DE2737943C2

DE2737943C2 - Antibiotisch wirksames Oligosaccharid, Verfahren zu seiner Herstellung sowie dieses enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2737943C2
Application number: DE2737943A
Authority: DE
Inventors: Takashi Hisamatsu; Shigeharu Inoue; Katsuyoshi Kanagawa Iwamatsu; Michio Tokio/Tokyo Kojima; Taro Niida; Shoji Tokio/Tokyo Omoto; Takashi Shomura; Shingo Yokohama Kanagawa Uchida; Hiroshi Yokohama Kanagawa Watanabe
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1976-08-23
Filing date: 1977-08-23
Publication date: 1985-05-09
Also published as: FR2362924B1; DE2737943A1; FR2362924A1; GB1537434A; JPS5946597B2; JPS5326398A; US4160026A

Description

OH

\ OH

CH₃

NH

OH

OH OH

CH₂OH

OH

— Oil

D-Glucose

worin (_m + «) = 5 ist, mit schwach basischer Natur in Form eines farblosen Pulvers, wobei dieses jeweils in Wasser und Dimethylsulfoxid löslich ist, weniger löslich in Methanol und Äthanol ist, jedoch in Aceton, Äthylacetat, Chloroform und Benzol unlöslich ist, die Substanz eine positive Reaktion mit Silbernitral, Tetrazoliumrot. Anthron, Ninhydrin und Greig-Leaback-Reagens zeigt und mit Saure unter Bildung von Glucose hyörolysierbar ist. und wobei das Oligosaccharid SF-1130-x, die weiteren Merkmale aufweist:

(a) eine Elementaranalyse von:

C = 43,65 %; H = 6,55 %; N = 1,05 % und O = 49,75 % (Rest);

(b) eine spezifische, optische Drehung [a]},' = +166° (c = 1 in Wasser);
(c) keine charakteristische Absorptionsspitze im UV-Spektrum;

(d) ein IR-Absorptionsspektrum als Kaliumbromidtablette, das dem in der Fig. 1 a der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht, das Bestandteil dieses Anspruches ist;

(e) ein kernmagetisches Resonanzabsorptionsspektrum (Wasserstoff) in Deuterowasser, das dem in der Fig. 2a der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht, das Bestandteil dieses Anspruches ist;

30 und

(0 einen einzigen Fleck bei einem R-Raffinose-Wert = 0,39 bei der Papierchromatographie mit Äthylaeetat/Pyridin/Wasser(10 : 4 · 3) als Entwicklerlösungsmittel und bei einem R-Raffinose-Wert = 0,19 bei der Papierchromat(?<;raphie mit n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (6:4:1:3) als Entwicklerlösungsmittel, wobei die R-Γ affinose-Werte unter der Annahme berechnet wurden, daß RalTinose einen einzigen Fleck bei Rf = l,0ü bei der gleichen Papierchromatographie ergibt.

2. Verfahren zur Herstellung des antibiolisch wirksamen Oligosaccharids SF-1130-X| gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces myxogenes ATCC 31 305 in einem Kulturmedium züchtet, das Nährstoffquellen, die durch gewöhnliche Mikroorganismen assimilierbar sind, enthält, 1^:c Fcrmcnta-

AO tionsbrühe oder das hieraus erhaltene Filtrat durch eine Säule eines stark sauren Kationenaustauscherharzes

in der H⁺-Form schickt, die Harzsäule mit Wasser wächst, dann die Harzsäule mit 0,1 N wjürigem Ammoniak wäscht, das Eiuat zur Trockene einengt, den Rückstand in Wasser auflöst, die erhaltene wäßrige Lösung auf pH 3,5 durch Zugabe von Schwefelsäure oder Salzsäure einstellt und dann durch eine Säule von Aktivkohle schickt, die Aktivkohlesäule mit Wasser wäscht und dann mit einer wäßrigen Lösung, welche 30 bis 35% Äthanol enthält, wäscht, das Eluat zur Trockene konzentriert, den Rückstand in Wasser aullöst, die so erhaltene Lösung durch eine Säule eines Kationenaustauscherharzes in der NHJ-Form schickt, die \ lar/säule mit Wasser wäscht und mit 0,1 N wäßrigem Ammoniak eluiert, das Eluat zur Trockene einengt, den Rückstand in Wasser auflöst, die so erhaltene wäßrige Lösung einer Chromatographie auf einem Kationenauslauscherharz in der Pyridiniumsalzform unter Verwendung eines 0,1 M Pyridin-Ameiscnsüure-I'ulTcrs (pH = 3,1) als Entwicklerlösungsmittel unterwirft, das Eluat in Fraktionen auffängt, die antibakteriell aktiven Fraktionen miteinander vereinigt und zur Trockene einengt, das dabei erhaltene farblose Pulver in Wasser aufnimmt, die erhaltene wäßrige Lösung einer Chromatographie in einer Ccllulosesäulc unter Verwendung eines Mischlösungsmittels aus n-Propanol/Äthylacetat/Wasser (6 : I : 3 im Volumen) als Entwicklcrlösungsmittel unterzieht, das Eluat in Fraktionen sammelt und solche Fraktionen, die einen ein/igen Fleck bei einem R-Raffinose-Wert von 0,39 (berechnet unter der Annahme, daß der Rf-Wert von RalTinose 1,00 ist) bei der Papierchromatographie unter Entwicklung mit Äthylacctat/Pyridin/Wasser (10.4 : 3 im Volumen) ergibt, miteinander vereinigt und zur Trockene einengt.

3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt des Oligosaccharids SF-I I3O-X| als aktivem Inhalisstoff, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für den aktiven

6ö Inhaltsstotl.

4. Arzneimittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich wenigstens eine der Substanzen Maltose, Maltolriosc, Maltotclraosc, Maltopcnlaose, Mallohcxaose oder Maltoheplaose enthüll.

Die Erfindung betrifft die Gegenstände der Patentansprüche I his 3. Der Anspruch 4 nennt eine Ausgestaltung des Gegenstands des Anspruchs 3.

Ks sind bereits Aminoglylcosid-Antibiotika, beispielsweise Kanamycine bekannt. Weiterhin ist bekannt, daü Phenylbutazon eine gute antiinflammatorische Wirkung besitzt.

Eine Anzahl von brauchbaren Substanzen wurden in der Kulturbrühe von verschiedenen Stämmen der Gattung Streptomyces erzeugt und hieraus isoliert. Es ist bekannt, daß Streptomyces myxogenes, SF-1130, der durch die Hinterlegungsnummer FERM-P 676 identifiziert wurde, ein Antibiotikum bildet, das als Substanz SF-1130 bezeichnet wurde, siehe japanische Patentveröffentlichung Nr. 30 393/73. Von der Anmelderin wurden weitere Untersuchungen an der Fermentationsbrühe des Mikroorganismus Streptomyces myxogenes SF-1130 durchgeführt, wobei gefunden wurde, daß neue, antibiotische Substanzen, welche gegenüber gram-negativen Bakterien aktiv sind, in der Fermentationsbrühe dieses Mikroorganismus gebildet werden. Es gelang, diese aktiven Substanzen aus der Brühe zu isolieren, und eine der isolierten Substanzen wurde von der Anmelderin als Substanz SF-1130-Xi bezeichnet.

Weiterhin wurde gefunden, daß diese aktive Substanz eine Aktivität aufweist, durch welche die bei lebenden Tieren und bei Menschen automatisch vorhandene Immunität davor geschützt wird, mehr oder weniger als Folge der Bildung von Tumoren und/oder als Folge der Applikation von die Immunität unterdrückenden Antilumormitteln reduziert zu werden, und weiterhin wurde gefunden, daß diese aktive Substanz daher als immunopotentierende Mittel (Immunopotentiator) zur Förderung des Immunansprechens bei lebenden Tieren und beim Menschen vorteilhaft ist.

Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen, antibiotisch wirksamen Substanz, die als autibakterielles Mittel und als Aktivator zur Förderung der Immunität bei lebenden Tieren und beim Menschen vorteilhaft ist. Weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser vorteilhaften Substanz.

Später -wurde gefunden, daß diese Substanz SF-!!30-Xj die folgende allgemeine Forme! besiizt:

H —

CH₂OH

OH

CH₂OH

— O

OH

OH CH₃

NH

OH OH

OH

— OH

D-Glucose

worin (m + n) = 5 ist.

30

Die Substanz SF-IHQ-X₁ wird durch Kultivierung eines Stammes der Gattung Streptomyces, der bei der »American Type Culture Collection«, Washington D.C., USA unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31 305 hinterlegt wurde, gewonnen.

Die Kultivierung erfolgt in üblicher Weise in einem wäßrigen, flüssigen Kulturmedium, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthält, unter aeroben Bedingungen.

Der Stamm SF-1130 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 31 305 besitzt die folgenden, mikrobiologischen Eigenschaften:

I. Morphologische Beobachtung

Substratmycelien wachsen gut auf verschiedenen Kulturmedien, während die Bildung von Luftmycelen im allgemeinen schlecht ist. Auf Stärkeagar und auf Stärke-Hefe-Extrakt-agar, wo sich Luftmycele entwickeln, werden kurze, dichte Luftmycele aus dem Substratmycel gebildet. Die Mycele bilden einfüßige Verzweigungen, wobei keine quirlständigen Verzweigungen beobachtet werden.

Die Luftmycele tragen an ihren Spitzen Spiralen, die meisten hiervon sind vom kompakten, geschlossenen Typ und einige hiervon smd vom nicht-vollständigen oder offenen Typ. Es wird keine Bildung von Sklerotium beobachtet. Die Beobachtung im Elektronenmikroskop zeigt, daß die Oberflächenstruktur der Sporen glatt ist. Die Sporen sind von elliptischer oder zylindrischer Gestalt und besitzen eine Größe von 0,6-0,7 X 0,9-1,0 Mikron.

2. Kulturmcrkmale auf verschiedenen Kulturmedien sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Kulturmedium

Wachstum

Luftmycel

lösliches Pigment

Saixharosc-Nilratagar
(ilucosc-Asparaginagur

(ily/^rin-Asparaginagur

schlechtes Wachstum,
farblos

braun bis gräulich-braun, die Rückseite ist matt in roter Farbe gefärbt
braun

gering, weiß keines

keines

keines
keines

keines

60 65

	Fortsetzung	27 37	Wachstum	943	lösliches Ι'ιμηιοηΐ
	Kulturmedium		dünnes Wachstum.		keines
	Calciummalatagar	blaßbraun	Luftmyccl
5		braun	keines	keines
	Glyzerin-Calciummalat-
	agar	blaß-braun bis braun	keines	keines
	Stärkeagar
IO			pulverförmig, gäulich-
			braun. Entwicklung
		gut, blaß-braun	hauptsächlich an der	keines
	Hafermehlagar	gutes Wachstum mit	Peripherie der Kolonie	braun
ι c	Nähragar	Falten, braun auf der	grau
IJ		Rückseite	keines
		blaß-braun bis braun		blaü-braür·.
	Stärke-Hefeextraktagar	gut, rötlich-braun		braun
	Hefeextrakt-		gräulich-braun bis grau
20	Malzextraktagar	dunkelbraun	keines	schwärzlich-braun
	Tyrosinagar	hochstehendes Wachstum		braun
	Kartoffelstück	mit Falten, braun	keines
		gräulich-braunes	keines	blaß-braun
25	Karottenstück	Wachstum mit Falten
		cremefarbig	keines	dunkelbraun bis
	Gelatine (20⁰C)			schwarz
		Wachstum am Boden,	keines	keines
	Magermilch (37⁰C)	dunkelgrau		kt-ines
30	koaguliertes Löffler-		keines
	Serum (37°C)	dunkelgrau bis	keines	graues Pigment an
	Ei (37°C)	dunkelbraun		der Peripherie des
			keines	Wachstums
35		Wachstum am Boden,		keines
	Czapek's-Glucoselösung	cremefarbig
		kein Wachstum	keines	-
	Cellulose
40	Anmerkung:	-
	Die Inkubationstemperatur
	betrug 28°C, falls kein anderer Wert angegeben ist.

3. Physiologische Eigenschaften

Verflüssigung von Gelatine Hydrolyse von Stärke Bildung von Tyrosinase Bildung von Schwefelwasserstoff Farbgebungsvermögen Abbau von Cellulose Reduktion von Nitrat Peptonisierung von Magermilch Koagulation von Magermilch Auflösung von koaguliertem Löffier-Serum

positiv positiv positivpositiv positiv negativ negativ negativ negativ negativ

Zusätzlich zu den oben genannten, physiologischen Eigenschaften bildet der Stamm SF-1130 auf Agarmedium und in einem flüssigen Medium Schleim, wobei dies ein wesentliches Merkmal des betreffenden Stammes ist.

Auf einem Agarmedium wie einem Stärke-Hefeextrakt-agar, Stärke-agar oder Glucose-Asparagin-agarmedium wurde beobachtet, daß der Schleim massiv auf der Kolonie in etwa 10 Tagen nach der Inkubation gebildet wird. Weiterhin wurde beobachtet, daß bei der Schüttelkultivierung des Stammes SF-1130 in einem flüssigen Medium, welches geeignete Kohlenstoffquellen (Glucose, Stärke usw.) und Stickstoffquellen (Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Weizenkeime usw.) enthält, die Kuiturbrühe alimählich viskos unter Bildung eines Schleimes wird.

4. Ausnutzung von KohlenstolTt|ucllen

1I) Ausgenutzt: Xylose, Glucose, Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, RulTinosc, Dextrin, Stärke, Glyze- ' rin. Inosit, Natriuniacclat, Natriumeitrat und Mannose.

(2) zweifelhaft: Arabinose, Fructose und Salicin. 5 Π

(3) nicht ausgenutzt: Rhamnose, Inulin, Dulcit. Mannit, Sorbit, Natriumsuccinat und Cellulose. j

üit /uvor genannten, mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes SF-1130 können wie folgt zusammenge- |

l'iiüt werden: 1

1I) Das Luftmyccl bildet geschlossene Spiralen an seiner Spitze und die Oberflächenstruktur der Sporen ist ■

glatt. ^;;

(2) Das Luftmyccl, das gräulich-braun bis grau gefärbt ist, wird nur sehr gering gebildet. ;

(3) Das Wachstum auf synthetischen Kulturmedien ist braun bis gräulich-braun in seiner Färbung. ·'

(4) Auf organischen Kulturmedien wird Farbgebungsvermögen (Chromogenität) beobachtet. is

(5) Auf Agarmcdium und in nüssigen Medien wird Schleim gebildet. i

Im Hinblick aufdie zuvor beschriebene mikrobiologischen Eigenschaften können Streptomyces phaeoochro-

mogenes, Streptomyces purpureochromogenes und Streptomyces noboritoensis als bekannte, mit dem Stamm ~\

SF-1130 verwandte Stämme genannt werden. Jedoch gehört der Stamm SF-1130 nicht zu einem dieser bekann- 20

ten Stämme, wie im folgenden gezeigt wird: '■

Streptomyces phaeochromogenes erzeugt große Mengen an Luftmycel und bildet ein braunes, lösliches Pigment auf Czapek-Saccharoseagar und Calciummalat-agar als Kulturmedien, während der Stamm SF-1130 nur .1 cine geringe Bildung von Luftmycel und keine Bildung von löslichem Pigment auf diesen Kulturmedien zeigt. ^

Obwohl Streplomyces purpureochromogenes orange bis rötlich-orange gefärbtes Wachstum auf Kartoffel- 25 :»

scheibenmedium zeigt, bildet dieser Stamm keinen Schwefelwasserstoff und bewirkt die Koagulierung von 'i

Magermilch, während der Stamm SF-1130 auf dem gleichen Medium ein braunes Wachstum zeigt und die BiI- {]

dung von Schwefelwasserstoff jedoch keine Koagulierung von Magermilch hervorruft. "h

Streplomyces noboritoensis bildet keine Spiralen und erzeugt ein grünes, lösliches Pigment auf Stärkeagarme- j

diurp (die Bildung des grünen, löslichen Pigmentes ist nicht in den früheren Dokumenten erwähnt, jedoch wird 30 Ί

sie tatsächlich tür diesen Typ von Stamm in nennenswerter Weise beobachtet), während der Stamm SF-1130 Spi- |

ralen bildet, jedoch kein lösliches Pigment auf Stärke-synthetischen Agar bildet. Darüber hinaus unterscheidet f;

sich der Stamm SF-1130 von Streptomyces noboritoensis auch in der Ausnutzung bzw. Annahme von Mannit ViJ

und Saccharose. |

Daher unterscheidet sich der Stamm SF-1130 deutlich von jedem der bekannten, verwandten Arten derGat- 35 *j

lung Streptomyces. Der Stamm SF-1130 unterscheidet sich weiterhin von irgendwelchen anderen bekannten 'i

Spccien von Sircpiomyces dadurch, daß der Stamm SF-! 130 die besondere Eigenschaft der Bildung von —

Schleim, wie bereits /uvor beschrieben, zeigt, während die anderen Specien von Streptomyces keinen Schleim π

entsprechend den früheren Veröffentlichungen bilden. ij.

Hieraus ergibt sich, daß der Stamm SF-1130 als neue Specie der Gattung Streptomyces identifiziert wurde, 40 H

wobei er als »Streptomyces myxogenes SF-1130« bezeichnet wurde. )$

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der eingesetzte Stamm in an sich bekannter Weise in einem KuI- ß

lurmedium gezüchtet werden, das Nährstoffquellen, die durch gewöhnliche Mikroorganismen assimilierbar $

sind, enthält. Zu diesem Zweck kann jeder bekannte Nährstoff verwendet werden, der ganz allgemein bei der ''

Kultivierung von bekannten Stämmen von Streptomyces verwendet wurde. Beispiele von anwendbaren Nähr- 45 ^.

stoffquellen umfassen: Glucose, Stärke, Maltosesirup und Melassen als Kohlenstoffquellen und Sojabohnen- |

mehl, Weizenkeime, getrocknete Hefe, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Ammoniumsulfat und |

Natriumnitrat als Stickstoffquellen. Gegebenenfalls können anorganische Salze wie Calciumcarbonat, ψ

Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Phosphate und dergleichen zugesetzt werden. Zusätzlich können solche organi- i

sehen und anorganischen Materialien, welche das Wachstum des verwendeten Stammes unterstützen und die 50 |

Bildung der Substanz SF-1130-x, fördern, in das Kulturmedium eingegeben werden. g

Als Züchtungsmethode, die gemäß der Erfindung angewandt werden kann, ist die Flüssigkeitskultivierung, |

insbesondere unter aeroben Submersbedingungen bevorzugt, wie sie im allgemeinen bei der Hersteilung von |

Antibiotika angewandt wird. Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, vorteilhafterweise bei einer |

Temperatur von 25 bis 38°C und besonders häufig bei einer Temperatur in der Nähe von 28°C durchgeführt. 55 f

Unter diesen Umständen erreicht die Bildung der Substanz SF-1130-x, in der Kulturbrühe ein Maximum nach |l

einer Schüttelkultivierung oder einer Tankkultivierung während einer Periode von 2 bis 5 Tagen. {»

Zur Untersuchung der erfindungsgemäßen Substanz SF-1130-x, kann die folgende Arbeitsweise angewandt U

werden: Als Untersuchungskulturmedium wird ein Medium verwendet, welches 0,5% Pepton,0,3% Fleischex- ύ,

trakt und 1,5% Agar, (pH = 6) (bekannt als Mycin-Untersuchungsagarmedium) zusammen mit 0,125% Malto- 60 9

triose enthält. Als Untersuchungsmikroorganismus wird Escherichia coli K-12 R verwendet. Die Untersuchung §

kann üblicherweise nach der konventionellen Papierscheibenmethode durchgeführt werden. |

Die erfindungsgemäße Substanz SF-1130-X| ist ein Oiigosaccharid von schwach basischer Natur, das die im |

folgenden angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften besitzt, und unter Ausnutzung dieser physika- §

iisch-chemischen Eigenschaften der Substanz SF-i 130-X₁ kann sie aus der Kuiturbrühe gewonnen und dann 65 |

gereinigt werden. Beispielsweise kann die Reinigung durch Adsorption auf Kohle, Chromatographie unter Ver- j

wendung von wäßrigem Alkohol als Elutionsmittel oder durch Umfallung aus Mischlösungsmittel Wasser/ * Äthanol erreicht werden.

Beispielsweise kann die Substanz SF*-1! ."ϊΟ-χ, nach der folgenden Arbeitsweise aus der Fermcnlalionsbruho gereinigt und isoliert werden: Die die Substanz SF-1130-x, enthaltende Fermentationsbrühe wird aiii pH durch Zugabe von z. B. Schwefelsäure oder Salzsäure angesäuert und dann unter sauren Bedingungen /ur Fmfernung der Myccle und der unlöslichen Stoffe filtriert, und das Briihenfiltral wird durch eine Säuie von Aktivkohle zur Adsorption der aktiven Substanzen durchgeschickt. Die Akiivkohiesäule wird dann mit 50"/.. Aceton/ Wasser eluiert, d. h. einem Gemisch von Aceton und Wasser in einem Verhältnis von I : I im Volumen, um die Substanz SF-! '30-Xi von der Aktivkohle zudcsorbieren. Das Eluat wird zurTroekne konzentriert, und der Rückstand wird in Wasser aufgelöst. Die erhaltene, wäßrige Lösung wird wiederum durch eine Säule von Aktivkohle zur Adsorption durchgeschickt, und die Aktivkohlesäule wird dann aufeinanderfolgend mit wäßrigen Lösungen

ίο eluiert, welche Äthanol in unterschiedlichen Konzentrationen im Bereich von 5 bis 25 Vo!.-";. enthalten. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und solche antibakteriellen aktiven Fraktionen, welche die Substanz SF-1130-x, enthalten, werden miteinander vereinigt und konzentriert. Zu der konzentrierten Lösung wird ein Volumen an Äthanol zugesetzt, um die Substanz SF-1130-x, auszufällen, wobei diese leicht als rohes Pulver gewonnen wird. Das in dieser Weise erhaltene, rohe Pulver enthält einen wesentlichen Anteil von neutralen Oligosacchariden und insbesondere Maltodextrin, welche in der Fermentationsbrühe ebenfalls erzeugt werden. I'm ein hochreines Produkt der Substanz SF-1130-x, zu erhalten, wird es daher mehr bevorzugt, die folgende Arbeitsweise der Gewinnung anzuwenden:

Die Fermentationsbrühe des Stammes SF-1130. welche die Substanz SF-1130-x, enthält, oder das hieraus erhaltene Brühenfiltrat wird durch eine Säule eines stark sauren Kiuiurieriuusiaiischerhurzes in dor! I' -Form /ur Adsorption der Substanz SF-1130-x, geschickt. Die Harzsäule wird gut mit Wasser gewaschen, um hierauf Spuren der neutralen Oligosaccharide wie Maltodextrin, Maltopentaose und Maltohexaose /u entfernen, die gegebenenfalls an das Harz aus der Fermentationsbrühe gebunden wurden. Nach dem Waschen wird die I lar/säule mit 0,1 N wäßrigem Ammoniak zur Desorption der Substanz SF-113ü-X| gewaschen. Das Eluat wird /ur Trockne eingeengt, und der Rückstand wird in Wasser aufgelöst. Die erhaltene, wäßrige Lösung wird auf pH = 3,5 durch Zugabe von Schwefelsäure oder Salzsäure eingestellt und dann durch eine Säule von Aktivkohle /ur Adsorption der Substanz SF-1130-x, durchgeschickt. Die Aktivkohlesäule wird mit Wasser gewaschen und dann mit einer wäßrigen Lösung, welche 30 bis 35 % Äthanol enthält, gewaschen. Das Eluat wird zur Trockne konzentriert, der Rückstand wird in Wasser aufgelöst, und die so erhaltene Lösung wird wiederum durch eine Säule eines Kationenaustauscherharzes in der NH^-Form durchgeschickt. Die Harzsäule wird mit Wasser gewaschen und mit 0,1 N wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird zur Trockne eingeengt, der Rückstand wird in Wasser ausgelöst, und die so erhaltene, wäßrige Lösung wird einer Chromatographie auf einem Kationenaustauscherhar/ inderPyridiniumsalzform unter Verwendung eines 0,1 M Pyridin-Ameisensäure-puffers(pH = 3,1) als Fntwicklerlösungsmittel unterworfen. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, und die antibakteriell aktiven Fraktionen werden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei ein farbloses Pulver erhalten wird, welches die Substanz SF-1130-x, in Form eines Gemisches der Substanz SF-1130-x, mit einem weiteren Oligosaccharid enthält. Die rohe Pulver kann als solches zur Durchführung des Tests der Abschätzung der physiologischen Eigenschaften der Substanz SF-ii30-X| verwendet werden. Für die isolierung der Substanz SF^--1130-\, wird das zuvor genannte, farblose, das Gemisch dieser Substanzen enthaltende Pulver in Wasser aufgenommen, und die erhaltene, wäßrige Lösung wird dann einer Chromatographie in einer Cellulosesäule unter Verwendung eines Mischlösungsmittels aus n-Propanol/Äthylacetat/Wasser (6:1:3 im Volumen) als Entwicklerlösungsmittel unterzogen. Das Eluat wird in Fraktionen gesammelt, und solche Fraktionen, die einen einzigen ^f:lcck bei einem R-Raffinose-Wert von 0.39 (berechnet unter der Annahme, das der Rf-Wert von Raffinose = 1.00 ist) bei der Papierchromatographie unter Entwicklung mit Äthylacetat/Pyridin/Wasscr(10:4 :3 im Volumen) ergehen, werden miteinander vereinigt und zurTrockne unter Lieferung der Substanz SF-1130-x, als farbloses Pulver eingeengt.

Im Falle der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Anwendung des zuvor erwähnten Stammes SF-1130 enthält die entstandene Kulturbrühe zusätzlich zu der Substanz SF-1130-x, und einem weiteren Oligosaccharid das bekannte Antibiotikum, Substanz SF-1130, siehe japanische Patentveröffentlichung 30 393/ 73, wie auch Maltopentaose und Maltohexaose, die von dem Stamm SF-1130 erzeugt werden; wegen dieser bciden letztgenannten Substanzen wird auf die am gleichen Tag hinterlegte deutsche Patentanmeldung der Anmclderin entsprechend der japanischen Patentanmeldung 99 756/76 verwiesen.

Die Substanz SF-1130 ist ein neutrales Oligosaccharid, welches in Wasser leicht löslich, in Methanol und Äthanol kaum löslich und in Aceton nicht-löslich ist, während Maltopentaose und Maltohexaose neutrale Oligosaccharide sind, die in Wasser leicht löslich, in Methanol kaum löslich jedoch nicht-löslich in Äthanol und Aceton sind. Im Gegensatz dazu ist die erfindungsgemäße Substanz SF-1130-x, ein Oligosaccharid mit basischer Natur, das leicht in Wasser löslich ist, weniger in Methanol und Äthanol löslich istjedoch nicht in Aceton löslich ist. Durch Ausnutzung dieser Unterschiede in den Eigenschaften der zuvor genannten, neuen Substanz und der bekannten Substanzen kann die Substanz SF-1130-x, von der Substanz SF-1130 wie auch von Maltopentaose und Maltohexaose abgetrennt werden. Beispielsweise kann die Fermentationsbrühe des Stamen) mes SF-1130 durch Zugabe der geeigneten, anorganischen Säure wie Salzsäure oder Schwefelsäure angesäuert und filtriert werden. Wenn das so erhaltene, angesäuerte Brühenfiltrat durch eine Säule eines stark sauren Kationenaustauscherharzes in der H~-Form geschickt wird, werden die Substanzen SF-1130-x, und das weitere Oligosaccharid von dem Harz adsorbiert, während die neutralen Oligosaccharide wie Maltopentaose und Maltohexaose durch die Harzsäule ohne Adsorption durch das Harz durchtreten. Wenn das die Substanz SF-! 130-x, hierauf adsorbiert enthaltende Harz mit 0,1 N wäßrigem Ammoniak als Elutionsmittel behandelt wird, wird die Substanz SF-1130-Xi aus dem Harz eluittt.

Die Substanz SF-1130-X] und das weitere Oligosaccarid sind jeweils ein Oligosaccharid von schwach basischer Natur in Form eines farblosen Pulvers, die in Wasser und Dimethylsulfoxid jeweils löslich sind, weniger löslich

ΔΙ Dl

in Mctnunol und Äthanol sind, jedoch in Aceton, Äthyla'-etat, Chloroform und Benzol unlöslich sind und wobei jede Substanz eine positive Reaktion mit Silbernitrat, Tetrazoliumrot, Anthron, Ninhydrin und Greig-Leaback-Rcagen/ /c'gt und wovon jede Substanz mit Saure unter Bildung von Glucose hydrolysierbar ist. Die Substanz SF-Il30-X| zeichnet sich durch die weiteren Merkmale aus:

(:i) Bei der Elementaranalyse wurden gefunden:

C 43,65 %; M - 6.55 %; N= 1.05 % und O = 49,75 % (Rest);

(b) eine spezifische, optische Drehung \u\li 1-166° (c I in Wasser); (el sie besitzt keine charakteristische Absorplions.spilzc im UV-Absorptionsspektrum;

(d) sie besitzt ein IR-Absorptionsspektrum in Form einer Kaliumbromidtablctte, das dem in der Fig. la der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht;

(Ο sie besitzt ein kernmagnetisches Resonanzabsorptionsspektrum in Deuterowasser, das dem in der Fig. 2a der Zeichnung wiedergegebenen Spektrum entspricht; und

(fl sie gibt einen einzigen Fleck bei R-Raffinose = 0,39 bei der Papierchromatographie mit Äthylacetat/Pyridin/Wasstr (10 : 4 : 3) als Entwicklerlösungsmittel und bei R-Raffinose = 0,19 bei der Papierchromatographie mit n-Butanol/Pyridin/Essigsiiure/Wasser(6 : 4 : 1 : 3) als Entwicklerlösungsmittel, wobei die R-Raffinosc-Werte unter der Annahme berechnet wurden, daß RafTinose einen einzigen Fleck bei RF = 1,0 bei der gleichen Papierchromatographie ergibt.

Die zuvor genannten und die weiteren physikalisch-chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanz SF-I U¹Vx₁ sind in der folgenden Tabelle II gezeigt.

Tabelle Il

Eigenschaften von SF-1130-x,

Aussehen Schmelzpunkt Elcmcntaranalyse (%) Molgewicht (bestimmt nach üer Dampfdruckmethode) spezifische, optische Drehung UV-Absorptionsspektrum IR-Absorptionsspektrum Wasserstoffkern- Absorptionsspektrum Löslichkeit:

löslich in:

weniger löslich in:

unlöslich in: Stabilität:

Farbreaktion: positiv bei:

R-Raffinose-Werte bei der Papierchromatographie (unter Annahme, daß Rf von RafTinose = 1,00 ist)

i) entwickelt mit Älhylacetat/Pyridin/Wasser (10:4:3)

ii) entwickelt r"it n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/ Wasser (6:4: 1:3)

farbloses, geruchloses, amorphes Pulver 203⁰C (Zers.)

C =43,65, H =6,55, N = 1,05

[α] ρ +166° (c= 1 in Wasser)

keine charakt. Absorptionsspitze in Fig. la wiedergegeben

in Fig. 2a wiedergegeben

Wasser, Dimethylsulfoxid

Methanol, Äthanol

Aceton, Äthylacetat, Chloroform, Benzol stabil unter neutralen Bedingungen, jedoch etwas instabil unter sauren und alkalischen Bedingungen

Silbernitrat, Tetrazoliumrot, Anthron, Ninhydrin und Greig-Leaback-Reagenz

In der Zeichnung sind in den Figuren folgende Spektren wiedergegeben:

Fig. 1 a die Kurve des IR-Absorptionsspektrums einer Probe der erfindungsgemäßen Substanz SF-1130-Xj als Pellet in Kaliumbromid;

Fi g. 2 a die Kurve des kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrums (Wasserstoff) einer Probe der Substanz SF-1130-Xi, bestimmt in Deuterowasser bei 100 MHz.

Die antibakterielle Aktivität der Substanz SF-1130-Xi zur Hemmuung des Wachstums von verschiedenen Bakterien wurde nach der konventionellen Papierscheiben-Plattenmethode abgeschätzt. Hierzu wurde die Substanz SF-1130-X| in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 1 mg/ml oder 2 mg/ml aufgelöst, und mit den so hergestellten Testlösungen wurden aus Filtrierpapier hergestellte Papierscheiben mit 8 mm Durchmesser imprägniert, die anschließend an der Luft getrocknet wurden. Diese Papierscheiben wurden auf eine obere Plattenschicht des bekannten Mycin-Untersuchungsinkubationsmediums aufgelegt, welches 0,5% Pepton, 0,3 % Fleischextrakt und 1,5% Agar (pH = 6) umfaßte, und welches die hierin zu inkubierenden Testmikroorga-

nismen enthielt, wobei dieses über die untere Schicht von Agarmedium in der Untersuchungsschak gelegt wurde. Die Inkubation bei einer Temperatur von 37°C über Nacht durchgeführt, und anschließend wurde der Durchmesser der rings um die Papierscheiben gebildeten Hemmzonen ausgemessen. Die so erhaltenen Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt, hieraus ist ersichtlich, daß die Substanz SF-1130-X₁ keine antibakteri«lle Aktivität gegenüber den gram-positiven Bakterien und den säurebeständigen Bakterien besitzt. Diese Tests wurden irrder gleichen Weise wie zuvor jedoch unter zusätzlicher Eingabe von 1,25 mg/ml an Maltotriose in die obere Plattenschicht des Mycin-Untersuchungsinkubationsmediums wiederholt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle III gezeigt, hieraus ist ersichtlich, daß die zusätzliche Anwesenheit von Maltotriose die äntibakterielle Aktivität der Substanz SF-1130-X| verbessert. Bei gleichartigen Tests wurde weiterhin gefunden, daß bei kombinierter Verwendung von Maltose oder einem Maltodextrin einschließlich Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose und Maltohexaose mit der Substanz SF-1130-x, die zuerst genannten Substanzen im allgemeinen die antibakterielle Aktivität der erfindungsgemäßen Substanz SF-1130-X₁ verbessern, mit der Ausnahme, daß eine Verbesserung der antibakteriellen Aktivität gegenüber Klebsjella pneumoniae nicht beobachtet wird. Alle Ergebnisse der in diesem Zusammenhang durchgeführten Tests sind in der Tabelle III aufgeführt. Es ist daraufhinzuweisen, daß Maltotriose und andere Maltodextrine überhaupt keine antibakterielle Aktivität unter den zuvor genannten Testbedingungen zeigen.

Tabelle III

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Testmikroorganismus

Durchmesser der Hemmzone (mm) mil der Substanz SH-I IiO-X₁

keine zusatz). Anwendung von Maltotriose

Gehalt an SF-1130-x,

2 mg/ml 1 mg/ml

zusätzl. Anwendung von Maltotriose

2 mg/ml

I mg/in I

Escherichia coli IAM 1239	0	0	15.')	15,0
Escherichia coli K-12	11,4	0	19,5	16,0
Escherichia coli (resistent	14,2	13,6	23,2	19,8
gegenüber Chloramphenicol)
Escherichia coli IAM 1264	15,9	12.1	26,1	24,0
Shigella sonnei	13,5	gering	20,0	18,0
Proteus vulgaris	gering	0	15,9	12,8
Salmonella typhi	13,7	12,0	20,1	18,3
KJebsiella pneumoniae	15,0	12,3	15,1	12.0
Bacillus subtilis	0	0	0	0
Staphylococcus aureus	0	0	0	0
Sarcina lutea	0	0	0	0
Mycobacterium smegmatis 607	0	0	0	0

Aus den Ergebnissen von weiteren Untersuchungen wurde gefunden, daß die Verbesserung der antibakteriellen Aktivität der Substanz SF-1130-x,, welche der zusätzlichen oder kombinierten Verwendung von Maltose. Maltotriose, Maltotetraose, Makopentaose oder Maltohexaose zuzuschreiben ist, signifikant ist, wenn Maltose oder Maltodextrin, wie sie oben genannt wurden, zusätzlich in einem Anteil eingesetzt wird, der von 0.1 bis 20 Gew.-Teilen auf 1 Gew.-Teil der Substanz SF-1130-x, beträgt.

Zur Abschätzung der akuten Toxizität der Substanz SF-1130-Xi wurden wäßrige Lösungen der Substanz SF-1130-x, subkutan an Mäusen injiziert, wobei gefunden wurde, daß alle untersuchten Mäuse bei Dosismengen bis zu 400 mg/kg überlebten. Aus den Ergebnissen von weiteren Untersuchungen auf akute Toxizität wurde gefunden, daß die Substanz SF-1130-x, einen LD₅₀-Wert von nicht mehr als 500 mg/kg bei der intravenösen Injektion an Mäusen besaß. Hieraus ist ersichtlich, daß die Substanz SF-1130-x, eine sehr geringe Toxizitäl besitzt.

Tests auf Zell-vermittelte Immunität wurden nach der bekannten Technik der verzögerten Hyperscnsitivitüi unter Anwendung von Mäusen durchgeführt, die mit einem Bauchwassersuchttumor »Sarcoma 180« gcimpfi waren, und aus den erhaltenen Ergebnissen dieser Untersuchungen wurde gefunden, daß die Substanz SF-1130 Χι einen immunopotentierenden Effekt bei Tumor aufweisenden Tieren, deren Immunität erniedrigt ist, besitzt Außerdem wurde aus weiteren Tests gefunden, daß die zuvor genannte Aktivität der Substanz SF-1130-x, eben falls wirksam ist, um den die Immunität unterdrückenden Effekt eines Antiturnormittcls wie von Cyclophospha mid (einer Präparation von N,N-Bis-(2-chloräthyl)-tetrahydro-2 H-l,3.2-oxazophophorin-2-amin-2-oxid) um/u kehren und vollständig die Immunreaktionsfähigkeit von lebenden Tieren wieder herzustellen. Hieraus is ersichtlich, daß die Substanz SF-1130-X| eine immunomodulierendc Aktivität bei lebenden Tieren besit/l Ergebnisse von weiteren, ähnlichen Tests zeigten, daß die zusätzliche Verwendung eines Mallodextrins und ins besondere von MalUipenlaosc und Maltohexaose, die Aktivität der Substanz SI·"-1130-x, zur Erhöhung de lmmunreaklivität signifikant verbessert.

Die Untersuchungen wurden nach folgender Methode durchgeführt: Gruppen von Mäusen vom Stamm ICR-JCL (6 männliche Mäuse pro Gruppe, durchschnittliches Körpergewicht 31,9 ±3 g) wurden mit dem Bauchwassersuchttumor »Sarcoma 180« (10⁶ Zellen) geimpft. 24 Stunden nach dem Einimpfen der Tumorzellen wurde jede der zu untersuchenden Arzneimittelproben subkutan appliziert, und ein bekanntes Antitumormittel (Cyc-Iophosphamid) wurde intraperitoncal bei den geimpften Mäusen appliziert. 2 Tage nach der Impfung wurde eine äthanolische Lösung von 5% Picryichlorid auf den Bauch der Mäuse, bei welchen die Haare abrasiert worden waren, zur Herbeiführung einer Sensibilisierung aufgetragen. Anschließend wurde jede umersuchte Arzneimittelprobe subkutan einmal am Tag für die nachfolgenden 4 Tage appliziert. 4 Tage nach dem Impfen wurde Cyclophosphamid erneut appliziert. 9 Tage nach dem Impfen wurde eine Lösung von 1 % Picrylchlorid in Olivenöl auf die beiden Seiten von beiden Ohren der Mäuse aufgebracht, um die zweite Sensibilisierung herbeizuführen. 24 Stunden nach der zweiten Sensibilisierung wurde das Ausmaß (%) der Zunahme der Dicke der Ohren bei den Testmäusen berechnet. Das Ausmaß des Anschwellens, welches als ein Maß zur Stimulierung der durch Zellen vermittelten, herbeigeführten Immunität dient, kann aus der prozentualen Zunahme der Dicke der Ohren bestimmt werden. Die Probe der bei diesem Test verwendeten Substanz SF-1130-X₁ war ein Gemisch der Substanzen SF-1130-Xi und des weiteren Oligosaccharide in einem Gewichtsverhältnis von 1:2. Die erhaltenen Teslergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Applizierte Arzneimittelprobe	Dosis (mg/kg)	Ausmaß der Zunahme	prozentuale
		der Stärke des Ohres	ZünSiiTiC
		(XlO"³ cm)
SF-1130-X	100	9,2 ± 1,88	119,5
SF-1130-x + Cyclophosphamid	100+ 75	10,4 ± 4,55	135,1
SF-1130-x + Maltohexaose	100 + 200	10,4 ±3,12	135,2
weiteres Oliogosaccharid	100	9,8 ± 2,03	127,2
Cyclophosphamid	75	4,0 ± 2,60	51,9
unbehandelt	-	7,7 ± 2,06	100,0

Die erfindungsgemäße Substanz SF-1130-X| kann zu injizierbaren Lösungen durch Auflösen einer geeigneten Mcn^e in einer physiologischen Salzlösung oder einem anderen konventionellen, pharmazeutisch annehmbaren, flüssigen Träger wie wäßrigen Trägern, z. B. Ringer'scher Injektionslösung, Dextroseinjektionslösung, raffinierten Ölen pflanzlichen Ursprungs oder synthetischen Mono- und Diglyceriden in Form von Fettemulsionen formuliert werden, oder durch Mischen mit einem pharmazeutisch annehmbaren, festen Träger wie Suppositorienkakao oder in einen porösen Äthylenschlauch formuliert werden. Für die Applikation der Substanz SF-1130-X| kann die so hergestellte Injektionslösung als intravenöser Tropf als lokale Injektion, als intramuskuläre Injektion, als inlrapleurale Injektion oder als intraperitoneale Injektion oder als Suppositorium gegeben werden. Als Immunpotentiator kann die Substanz SF-1130-X₁ in einer Dosis von annähernd 10 bis 400 mg/kg/Tag und vorzugsweise von etwa 50 bis 100 mg/kg/Tag jeden Tag oder zwei- oder dreimal pro Woche alleine oder in M ischung oder in Kombination mit antibakteriellen Mitteln, Antitumormitteln oder anderen die Immunität stimulierenden Mitteln gegeben werden. Als antibakterielle Mittel ist eine sehr hohe Dosis von über 400 mg/kg/ Tag erforderlich.

Die Erfindung betrifft daher weiterhin einen Stimulator für die Wirtsabwehr, d. h. ein Mittel, um hauptsächlich das Immunansprechen bei lebenden Tieren und Menschen zu fördern, wobei dieser Stimulator als aktiven Bestandteil die Substanz SF-IBO-X₁ in Kombination mit einem bekannten, pharmazeutisch annehmbaren, wäßrigen oder nicht-wäßrigen Träger für den aktiven Inhaltsstoff umfaßt. Wäßrige Träger umfassen P üiger'sche Injektionslösung und injizierbare Nährlösungen wie Dextroseinjektionslösungen und Natriumchloridinjektionslösungen, und nicht-wäßrige Träger umfassen Wasser-in-Öl-Emulsionen, die aus 65% Sesamöl, 5% eines grenzflächenaktiven Mittels und 30% wäßriger Lösung von SF-1130-x, bestehen, Öl-in-Wasser-Emulsionen, die aus 30 % Sesamöl, 65 % wäßriger Lösung von SF-1130-Xi und 5 % grenzflächenaktivem Mittel bestehen und Wasser-in-Öl-Emulsionen, welche aus 9%iger wäßriger Lösung von SF-1130-x,, 19,5% Sesamöl, 1,5 % grenzflächenaktivem Mittel, 65 % destilliertem Wasser und 5 % nichtionogenen Polyätherglykole bestehen. Das erfindungsgemiiße Arzneimittel kann in wirksamer Weise zur Verhinderung einer Reduzierung der Immunresistenz verwendet werden, die normalerweise durch Entwicklung und Bildung von Tumor oder durch Applikation von die Immunität unterdrückenden Antitumormitteln bedingt sein könnte, wobei das erfindungsgemäße Arzneimittel zusätzlich wenigstens eine der Substanzen Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose und Maltohcptaose in einer ausreichenden Menge enthalten kann, um die Aktivität der Substanz SF-1130-X₁ zu verbessern.

Der Anteil von zugegebener Maltose, Maltotriose oder den zugegebenen, anderen Maltodextrin beträgt 0,1 bis 20 und vorzugsweise 0,5 bis 10 Gew.-Teile auf 1 Gew.-Teil der Substanz SF-1130-X|.

Der erfindungsgemäße Stimulator für die Wirtsabwehr kann gegebenenfalls wenigsten eines der bekannten antibaktcriellen Mittel, Antitumormittel und der anderen die Immunität potentirenden Mittel zusammen mit oder ohne einem Maltodextrin zusätzlich zu der Substanz SF-1130-x, enthalten. Aus den zuvor gemachten Ausführungen wird deutlich, daß die Substanz SF-1130-x, für die prophylaktische Anwendung gegenüber Baktencninlektionen, gegen Tumore und bei rheumatischen Erkrankungen dienen kann.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel

Eine Impfkultur von Streptomyces myxogenes SF-1130 = ATCC 31305 wurde in 2001 eines flüssigen Kulturmediums eingeimpft, welches 5,0 1 Stärkesirup, 2,5% Sojabohnenmehl, 1,0% Weizenkeime und 0,25% Natriumchlorid enthielt. Das beimpfte Medium wurde in einem Behälterfermentator unter Belüftung und Rühren bei 28°C während 64 Stunden inkubiert.

Am Ende dieser Inkubation wurde die erhaltene Kulturbrühe auf pH = 3 durch Zugabe von Salzsäure eingestellt und dann unter sauren Bedingungen filtriert, wobei 140 1 Briihenfiltrat erhalten wurden. Dieses Filliat wurde durch eine Säule von 20 1 eines stark sauren Kationenaustauscherharzes ;n der H⁺-Form zur Adsorption der Substanzen SF-1130-X₁ und -X₂ durch das Harz geschickt. Nach dem gründlichen Waschen mit Wasser wurde die Harzsäule mit einer Gesamtmenge von 80 10,1 N wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen aufgefangen, und solche Fraktionen, welche antibakterielle Aktivität gegenüber Escherichia coli K-12R zeigten, wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 7.50 g eines braun gefärbten Pulvers erhalten wurden.

Die austretende Flüssigkeit (1501), welche direkt aus der zr vor genannten Harzsäule beim Durchschicken des hierauf aufgegebenen Brühenfiltrates austrat, wurde auf pH = 3,0 mit Salzsäure angesäuert und dann in eine Säule von 201 eines Kationenaustauscherharzes in der H⁺-Form zur Adsorption der zurückbleibenden, aktiven Substanzen gegeben. Die Harzsäule wurde gründlich mit Wasser gewaschen und dann mit einer Gesamtmenge von 80 1 0,1 N wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde wiederum in Fraktionen aufgesammelt, und die gegenüber E. «_Ai K-12 R aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 5! g cir.es braun gefärbter. Pulvers als zweite Teilmenge- erhalten wurden.

Das braun-gefärbte Pulver (47 g), das als erste Teilmenge erhalten worden war, wurde in 250 ml Wasser aufgelöst, anschließend wurde auf pH =3,0 durch Zugabe von Salzsäure eingestellt. Die so erhaltene, saure Lösung wurde durch eine Säule (5,5 X 26 cm) von 600 ml Aktivkohle zur Adsorption der aktiven Substanzen geschickt.

Die Aktivkohlesäule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer wäßrigen Lösung von 30% Äthanol und dann mit einer wäßrigen Lösung von 35% Äthanol eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen aufgefangen, und die aktiven Fraktionen, welche antibakterielle Aktivität gegenüber E. coli K-12 R zeigten, wurden miteinander vereinigt (4 1) und zur Trockne eingeengt, wobei 5,6 g eines gelblich-braunen Pulvers erhalten wurden.
Dieses Pulver wurde wiederum in 100 ml Wasser aufgenommen, anschließend wurde auf pH = 3 durch Zugabe von Salzsäure eingestellt. Die so erhaltene, saure Lösung wurde durch eine Säule von 600 ml Kationenaustauscherharz in der NH^-Form zur Adsorption der aktiven Substanzen durchgeschickt. Diese Harzsäule wurde gut mit Wasser gewaschen und dann mit 0,1 N wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde in Fraktionen aufgefangen und die gegenüber E. con K12-R aktiven Fraktionen wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 1,5 g eines gelblirh-braunen Pulvers erhalten wurden.

Ein Teil (1 g) dieses Pulvers wuru; in 70 ml einer Pufferlösung (0,1 M Pyridin/Ameisensäurc-Lösung, pH = 3,1) aufgelöst, und die erhaltene Lösung wurde in eine Säule (3,5 X60 cm) von 50 ml Ionenaustauscherharz in der Pyridtniumform, Korngröße 0,074-0,037 mm zur Adsorption der aktiven Substanzen gegeben. Die Harzsäule wurde dann mit der gleichen Pufferlösung wie zuvor eluiert, und das Eluai wurde in 10-ml-Fraktionen aufgefangen. Die antibakteriell aktiven Fraktionen 63-79, die jeweils einen einzigen durch das Silb^rnitratrcagen/ gefärbten Fleck bei einem R-Alanin-Wert von 0,53 (berechnet unter der Annahme, daß der Rf-Wert von Alanin = 1,00 beträgt) bei einer Hochspannungsfilterpapier-Elektrophorese ergaben, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 380 mg eines farblosen Pulvers erhalten wurden, das die Substanz SF-1130-x als ein Gemisch der Substanz SF-1130-X| mit dem weiteren Oligosaccharid enthielt.

Dieses farblose Pulver wurde in einem kleinen Wasservolumen aufgelöst und die erhaltene, wäßrige Lösung

wurde mit einem Mischlösungsmittel aus n-PropanoI/Äthylacetat/Wasser (6:1:3 im Volumen) zusammengegeben. Diese Mischung wurde durch eine Säule (3 x30 cm) von 200 ml Cellulose zur Adsorption der aktiven Substanzen durchgeschickt, und die Cellulosesäule wurde mit dem gleichen Mischiösungsmittel wie zuvor eluiert. Das Eluat wurde in 7-ml-Fraktionen aufgefangen, und jede Fraktion wurde mittels Papierchromatographie unter Verwendung eines Mischlösungsmittels aus Äthylacetat/Pyridin/Wasser (10:4 :3 im Volumen) als Entwicklerlösungsmittel untersucht. Die antibakteriell aktiven Fraktionen 351-445, die jeweils einen einzigen, durch das Silbernitratreagenz gefärbten Fleck bei einem R-Raffinose-Wert von 0,57 (berechnet unter der Annahme, daß der Rf-Wert von Raffinose = 1,00 beträgt) bei r<er zuvor genannten Papierchromatographie ergaben, wurden miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 150 mg eines farblosen Pulvers erhalten wurden, welches das andere Oligosaccharid enthielt.

Weiterhin wurden die antibakteriell aktiven Fraktionen 503-550, die jeweils einen einzigen durch das Silbernitratreagenz gefärbten Fleck bei einem R-Raffinose-Wert von 0,39 - entsprechend der zuvor gegebenen Definition - bei der gleichen Papierchromatographie ergaben, miteinander vereinigt und zur Trockne eingeengt, wobei 70 mg eines farblosen Pulvers erhalten wurden, welches die Substanz SF-1130-X| enthielt.
Das die Substanz SF-H30-X| enthaltende, farblose Pulver (70 mg) wurde in der gleichen Weise wie /uvor beschrieben verarbeitet, wobei ein reines Produkt der Substanz SF-1130-x, als farbloses Pulver mil einem Schmelzpunkt von F. = 203⁰C (unter Zersetzung) erhalten wurde. Die Ausbeute betrug 55 mg.

Das braune Pulver (51 g), das als zuvor erwähnte zweite Teilmenge aus dem Eluat erhalten wurde, welches direkt aus der zweiten Säule des lonenaustauscherharzes in der H'-Form (Dowex 50 Wx2), eluiert mit 0,1 N wäßrigem Ammoniak erhalten worden war, wurde denselben Reinigungsbedingungen und lsolierungsarbeiisweisen wie zuvor unterworfen, wobei 210 mg eines reinen Produktes der Substanz SF-1130-x, erhalten wurden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

K)

Claims

Patentansprüche:

1. Antibiotisch wirksames Oligosaccharid mit der Bezeichnung SF-1130-X| der folgenden (nachgereichten) allgemeinen Formel:

CH₂OH

H —

CH₂OH