyvin leveä, voimakas), 2975 (terävä,, heikko), 2920 (terävä, heikko), 10 1659 (normaali, voimakas), 1492 (olka), 1430 (terävä, heikko), 1386 (leveä, heikko), 1337 (leveä, heikko), 1308 (terävä, heikko), 1264 (terävä, heikko), 1230 (leveä, keskinkertainen), 1145 (leveä, keskinkertainen), 1077 (terävä, keskinkertainen), 1062 (terävä, keskinker- 15 täinen), 1014 (terävä, keskinkertainen), ja 846 (leveä, keskinkertainen) cm (d) ultraviolettiabsorptiospektrissä on absorp-tiomaksimi happamassa tai neutraalissa metanoli:vedessä (1:1) kohdalla 278 nm (C 15000) ja emäksisessä metano- 20 li:vedessä (1:1) kohdalla 298 nm (£ 18000); (e) kahden titrauskelpoisen ryhmän pK -arvot 66-%:isessa dimetyyliformamidin vesiliuoksessa ovat noin 5,4 ja 7,0; ja (f) joka liukenee alkoholi-vesiseoksiin, dimetyy- 25 lisulfoksidiin, dimetyyliformamidiin, dimetyylisulfok- sidi-vesiseoksiin, dimetyyliformamidi-vesiseoksiin, laimeisiin hapon vesiliuoksiin tai laimeisiin emäksen vesi-liuoksiin; tai näiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen 30 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää Streptomyces virginiae NRRL 15156 tai 12525 kasvattamisen kasvualustalla, joka sisältää yhteyttämis-kelpoiset hiili-, typpi- ja epäorgaanisten suolojen lähteet aerobisissa submerssikäymisolosuhteissa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t unnettu siitä, että sitä seuraa kompleksin erottaminen kasvualustasta. _ - r 96 751 90

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tekijät A, B, C, D, E, F ja/tai G eristetään kompleksista. Patentkrav 7 519 0