DD204389A5

DD204389A5 - Tierfuttermittel

Info

Publication number: DD204389A5
Application number: DD81244038A
Authority: DD
Inventors: Manuel Debono; Kurt E Merkel; Robert E Weeks; Harald J Cole
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1980-12-18
Filing date: 1981-12-18
Publication date: 1983-11-30
Also published as: PT74137A; IE51883B1; JPS57132888A; IL64485A0; RO82520A; GR77286B; AU547906B2; US4322406A; RO82520B; EP0055070A1; IE812971L; DK562281A; NZ199197A; ES8304203A1; PH18801A; GB2089814A; AU7859881A; HU189548B; DE3175527D1; DD202048A5

Abstract

Beschrieben wird ein Tierfuttermittel, das das Actaplaninantibiotikum A-4696 oder seine neuen Faktoren B tief 1, B tief 2, B tief 3, C tief 1a, C tief 3 und E tief 1 enthaelt, zu denen man gelangt durch Zuechtung eines Stammes ATCC 31680, ATCC 31682 oder ATCC 31683 von Actinoplanes missouriensis in einem Fermentationsmedium, das uebliche assimilierbare Quellen fuer Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthaelt, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen, bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an antibiotischer Aktivitaet, und anschliessende, an sich bekannte Auftrennung des hierdurch erhaltenen Komplexes des Antibiotikums A-4696 in die jeweiligen Faktoren. Diese Faktoren sind wirksame antibakterielle und antimikrobielle Mittel, die sich unter anderem als wachstumsfoerdernde und die Futterverwertung verbessernde Mittel bei Gefluegel, Schweinen, Schafen und Rindern (Wiederkaeuern) eignen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Tierfuttermittel auf Basis ein« Actaplaninantibiotikum-Komplexes oder einzelner Faktoren dieses Komplexes. Dieses neue Antibiotikum und seine Fakte ren sind wirksame antibakterielle und antimikrobielle Mittel und eignen sich als wachstumsfördernde Mittel bei Tieren, insbesondere bei Geflügel, Schweinen, Schafen und Rii dern.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen: Aus US-PS 3 952 095 ist bereits ein Antibiotikum und ein Verfahren zu seiner Herstellung bekannt. Das Antibiotikum A-4696 wird in US-PS 4 064 233 beschrieben. Aus US-PS 4 115 552 gehen die Faktoren A und B des Antibiotikums A-4696 hervor.

Keiner der vorliegenden Faktoren des Antibiotikums A-4696 ist jedoch mit dem Faktor B des Antibiotikums A-4696 gemäJ US-PS 4 064 233 oder US-PS 4 115 552 identisch. Ferner sind die vorliegenden Faktoren des Antibiotikums A-4696 aus dem Stand der Technik weder bekannt noch nahegelegt.

Vielmehr geht aus obigen Patenten hervor, daß irgendwelche zusätzliche Faktoren oder chromatographische Flecke lediglich Artefakten der chromatographischen Verfahren sind, so daß diese Literatur eigentlich von der Erfindung

— 2 — 1 wegführt.

Aufgabe der Erfindung:

Die bekannten antibiotikahaltigen Tierfuttermittel verfügen zwar über eine entsprechende Wirksamkeit, sind diesbezüg- lieh jedoch immer noch verbesserungsbedürftig. Die in ih- . nen enthaltenen Antibiotika unterliegen zudem im Laufe der Zeit einer Resistenzbildung, so daß sie an Wirksamkeit verlieren. Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung ei-]'O η es Tierfuttermittels, das infolge seines Gehalts an einem neuen Antibiotikum oder von Faktoren hiervon über eine verbesserte Wirksamkeit verfügt und noch keine Resistenz aufweist.

Darlegung des Wesens der Erfindung;

Die obige Aufgabe wird nun durch das aus den Erfindungsansprüchen hervorgehende Tierfuttermittel, Tierfuttermittelvorgemisch oder Tierfutterergänzungsmittel gelöst, das sich dadurch auszeichnet, daß es als Wirkstoff das im folgenden näher beschriebene Actaplaninantibiotikum A-4696, die Faktoren B, , B₀ , B-., C-, , C-, und E, dieses Antibiotikums oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon enthält. Dieses Antibiotikum und seine Faktoren beschleunigen das Wachstum und erhöhen die Futterverwertung von Geflügel, Schweinen, Schafen und Rindern (Wiederkäuern).

Die Faktoren B₁ , B-, B-,, C₁ , C-, und E₁ des Antibiotikums χ .ώ ο j. a .j J-

A-4696 werden aus dem Antibiotikumkomplex A-4696 isoliert, der gebildet wird, indem man einen Mikroorganismus Actinoplanes missouriensis ATCC 31680, ATCC 31682 oder ATCC 31683 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Bedingungen so lange züchtet, bis eine wesentliche Menge an antibiotischer Aktivität entstanden ist.

Die im erfindungsgemäßen Tierfuttermittel als Wirkstoff enthaltenen neuen Faktoren B, , B-, B-,, C, , C-, und E, des Actaplaninantibiotikums A-4696 werden aus dem Antibiotikum

. 1 A-4696 in an sich bekannter Weise isoliert, wobei das Antibiotikum A-4696 gebildet wird, indem man einen zu den Actinoplanes gehörenden Mikroorganismus, nämlich einen Stamm ATCC 31680, ATCC 31682 oder ATCC 31683, in einem Nährmedium so lange züchtet, bis sich im Kulturmedium ei- ' ne wesentliche antibakterielle Aktivität feststellen läßt.

Durch entsprechende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie hat sich ergeben, daß der im eingangs erwähnten Stand

"10 der Technik beschriebene Antibiotikumkomplex A-4696 mehrere bisher unbekannte Faktoren enthält, die vorliegend als die Faktoren B-,, B„, B₃, C-, und C-, bezeichnet werden. Aus dem Antibiotikumkomplex A-4696 läßt sich auch noch ein weiterer Faktor isolieren, der als Faktor E-, bezeichnet wird, und bei dem es sich um ein Abbauprodukt handeln dürfte. Die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften dieser Faktoren zeigen, daß es sich hierbei um neue Antibiotika handelt, die - außer möglicherweise dem Faktor E, - aus dem gleichen Peptidkern (Aglykon) und Aminozucker zusammengesetzt sind und verschiedene Mengen an Glucose, Mannose und Rhamnose enthalten. Der Faktor E, ähnelt großteils den anderen Faktoren, dürfte jedoch einen etwas abgewandelten Peptidkern haben. Durch bioautographische Verfolgung der Aglykonbildung während der Hydrolyse von sowohl dem Antibiotikumkomplex A-4696 als auch den einzelnen Faktoren hiervon ergibt sich, daß innerhalb einer verhältnismäßig kurzen. Zeit ein einfaches Gemisch aus antimikrobiell wirksamem Pseudo-Aglykon und Aglykon ent- ' steht. Die Stelle der antimikrobiellen Wirksamkeit des Antibiotikumkomplexes A-4696 und der einzelnen Faktoren dürfte in dem Peptid Pseudo-Aglykon liegen, wobei die einzelnen Faktoren durch Unterschiede in der Zusammensetzung ihrer Neutralzucker wesentlich voneinander verschieden sind. Die vorhandenen Zucker dürften hauptsächlich die Funktion einer Modulierung der Löslichkeit und anderer wichtiger pharmakodynamischer Parameter haben. Die Art und Weise, in der die vorliegenden antibiotischen Faktoren wirken oder produziert werden, bildet jedoch keinen Teil

44 0 38 7

der Erfindung. Es soll daher auch keinerlei Beschränkung hinsichtlich des hierin angegebenen postulierten Wirkungsmechanismus geben.

Die antibiotischen Faktoren werden aus deiff Antibiotikum A-4696 isoliert, das gebildet wird, indem man den jeweiligen Organismus von Actinoplanes missouriensis in einem wäßrigen Nährmedium unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen züchtet. Man trennt den Antibiotikumkomplex A-4696 zuerst aus der dabei erhaltenen Fermentationsbrühe ab und isoliert anschließend die einzelnen Faktoren durch Flüssigkeitschromatographie. Vorzugsweise werden die antibiotischen Faktoren in das entsprechende Hydrochlorid oder Sulfat überführt.

Unter dem Antibiotikum A-4696 wird vorliegend der Actaplaninantibiotikum-Komplex verstanden, während die aus diesem.Komplex isolierten verschiedenen Faktoren als die Faktoren A, B₁, B₀, B-., C₁ ,C₃, E₁ usw. des Antibio-

j. δ ό J. a ό χ

tikums A-4696 bezeichnet werden. Das Antibiotikum A-4696 und die daraus isolierten einzelnen Faktoren stellen äußerst wirksame Mittel zur Verhinderung des Wachstums von Mikroorganismen dar, die Krankheitserreger für Mensch und Tier sind. Infolgedessen lassen sich diese antibiotischen Faktoren auch in der Landwirtschaft anwenden, und zwar als wachstumsfördernde Mittel bei Hühnchen, Schweinen, Schafen und Rindern.

Die neuen antibiotisch wirksamen Faktoren B,, B₂, B-., C, , C-. und E-, des Antibiotikums A-4696 sind basische Verbindungen, die zur Salzbildung mit geeigneten Säuren befähigt sind und aus dem Antibiotikum A-4696 isoliert werden, das produziert wird, indem man einen zur Spezies Actinoplanes missouriensis gehörenden Mikroorganismus so lange in einem Nährnedium züchtet, bis sich im Kulturmedium eine wesentliche antibakterielle Wirksamkeit feststellen läßt. Die Kennzeichnung der einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696 durch physikalische Daten erfolgt vorliegend in

Form der jeweiligen Hydrochloride. Unter Anwendung an sich bekannter Verfahren lassen sich selbstverständlich jedoch auch andere unbedenkliche Salze

dieser Faktoren herstellen.

Durch Dünnschicfttchromatographie mittels Silicagel, Bioautographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ergibt sich, daß das Antibiotikum A-4696 nach entsprechender Isolierung zu einem Gemisch aus mehreren Komponenten führt, die antibiotisch. wirksam sind. Diese Komponenten werden als die Faktoren A, B, , B„, B.,, C, , C, und E-, des Antibiotikums A-4696 bezeichnet, und sie lassen sich präparativ vom Antibiotikum A-4696 durch Chromatographie mittels einer mit einem Polyamid gefüllten Säule abtrennen. Die bei dieser Chromatographie anfallenden Fraktionen werden durch UV-Aktivität und Dünnschichtchromatographie überwacht, wobei identische chromatographische Fraktionen, die reine Faktoren A, B,, B„, B₃, C, , C₃ oder E, des Antibiotikums A-4696 enthalten, vereinigt, und gefriergetrocknet werden. Identität und Reinheit der dabei anfallenden gefriergetrockneten chromatographischen Sammlungen lassen sich durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bestimmen.

Der Faktor A des Antibiotikums A-46 96 wurde bereits früher isoliert und verfügt im wesentlichen über physikalische Daten, wie sie aus US-PS 4 115 552 hervorgehen. Die vorliegend in diesem Zusammenhang angegebenen physikalischen Daten über diesen Faktor dienen lediglich zur Erläuterung .

der Abtrennung und Charakterisierung der anderen neuen Faktoren des Antibiotikums A-4696.

Durch dünnschichtchromatographische Untersuchung des Antibiotikums A-4696 unter Anwendung einer Bioauflage und Einsatz eines Lösungsmittelgemisches aus Methanol, Chloroform, konzentriertem Ammoniumhydroxid, sekundärem Butanol und Wasser. (50:25:25:25:10) sowie unter Anwendung yon Bacillus subtilis als Detektionsorganismus zeigt folgende Ergebnisse:

Jeweiliger Faktor des R_f-Wert

Antibiotikums A-4696

A 0,25

B₁ . 0,.35

B₂ 0,45

B₃ 0,40

C₁ 0,51

Eine entsprechende Untersuchung des Antibiotikums A-4696 durch H.ochleistungsflüssigkeitschromatographie bei Umgebungstemperatur unter Verwendung eines 90:10-Gemisches aus 2 %-iger wäßriger Essigsäure und Acetonitril sowie eines 70:30-Gemisches aus 2 %-iger wäßriger Essigsäure und Acetonitril als Lösungsmittel zeigt folgende Ergebnisse: · .

Jeweiliger Faktor des · K¹-Wert

Antibiotikums A-4696

A 1,60

B₁ 1,99

B₂ · 3,84

B₃ 2,50

^Cla ²'⁹²

C₃ 4,23

E₁ 0,38

Durch Dünnschichtchromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie lassen sich auch noch mehrere zusätzliche untergeordnete Faktoren vom Antibiotikum A-4696 abtrennen. Diese Faktoren werden als Faktoren C,, , C₀ , C₀, und D bezeichnet und ähneln in mancher Hinsicht den Faktoren A, B₁, B₀, B,, C₁ , C-, und E₁ des Antibiotikums A-4696. Im Antibiotikumkomplex A-4696 können weiter auch noch bisher nicht entdeckte Faktoren enthalten sein. Die im Antibiotikum A-4696 in untergeordneter Menge Vorhände-

44038 7

nen Faktoren konnten nicht durch entsprechende physikalische Daten charakterisiert werden, da sie sich nicht in ausreichender Menge isolieren und reinigen ließen.

Hydrolysiert man entweder das Antibiotikum A-4696 oder die einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696 unter schwach sauren Bedingungen (5 %-iger methanolischer Chlorwasserstoff säure, Rückflußtemperatur, 70 Minuten), dann wird ein Pseudo-Aglykon gebildet. Dieses Pseudo-Aglykon fällt aus dem Hydrolysegemisch aus und hat im Falle der Faktoren A, B₁, B„, B,, C₁ und C-, des Antibiotikums A-4696 folgende Struktur:

(L-Ristosaiain4-0

Beim Faktor E, des Antibiotikums A-4696 kann das obige Pseudo-Aglykon etwas abgewandelt sein, was jedoch nicht sicher ist.

Durch papierchromatographische Untersuchung sowie durch dünnschichtchromatographische Untersuchung der Hydrolyse-

filtrate des Antibiotikumkomplexes A-4696 und der einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696 ergibt sich, daß der Komplex und die Faktoren zusätzlich zum Pseudo-Aglykonkern jeweils verschiedene Mengen an Neutralzuckern enthalten. Art und Molverhältnisse der hierbei für die Faktoren A, B₁, B₀, B-. und C₁ des Antibiotikums A-4696-

J. C. Jj J. ei

gefundenen Neutralzucker gehen aus der folgenden Tabelle I hervor:

TABELLE I Molverhältnisse der Neutralzucker *

Jeweiliger Faktor des Mannose Glucose Rhamnose Antibiotikums A-4696 · '

-A 2,8 0 1,0 . -

B₁ 2,05 1,0 1,01

B₂ 1,80 1,0

B₃ 2,37 1,0 . -

C_la 1,12 1,0 1,08

* Die Neutralzucker wurden durch gaschromatographische Analyse ihrer Trimethylsilyl-Derivate bestimmt. Für jeden Zucker ist die Summe aus dem cc- und dem ß-Isomer angegeben.

Die einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696 unterscheiden sich wesentlich voneinander durch die in ihnen vorhandenen Neutralzucker, die an unbekannten Stellungen des Pseudo-Aglykons vorhanden sind.

Der Faktor B, des Antibiotikums A-4696 ist in Form des Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Verbindung, die löslich ist in Wasser sowie hydroxylgruppenhaltigen und polaren Lösungsmitteln, jedoch unlöslich ist in Lösungs-

244 0 38 7

mitteln, wie Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen, Chlorkohlenwasserstoffen und dergleichen- Dieser Faktor ist in wäßriger Lösung über einen pH-Bereich von etwa 4 bis 9 bei Temperaturen von bis zu etwa 27°C stabil.

Eine mikroanalytische Untersuchung des Hydrochlorids des Faktors B-, des Antibiotikums _A-4696 ergibt folgende ungefähre Elementarzusanlmensetzung, wobei der Rest Sauerstoff ist:

C = 51,51, H = 5,25, N = 4,88, Cl= 4,62.

Dieses Hydrochlorid hat aufgrund einer theoretischen Bestimmung durch Kombination der Molekulargewichte des Pseudo-Aglykons und der daran befindlichen bekannten Zukker ein Molekulargewicht von etwa 1954.

Das Hydrochlorid des Faktors B, des Antibiotikums A-4696 weist in Wasser bei 280 nm ein Ultraviolett-Absorptions-

1 %

maximum E,° von 4 2,8 auf. lern '

Das Hydrochlorid des Faktors B, des Antibiotikums A-4696 zeigt in Kaliumbromid das aus der Fig. 1 "hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Im Bereich von 4000 bis cm lassen sich in diesem Spektrum folgende voneinander unterscheidbare Absorptionsmaxima feststellen: 3380 breit, 2930, 1731, 1693, 1654, 1637, 1615, 1588, 1577, 1521, 1503, 1488, 1423, 1321, 1289, 1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030, 1012, 982, 880, 842, 831 und 810 cm"¹.

Der Faktor B₂ des Antibiotikums A-4696 ist in Form des Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Verbindung, die löslich ist in Wasser sowie hydroxylgruppenhaltigen und polaren Lösungsmitteln, jedoch unlöslich ist in Lösungsmitteln wie Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen

Kohlenwasserstoffen, Chlorkohlenwasserstoffen und dergleichen. Dieser Faktor ist in wäßriger Lösung über einen pH-Bereich von etwa 4 bis 9 bei Temperaturen von bis zu etwa 27⁰C stabil.

Eine mikroanalytische Untersuchung des Hydrochlorids des Faktors B^ des Antibiotikums A-4696 ergibt folgende ungefähre Elementarzusammensetzung, wobei der Rest Sauerstoff ist:

C = 51,96, H = 4,67, N = 5,72, Cl = 5,88=

Dieses Hydrochlorid hat aufgrund einer theoretischen Bestimmung durch Kombination der Molekulargewichte des Pseudo-Aglykons und der daran befindlichen bekannten Zucker ein Molekulargewicht von etwa 1808. .

Das Hydrochlorid des Faktors B„ des Antibiotikums A-4696 weist in Wasser bei 280 nm ein Ultraviolett-Absorptions-

1%

maximum E₁ von 44,7 auf. lern '

Das Hydrochlorid des Faktors B- des Antibiotikums A-4696 zeigt in Kaliumbromid das aus der Fig. 2 hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Im Bereich von 4000 bis 700. cm lassen sich in diesem Spektrum folgende voneinander unterscheidbare Absorptionsmaxima feststellen: 3409 breit, 2934, 1730, 1658, 1614, 1588, 1548, 1504, 1498, 1490, 1426, 1290, 1231, 1210, 1179, 1121, 1061, 1031, 1017, 987, 903, 88 4 und 818 cm" .

Der Faktor B₃ des Antibiotikums A-4696 ist in.Form des Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Verbindung, die löslich ist in Wasser sowie hydroxylgruppenhaltigen und polaren Lösungsmitteln, jedoch unlöslich ist in Lösungsmitteln wie Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen, Chlorkohlenwasserstoffen und

- li -

dergleichen. Dieser Faktor ist in wäßriger Lösung über einen pH-Bereich von etwa 4 bis 9 bei Temperaturen von bis zu etwa 27⁰C stabil.

Eine mikroanalytische Untersuchung des Hydrochlorids des Faktors B, des Antibiotikums A-4696 ergibt folgende ungefähre Elementarzusammensetzung, wobei der Rest Sauerstoff ist:

C = 51,84, H = 4,74, N = 5,83, Cl = 5,57.

Dieses Hydrochlorid hat aufgrund einer theoretischen Bestimmung durch Kombination der Molekulargewichte des Pseudo-Aglykons und der daran befindlichen bekannten Zucker ein Molekulargewicht von etwa 1808.

Das Hydrochlorid des Faktors B, des Antibiotikums A-4696 weist in Wasser bei 280 nm ein Ultraviolett-Absorptions-.

1 %

maximum E, von 46,3 auf. icm

Das Hydrochlorid des Faktors B-, des Antibiotikums A-4696 zeigt in Kaliumbromid das aus der Fig. 3 hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Im Bereich von 4000 bis cm lassen sich in diesem Spektrum folgende voneinander unterscheidbare Absorptionsmaxiina feststellen: 3394 breit, 2938, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, 1614, 1591_r 1515, 1504, 1489, 1427, 1359, 1291, 1228, 1209, 1180, 1120, 1072, 1051, 1018, 985, 903, . 882, 846 und 816 cm"¹.

Der Faktor C, des Antibiotikums A-4696 ist in Form des Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Verbindung, die löslich ist in Wasser sowie hydroxylgruppenhaltxgen und polaren Lösungsmitteln, jedoch unlöslich ist in Lösungsmitteln wie Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen, Chlorkohlenwasserstoffen und dergleichen. Dieser Faktor ist in wäßriger Lösung über ei-

44038 7

nen pH-Bereich von etwa 4 bis 9 bei Temperaturen von bis zu etwa 27⁰C stabil.

Eine mikroanalytische Untersuchung des Hydrochlorids des

Faktors C₁ des Antibiotikums A-4696 ergibt folgende ungel a

fähre Elementarzusammensetzung, wobei der Rest Sauerstoff ist:

C = 53,05, H = 4,74, N = 5,83, Cl = 5,39.

Dieses Hydrochlorid hat aufgrund einer theoretischen Bestimmung durch Kombination der Molekulargewichte des Pseudo-Aglykons und der daran befindlichen bekannten Zucker ein Molekulargewicht von etwa 1792.

Das Hydrochlorid des Faktors C-, des Antibiotikums A-4696 weist in Wasser bei 279 nm ein Ultraviolett-Absorptions-

1%

maximum E-, von 47,9 auf

lern

Das Hydrochlorid des Faktors C, des Antibiotikums A-4696 zeigt in Kaliumbromid das aus der Fig. 4 hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Im Bereich von 4000 bis cm lassen sich in diesem Spektrum folgende voneinander unterscheidbare Absorptionsmaxima feststellen: 3380 breit, 2931, 1734, 1650, 1616, 1591, 1505, 1491, 1427, 1359, 1290, 1228, 1213, 1177, 1123, 1072, 1061, 1032, 1017, 987, 903, 832, 814 und 715 cm'¹.

Der Faktor C₃ des Antibiotikums A-4696 ist in Form des Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Verbindung, die löslich ist in. Wasser sowie hydroxylgruppenhaltigen und polaren Lösungsmitteln, jedoch unlöslich ist in Lösungsmitteln wie Ether, Chloroform, Benzol. Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen, Chlorkohlenwasserstoffen und dergleichen. Dieser Faktor ist in wäßriger Lösung über.einen pH-Bereich von etwa 4 bis 9 bei Temperaturen von bis zu etwa 27⁰C stabil.

4403b

Eine mikroanalytische Untersuchung des Hydrochlorids des Faktors C₃ des Antibiotikums A-4696 ergibt folgende ungefähre Elementarzusamrnensetzung, wobei der Rest Sauerstoff ist:

C = 51,73, H = 4,69, N = 5,94, Cl = 6,02.

Das Hydrochlorid des Faktors C, des Antibiotikums A-4696 weist in Wasser bei 280 nm ein Ultraviolett-Absorptions-

1 % maximum E-, von 4 7,9 auf.

Das Hydrochlorid des Faktors C-. des Antibiotikums A-4696 zeigt in Kaliumbromid das aus der Fig. 5 hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Im Bereich von 4000 bis cm lassen sich in diesem Spektrum folgende voneinander unterscheidbare Absorptionsmaxima feststellen: 3378 breit, 2925, 1728, 1689, 1658, 1637, 1616, 1589, 1579, 1573, 1546, 1536, 1529, 1523, 1503, 1489, 1474, 1457, 1426, 1421, 1397, 1387, 1286, 1231, 1206, 1121, 1075, 1062, 1028, 1012, 987, 965, 949, 878, 840, 816, 769 und 708 cm"¹.

Der Faktor E, des Antibiotikums A-4696 ist in Form des Hydrochloridsalzes eine weiße kristalline Verbindung, die löslich ist in Wasser sowie hydroxylgruppenhaltigen und polaren Lösungsmitteln, jedoch unlöslich ist in Lösungs-, mitteln wie Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphati- '. sehen Kohlenwasserstoffen, Chlorkohlenwasserstoffen und dergleichen. Dieser Faktor ist in wäßriger Lösung über einen pH-Bereich von etwa 4 bis 9 bei Temperaturen von bis zu etwa 27°C stabil.

Eine mikroanalytische Untersuchung des Hydrochlorids des Faktors E, des Antibiotikums A-4696 ergibt folgende ungefähre Elementarzusamrnensetzung, wobei der Rest Sauerstoff ist:

C = 5 0,71, H = 4,70, N = 9,01, Cl = 1,84.

244038

Das Hydrochlorid des Faktors E, des Antibiotikums A-4696 weist in Wasser bei 279 nm ein Ultraviolett-Absorptions-

1⁵^

maximum E₁° von 39,9 auf. lern

Das Hydrochlorid des Faktors E, des Antibiotikums A-4696 zeigt in Kaliumbromid das aus der Fig. 6 hervorgehende Infrarot-Absorptionsspektrum. Im Bereich von 4000 bis cm lassen sich in diesem Spektrum folgende voneinander unterscheidbare Absorptionsmaxima feststellen: 3394 breit, 2933, 1657, 1636, 1610, 1589, 1538, 1511, 1505, 1453, 1424, 1393, 1369, 1328, 1320, 1291, 1232, 1212, 1178, 1120, 1075, 1061, 1031, 1018, 986, 973, 904, 878,- 847, 813, 770, 752, 738 und 714 cm"¹.

Die Hydrochloride der Faktoren B,, B„, B,, C, , C-, oder E, des Antibiotikums A-4696 sind gegenüber Bacillus sub— tilis praktisch genauso antibiotisch wirksam wie das Antibiotikum A-4696 (US-PS 4 115 552).

Aus den Faktoren B, , B-, B₃, C-, , C₃ und E, des Antibiotikums A-4696 lassen sich unter Anwendung an sich bekannter Methoden und Einsatz von Mineralsäuren, wie .Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen entsprechende pharmazeutisch unbedenkliche Salze herstellen. Zur Bildung antibiotisch wirksamer Salze derartiger Säuren säuert man beispielsweise eine Lösung der freien Base des jeweiligen Antibiotikums mit der gewünschten Säure an und fällt das jeweilige Salz dann durch Zugabe von Aceton zur Lösung aus. In bestimmten Fällen lassen sich solche Salze auch durch Ionenaustausch mittels einer Ionenaustauschersäule herstellen. Andere bekannte Methoden zur Bildung antibiotischer Salze können natürlich ebenfalls angewandt werden.

Die neuen Faktoren des Antibiotikums A-4696 hemmen das Wachstum einer Reihe von Mikroorganismen, die Krankheits-

^ ö i ' ¹⁵ -

erreger sind für Menschen, Tiere und Pflanzen, und sie eignen sich daher zur Unterdrückung des Wachstums solcher Organismen. Die Konzentrationen, in denen die Hydrochloride der Faktoren B₁ , B_n, B-,, C₁ , C-. und E₁ des Antibio-

l ζ j la j ι

tikuins A-4696 das Wachstum verschiedener Mikroorganismen hemmen, gehen zahlenmäßig aus den folgenden Tabellen II und III hervor. Die darin enthaltenen Hemmwerte beruhen auf dem sogenannten Agar-Verdünnungsversuch und sind in Form der Werte für die minimale Hemmkonzentration (MIC-Werte) in Mikrogramm pro Milliliter ^g/ml) angegeben.

Zur Durchführung der hierzu erforderlichen Agar-Verdünnungsversuche bringt man den jeweiligen Versuchsorganismus auf Agarplatten auf, in deren Agar das jeweilige Hydrochlorid des entsprechenden Faktors des Antibiotikums A-4696 in verschiedener Konzentration enthalten ist. Die Versuchsplatten werden dann 48 Stunden bei 37°C inkubiert, worauf man den jeweiligen MIC-Wert in Form der Platte mit der niedrigsten Konzentration an Antibiotikum bestimmt, durch welche das Wachstum des Versuchsorganismus gehemmt wird. .

Die dabei erhaltenen Versuchsergebnisse lassen sich den folgenden Tabellen entnehmen.

TABELLE II

Minimale Henirnkonzentration - Agar-Ver-

ciunnungsversuch '

Jeweiliger Actaplanin-Faktor (pg/ml)

. . ·CD

Versuchsorganismen (Bakterien) B-. Β_Ί B₀ C,

ι. ζ λ -La

Staphylococcus epi Hitchens- 32 8 2 2

Staphylococcus epi Dutt. 0,25 0,25 0,06 0,13

Staphylococcus epi Bennet 16 4 2 1

Staphylococcus aureus 4 283 16 4 1 1

Staphylococcus aureus 3 055 4 2 11

Staphylococcus aureus 3132 16 4 2 2

Staphylococcus aur^us H25 4 2 2 1

staphylococcus aureus 3134 8 4 2 2

Staphylococcus aureus 3123 8 4 12

Staphylococcus aureus 1153 5 8 4 2 2

Staphylococcus ciureus 3131 8 4 2 1

Streptococcus Group D 282 2 2 0,5 0,5

Streptococcus Group D 238 2 2 0,5 0,5

Streptococcus Group D SS992 2 1 0,5 0,5

Streptococcus Group D 9901 2 2 0,5 0,5

Streptococcus Group D 9913 2 2 0,5 0,5

Streptococcus Group D 9933 2 2 0,5 0,5

Streptococcus Group D Guze 2 1 0, 5 0,

Streptococcus Group D 12753F 2 2 0,5 0,5

TABELT,E T. I ( Fortsetzung )

VersuchsOrganismen (Bakterien)

SIreptoeoccus viridans 9943— Strepi-ocoocus viridans 9961 Streptococcus pyogenes C203

i)Lreptocoecus pyogenes DSb63-7 2

Streptococcus pyogenes l)SG()-l-72

StrepLococcub piicumoniae Park I

HLiL-iiLocücous ptieumoniae Type 1-4

Staphylococcus aureus 3074 Streptococcus fciecalis X66 Pro Leu s imurgaivii PR15 Salnionella typhosa SA12 Klob.s.iella pneumoniae KLl4 Enterobacter aerogenes EB17 SerraLia niarcescens SE3 Eücherlcia coli li;Cl4 Citrobacter rreundii CF17

Minimale llemmkorr/.entration - Agar-Ver-

dünnungsversuch Jevjoiliger Actaplanin-Faktor (pq/ml)

^Bl 0, 5 1 0,5

0,5

^B3

0,25 0,5 0,25

0,5

0,5	0,5	o,	5	0,5
Ο, 5	0,5	o,	5	0, 5
0,. 5	0,5	°'	5	0,5
32	ti	4		8
1	1	<o,	5	2
>128	>128	>128		>128
>l 28	>].28	>128		M28
>128	>128	>128		>128
>128	>128	>128		>128
>128	>128	>128		>128
>128	>128	>128		>128
>128	>128	>128		M28

TABELLE II(Fortsetzung)

Minimale Hercimkonzentration - Agar-Ver-

dünηungsversuch Jeweiliger Actaplanin-Faktor

Versuchsorganisrnen (Bakterien)

Pseudomonas aeruginosa X23 9 BordeLe'lla bronchi.septica 16 Salmonella typhimurium Pseudomonas solanacßarum X185 Erwinia aniylovora Cani.li.da Lropicali s A17 Tr i chophyi'-on meutacrophybes 27 Asporcjillus flavus E CciraLooyαL.is ulini

1/ MH Acjarinokulum 1:500 2/ Mti AgarinokuIum 3:10 5'i Hasenblut

B.

'la

>128	>128	>128	>128
>128	>128	>128	>128
>128	>128	, >128	>128
>128	>128	>128	>128
64	128	128	128
>128	>128	>128	>128
>128	>128	>128	>.l 28
>128	>128	>128	>128
>128	>128	>128	>128

TABELLE III

Minimale Hemrakonzentration - Agar-Lösungsversuch

Actaplanin-Faktor (mg/ml)

Versuchsorganismen (Bakterien)

S taphγLocuccus^; aureus X] . 1 Staphylococcus aureus V41 Staphylococcus aureus X400 Staphylococcus aureus S13E Staphylococcus epidermid.is Staphylococcus epidermidis Streptococcus Croup A C203 Streptococcus Group D X66 Streptococcus Group ü 9960 Streptococcus pneumoniae park Iiaenioplii.lus iüfluenzae sens. CL. llaemophilus influenzae res. Sh.uie'l.la sonnei N9 E. cdi NlO E. coli ECl4 [ :. col.i TEM Klebsieila X26 Klebsiel.! a KAE

2	16
1	16
2	16
2	16
2	32
1	16
0,5	1
ι	4
CN.	8
0,5 32	2 >128
64	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
128	>128
>128	>128
>128	>128

TABELLE III (Fortsetzung)

Minimale Hemmkonzentration - Agar-Lösungsversuch

Actaplanin-Faktor (mg/ml)

Versuchsorganismen (Bakterien) Enterobaober aerogenes X68 Enterobacter aerogenes C32 ßnterobacter aerogenes EB17 l'.aLorobacLer cloacae EB5 ßnterobacter cloacae 265A Salmonella typhosa X514 Salmonella typhosa 1335 pseudoitionas acruginosa X528 Pseudotnonas aeruginosa X23 Pseudomonas aerugincsa PsIS SerraLia raarcescens X99 SerraLi.a inarcescoiis SE3 ProL'-!Us morganii PRl5 ProüeuiJ inconstans PR33 Prot.eus rettgeri PR? Prot.eus rettgeri 024

^C3	^El
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128
>128	>128

TABELLE IU (Fortsetzung)

Minimale Hemmkonzentration - Agar-Lösungsversuch

actaplanin-Faktor (mg/ml)

Versuchsorganismen (Bakterien)

Ci ü ro bei CLe r freundii CF.1.7 BordeLeIIa fronohiseptica ClosLrid ium difficile 2994 Clostridium perfringens 81 Clostridium sept.i.cum 1128 ttubacLeruim aerofaciens 123 PepLoeoocus asaccharolyticus 13 Peptöcoccus prevoti 1281 PcpLostreptococcus anaerobius 1428 PepLoistrepLococcus- intermedius 1264 Propionibacterium acnes 7 9 Daeteroides frogilis 111 BaeLeroJdes fragilis 1877 Bc.ci-eroides fragilis 1936B ßäoteroides thetaiotaomicron 1438 Bacteroides inelaninogenicus 1856/28

^C3	E₁
>128	>128
>128	>128
1	1
1	1
1	1
1 0,5	1 1
128	128
M28	>128
2	4
1	1
128	>12i)
128	>128
64	128
64	>128
>128	>128

TABELLE III (Fortsetzung)

Minimale Hemmkonzentration - Agar-Lösungsversuch

Actaplanin-Faktor (mg/ml)

Versuchsorganismen (Bakterien) C^ E^

Baclcroides melaninogenicus 2736 128 >128

Bactoroides vulqaLi.s 121.1 128 >128

Bacl-eroides corrodens 1874 128 >128

Fusobaeteriuni symbiosum 1470 32 128 ₍

Fusobacterium necrophorum 6054A 128 >128 to

Die obigen Versuchsdaten zeigen, daß die Hydrochloride der Faktoren B,, B-, B₃, C, , C₃ und E₁ des Antibiotikums A-4696 wirksame antibakterielle und antimikrobielIe Mittel darstellen, die sich allgemein zur Bekämpfung pathogener Mikroorganismen eignen.

Die Faktoren B,, B-, B₃, C, , C₃ und E₁ des Antibiotikums A-4696 sind auch wachstumsfördernd wirksam, so daß

sie das Wachstum von Geflügel, Schweinen, Schafen und Rindem beschleunigen und die Futterverwertung erhöhen. So führt beispielsweise eine tägliche Aufnahme eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Antibiotika durch Geflügel und Schweine in einer Menge von etwa 0,5 bis 25 mg/kg Körper-. gewicht zu einem rascheren Wachstum und einer höheren Futterverwertung als wenn man den entsprechenden Tieren die gleiche Grundfutterration gibt, welche jedoch keinen Wirkstoff enthält. Unter einer solchen Grundfutterration wird die gesamte Futteraufnahme des jeweiligen Tieres verstanden, und hierbei handelt es sich demnach um die verschiedenen Futtermittel, Konzentrate, Ergänzungsfutter, Mineralien, Vitamine oder wirkstoffhaltigen Vorfutter, Rauhfutter und dergleichen, die die einzelnen Stoffe des jeweiligen Diätplans der Tiere enthalten. Beispiele für entsprechende Grundrationen für Geflügel und Schweine gehen aus

25 US-PS 4 115 552 hervor.

Als Wirkstoff in einem Tierfuttermittel verabreicht man den jeweiligen Faktor B₁, B„, B,, C-, , C₃ oder E-, des Antibiotikums A-4696 oder ein geeignetes Derivat oder Gemisch hiervon oral zusammen mit einem geeigneten Futter derart in einer Menge von etwa 2 bis 200 g/t Gesamtfutter, daß sich die gewünschte erhöhte Futterausbeute und Wachstumsförderung ergibt. Der Zusatz der Faktoren des Antibiotikums A-4696 zu einem entsprechenden Tierfutter erfolgt vorzugsweise in Form eines Vorfuttergemisches (US-PS 4 115 552), das etwa 1 bis 200 g der Faktoren B₁,

B„, Β-,, C₁ , C, oder E₁ des Antibiotikums A-4696 oder eines

i. j J. a ο L

geeigneten Derivats oder Gemisches hiervon pro kg Vorgemisch enthält. Das hierdurch erhaltene fertige Vorgemisch wird dann der entsprechenden fertigen Futterration zugegeben. Wahlweise kann man in das Futter auch ein wirkstoff haltiges Konzentrat oder Ergänzungsfutter einmischen.

Die heuen antibiotisch wirksamen Faktoren werden aus dem Antibiotikum Ά-4696 isoliert, das gebildet wird, indem man einen von mehreren Stämmen von Actinoplanes unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium so lange züchtet, bis das Kulturmedium eine wesentliche antibiotische Aktivität enthält. Die im Kulturmedium enthaltenen antibiotischen Faktoren lassen sich unter Anwendung der verschiedensten bekannten Isolierungs- und Reinigungsverfahren gewinnen.

Der zur Herstellung des Antibiotikums A-4696 geeignete Mikroorganismus ist als Stamm von Actinoplanes missouriensis aus der Familie der Actinoplanaceen identifiziert worden. Bei den Actinoplanaceen handelt es sich um eine Familie von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales, deren erste Beschreibung zu finden ist in Sei. Soc. 65, 315 bis 318 (1949) und 66, 87 bis 92 (1950), Trans. New York Acad.

25, Sei. 16, 315 bis 318 (1954), Jour. Elisha Mitchell Sei. Soc. 71, 148 bis 155 und 269 (1955), BergeyVs Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, 825 bis 829 (1957) und Jour. Elisha Mitchell Sei. Soc. 79, 53 bis 70 (1963).

Biologisch reine Kulturen der zur Herstellung des Antibiotikums A-4696 und zur anschließenden Isolierung der Faktoren B,, B„, B,, C-, , C-, und E, des Antibiotikums A-4696 geeigneten Stämme von Actinoplanes missouriensis sind in der ständigen Kulturensammlung der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt worden und bilden Teil dieser Sammlung, wovon sie unter den Nr. ATCC 31680, ATCC 31682 und ATCC 31683 ohne jegliche Beschränkung der Öffentlichkeit zugänglich sind.

Der Stamm ATCC 31682 eignet sich zur Herstellung des Antibiotikums A-4696 und nachfolgenden Isolierung der Faktoren B, sowie C-, des Antibiotikums A-4696. Der Stamm' ATCC 31680 eignet sich zur Isolierung der Faktoren B„ sowie C₃ des Antibiotikums A-4696. Der Stamm ATCC 31683 läßt sich zur Isolierung der Faktoren B₃ sowie Έ, des Antibiotikums A-4696 verwenden.

Die Stämme ATCC 31680, ATCC 31682 und ATCC 31683 von Actinoplanes missouriensis zeichnen sich durch die im folgenden näher angegebenen physikalischen Eigenschaften und Kultureigenschaften aus.

Die drei Stämme stammen aus einer Reihe von Mutationen des Stammes ATCC 23342, der in ÜS-PS 4 115 552 beschrieben wird. Die vorliegenden Stämme bilden ein ähnliches Substrat oder Mycel, und ihre Morphologie ist von der des Ursprungsstammes praktisch nicht zu unterscheiden. Es lassen sich weder Luftmycelien,Sekundarmycelien noch Sporangien feststellen, wobei ferner auch Techniken, wie ein Wachsenlassen auf Pollenkörnern, ebenfalls keinerlei Sporangien ergibt.

Die wesentlichen Unterschiede der vorliegenden Stämme bestehen in den entsprechenden Züchtungseigenschaften, insbesondere der Pigmentation der Primärrnycelien. Der Stamm ATCC 31680 hat ein orange gefärbtes Mycel, dessen Farbe je nach dem jeweiligen Medium von mittelorange bis bräunlich-orange zu stark orange reicht. Die Stämme ATCC 31682 und ATCC 31683 weisen keine derartige, unterscheidbare Farbe auf und haben gelblich-graue Mycelien.

Die zur taxonomischen Untersuchung der Stämme ATCC 31680, ATCC 31682 und ATCC 31683 geeigneten Methoden sind dem Fachmann bekannt. Im großen und ganzen handelt es sich hierbei um die vom International Streptomyces Project

44038 7

(ISP) hierfür empfohlenen Methoden, wie sie von Shirling und Gott lieb in Intern. J. of Systematic Bacteriol. 16(3),313 bis 340 (1966) beschrieben sind. Die Biountersuchungen werden durchgeführt nach den Methoden von Blazevic und Edere-r, 1975, Principles of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.,New York. Die Zuordnung der Farbnamen, Abkürzungen und Zahlen erfolgt nach der Methode ISCC-NBS von Kelly und Judd, 1976, The ISCC-NBS Centroid Color Charts Standard Sample No. 2106, US-Dept. of Commerce, National Bureau of Standards, Washington D.C. Die Lysozymresistenz und die Zersetzung von Casein, Aesculin, Hypoxanthin, Tyrosin und Xanthin werden unter Anwendung des Verfahrens von Berg, 1973, Appl. Microbiol. 25, 665 bis 681 ermittelt. Es werden ferner auch Untersuchungen über die Kohlenstoffverwertung durchgeführt, deren Ergebnisse wie folgt bewertet werden:

++ = gleich bis/oder > Glucosekontrolle, positive Verwertung

+ = < Glucosekontrolle,> keine Kohlenstoffkontrolle, positive Verwertung

(+) = fragliches Wachstum, fragliche Verwertung = kein Wachstum, negative Verwertung.

Die folgenden tabellarischen Aufstellungen zeigen eine taxonomische Beschreibung unter- Einschluß der Kulturcharakteristiken und der physiologischen Charakteristiken der erfindungsgemäß zu verwendenden Stämme von Actinoplanes.

Z44Ü38

Allgemeine Kulturcharakteristiken und physiologische Charakteristiken des Stammes Actinoplanes ATCC 31680

Beobachtete Eigenschaften Charakteristiken

Kulturcharakteristiken von: ISP-Medium, Nr.

ISP-Medium Nr. 3 ISP-Medium Nr. 4

ISP-Medium Nr. 5 ISP-Medium Nr. 7 Bennett-Agar Calciummalat Czapek-Agar Glucose-Asparagin Tomatenpaste-Hafermehl Anio-Heηsens-Agar reichliches Wachstum,Farbe der Unterseite 76. l.yBr, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 93. yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 53.m.O., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, glänzend, Farbe der Unterseite 50. s.o., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 54.brO, kein Luftmycel, hellbraunes lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 53.m.O., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, glänzend Farbe der Unterseite 50. s.o., kein Luftmycel,. kein lösliches Pigment.

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 5 0.S.O., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Deutliches Wachstum, Farbe der Unterseite 53.m.O., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 53.m.O., kein Luftmycel, kein lösliches. Pigment

Schiechtes Wachstum, Farbe der Unterseite 93.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Beobachtete Eigenschaften Charakteristiken

3H-Medium

Czapek-Pepton Schlechtes Wachstum, Farbe der Unterseite 91.d.gyY, kein Luftmycel, kein lös-_ liches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 54.brO, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Casein-Zersetzung Catalase-Reaktion Aescu1 in-Zersetzung Gelatine-Verflüssigung H-S-Produktion in ISP-Medium Nr. 6 Hypoxanthin-Zersetzung Lysozym-Resistenz MeXanoidpigmente auf ISP-Medium Nr. ISP-Medium Nr. ISP-Medium Nr,

ISP-Medium Nr, minus Tyrosin

6 7 7

NaCl-Verträglichkeit auf ISP-Medium Nr. 2

Nitrat-Reduktion

pH-Wachstumsbereich auf ISP-Medium Nr. 2 Phosphatase-Produktion Magermilch-Reaktion

Stärke-Hydrolyse auf ISP-Medium Nr. 4

Saccharose-Verträglichkeit auf ISP-Medium Nr. 2

Temperatur-Wachstumsbereich auf ISP-Medium Nr. 2 Tyrosin-Zersetzung Urease-Produktion Antibiotische Empfindlichkeit: Cephalothin (Natrium) 30 μα Erythromycin (Estolat) 15 ug Novobiocin 30 μς Penicillin (G) 10 Einheiten Rifampin 5 μg Streptomycin 10 μς Tetracyclin 30 μg

Positiv Positiv Positiv Negativ Spur

Negativ Negativ

Negativ Negativ Negativ

Negativ

2 %

Negativ

6 bis 8,4 Positiv Negativ.

Negativ 20 %

5 bis 37°C Negativ Positiv

Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv

244038

Vancomycin HCl 30 μg Sensitiv

Xanthin-Produktion Negativ

KohlenstoffVerwertung auf ISP-Medium Nr. 9 * mit:

keinem Kohlenstoff -

Glucose ++

L-Arabinose . ++

Cellobiose ++

D-Fructose ++

D-Galactose ++ Isoinosit

D-Mannit . +

Melibiose +

Raffinose +

D-Rharnnose . ++

D-Ribose (+)

Salicin + .

Saccharose +

D-Xylose ++

* Zusatz sterilisierter Kohlenstoffquellen bis zu einer Endkonzentration von 1,0 %.

Bildung von Faktoren des Antibiotikums A-4696 B_ und C₃

Allgemeine Kulturcharakteristiken und physiologische Charakteristiken des Stammes Actinoplanes ATCC 31682

Beobachtete Eigenschaften Charakteristiken

Kulturcharakteristiken von:

ISP-Medium Nr. 2 Gutes Wachstum, Farbe der

Unterseite 9O.gy.Y., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

ISP-Medium Nr. 3 Gutes Wachstum, Farbe der

Unterseite 93. yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

ISP-Medium Nr. 4 ISP-Medium Nr. 5 ISP-Medium Nr. 7 Bennett-Agar Calciummalat Czapek-Agar Glucose-Asparagin Tomatenpaste-Hafermehl Anio-Hensen-Agar 53H-Medium Czapek-Pepton

Caseiη-Zersetzung Catalase-Reaktion Aescu1 in-Zersetzung Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 79.1.gy. yBr, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, glänzend, Farbe der Unterseite 9O.gy.Y, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Ausreichendes Wachstum, Farbe der Unterseite 80.gy.yBr, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 93.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, glänzend, Farbe der Unterseite 93.yGrau kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 93.yGr.au, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 9 3.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 91.d.gy.Y., kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Ausreichendes Wachstum, Farbe der Unterseite 91.d.gy.Y, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 91.d.gy.Y, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite 9O.gy.Y, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Positiv Positiv Positiv

Gelatine-Verflüssigung H„S-Produktion in

ISP-Medium Nr.

Hypoxanthin-Zersetzung Lysozym-Resistenz Melanoid-Pigmente auf ISP-Medium Nr. 1 ISP-Medium Nr. 6 ISP-Medium Nr. 7

ISP-Medium Nr. 7 minus Tyrosin

NaCl-Verträglichkeit auf ISP-Medium Nr. 2

Nitrat-Reduktion

pH-Wachstumsbereich auf ISP-Medium Nr. 2

Phosphatase-Produktion Magermilch-Reaktion

Stärke-Hydrolyse auf ISP-Medium Nr. 4

Saccharose-Verträglichkeit auf ISP-Medium Nr.

Temperatür-Wachstumsbereich auf ISP-Medium Nr.

Positiv (100 %)

Spur

Negativ Negativ

Negativ Negativ Negativ

Negativ

2 % Negativ

'6 bis 8 Positiv Negativ

Negativ 20 %

10 bis 37°C Positiv Positiv

Tyrosin-Zersetzung Urease-Produktion Antibiotische Empfindlichkeit:

Cephalotin (Natrium) 30 μg Sensitiv

Erythromycin (Estolat)

15 μg Sensitiv

Chlormycetin 30 μg Sensitiv

Novobiocin 30 μg Sensitiv Penicillin (G) 10 Einheiten Sensitiv

Rifampin 5 μg Sensitiv

Streptomycin 10 μg Sensitiv

Tetracyclin 30 μg ' Sensitiv

Vancomycin HCl 30 μg · Sensitiv

Xanthin-Produktion Negativ

7 -33-

Kohlenstoffverwertung auf ISP-Medium Nr. 9 * mit:

keinem Kohlenstoff

Glucose ++

L-Arabinose ++

Cellobiose ++

D-Fructose ++

D-Galactose ++ Isoinosit

D-Mannit ++

Melibiose +

Raffinose +

D-Rhamnose +

D-Ribose +

Salicin +

Saccharose +

D-Xylose ++

* Zusatz sterilisierter Kohlenstoffquellen bis zu einer

Endkonzentration von 1,0 h.

Bildung von Faktoren des

Antibiotikums A-4696 A, B₁ , B-, und C₁

Al!gemeine Kulturcharakteristiken und physiologische Charakteristiken des Stammes Actinoplanes ATCC 31683

Beobachtete Eigenschaften Charakteristiken

Kulturcharakteristiken von:

ISP-Medium Nr. 2 . Gutes Wachstum, Farbe der

Unterseite 9O.gy.Y, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

ISP-Medium Nr. 3 Gutes Wachstum, Farbe d.er

Unterseite 93.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

ISP-Medium Nr. 4 ISP-Medium Nr. 5 ISP-Medium Nr. 7 Bennett-Agar Calciummalat Czapek-Agar Glucose-Asparagin Tomatenpaste-Hafermehl Anio-Hensen-Agar 53H-Medium

Czapek-Pepton

Casein-Zersetzung Catalase-Reaktion Aescu1in-ZerSetzung Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 79.1.gy.yBr, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Ausreichendes Wachstum, Farbe der Unterseite 9O.gy.Y,-kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Ausreichendes Wachstum, Farbe der Unterseite 80.gy.yBr, kein Luftmycel, hellbraunes lösliches Pigment

Reichliches Wachstum, Farbe der. Unterseite 93.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, glänzend, Farbe der Unterseite 93.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, Farbe der Unterseite 93.yGrau, kein Luftmycel, kein lösliches Pigment

Positiv Positiv Positiv

Gelatine-Verflüssigung H_S-Produktion in

ISP-Medium Mr.

Hypoxanthin-Zersetzung Lysozym-Resistenz

Melanoid-Pigrnente auf ISP-Medium Nr. 1 ISP-Medium Nr. 6 ISP-Medium Nr. 7

ISP-Medium Nr. 7 minus Tyrosin

NaCl-Verträglichkeit auf ISP-Medium Nr.' 2

Nitrat-Reduktion

pH-Wachstumsbereich auf ISP-Medium Nr. 2

Phosphatase-Produktion Magermilch-Reaktion

Stärke-Hydrolyse auf ISP-Medium Nr.· 4

Saccharose-Verträglichkeit auf ISP-Medium'Nr. 2

Temperaturwachstumsbereich auf ISP-Medium Nr.

Tyrosin-Zersetzung Urease-Produktion Antibiotische Empfindlichkeit:

Cephalothin (Natrium) 3(f Mg

Erythromycin (Estolat) 15* Mg

Chlormycetin 30 μg Novobiocin 30 μg Penicillin (G) 10 Einheiten Rifampin 5 μg Streptomycin 10 μg Tetracyclin 30 μg Vancomycin HCl 3 0 μg Positiv (100 %)

5 ρ u r Negativ Negativ

Negativ Negativ Negativ

Negativ

< 2 % Negativ

6 bis 8,4 Positiv Negativ

Negativ 20 %

5 bis 40⁰C Positiv Negativ

Sensitiv

Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv Sensitiv

Xanthin-Produktion Negativ-

Kohlenstoff verwertung auf ISP-Medium Nr. 9 * mit:

keinem Kohlenstoff -

Glucose ++

L-Arabinose ++

Cellobiose ++

D-Fructose ++ . ·

D-Galactose ++

Isoinosit -

D-Mannit ++

Melibiose +

Raffinose +

D-Rhamno'se +

D-Ribose +

Salicin +

Saccharose +

D-Xylose ++

* Zusatz sterilisierter Kohlenstoffquellen bis zu einer Endkonzentration von 1,0'%.

Bildung von Faktoren des

Antibiotikums Ά-4696 A, B-,, B₂ und B~

Wie bereits oben erwähnt, kann man die Stämme ATCC 31680, ATCC 31682 und ATCC 31683 von Actinoplanes missouriensis in einem Kulturmedium wachsen lassen, um hierdurch das Antibiotikum A-4696 zu produzieren, aus welchem anschließend die antibiotisch wirksamen Faktoren von A-4696 isoliert v/erden. Als Kulturmedium läßt sich hierzu irgendeines der verschiedensten bekannten - Medien verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, maximalen Ausbeute und leichten Isolierbarkeit des Antibiotikums werden hierzu jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. So ist beispielsweise Stärke eine der bevorzugten Quellen

für Kohlehydrat, während Hefe eine der bevorzugten Quellen für Stickstoff darstellt. Zu anderen verwendbaren Quellen für Kohlehydrat gehören Melasse, Glucose, Dextrin, Glycerin und dergleichen. Zu weiteren Quellen für Stickstoff gehören Aminosäuregemische, Peptone und dergleichen.

Zu anorganischen Nährsalzen, die in das Kulturmedium eingeführt werden können, gehören die üblichen Salze, die Ionen von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Chlorid oder Sulfat liefern. Ferner können auch Quellen für Wachstumsfaktoren verwendet v/erden, wie bei der Korndestillation anfallende Rückstände oder Hefeextrakte, die die Bildung der einzelnen Faktoren des Antibiotikums Α-4β9β günstig beeinflussen.

In dem Kulturmedium, in dem man die erfindungsgemäßen Stämme von Actinoplanes wachsen läßt, sollen ferner auch essentielle Spurenelemente vorhanden sein, wie man sie auch zum Wachsenlassen und zur Entwicklung anderer Mikroorganismen braucht. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die den Wachstumserfordernissen des Organismus genügen.

Die zur Bildung des Antibiotikums A-4696 und zur nachfolgenden Isolierung der Faktoren B., B₉, B₃, C, ,.C^ und E, des Antibiotikums A-4696 verwendeten Organismen können in einem verhältnismäßig breiten pH-Bereich wachsen. Zweckmäßigerweise züchtet man den jeweiligen Organismus jedoch in einem Medium, das einen pH-Wert zwischen etwa 6,5 und 7,0 hat. Wie bei anderen Actinomyceten, so verändert sich auch im vorliegenden Fall der pH-Wert des wachsenden Mediums allmählich während der Wachstumszeit, so daß der pH-Wert am Ende der Fermentationszeit gewöhnlich zwischen

etwa 6,5 und 7,5 liegt.

Für die Bildung der Faktoren des Antibiotikums Ä-4696 werden submerse aerobe Kulturbedingungen bevorzugt. Durch . · Schüttelkolben-Fermentation lassen sich verhältnismäßig geringe Mengen der Antibiotika erzeugen. Zur Herstellung größerer Mengen hiervon wird jedoch eine Züchtung unter submersen aeroben Bedingungen in sterilen Tanks bevorzugt. Das im jeweiligen sterilen Tank befindliche Kulturmedium kann mit einer Suspension von Mycelfragmenten beimpft werden.

Es empfiehlt sich demnach, durch Beimpfen einer verhältnismäßig geringen Menge eines Kulturmediums mit den Mycelbruchstücken des jeweiligen Organismus zuerst ein vegetatives Inokulum des Organismus zu bilden, und das hierdurch erhaltene junge aktive vegetative Inokulum dann, unter aseptischen Bedingungen in den großen Tank zu übertragen. Zum Wachsenlassen des vegetativen Inokulums kann man das gleiche Medium verwenden wie für die großtechnische Produktion der einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696. Es können jedoch auch jeweils andere Medien eingesetzt werden.

Die die einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4596 bildenden Stämme ATCC 31680, ATCC 31682 und ATCC 31683 von Actinoplanes missouriensis wachsen bei Temperaturen zwischen 20 und 40⁰C. Die größten Mengen an Faktoren des Antibiotikums A-4696 scheinen bei einer Temperatur von etwa 30⁰C gebildet zu werden.

Beim submersen aeroben Züchtungsverfahren wird durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Die Menge an in das Kulturmedium eingeleiteter Luft schwankt zwischen etwa 0,1 und 1,0 Volumenteilen Luft pro Minute und pro Volumen Kulturmedium. Am besten sind Wachstum und Bilduna

an Antibiotikum bei Einleitung einer Luft in einer Menge von wenigstens 0,5 Volumenteilen Luft pro Minute und pro Volumen an Kulturmedium.

Das Ausmaß der Bildung der Faktoren des Antibiotikums A-4696 und die Konzentration der antibiotischen Aktivität im Kulturmedium läßt sich während der Wachstumszeit verfolgen, indem man Proben der Fermentationsbrühe bezüglich ihrer antibiotischen Wirksamkeit gegenüber Organismen untersucht, von denen man weiß, daß sie antibiotikaempfindlich sind. Ein hierfür geeigneter Prüforganismus ist Bacillus subtilis. Diese Biountersuchung läßt sich unter Verwendung der üblichen Becher-Platten-Methoden oder mit Hilfe von Papierscheiben auf Agarplatten durchführen.

Eine maximale Bildung an Antibiotikum erfolgt im allgemeinen innerhalb von etwa 4 bis 6 Tagen in Schüttelkolben-Fermentationen oder bei submersen aeroben Kulturbedingungen.

Das nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene Antibiotikum A-4696 kann zur anschließenden Isolierung der Faktoren B-,., B₂, B₃, C, , C₃ und E-, des Antibiotikums A-4696 vom Kulturmedium abgetrennt und von anderen eventuell vorhandenen Substanzen befreit werden, wozu man sich üblicher Adsorptionsverfahren und Extraktionsverfahren bedient. Die Adsorptionsverfahren werden hierzu bevorzugt, da man hierbei im Gegensatz zu den Extraktionsverfahren nicht mit großen Lösungsmittelvolumina arbeiten muß.

Die einzelnen Verfahren sind für ein

Arbeiten mit den Stämmen ATCC 31680 (zur Isolierung der Faktoren B„ und C₃ des Antibiotikums A-4696), ATCC 31682 (zur Isolierung der Faktoren B, und C, des Antibiotikums A-4696) und ATCC 31683 (zur Isolierung der Faktoren B₃

und E, des Antibiotikums A-4696) praktisch gleich, so daß in den folgenden Beispielen lediglich die Verwendung von ATCC 31682 beispielsmäßig erläutert wird. Bestimmte verfahrensmäßige Unterschiede in bezug auf das Produktionsmedium und die Verwendung des Stammes ATCC 31683 sind bei Beispiel 1 jedoch ebenfalls angegeben.

Ausführunqsbeispiele: .

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert..

Beispiel 1

A. Schüttelkolben-Fermentation

Man beimpft Mycelbruchstücke von Actinoplanes missouriensis, nämlich im vorliegenden Fall vom Stamm ATCC 31682, auf einer Nähragarschräge folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Mengen

Cerelose 0,5 %

Kartoffeldextrin 2,0 %

Sojabohnenmehl * 1,5 %

Hefeextrakt 0,25 %

CaCO₃ 0,1 %

Agar 2,0 %

* Nutrisoy-Flour von Archer Daniels Midland Company, 4666 Faries Parkway, Decatur, Illinois 62526.

Die mit ATCC 31682 beimpfte Schräge wird dann 6 Tage bei 30⁰C inkubiert. Die Kultur bildet keine Sporen, so daß man die Mycelmatter mit einer sterilen Pipette zerkleinern muß. Die zerkleinerte reife Kultur wird mit

sterilem destilliertem Wasser überdeckt und sorgfältig mit der Pipette oder einem sterilen Stab abgeschabt, wodurch man zu einer Mycelsuspension gelangt.

Die auf diese Weise erhaltene Suspension verwendet man dann zur Beimpfung von 100 ml eines sterilen vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Mengen

Cerelose 0,5 %

Kartoffeldextrin · 2,0 %

Sojabohnenmehl 1,5 %

Hefeextrakt 0,25 %

CaCO₃ 0,1 %

Das inokulierte vegetative Medium läßt man 48 Stunden bei 30⁰C auf einem Rotationsschüttler wachsen, der mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen/Minute bewegt wird. Sodann inokuliert man 10 ml dieses vegetativen Mediums in 100 ml eines sterilen Ausgangsmediums (Stoßrcediurn) folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Mengen

Cerelose 0,5 %

Hefe : 0,25 %

Sojabohnenmehl 1,5 %

Maisstärke 2,0 %

CaCO₃ . 0,1 %

Sag 471 0,05 %

Das erhaltene inokulierte Ausgangsmedium inkubiert man dann 24 Stunden bei 30⁰C unter ständigem Schütteln eines mit 250 Umdrehungen/Minute betriebenen Rotationsschüttlers.

0,4 ml des so gebildeten Ausgangsmediums inokuliert man hierauf jeweils in 100 ml eines Produktionsmediums mit folgender Zusammensetzung, das in 500 ml fassenden Erlenmeyerkolben enthalten und bei 121⁰C über eine Zeitdauer von 30 Minuten sterilisiert worden ist.

Bestandteile Mengen

Cerelose	1,0 %
Maisstärke	3,5 %
Saccharose	3,0 % ·
Melasse	. 1,5 %
Hefe	1,0 %
Baumwollsaatmehl (ProfIo)	1,0 %
CaCO₃	0,2 %
K₂HPO₄	0,05 %
(NH₄)₂SO₄	0,025 %
MgSO₄.7H₂O	0,5 %
Sag 471	0,03 %

Das obige Produktionsmedium wird etwa 96 Stunden bei einer Temperatur von 30⁰C auf einem mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen/Minute betriebenen Rotationsschüttler geschüttelt. Am Ende der Fermentationsdauer verfügt dieses Medium über einen pH-Wert von etwa 8,0.

Für die Herstellung der Faktoren B-, und E, des Antibiotikums A-4696 verwendet man den Stamm ATCC 31683 für die Bildung des als Produktionsmedium benötigten Ausgangsmediums. Zu diesem Zweck impft man 0,4 ml des den Stamm ATCC 31683 enthaltenden Ausgangsmediums in jeweils 100 ml eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung ein, das in 500 ml fassenden Erlenmeyerkolben enthalten ist und. bei 121⁰C über eine Zeitdauer von 30 Minuten sterilisiert worden ist.

u ο ο / - 43 -

Bestandteile Mengen

Cerelose 1,0 %

Hefe . 2,0 %

CaCO₃ 0,2 %

K₃HPO₃ ' . 0,05 %

^)₂SO₄ . 0,025 %

Sag 471 .0,03 %

Das so gebildete Produktionsmedium wird etwa 96 Stunden bei einer Temperatur von 3O⁰C auf einem bei 250 Umdrehungen/Minute betriebenen Rotationsschüttler geschüttelt. Am Ende der Fermentationszeit verfügt das Medium über einen pH-Wert von etwa 8,0.

B. Tankfermentation in einem 40 1 fassenden Tank

Zur Herstellung des benötigten Inokulums geht man wie oben unter Abschnitt A. beschrieben bis zur Inkubation des Ausgangsmediums vor. 25 1 eines Produktionsmediums der angegebenen Art sterilisiert man dann durch 30 Minuten lange Behandlung bei 121⁰C in einem Autoklav und gibt das Ganze hierauf in einen 40 1 fassenden Fermentationstank. Das sterile Produktionsmedium beimpft man hierauf mit 100 ml des Ausgangsmediums. Sodann läßt man das beimpfte Produktionsmedium 4 Tage bei 30⁰C fermentieren. Die Fermentation wird mit steriler Luft in einer Menge von etwa 0,5 Volumenteilen Luft/Volumenteil Kulturmedium/Minute belüftet. Das'fermentierende Produktionsmedium wird mit einem mit Schaufeln versehenen Mischer bewegt, um hierdurch für eine saubere Durchmischung von Luft und Medium zu sorgen. Mit fortschreitender Fermentation erhöht sich der pH-Wert des Kulturmediums allmählich von einem Anfangswert von etwa 6,5 auf etwa 8,0.

C. Isolierung des Antibiotikums A-4696

Die nach obigem Verfahren hergestellte Fermentationsbrühe (3800 1). wird nach Zugabe von 5 % (Gewicht/Volumen) FiI-terhilfe (Celite 545) filtriert. Der erhaltene Filterkuchen wird in deionisiertem Wasser (3600 1) suspendiert und der pH-Wert der wäßrigen Suspension mittels wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 10,5 eingestellt. Die suspendierten Feststoffe werden durch Filtrieren abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Filtrat und Waschflüssigkeit werden vereinigt, und die hierbei erhaltene Lösung wird mit 20 %-iger (Gewicht/Volumen) wäßriger Schwefelsäure auf pH 4,5 angesäuert. Die saure Lösung wird durch Filtrieren unter Verwendung von 1 % Filterhilfe (Celite 545)· geklärt. Die klare Lösung wird dann durch eine Säule (0,55 χ 1,5 m) geführt, die 350 1 Amberlite IR-116 (Na⁺- Form) enthält, und die Säule wird hierauf mit deionisiertem Wasser (1200 1) gewaschen. Hierauf wird das IR-116-Harz aus der Säule entfernt und absatzweise bei pH 10,5 mit einer wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid (insgesamt 1000 1) eluiert. Das erhaltene Harzeluat wird mit 20 %-iger (Gewicht/Volumen) wäßriger Schwefelsäure neutralisiert (pH 7) und dann dreimal mit deionisiertem Wasser (insgesamt 150 1) gewaschen. Das Waschwasser wird neutralisiert und mit dem neutralisierten Eluat vereinigt. Die erhaltene Lösung wird konzentriert und dann gefriergetrocknet. Der auf diese Weise hergestellte rohe Komplex schwankt in seiner Farbe von lohfarben bis dunkelbraun.

D. Entfernung der Salze aus dem rohen Antibiotikum A-4696

Man gibt den obigen rohen Komplex (1,0 kg) langsam unter kräftigem Rühren zu deionisiertem Wasser (1,5 1). Die erhaltene Suspension wird 20 Minuten gerührt und dann unter Verwendung von 10 %-iger wäßriger Ammoniumhydroxid-

r» - 45 -

lösung neutralisiert (pH /). Der unlösliche Komplex des Antibiotikums A-4696 wird durch Vakuumfiltration abgetrennt, mir deionisiertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet. Auf diese Weise erhält man den getrockneten und von Salz befreiten Komplex in einer Ausbeute von etwa 80 % (bezogen auf die Biowirksamkeit).

E. Reinigung des von Salzen befreiten Antibiotikums Ä-4696

Der in obiger Weise erhaltene getrocknete und von Salz befreite Komplex (300 g) wird in deionisiertem Wasser (2 1) suspendiert, worauf man den pH-Wert der Suspension durch Zugabe von 3n wäßriger Chlorwasserstoffsäure auf pH 2,7 einstellt. Die angesäuerte Lösung wird 40 Minuten bei 2500 ürndrehungen/Minute zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und auf eine Säule (8 χ 85 cm) gegeben, die 6 1 Entfärbungsharz (Duolite S761) enthält.Die Aktivität wird von der Säule mit deionisiertem Wasser unter einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml/Minute eluiert. Die Eluierung wird dünnschichtchromatographisch überwacht. Der das Antibiotikum A-4696 enthaltende Säulenabstrom wird unter Vakuum (3 mm, 35⁰C) auf ein Volumen von 3 1 eingeengt und dann gefriergetrocknet. Auf diese Weise gelangt man zu einem entsprechend entfärbten Komplex in Form eines weißen bis lohfarbenen Feststoffs in einer Ausbeute von etwa 70 % (bezogen auf die entsprechende Bioaktivität).

F. Isolierung der Hydrochloride der Faktoren B,., B_, B,, C, , C, und E, des Antibiotikums A-4696

Der in obiger Weise gebildete getrocknete und entfärbte Komplex des Antibiotikums A-4696 (10 g) wird in 100 ml deionisiertem Wasser gelöst. Die erhaltene wäßrige Lösung wird filtriert und auf eine chromatographische Sau-

le (5 χ 100 cm) gegeben, die 2 1 eines Polyamidharzes (Machery & Nagel SC6) enthält. Die Säule wird mit deionisiertem Wasser eluiert, wobei 200 bis 300 Fraktionen (jeweils 25 ml) aufgefangen werden. Die Elution wird durch UV-Aktivität und Dünnschichtchromatographie überwacht. Die Fraktionen werden aufgrund der dünnschichtchromatographischen Identität vereinigt und gefriergetrocknet. Bei einigen Auftrennungen ist eine Verdoppelung der Länge der Säule ('200 cm) erforderlich, indem man zwei in Reihe .geschaltete und mit Polyamidgel gefüllte Säulen verwendet. Durch wiederholte Chromatographie läßt sich eine weitere Reinigung erreichen.

Die oben unter A. bis F. beschriebenen Verfahren werden im einzelnen wiederholt, und zwar unter Verwendung des Stammes ATCG 31682, wenn man die Faktoren B, und C, des Antibiotikums A-4696 isolieren möchte, unter Verwendung des Stammes ATCC 31680, wenn man die Faktoren B₂ und C₃ des Antibiotikums A-4696 isolieren möchte, und unter Verwendung des Stammes ATCC 31683, wenn man die Faktoren B-. und E, des Antibiotikums A-4696 isolieren möchte. Zur Isolierung der oben erwähnten Faktoren lassen sich zwar auch andere Stämme von Actinoplanes verwenden, doch werden für die Isolierung der erfindungsgemäßen Faktoren des Antibiotikums A-4696 vorzugsweise die angegebenen Stämme herangezogen.

Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Hydrochloride der Faktoren B, , B_ , B_., C-. , C, und E, des Antibiotikums A-4696 unter Verwendung eines einzelnen Stammes von Actinoplanes missouriensis wird wie folgt durchgeführt.

Der getrocknete und entfärbte Komplex des Antibiotikums A-4696 (200 mg, hergestellt aus dem Stamm ATCC 31683 gemä.ß Beispiel 1, Stufen A. bis E.) wird in etwa 2 ml destilliertem Wasser gelöst. Die erhaltene wäßrige Lösung

-τ -sr w ν w g _₄₇_

wird filtriert und durch Säulenchromatographie aufgetrennt, und zwar unter Verwendung von Urr.kehrphasenadsorbentien, wie beispielsweise Li Chroprep ^v RP-IS* als stationäre Phase und wäßrigen Acetonitrilgradienten, die Triethylaminphos-· phat enthalten, als mobile Phase. Vorzugsweise v/ird mit einer Gradientenkonzentration von 10 bis 40 % gearbeitet. Je nach der Zusammensetzung der jeweiligen Fermentationen kann der Fachmann die Acetonitrilgradienten-Konzentration natürlich ändern. Der Säulenabstrom wird durch UV-Aktivität überwacht, und die die einzelnen Faktoren enthaltenden Fraktionen werden gesammelt. Das Acetonitril wird unter Hochvakuum verdampft, und die erhaltenen wäßrigen Lösungen werden gefriergetrocknet. Die gefriergetrockneten chromatographischen Fraktionen werden in destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wird auf Umkehrphasenadsorbentien, beispielsweise auf mit Sep Pak C18 gefüllte Patronen ** aufgegeben, die man mit 50 %-igem wäßrigem Methanol eluiert. Die die einzelnen Faktoren des Antibiotikums A-4696 enthaltenden wäßrigen Lösungen werden zur Trockne eingedampft, worauf man die gereinigten Faktoren des Antibiotikums A-4696 in Form trockener amorpher Feststoffe gewinnt.

* Erhältlich von E. Merck, Darmstadt, Deutschland ** Erhältlich von Waters Associates Inc., Milford, Massachusetts, V.St.A.

Beispiel 2

Herstellung der Sulfatsalze der Faktoren B₁, B₀, B-, C₁ ,

JL Z. j J. el

C-, und E, des Antibiotikums A-4696

Das Antibiotikum A-4696 (300 g, hergestellt gemäß Beispiel 1, Stufen A. bis D.) wird in deionisiertem Wasser (2 1) suspendiert, und der pH-Wert der Suspension wird durch Zugabe von 3n wäßriger Schwefelsäure auf pH 2,7 eirige-'

stellt. Die angesäuerte Lösung wird 40 Minuten bei 2500 Umdrehungen/Minute zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und auf eine Säule (8 χ 85 cm) gegeben, die 6 1 Entfärbungsharz (Duolite S761) enthält. Die Aktivität wird mit deionisiertem Wasser bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 30 ml/Minute eluiert. Die Elution wird dünnschichtchromatographisch überwacht. Der das Antibiotikum A-4696 enthaltende Säulenabstrom wird unter Vakuum (3 mm, 35°C) auf ein Volumen von 3 1 eingeengt und dann gefriergetrocknet. Auf diese Weise erhält man den entfärbten Komplex in Form eines weißen bis lohfarbenen Feststoffs in einer Ausbeute von etwa 70 % (bezogen auf die entsprechende Bioaktivität). Die Sulfate der einzelnen Faktoren B₁, B₀, B,, C₁ , C₅ und E₁ des An-

J. ζ. ο xa ο χ

tibiotikums A-4696 werden nach dem in Beispiel 1 unter Stufe F. beschriebenen Verfahren isoliert.'

Claims

1. Tierfuttermittel, dadurch gekennzeichnet , daß es als Wirkstoff eine wachstumsfördernde Menge des durch Züchtung eines Stammes ATCC 31 680,. ATCC 31682 oder ATCC 31683 von Actinoplanes missouriensis in einem Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlehydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur BiI-dung einer wesentlichen Menge an antibiotischer Aktivität erhaltenen Antibiotikumkomplexes A-4696, die Faktoren B,, B-, B-., C, , C, oder E-, des Antibiotikums A-4696 oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon enthält.

2. Tierfuttermittel nach Punkt 1, dadurch, gekennzeichnet, daß es den Faktor B-, des Antibiotikums A-4696 oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon enthält, wobei dieser Faktor B-, in Form seines Hydrochlorids eine weiße, kristalline Substanz ist, die sich in Wasser und hydroxylgruppenhaltigen sowie polaren Lösungsmitteln löst, jedoch unlöslich ist in Ether, Chloro- ' form,Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffen, eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 51,51 % Kohlenstoff, 5,25 % Wasserstoff, 4,88 % Stickstoff, 4,62 % Chlor und Sauerstoff als Rest hat, ein ungefähres.theoretisches Molekulargewicht von 1954 aufweist, über ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum in Wasser

1 %
bei 280 nm bei E-, von 4 2,8 verfügt und im Infrarot-Ab— sorptionsspektrum bei einer Bestimmung in Kaliumbromid folgende unterscheidbare Banden hat: 3380 breit, 2930, 1731, 1693, 1654, 1637, 1615, 1588, 1577, 1521, 1503, 1488, 1423,

1321, 1289, 1229, 1210, 1178, 1154, 1121, 1076, 1060, 1030, 1012, 982, 880, 842, 831 und 810 cm"¹, wobei dieser Faktor B-, aus dem durch Actinoplanes missouriensis ATCC 31682 oder AT.CC. 316.83 gebildeten Komplex A-4696 isoliert worden ist.

3. Tierfuttermittel nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß es den Faktor B„ des Antibiotikums A-4696 oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon enthält, wobei dieser Faktor B„ in Form seines Hydrochlorids eine weiße, kristalline Substanz ist, die sich in Wasser und hydroxylgruppenhaltigen sowie polaren Lösungsmitteln löst, jedoch unlöslich ist in Ether, Chloroform Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffen, eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 51,96 % Kohlenstoff, 4,67 % Wasserstoff, 5,72 % Stickstoff, 5,88 % Chlor und Sauerstoff als Rest hat, ein ungefähres theoretisches Molekulargewicht von 1808 aufweist, über ein Ultra-

1% violett-Absorptionsmaximum in Wasser bei 280 nm bei E-, von 44,7 verfügt und im Infrarot-Absorptionsspektrum bei einer Bestimmung in Kaliumbromid folgende unterscheidbare Banden hat: 3409 breit, 2934, 1730, 1658, 1614, 1588, 1548/ 1504, 1498, 1490, 1426, 1290, 1231, 1210, 1179, 1121, 1061, 1031, 1017, 987, 903, 884 und 818 cm"¹, wobei dieser Faktor B₂ aus dem durch Actinoplanes missouriensis ATCC 31680 oder ATCC 31683 gebildeten Komplex A-4696 isoliert worden ist.

4. Tierfuttermittel nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß es den Faktor B₃ des Antibiotikums A-4696 oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon enthält, wobei dieser Faktor B-. in Form seines Hydrochlorids eine weiße, kristalline Substanz ist, die sich.in Wasser und hydroxylgruppenhaltigen sowie polaren Lösungsmitteln löst, jedoch unlöslich ist in Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffen, eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 51,84 % Kohlenstoff, 4,74 % Wasserstoff, 5,83 % Stickstoff, 5,57 % Chlor und Sauerstoff als Rest hat, ein ungefähres theoretisches Molekulargewicht von 1808 aufweist, über ein Ultraviolett-Absorptionsmaxiinum in Wasser bei 280 nm bei E-. ° von 46,3 verfügt und im Infrarot-Absorptionsspektrum

W %J KJ / - 51 -

bei einer Bestimmung in Kaliumbromid folgende unterscheidbare Banden hat: 3394 breit, 2938, 1733, 1697, 1675, 1656, 1638, 1614, 1591, 1515, 1504, 1489, 1427, 1359, 1291, 1228, 1209, 1180, 1120, 1072, 1051, 1018, 985, 903, 882, 846 und 816 cm , wobei dieser Faktor B-. aus dem durch Actinoplanes missouriensis ATCC 31683 gebildeten Komplex A-4696 isoliert worden ist.

5. Tierfuttermittel nach Punkt 1, dadurch

gekennzeichnet, daß es den Faktor C, des Antibiotikums A-4696 oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon enthält, wobei dieser Faktor C, in Form seines Hydrochlorids eine weiße, kristalline Substanz ist, die sich in Wasser und hydroxylgruppenhaltigen sowie polaren Lösungsmitteln löst, jedoch unlöslich ist in Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffen, eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 53,05 % Kohlenstoff, 4,74 % Wasserstoff, 5,83 % Stickstoff, 5,39 % Chlor und Sauerstoff als Rest hat, ein ungefähres theoretisches Molekulargewicht von 1792 aufweist, über ein Ultraviolett-Absorptionsmaximum in Wasser bei 279 nm bei

lg.

E-, ° von 47,9 verfügt und im Infrarot-Absorptionsspektrum bei einer Bestimmung in Kaliumbromid folgende unterscheidbare Banden hat: 3380 breit, 2931, 1734, 1650, 1616, 1591, 1505, 1491, 1427, 1359, 1290,1228, 1213, 1177, 1123, 1072, 1061, 1032, 1017, 987, 903, 832, 814· und 715 cm"¹, wobei dieser Faktor C-, aus dem durch Actinoplanes missouriensis ATCC 31682 oder ATCC .3168 3 gebildeten Komplex

30 a-4696 isoliert worden ist.

6. Tierfuttermittel nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet , daß es den Faktor C, des Antibiotikums A-4696 oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon enthält, wobei dieser Faktor C, in Form seines. Hydrochlorids eine weiße, kristalline Substanz ist, die sich in Wasser und hydroxylgruppenhaltigen sowie polaren Lösungsmitteln löst, jedoch

OO / - 52 -

unlöslich ist in Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffen, eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 51,73 % Kohlenstoff, 4,69 % Wasserstoff, 5,94 % Stickstoff, 6,02 % Chlor und Sauerstoff als Rest hat, über ein Ultraviolett-

1 2"

Absorptionsmaximum_in Wasser bei 2 80 nm bei E-, ° von 47,9 verfügt und im Infrarot-Absorptionsspektrum bei einer Be-. Stimmung in Kaliumbromid folgende unterscheidbare Banden hat: 3378 breit, 2925, 1728, 1689, 1658, 1637, 1616,

10 1589, 1579, 1573, 1546, 1536, 1529, 1523, 1503, 1489, 1474, 1457, 1426, 1421, 1397, 1387, 1286, 1231, 1206,

1121, 1075, 1062, 1028, 1012, 987, 965, 949, 878, 840, 816, 769 und 708 cm , wobei dieser Faktor C-> aus dem

. durch Actinoplanes missouriensis ATCC 31680·oder ATCC

15 31683 gebildeten Komplex A-4696 isoliert worden ist.

7. Tierfuttermittel nach Punkt 1, dadurch . gekennzeichnet , daß es den Faktor E, des Antibiotikums A-4696 oder ein unbedenkliches Säureadditionssalz hiervon enthält, wobei dieser Faktor E-, in Form seines Hydrochlorid eine weiße, kristalline Substanz ist, die sich in Wasser und hydroxylgruppenhaltigen sowie polaren Lösungsmitteln löst, jedoch unlöslich ist in Ether, Chloroform, Benzol, Aceton, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffen, eine ungefähre Elementarzusammensetzung von 50,71 % Kohlenstoff, 4,70 % Wasserstoff, 9,01 % Stickstoff, 1,84 % Chlor und Sauerstoff als Rest hat, über ein Ultraviolett-

1 * Absorptionsmaximum in Wasser bei 279 nm bei E,° von 39,9 verfügt und im Infrarot-Absorptionsspektrum bei einer Bestimmung in Kaliumbromid folgende unterscheidbare Banden hat: 3394 breit, 2933,1657, 1636, 1610, 1589, 1538, 1511, 1505, 1453, 1424, 1393, 1369, 1328, 1320, 1291, 1232, 1212, 1178, 1120, 1075, 1061, 1031, 1018, 986, 973, 904, 878,

847, 813, 770, 752, 738 und 714 cm"¹, wobei dieser Faktor C-. aus dem durch Actinoplanes missouriensis ATCC 31683 gebildeten Komplex A-4696 isoliert worden ist.

- 53 -

8. Tierfuttermittelvorgemisch für Wiederkäuer oder Ge-

f 1 üge 1, dadurch gekennzeichnet, daß es etwa 1,0 bis 90,0 % einer Verbindung oder eines unbedenklichen Salzes nach einem der Punkte 1 bis 7 ent-

5 hält.

9. Tierfutterergänzungsmittel für Wiederkäuer oder Geflügel, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung oder ein unbedenkliches Salz nach einem der Punkte 1 bis 7 in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 1,0 Gew.-% enthält.

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