DE1617299C3

DE1617299C3 - Glycopeptid-Antibiotikum AV 290 - Komplex (Avoparcin) Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

Info

Publication number: DE1617299C3
Application number: DE1617299A
Authority: DE
Inventors: John Norman Ramsey N.Y. Porter
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1966-07-29
Filing date: 1967-07-29
Publication date: 1982-05-13
Also published as: US3338786A; DE1617299A1; GB1194365A; MY7400019A; DE1617299B2; FR6697M

Description

Luftmycel und/oder Sporenfarbe in Masse

Die Erfindung betrifft den neuen Glycopeptid-Antibiotikum-AV 290-Komplex (Avoparcin), ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur Bekämpfung von grampositiven Bakterien.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum ist gegen eine große Vielzahl von Mikroorganismen einschließlich grampositiver und gramnegativer Bakterien aktiv und insbesondere für die Bekämpfung von grampositiven Bakterien geeignet. Die Wirkung des neuen Antibiotikums auf einzelne Mikroorganismen sowie seine chemischen und physikalischen Eigenschaften unterscheiden es von früher beschriebenen Antibiotika.

Es hat sich gezeigt, daß der erfindungsgemäße Glycopeptid-Antibiotikum-AV 290-Komplex (Avoparcin) bei der oralen Applikation nicht über den Magen-Darm-Trakt von dem Organismus aufgenommen wird.

Gegenstand der Erfindung ist daher der Glycopeptid-Antibiotikum-AV 290-Komplex (Avoparcin) gemäß Hauptanspruch. Bei der darin enthaltenen Angabe, wonach Avoparcin'α und Avoparcin β in diesem Komplex im Verhältnis von 3 :1 oder 4 :1 vorliegen sollen, handelt es sich allerdings um keine Bereichsangabe für diese beiden Komponenten, sondern um eine sich aus den Fehlergrenzen der Bestimmungsmethoden, z. B. hier den Chlorgehalt, und Drehwert ergebenden Unschärferelation, da die Unterschiede in der. Struktur der Verbindungen mit R = H bzw. Chlor in bezug auf die Molekülgröße gering sind und daher nach dem derzeitigen Stand der Technik nicht ohne weiteres entschieden werden kann, ob das Verhältnis nun 1 :3 oder 1 :4 beträgt.

Die Erfindung betrifft ferner das Verfahren zur Hersteilung dieses Antibiotikums gemäß den Ansprüchen 2 und 3 sowie die Verwendung dieses Glycopeptid-Antibiotikum-AV 290-Komplexes (Avoparcin) zur Bekämpfung von grampositiven Bakterien.

Das neue Antibiotikum, das die Bezeichnung AV 290 erhielt, entsteht während der Züchtung eines neuen Stammes von Streptomyces candidus unter gesteuerten Bedingungen. Der neue, Antibiotikum erzeugende Streptomyces-Stamm wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die in Colorado gefunden wurde. Eine lebensfähige Kultur des neuen Stammes von Streptomyces candidus wurde bei Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und in die ständige Sammlung unter der Bezeichnung N RRL 3218 aufgenommen.

Im folgenden wird eine allgemeine Beschreibung des Organismus Streptomyces candidus NRRL 3218 aufgrund der beobachteten diagnostischen Merkmale gegeben. Die unterstrichenen Farbangaben und die Farbplättchenbezeichnungen sind aus Jacobson et al., »Color Harmony Manual«, 3. Ausg. (1948), entnommen.

Luftmycel und Sporen weiß, Sporenbildung schwach bis mäßig auf den meisten Medien; fehlt praktisch völlig auf Czapeks-Lösung-Agar und Asparagin-Dextrose-Agar.

Lösliche Pigmente

Gelblich auf den meisten Medien und in geringen bis mäßigen Mengen. Fehlt auf Czapeks-Lösung-Agar, Asparagin-Dextrose-Agar und anorganischem Salze-Stärke-Agar.

.■_ Farbe der Unterseite -;,-.-■'

In gelblichen bis hell orangefarbenen Farbtönungen auf den meisten Medien.

Verschiedene physiologische Reaktionen

In organischer Nitratbrühe keine Reduktion von Nitrat zu Nitrit; partielle Verflüssigung von Gelatine in 14 Tagen; keine Melaninbildung auf Pepton-Eisen-Agar.

Kohlenstoffqüellenverwertung nach - Pridham: et al. [J.

Bact. 56 (1948), S. 107 -114] wie folgt: Gute Verwertung von d-Fructose und Dextrose; schlechte bis keine Verwertung von Adonit, 1-Arabinose, Dextran, i-Inosit, Lactose, d-Mannit, d-Melezitose, d-Melibiose, d-Raffinose, l-Rhamnose, Salicin, Saccharose, d-Trehalöse und

d-Xylose. " "' «■■■■---■■ ■■.-·. ■■.,-. .■.>■_·.:,

Mikromorphologie

Sporen in langen geraden bis gewellten Ketten, Sporen länglich, 0,9—1,4 μ χ 0,4-0,5 μ, und glattwandig (durch Elektronenmikroskopie bestimmt).

Der neue Organismus ist ein Glied der weißsporigen Reihe von Streptomyceten mit geraden bis gewellten Sporenketten. Aufgrund eines Vergleichs der Kultur mit anderen anerkannten Gliedern dieser Reihe mit Hilfe taxonomischer Schlüssel und Vergleichsproben wurde geschlossen, daß dieser Organismus am besten der Species S. candidus (Krassilinikov) Waksman entspricht.

Nach Züchtung des Organismus auf verschiedenen

Medien, darunter den von Pridham et al. [»A Selection of Media for Maintenance and Taxonomic Study of Streptomyces«, Antibiotics Annual (1956/1957), S. 947-954] empfohlenen, wurde eine kritische Untersuchung der Kultur-, physiologischen und morphologischen Merkmale des Organismus durchgeführt.

In den nachstehenden Tabellen I, III und IV sind detaillierte Beobachtungen angegeben. Die unterstrichenen Farbangaben sind aus dem »Color Harmony Manual« entnommen.

Tabelle I

Kultureigenschaften von Streptomyces candidus NRRL 3218

Medium

Wachstum Luftmycel und/oder Sporen

lösliches Inkubation: 14 Tage
Pigment Temperatur: 28 C

Unterseitenfarbe Bemerkungen

Czapek' Lösung-Agar

sehr gering Spuren von weißlichem Luftmycel und Sporulation

keines weißlich

Asparagin-Dextro- gering
se Agar

Tomatenmark-Agar gut

Hickey & Tresner's mäßig
Agar

Hefeextrakt-Agar gut

Haferflocken-Agar mäßig

Carvajal's Hafer- mäßig
mehl-Agar

Tomatenmark- gut
Hafermehl Agar '

Kartoffel-Dextrose- mäßig

Bennett's Agar

mäßig

Anorganische Salze- gut
Stärke-Agar

Kein Luftwachstum keines

oder Sporulation

Luftmycel gelblichweiß; Sporulation weiß, spärlich.

Luftmycel und Sporulation weiß. Sporulation gering

Luftmycel und Sporulation weiß; Sporulation spärlich

Luftmycel und Sporulation weiß. Sporulation gering -■ V ^:

Luftmycel und Sporulation weiß. Sporulation gering

Luftmycel und Sporulation weiß. Sporulation mäßig

Luftmycel gelblich-weiß; Sporulation weiß, spärlich

Luftmycel und Sporulation weiß. Sporulation Bamboo (2 fb)
Bambusfarben

gelblich; Amber (3 Ic)
mäßig bernsteinfarben

gelblich; Lt.Weath (2 ea)
gering hellweizenfarben

gelblich; Amber (3 el)
mäßig bernsteinfarben

gelblich; Lt.Weath (2 ea)
gering hell-weizenfarben

gelblich; LLWeath (2 ea)
gering hell-weizenfarben

gelblich; Amber (3 Ic)
mäßig bernsteinfarben

gelblich; Topaz (3 ne)
mäßig. topasfarben

gelblich; Xmber(3 Ic)
mäßig bernsteinfarben ■"■':"

Kolonieoberfläche fein gerunzelt. Sporulation auf Randzonen begrenzt.

Kolonieoberfläche fein gerunzelt.

Kolonieoberfläche schwach gerunzelt.

Kolonieoberfläche fein gerunzelt, Sporulation auf Randzonen begrenzt

Kolonieoberfläche fein gerunzelt '_.__ , _;

Luftmycel und Sporulation weiß. Sporulation mäßig

keines Lt.Weath (2 ea) Kolonien breiten hellweizen- sich aus. farben

Tabelle II

Micromorphologie von Streptomyces candidus NRRL 3218

Medium

Luftmycel und/oder Sporengestalt Sporengröße

Sporenträgerstrukturen

Sporenoberfläche

Anorganische Salze- Sporen in langen Länglich bis

Stärke-Agar geraden bis gewellten elliptisch

Ketten

0,9-1,4 μΧ 0,4-0,5μ glatt (durch Elektronenmicroscopie bestimmt).

Tabelle III

Verschiedene physiologische Reaktionen von Streptomyces candidus NRRL 3218

Medium

Inkubationsdaucr Wachstum

Temperatur: 28 C physiologische Reaktion

Organische Nitratbrühe
Organische Nitratbrühe

7 Tage 14 Tage

gut gut Nitrat nicht reduziert Nitrat nicht reduziert

Fortsetzung

Medium

Inkubationsdauer Wachstum

Temperatur: 28 C
physiologische Reaktion

Gelatine	7 Tage	Inkubation: 10 Tage
Gelatine	14 Tage	Temperatur: 28 C
Pepton-Eisen-Agar	24 Stunden	Verwertung*)
Tabelle IV		0
Kohlenstoffquellenverwertungsbild von Streptomyces	, 0
candidus NRRL 3218	0
Kohlenstoffquelle	3
	0
	0
Adonital	ι -
1-Arabinose	0
Dextran	0
d-Fructose	0
i-Inosit	0
Lactose	0
d-Mannit. ,„"/■	0
d-Melezitose	1
d-Melibiose	0
d-Raffinose	3
1-Thamnose	0
Salicin
Saccharose
d-Trehalose
d-Xylose
Dextrose
Blindprobe

gut
gut
gut

keine Verflüssigung
Partielle Verflüssigung keine Chromogenität

15

20 500-ml-Flaschen mit abgeschabten oder abgewaschenen Sporen aus einer Schräg-Agar-Kultur bereitet.
Gewöhnlich wird das folgende Medium verwendet:

Soyabohnenmehl 10 Gramm

Glucose 20 Gramm

Maisquellwasser 5 Gramm

Calciumcarbonat 3 Gramm

Wasser bis auf iOOO Milliliter

Die Flaschen werden bei einer Temperatur von 25 bis 29°C, vorzugsweise 28° C, und unter intensivem Bewegen auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 30 bis 48 Stunden lang inkubiert. Diese 100-ml-Mengen an Saatinokulum wurden zum Beimpfen von 1-1- und . 12-1-Ansätzen des gleichen Mediums in 2-1- bzw. 20-1-GIasfermentierbehältern verwendet. Die Inokulummaische wird mit steriler Luft belüftet, während das Wachstum 30 bis 48 Stunden fortgesetzt wird, diese Inokulumansätze werden ihrerseits zum Beimpfen von Fermentiertanks verwendet.

Tankfermentation

Zur Herstellung des Antibiotikums jn Fermentiertanks wird vorzugsweise das folgende Fermentiermedium verwendet:." ,. i , ':,;v v,.;.;·.:::;''..- -*^r? v'-/^;:v ■" ν 7-v^:·.'

*) 3 - gute Verwertung

2 - mittlere Verwertung 1 - schlechte Verwertung
0 - keine Verwertung

Das Fermentations-Verfahren

Die Züchtung des Organismus S. candidus NRRL 3218 kann in einer Vielzahl von flüssigen Kulturmedien durchgeführt werden. Zu Medien, die sich für die Herstellung des neuen Antibiotikums eignen, gehören beispielsweise eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, z. B. Stärke, Zucker, Melasse, Glycerin u. dgl.; eine assimilierbare Quelle für Stickstoff, z. B. Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäure, Maisquellwasser u. dgl.; und anorganische Anionen und Kationen, z. B. Kalium, Natrium, Calcium, Sulfat, Phosphat, Chlorid u. dgl. Spurenelemente, z. B. Bor, Molybdän, Kupfer u. dgl., werden als Verunreinigungen anderer Bestandteile der Medien zugeführt. Für Belüftung in Tanks und Flaschen wird gesorgt, indem sterile Luft durch oder auf die Oberfläche des Gärmediums geleitet wird. Durch einen mechanischen Rührer wird für weitere Bewegung in Tanks gesorgt. Ein Antischaummittel, z.B. 1% Octacecanol in Specköl, kann nach Bedarf zugesetzt werden.

Inokulumherstellung

Schüttelflaschen Saatinokulum wird durch Beimpfen von 100 ml Mengen an sterilem flüssigem Medium in

45

Glycerin . . ■

Soyabohnenmehl ;.■:./''
Kaliumdihydrogenphosphat
Calciumcarbonat ■?V-^j¹I-V
Natriumchlorid
Kaliumchlorid
Magnesiumsulfat
Wasser bis auf

■■-.:■ 30 Gramm ...
: 10 Gramm
cv i 0 Gramm \- '■\i al 0 Gramm i>'
5 Gramm
0,5 Gramm
0,5 Gramm
1000 Milliliter

Jeder Tank wird mit 3 bis 10% Inokulüm, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, beimpft. Die Belüftung erfolgt durch sterile Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,5 bis 1,0 1 pro Liter Brühe und Minute, und die Fermentiermischung wird durch einen mit 200 bis 400 UpM betriebenen Rührer bewegt. Die Temperatur wird bei 25 bis 29° C, gewöhnlich bei 28° C, gehalten.

Gewöhnlich wird 120 bis 160 Stunden lang fermentiert. Dann wird die Maische geerntet.

Reinigungsverfahren

Nach beendeter Fermentation wird die fermentierte Maische, die das Antibiotikum enthält, zur Entfernung des Mycels filtriert, vorzugsweise bei pH-Wert 6. Zur Unterstützung der Filtration kann Diatomeenerde oder eine beliebige andere übliche Filterhilfe verwendet werden. Gewöhnlich wird der Mycelkuchen mit Wasser gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat vereinigt. Die antibiotische Aktivität wird an Aktivkohle

130 117/1

oder einer anderen geeigneten Adsorptionskohle Schwefel

adsorbiert, wobei etwa 0,5% (Gewicht/Volumen) des Chlor

Adsorptionsmittels verwendet werden. Gefärbte Verunreinigungen werden aus dem Adsorptionsmittel durch Waschen mit 40%igem wäßrigem Aceton entfernt. Es werden etwa 20 ml Waschflüssigkeit pro Gramm Adsorptionsmittel verwendet. Die antibiotische Aktivität wird auf der Aktivkohle zurückgehalten. Die antibiotische Aktivität kann aus der Aktivkohle eluiert werden, indem man diese etwa V2 Stunde mit 40%igem wäßrigem Aceton, das mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH-Wert 2 eingestellt ist, rührt, wobei ein Eluiervolumen verwendet wird, das etwa ¹A des ursprünglichen Maischevolumens beträgt. Das Eluat wird unter vermindertem Druck zu einer wäßrigen Phase eingeengt, die etwa V20 ihres ursprünglichen Volumens beträgt. Man stellt den pH-Wert dieser Phase mit Bariumhydroxyd auf etwa 5,5 ein und filtriert den entstehenden Bariumsulfatniederschlag ab. Die eingestellte Lösung (Filtrat) wird weiter auf etwa 400 bis 800 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird dann mit angesäuertem Aluminiumoxyd aufgeschlämmt (es wird etwa Vs der Aluminiumoxydmenge in Gramm, bezogen auf das Volumen des Konzentrats, verwendet), und diese Aufschlämmung wird auf eine geeignete Säule mit angesäuertem Aluminiumoxyd (es wird etwa die zehnfache Menge des in der Beschickung verwendeten Aluminiumoxyds angewandt) aufgegeben, das als Aufschlämmung in Methanol eingefüllt wurde. Die antibiotische Aktivität wird aus der Säule mit 50%igem wäßrigem Methanol eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen (1 1 oder weniger) eingeengt. Der pH-Wert dieses Konzentrats wird mit Bariumhydroxyd auf etwa 6,0 bis 6,5 eingestellt. Der entstandene Bariumsulfatniederschlag wird wiederum abfiltriert, und das klare Filtrat wird lyophilisiert, wodurch das rohe Antibiotikum AV 290 erhalten wird. Dieses lyophilisierte Material wird durch Säulenchromatographie an einem geeigneten Ionenaustauschharz weiter gereinigt. Die Säule kann mit verdünnten Schwefelsäurelösungen eluiert werden. _; : ■: i ,- . .

Falls gewünscht, kann man mit Salzlösungen eluieren. Das Eluat, das das Antibiotikum enthält, was durch Ultraviolettabsorption bei 280 ιτιμ festgestellt wird, wird mit Bariumhydroxyd auf etwa pH-Wert 6,3 eingestellt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, und das Filtrat wird auf ein Volumen von 30 bis 80 ml eingeengt. Das Konzentrat wird unter Rühren zu einer größeren Menge Äthanol zugegeben, und der entstehende Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen. Der Niederschlag wird mit Aceton gewaschen und bei mäßiger Temperatur unter vermindertem Druck getrocknet, wodurch Antibiotikum AV 290 in der Sulfatform erhalten wird.

Eine Mikroanalysenprobe wird durch zweimaliges Fällen von AV 290-Sulfat aus wäßrigem Aceton und 2 Tage langes Trocknen des Niederschlags im Hochvakuum (ΙΟ-³ mm) bei 100°C hergestellt.

Das auf diese Weise hergestellte Antibiotikumsulfat enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Chlor im wesentlichen in den folgenden Gewichtsprozentsätzen:

0,95 3,00

Das Material hat keinen definierten Schmelzpunkt. Der Prozentanteil an Methylgruppen, die an Stickstoff gebunden sind, beträgt 0,53. Der optische Drehwert beträgt I^s [<x] =-86° (±3°) (C= 0,925 Wasser). Ultraviolettmaxima treten auf bei

ίο 280 ιτιμ (EW = 43) in sauren Lösungen,
280 πιμ (EW = 49,5) in neutralen Lösungen.
300 Γημ (EW = 55) in basischen Lösungen.

Ein Infrarotabsorptionsspektrum von AV 290-Sulfat in einem KBr-Preßling (in üblicher Weise hergestellt) weist charakteristische Absorption bei den folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron, auf: 2,98,3,45,6,02, 6,23, 6,31, 6,66, 6,90, 7,05, 7,23, 8,15, 8,88, 9,44, 9,75, 9,88, 10,20,11,95,14,40.

Das Sulfatsalz kann folgendermaßen in die Base übergeführt werden: 1 g des Sulfats wird in 50 ml Wasser gelöst, wobei eine Lösung mit einem pH-Wert von 6,3 erhalten wird. Diese Lösung wird durch eine Kolonne geleitet, die aus einer Mischung von jeweils 5 ml eines Kationenaustauschers und eines Anionenaustauschers besteht, und mit weiteren 150 ml Wasser ausgewaschen. Das gesamte Eluat mit pH-Wert 7,6 wird auf ein kleines Volumen eingeengt. Die antibiotische Base fällt nach Zugabe von Äthanol aus. Nach Abfiltrieren und Waschen mit Aceton werden 845 mg freie Base erhalten.

Eine Mikroanalysenprobe der freien Base wird durch Fällen der antibiotischen Base aus wäßrigem Äthanol, methanolischem Äthanol und wäßrigem Aceton und 2 Tage langes Trocknen des Niederschlags im Hochvakuum (ΙΟ-³ mm) bei 100⁰C hergestellt.

Die so hergestellte Antibiotikumbase enthält die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Chlor im wesentlichen in den folgenden Gewichtsprozentsätzen:

Kohlenstoff

Wasserstoff

Sauerstoff

Stickstoff

53,11
6,04

30,04
6,12
3,34

Der Prozentsatz an Methylgruppen, die an Stickstoff gebunden sind, beträgt 0,60. Der optische Drehwert beträgt [«]² _D ⁵=-95° (±3,8°) (C =0,780 in Wasser). Ultraviolettmaxima treten auf bei

280 Γημ (EW = 44) in sauren Lösungen,
280 πιμ (EW = 48,5) in neutralen Lösungen,
300 ΐημ (EW = 55,5) in basischen Lösungen.

Kohlenstoff
Wasserstoff
Sauerstoff
Stickstoff

52,36
5,77

30,95
5,70

Ein Infrarotabsorptionsspektrum der freien Base von AV 290 in einem KBr-Preßling (in üblicher Weise hergestellt) weist charakteristische Absorption bei den folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron, auf: 2,98, 3,43, 6,04, 6,22, 6,30, 6,65, 6,85, 7,02, 7,21, 8,12, 8,88, 9,43,9,75,9,88,10,17,12,00,14,40.

Die Infrarotabsorptionskurve ist in der Zeichnung dargestellt.

AV 290 zeigt die folgenden RF-Werte in den nachstehend angegebenen Lösungsmittelsystemen unter Verwendung von Bacillus subtilis, pH-Wert 6,0, oder Corynebacterium xerosis als Nachweis-Organismus:

Rf-Wert Lösungsmittelsystem

0,54 Methanol 4 Teile

1,5% wässr.NaCl ι Teil 0,75 5% wässr. NH₄Cl

*) Die Streifen wurden mit einer Lösung gepuffert, die 0,95 m Natriumsulfat und 0,05 m Natriumbisulfat enthielt.

Sowohl die antibiotische AV 290-Base als auch das Sulfat sind in Wasser und Dimethylsulfoxyd löslich. Keiner der beiden Stoffe ist in den üblichen organischen Lösungsmitteln löslich mit der Ausnahme, daß die

antibiotische Base in Methanol mäßig löslich ist.

Von anderen Antibiotika unterscheidet sich der Glycopeptid-Antibiotikum-AV 290-Komplex (Avoparcin) durch die zu seiner Charakterisierung oben angegebenen Werte und durch seine antimikrobielle Aktivität. Die antimikrobielle Aktivität dieses neuen Antibiotikums und seines Hydrolyseprodukts in vitro ist in der nachstehenden Tabelle aufgeführt, die die minimale inhibierende Konzentration angibt, die zur Inhibierung des Wachstums repräsentativer Mikroorganismen in einem Nährmedium erforderlich ist.

Der Glycopeptid-Antibiotikum-AV 290-Komplex (Avoparcin) hat gemäß Journal of the American Chemical Society, Band 101 (1979), Seiten 2237 bis 2239, die erst später aufgeklärte Molekularstruktur der Formel

HO

OH

CH₂OH

AVOPARCIN a-R= H β, R = Cl

HO

OH

HO OH

worin R für Wasserstoff oder Chlor steht. 55 und die Substanz mit der Bedeutung R = Chlor als

Die Substanz mit der Bedeutung R = Wasserstoff Rhamnosid von Avoparcin-jS-aglycon bezeichnet, wird demnach als Rhamnosid von Avoparcin-a-aglycon

Tabelle V

Minimale inhibierende Konzentrationen
(Microgramm pro ml)

Antibioticum AV 290 Hydrolyseprodukt

Staphylococcus aureus ATCC 6538P Staphylococcus aureus No. 69 Staphylococcus aureus Rose ATCC 14154 6,2
3,1

12,5

3,1
3,1
6,2

Fortsetzung

Minimale inhibierende Konzentrationen
(Microgramm pro ml)

Antibioticum AV 290 Hydrolyseprodukt

Staphylococcus aureus Smith ATCC 13709 Staphylococcus aureus 4050B-122-3 Staphylococcus aureus 4050B-122-7 Staphylococcus aureus 4050B-122-9 Staphylococcus aureus 4050B-122-11 Staphylococcus aureus 4050B-122-14 Streptococcus faecalis ATCC 8043 Streptococcus faecalis pyogenes C 203 Streptococcus faecalis sp. nichthämolytisch No. Streptococcus faecaüs sp. ß hämolytisch No. Streptococcus faecalis pyogenes NY-5 Sarcina lutea ATCC 9341 Bacillus subtilis ATCC 6633 Proteus vulgaris ATCC 9484 Escherichia coli ATCC 9637 Mycobacterium smegmatis ATCC 607 Corynebacterium xerosia NRRL B 1397 Bacillus cereus ATCC 10702 Klebsieila pneumonia ATCC 10031 Salmonella gallinarium Led.An.Ind.604 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Clostridium sporogenes ATCC 7955

11

6,2	3,1
6,2	-
6,2	-
6,2	-
12,5	-
6,2	-
3,1	12,5
0,6	3,1
6,2	31,0
6,2	6,2
1,3	-
1,3	3,1
0,6	6,2
250	>250
>250	>250
>250	125
-	3,1
-	12,5
-	>250
>250	>250
>250	>250
0,6	-

Das neue Antibiotikum ist gegen eine Vielzahl von grampositiven Mikroorganismen, z. B. Staphylokokken, Streptokokken und Diplokokken wirksam.

Die Brauchbarkeit von Antibiotikum AV 290 zeigt sich an seiner Fähigkeit, letale Systeminfektionen bei Mäusen zu bekämpfen. Das neue Antibiotikum zeigt hohe antibakterielle Aktivität in vivo bei Mäusen gegenüber Staphylococcus aureus, Stamm Smith, und Staphylococcus aureus, Stamm Rose, Streptococcus pyogenes, C-203, Escherichia coli und Diplococcus pneumonia, SVI, wenn es in einer subkutanen Einzeldosis an Gruppen von weiblichen Carworth-Farm-CFl-Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g verabreicht wird, die intraperitoneal mit einer letalen Dosis dieser Bakterien in Trypticase-Soyabrühe (TSP)-Verdünnungen einer 5stündigen TSP-Blutkultur infiziert wurden. Die in Klammern gesetzten Zahlen nach dem Namen eines Organismus in der nachstehenden Tabelle geben die Verdünnungen dieser Bakterien an.

Die nachstehende Tabelle VI zeigt die antibakterielle Aktivität von Antibiotikum AV 290 und seines Hydrolyseproduktes in vivo.

Tabelle VI

Antibakteriell; Aktivität von Antibioticum AV 290 und seines Hydrolvseprodukts in vivo

Test-System

Dosierung*) Überlebende insgesamt**)

(mg/kg Körper- Antibioticum Hydrolyseprodukt

gewicht) AV 290

Staphylococcus aureus	320	5/5	9/10
Stamm Smith (10~²)	160	5/5	5/10
	80	5/5	0/10
	40	5/5	0/10
	20	25/25	0/10
	10	21/25
	5	9/20
	2,5	3/20
	1,25	1/20
	0,63	0/10

Fortsetzung

Test-System	Dosierung*)	Überlebende insgesamt**)
	(mg/kg Körper	Antibioticum Hydrolyseprodukt
	gewicht)	AV 290
Staphylococcus aureus	320	5/5
Stamm Rose (10°)	80	1/5
	20	0/5
	5	0/5
Steptococcus pyogenes	320	5/5
C-203 (ICT⁵)	80	5/5
	20	5/5
	5	4/5
	1,25	1/5
Escherichia coli	320	9/15
311 (IO"³)	160	1/5
	80	0/5
Diplococcus pneumoniae	320	5/5
SVI (1(T⁶)	80	5/5

*) Das Antibioticum wurde in einer subcutanen Einzeldosis verabreicht.

**) Zahl der überlebenden Mäuse / Zahl der behandelten Mäuse, 5-6 Tage nach Infizierung. Bei Blindversuchen starben alle infizierten unbehandelten Mäuse.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1 Inokulumherstellung

Ein typisches Medium zur Züchtung des Primärinokulums wird nach der folgenden Formel hergestellt:

Soyabohnenmehl
Glucose

Maisquellwasser
Calciumcarbonat
Wasser bis auf

10 Gramm

20 Gramm

5 Gramm

3 Gramm

1000 Milliliter

Die von einer Schrägagarkultur von S. candidus NRRL 3218 abgewaschenen oder abgeschabten Sporen werden zum Beimpfen von zwei 500-ml-Kolben verwendet, die jeweils 100 ml des oben angegebenen Mediums enthalten. Die Kolben werden auf eine rotierende Schüttelvorrichtung gebracht und 48 Stunden lang bei 28°C intensiv bewegt. Das erhaltene Flaschen-Inokulum wird in einen 18,9-1-Fermentierbehälter aus Glas^übergeführt, der 12 1 steriles Medium enthält. Der Glasfermentierbehälter wird mit steriler Luft belüftet, während etwa 48 Stunden lang gezüchtet wird. Dann wird der Inhalt zum Beimpfen eines 300-1-Fermentiertanks verwendet.

Beispiel 2 Fermentation

Ein Fermentationsmedium wird nach der folgenden Formel hergestellt:

Glycerin 30 Gramm

Soyabohnenmehl lOGramm

Dibasisches Kaliumphosphat lOGramm

Calciumcarbonat lOGramm

Natriumchlorid
Kaliumchlorid
Magnesiumsulfat
Wasser bis auf

5 Gramm
0,5 Gramm
0,5 Gramm
1000 Milliliter

Das Fermentationsmedium wird 45 bis 60 Minuten bei 120⁰C mit Wasserdampf mit einem Druck von etwa 1 atü sterilisiert Der pH-Wert des Mediums nach dem Sterilisieren beträgt 7,5. 3001 steriles Medium in einem 400-1-Fermentiertank werden mit 12 1 Inokulum beimpft, das wie in Beispiel 1 angegeben hergestellt wurde, und die Fermentation wird bei 28° C unter Verwendung eines Entschäumungsmittels durchgeführt.

Die Belüftung erfolgt mit einer Geschwindigkeit von 0,5 1 steriler Luft pro Liter Maische und Minute. Die Maische wird durch einen mit 200 Umdrehungen pro Minute betriebenen Rührer bewegt. Nach einer Fermentationszeit von etwa 155 Stunden wird die Maische geerntet.

■><> B e i s ρ i e 1 3

Isolierung und Reinigung

260 1 fermentierter Maische werden mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH-Wert 6,0 eingestellt. Man gibt etwa 3% (Gewicht/Volumen) Diatomeenerde zu und filtriert die Mischung. Das Mycelkissen wird mit etwa 30 1 Wasser gewaschen und dann verworfen. Filtrat und Waschwasser werden vereinigt und 30 Minuten mit _W) 1375 g Aktivkohle gerührt. Man setzt 1 % (Gewicht/Volumen) einer Filterhilfe Hyfloo zu und filtriert die Mischung. Der Kohlekuchen wird mit etwa 30 1 Wasser gewaschen, und die Waschlösung und das Filtrat werden beide verworfen. Der Kuchen wird 10 Minuten mit 27,5 I (,■) 4O°/oigem wäßrigem Aceton gerührt, das anschließend abfiltriert und verworfen wird. Dann wird der Kuchen 10 Minuten mit 701 40%igem wäßrigem Aceton gerührt, das vorher mit konzentrierter Schwefelsäure

130 117/1

auf pH-Wert 2,0 eingestellt wurde. Diese Suspension wird filtriert, und das Filtrat wird auf 4,01 eingeengt. Das Konzentrat wird mit gepulvertem Bariumhydroxyd auf pH-Wert 5,2 eingestellt, und das ausgefallene Bariumsulfat wird mit Hilfe eines Filterhilfsmittels abfiltriert.

Das Filtrat wird weiter auf 5OC ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird mit 100 g säurebehandeltem Aluminiumoxyd aufgeschlämmt und auf eine Kolonne aufgegeben, die aus 1 kg säurebehandeltem Aluminiumoxyd in Methanol besteht. Das säurebehandelte Aluminiumoxyd wird durch Ansäuern einer wäßrigen Aufschlämmung von Aluminiumoxyd Merck mit konzentrierter Schwefelsäure, bis ein konstanter pH-Wert von 3,0 erhalten wird, Filtrieren, Waschen mit Wasser und Methanol und Lufttrocknen bereitet. Die Kolonne wird dann mit 2,0 1 Methanol und anschließend 60,0 1 50%igem wäßrigem Methanol eluiert. Das mit 5O°/oigem wäßrigem Metha- · nol erhaltene Eluat wird auf 700 ml eingeengt, und der pH-Wert wird mit Bariumhydroxyd auf 6,3 eingestellt. Das Bariumsulfat wird mit Hilfe eines Filterhilfsmittels abfiltriert, und das Filtrat wird lyophilisiert, wodurch 36,4 g gereinigtes AV 290-Produkt mit antibiotischer Aktivität erhalten werden.

10 g des lyophilisierten Rückstandes aus der Aluminiumoxydkolonne werden in 30 ml Wasser gelöst, und der pH-Wert dieser Lösung wird mit verdünnter Schwefelsäure auf (5,0 eingestellt. Diese Lösung wird auf eine Kolonne gegeben,' die 250 g eines vernetzten Dextrans (H ^± -Form) enthält, und die Kolonne wird mit 4,01 Wasser, das mit verdünnter Schwefelsäure auf pH-Wert 6,0 eingestellt ist, und 4,0 1 Wasser, das mit konzentrierter Schwefelsäure auf pH-Wert 2,0 eingestellt ist, unter Anwendung eines linearen Gradienten eluiert. Die antibiotische Aktivität wird in dem Eluat durch Ultraviolettabsorption bei 280 πιμ festgestellt.

ίο Der Teil des Eluats, der die antibiotische Aktivität enthält, wird mit Bariumhydroxyd auf pH-Wert 6,3 eingestellt. Das Bariumsulfat wird mit Hilfe von Hyflo abfiltriert, und das Filtrat wird auf 50 ml eingeengt. Dazu werden unter Rühren 500 ml Äthanol gegeben, wobei sich ein Niederschlag bildet. Die Suspension wird zentrifugiert, und der Niederschlag wird mit Aceton gewaschen und unter vermindertem Druck bei 58° C getrocknet, wodurch 7,25 g AV 290-Antibiotikum in der Sulfatform erhalten werden.

Eine Mikroanalysenprobe wird durch zweimaliges Fällen von AV 290-Sulfat aus wäßrigem Aceton und 2 Tage langes Trocknen des Niederschlages im Hochvakuum (10-³ mm) bei 100°C hergestellt.
Die chemische Analyse dieses Produkts und seine anderen chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften wurden bereits vorstehend angegeben.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Glycopeptid-Antibiotikum-A V 290-Komplex (Avoparcin), der in Form seiner freien Base gekennzeichnet ist durch ein durch Membranosmose und Dampfdruckosmose bestimmtes Molekulargewicht von etwa 1500,
eine Analyse von

53,11% Kohlenstoff,

6,04% Wasserstoff,
30,04% Sauerstoff,

6,12% Stickstoff und

3,34% Chlor,

CH₂OH

HO

einen optischen Drehwert [α] %⁵ von (C = 0,780 in Wasser),
Ultraviolettmaxima von

95° (±3,8°)

10

15 280 μπι (EY:. = 44) in sauren Lösungen, 280 μηι (Eu, = 48,5) in neutralen Lösungen und 300 μπι (E\l = 55,5) in basischen Lösungen,

und das in der Zeichnung dargestellte Infrarotspektrum, bestehend aus Avoparcin <x und β der Formeln

HO

OH

CH₂OH

HO

OH HO OH

worin R entweder ein Wasserstoff- oder ein Chloratom bedeutet, im Verhältnis 1 :3 oder 1:4.

2. Verfahren zur Herstellung des Glycopeptid-Antibiotikum-AV 290- Komplexes (Avoparcin) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces candidus NRRL 3218 in einem üblichen wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenhydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, submers unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 20 bis 35° C während einer Zeitspanne von 24 bis 240 Stunden züchtet und das Antibiotikum in an sich bekannter Weise mittels Absorption und Chromatographie aus der Kulturbrühe nach Entfernen des Mycels isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kraftbrühe nach Entfernen des Mycels bei einem pH-Wert von etwa 6 mit Aktivkohle behandelt, die absorbierte antibiotische Aktivität bei einem pH-Wert von 2 mit 40%igem wäßrigem Aceton eluiert, aus dem Eluat unter vermindertem Druck das Aceton entfernt und das Material nach Einstellung auf einen pH-Wert von 5,5 an saurem Aluminiumoxid unter Elution mit 50%igem wäßrigem Methanol Chromatographien und den erhaltenen Extrakt durch Säulenchromatographie an einem Ionenaustauscherharz in der H+ -Form weiter reinigt, indem man mit verdünnter Schwefelsäure eluiert, wobei die antibiotische Aktivität durch UV-Absorption bei 280 μπι kontrolliert werden kann.

4. Verwendung des Glycopeptid-Antibiotikum-AV 290-Komplexes (Avoparcin) zur Bekämpfung von grampositi' en Bakterien.

Wachstumsstärke

Mäßig bis gut auf den meisten Medien; schwach bis sehr schwach auf Czapeks-Lösung-Agar und Asparagin-Dextrose-Agar.