DE2450411B2

DE2450411B2 - Aminoglykoside, xk-88-1, xk-88-2, xk-88-3 und xk-88-5 ihre salze, verfahren zu ihrer herstellung und arzneimittel

Info

Publication number: DE2450411B2
Application number: DE19742450411
Authority: DE
Inventors: Takashi Tokio Takasawa Seigo Hadano Kanagawa Okachi Ryo Kawamoto Isao Yamamoto Mitsuyoshi Sato Seiji Sato Tomoyasu Machida Monkawa Atsuko Tama Tokio Nara, (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1973-10-24
Filing date: 1974-10-23
Publication date: 1977-07-21
Also published as: US3939043A; DE2450411A1; JPS5615232B2; NO743760L; AT332547B; AR205726A1; IN140482B; DK139588B; CA1032100A; AU496758B2; ZA746606B; BE821441A; GB1479179A; DK555974A; ATA853374A; FR2248850B1; FR2248850A1; DE2450411C3; CH606425A5; NO141343B

Description

NH₂

OH OCH₃

und seine Salze mit Säuren.

und seine Salze mit Säuren. 2. Aminoglykosid XK-88-2 der Formel

HO

HO I NH₂ OH

und seine Salze mit Säuren. 3. Aminoglykosid XK-88-3 der Formel

HO

CH₂NH

HO

und seine Salze mit Säuren.

5. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen des Stammes Streptomyces hofuensis ATCC 21970 oder nach üblichen Methoden daraus erhaltene, diese Antibiotika bildende Mutanten in einem wäßrigen, verwertbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthaltenden Nährmedium bei Temperaturen von 26 bis 43° C züchtet, aus dem Kulturmedium die Verbindungen nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls durch Umsetzen mit einer Säure in die Salze überführt.

6. Arzneimittel mit antibiotischer Wirkung, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch I bis 4.

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Die Verbindungen der Erfindung werden auf mikrobiologischem Wege hergestellt unter Verwendung von Mikroorganismen des Stammes Streptomyces hofuensis ATCC 21970 oder von nach üblichen Methoden daraus erhaltenen, diese Antibiotika bildenden Mutanten, die in einem wäßrigen, verwertbare Stickstoff- und Kohlenstoffquellen enthaltenden Nährmedium bei Temperaturen von 26 bis 43°C gezüchtet werden. Nach beendeter Züchtung werden die Antibiotika nach an sich bekannten Methoden isoliert, beispielsweise als aktive Fraktionen an einem lonenaustauscherharz und weitere Reinigung der Fraktionen.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte

Stamm von Streptomyces hofuensis ist ein neuer Stamm, der nicht nur bei der American Type Culture Collection, sondern auch bei dem Fermentation

to Research Institute, Japan, unter der Nummer FERM-P 2216 hinterlegt wurde. Nachstehend wird dieser Stamir auch als ΜΚ-88-Stamm bezeichnet. Dieser Stamm hai die folgenden Eigenschaften:

I. Morphologische Eigenschaften:

Im allgemeinen zeigt der ΜΚ-88-Stamm schlechte: Wachstum. In den nachstehend in Tabelle I aufgeführter NührtYiedien zeigt der Stamm nur in drei Mediet

mäßiges Wachstum, nämlich in Hafermehl-Agar, Stärke-Agar und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar. In den restlichen Nährmedien zeigt der Stamm nur geringes Wachstum, Die Bildung von Luftmycel ist schlecht; nur auf Rohrzucker-, Nitrat-Agar, Stärke-Agar und Hefeextrakt-Agar bildet sich ein weißes Luftmycel, Das Luftmycel zeigt einfache Verzweigung. Die Sporophoren sind gerade oder gebogen; der obere Teil bildet bisweilen eine Schleife, jedoch keine Spirale, Häufig bilden sich am Ende der Sporophoren mehr als 10 Sporen mit einer warzigen oder stacheligen Oberfläche.

11. Züchtungseigenschalten auf verschiedenen Nährmedien:

Die Züchtungseigenschaften auf verschiedenen allgemein verwendeten Nährmedien nach einer zweiwöchigen Züchtung bei 3O⁰C sind in Tabelle I zusammengestellt. Die Farbangaben entsprechen der Einteilung in »Descriptive Color Names Dictionary«, Ergänzung der 3, Auflage des »Color Harmony Manual«, Herausgeber Helen D. Taylor, Lucille Knoche u. Walter C. Granville, 1950.

Tabelle 1

ZUchtungseigenschaften auf verschiedenen Nährmedien

Medium	Wachstum	Substratmycel	Luftmycel	Lösliches Pigment
Saccharose-Nitrat-Agar	schlecht	farblos bis cremefarben (1-V₂ca)	W: schlecht F: weiß (a)	keines
Glucose-Asparagin-Agar	schlecht	farblos bis cremefarben	W: keines	keines
Nähragar	schlecht	farblos bis ahorngelb (3ng)	W: keines	keines
Hafermehl-Agar	mäßig	senfgüldlarben (2 pg) bis hellsenffarben (2 ie)	W: keines	keines
Stärke-Agar	mäßig	bambuschamois (2 gc)	W: schlecht F: weiß (a)	keines
Tyrosin-Agar	schlecht	farblos bis ahorngelb (3 ng)	W: keines	keines
Hefeextrakt-Malzextrakt- Agar	mäßig	ahorngelb (3 ng)	W: schlecht F: weiß (a)	keines
Glycerin-Asparagin-Agar	schlecht	farblos bis hellelfenbein eierschalenfarbig (2 ca)	W: keines	keines
W: Wachstum; F: Farbe.

Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß das Substratmycel farblos oder cremefarben bis braun und das Luftmycel weiß ist und sich auf keinem der Medien ein lösliches Pigment bildet.

Ϊ	Ul. Physiologische Eigenschaften:	26 bis 4 J⁰C
	Wachsiumstemperatur
1 1	Verflüssigung von	negativ
	Gelatine	positiv
	Hydrolyse von Stärke
	Coagulation und
	Peptonisierungvon	negativ
	Magermilch
	Bildung von melanoiden	auf Tyrosin-
	Pigmenten	Agar und
		Pepton-Hcfe-
		Eisen-Agar
		bilden sich
		keine Pigmente

IV. Verwertung von Kohlenstoffquellen:

Kolik'nstolTqiiclle

D-Glucose
Saccharose
Mannit

I- r
I- r
I- γ-Η I-

Kohlenstoffquelle

L-Rhamnose

D-Arabinose

Inosit

D-Fructose

D-Raffinose

Verwertung

In dem Buch »The Actinomycetes«, Bd. II, herausgegeben von S. A. W a k s m a η u. H. A. L e c h e ν a 1 i e r 1962, und in der Zeitschrift International lournal öl Systematic Bacteriology, Bd. 18, Nr. 2, Seiten 69 bis 189 Bd. 18, Nr. 4, Seiten 279 bis 392, Bd. 19, Nr. 4, Seiten 391 bis 512 und Bd. 22, Nr. 4, Seiten 265 bis 394 wurde nacl

S5 Stämmen von Arten mit folgenden Kriterien recher chiert:

Einfache Verzweigungen, keine Bildung von melanoi den Pigmenten oder löslichen Pigmenten, gerade gekrümmte oder schleifenartige Sporophoren, warzigi

ho oder stachelige Sporenoberfläche, weißes Luftmyce uik! farbloses oder gelbstichig braunes Substratmyce das keine andere spezielle Farbe zeigt. Auf Grund diese Untersuchungen wurde der Stamm MK-88 als ähnlic befunden zu den Stämmen von Streptomyces craterife

<>s und insbesondere Streptomyces blucnsis. Die unter schiedlichen Eigenschaften des Stammes MK-88 gcger über den beiden vorgenannten Arten sind in Tabelle I angegeben.

Tabelle II

S. crateriCcr

S. bluensis

M K-88

Die Sporophoren
bilden selten
Spiralen

Die Sporophoren bilden selten Spiralen

Bildet Luftmycel bildet Luftmycel auf Hafermehl-Agar und auf Hafermehl- Glycerin-Asparagin-Agar Agar und Glycerin-Asparagin-Agar

luftmycel ist bisweilen auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar blau gefärbt verwertet Inosit, Fructose und Raffinosc Die Sporophoren bilden keine Spiralen unter den gleichen Kulturbedingungen wie die beiden Stämme von S. craterifer und

S. bluensis

bildet kein Luftmycel auf Hafermchl-Agar und Glycerin-Asparagin-Agar

luftmycel ist auf Hefeextrakt-Malzcxtrakl-Agai weiß gefärbt.

keine Verwertung von Inosit, Fructose und Raffinosc

Auf Grund der vorgenannten Eigenschaften wird der Stamm MK-88 einer neuen Art zugeordnet, die mit Streptomyces hofuensis bezeichnet wird, da sie aus einer Erdprobe bei Hofu, Yamaguchi Präfektur, Japan, isoliert wurde.

Wie im Fall von anderen Stämmen der Actinomyceten können aus dem Stamm MK-88 künstliche Mutanten nach üblichen Methoden erhalten werden, beispielsweise durch Bestrahlung mit UV-Licht, Co^ft0-Strahlen, Röntgenstrahlen oder Behandlung mit verschiedenen mutagenen Verbindungen. Die Erfindung betrifft somit neben dem Stamm MK-88 auch sämtliche Mutanten, die zur Bildung von Verbindungen gemäß Anspruch 1 bis 4 in der Lage sind.

Zur Züchtung des erfindungsgemäßen Stammes und seiner Mutanten können übliche Verfahren zur Züchtung von Actinomyceten verwendet werden. Das Nährmedium kann verschiedene Kohlcnstoffquellen, wie Glucose, Stärke, Mannose, Saccharose (Rohrzukker), Melassen oder pflanzliche Öle oder deren Gemisch enthalten. Je nach ihrer Verwertbarkeit können auch Kohlenwasserstoffe, Alkohole und Carbonsäuren verwendet werden. Als anorganische und organische Stickstoffquellen können Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt,Trockenhefc, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmchl. Casaminsäurc und/ oder lösliche pflanzliche Proteine verwendet werden. Gegebenenfalls können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Caleiumcarbonat und/oder verschiedene Phosphate zugesetzt werden. Außerdem so können gegebenenfalls anorganische oder organische Substanzen zugesetzt werden, die das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus und die Bildung der Antibiotika der Erfindung fördern. Die Züchtung wird vorzugsweise in einem flüssigen Nährmedium durchgcführt. Insbesondere eignet sich das Submersverfahrcn unter gleichzeitigem Rühren. Die Züchtungstcmpcraiur beträgt 26 bis 43°C bei einem pH-Wert um den Neutralpunkt. Die Züchtungsdauer beträgt gewöhnlich 2 bis 15 Tage. Sobald die Ausbeute an den Verbindungen oo der Erfindung ein Maximum erreicht hat, wird die Züchtung abgebrochen, die Zellmassc abfiliricrt und das Flit ro l zur Gewinnung der Verbindungen aufgearbeitet

Die Isolierung und Reinigung der entstandenen Antibiotika aus dem Flltrnl wird nach «n sich bcktinntcn <« Methoden zur Isolierung und Reinigung von mikrohiei len Stoffwcchaclproduktcn aus KulüirhrUhcn diirch|tc fuhrt. Dn die Verbindungen der Mrflndiinp Ixisisrh und in Wasser leicht löslich, in üblichen organischen Lösungs mitteln jedoch schlecht löslich sind, lassen sich di( Produkte nach üblichen Methoden reinigen, wie sie zui Reinigung von wasserlöslichen basischen Antibiotic angewendet werden. Die Verbindungen der Erfindung können durch entsprechende Kombination von Adsorp· tion und Desorption an Kationenaustauscherharzen unc Aktivkohlen, Säulenchromatographie an Cellulose Adsorption und Desorption an vernetztem unc hydroxypropyliertem Dextran, Kieselgelchromatogra· phie und ähnliche Methoden gereinigt wemen.

Beispielsweise wird das zellfreie Kulturfiltrat zu nächst auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt unc anschließend zur Adsorption der Verbindungen aul einen schwach sauren Kationenharzaustauscher in dei Ammoniumform gegeben. Nach dem Waschen mil Wasser wird mil 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird auf einer pH-Wert von 7,5 eingestellt und auf eine mit Aktivkohle gefüllte Säule gegeben. Die Säule wird mit wenig Wasser gewaschen und sodann mit 0,5normalei Schwefelsäure eluiert.Gefärbte Verunreinigungen werden kaum eluiert. Das Eluat wird mit einem Anionenaustausch^ in der OH -Form auf einen pH-Wert von 7,C eingestellt und auf eine mit einem schwach saurer Kationenharzaustauscher in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wassei wird mit 0,2normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Dabei wird zunächst die Verbindung XK-88-1 sodann die Verbindung XK-88-3 und hierauf die Verbindung XK-88-5 eluiert. Schließlich kann die Verbindung XK-88-2 mit unnormaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert werden.

Die XK-88-1 als Hauptkomponente enthaltende Fraktion wird eingedampft. Das Konzentrat wird aul eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben, die sodanr mit SOprozentigem wäßrigem Methanol eluiert wird Fraktionen mit der aktiven Substanz mit RrWerter von 0,58 und 0,31 bei der Dünnschichtchromatographic an Kiesclgel mit dem Entwickler Il (Methanol und lOprozcntige wäßrige Ammoniumacetatlösung 1:1] und Entwickler M (n-Butanol, Äthanol, Chloroform unc 17prozcntige wäßrige Ammoniaklosung 4:5:2:3] werden vereinigt und eingedampft. Das Konzentrat wird auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und sodann Huf eine mit einem schwach sauren Kationcnharzaustau scher in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben NwIt dem Waschen mit Wasser wird mit 0,2normalci

93«

wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, und das Konzentrat wird mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Nach Zugabe von Methanol fällt das Sulfat der Verbindung XK-88-1 als weißes Pulver aus.

Die XK-88-3 und XK-88-5 als Hauptbestandteile enthallenden Fraktionen werden eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben. Eine etwa vorhandene Verunreinigung durch XK-88-1 wird zunächst mit 50prozentigem wäßrigem Methanol eluiert. Sodann wird die Verbindung XK-88-3, die einen R/--Wert von 0,39 bzw. 0.27 bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit dem Entwickler Il bzw. dem Entwickler M zeigt, mit einem Gemisch von Methanol und lOprozentiger wäßriger Ammoniumacetatlösung (1:1) eluiert. Die Verbindung XK-88-5 mit einem Rr-Wert von 0,20 bzw. 0,50 bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit dem Entwickler Il bzw. dem Entwickler M wird danach eluiert. Die XK-88-3 als Hauptbestandteil enthaltende aktive Fraktion und die XK-88-5 als Hauptbestandteil enthaltende Fraktion werden jeweils auf eine mit einem schwach sauren Kationenharzaustauscher in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die jeweils erhaltenen aktiven Fraktionen werden eingedampft und auf mit Kieselgel gefüllte Säulen gegeben. Sodann wird mit einem Gemisch von n-Butanol, Äthanol, Chloroform und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (4:5:2:5) eluiert. Die XK-88-3 als einzigen Bestandteil enthaltende aktive Fraktion sowie die XK-88-5 als einzigen Bestandteil enthaltende aktive Fraktion werden eingedampft und auf mit einem schwach sauren Kationenharzaustauscher in der Ammoniumform gefüllte Säulen gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die jeweils erhaltenen aktiven Fraktionen werden eingedampft und mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Nach Zugabe von Methanol fällt das Sulfat der Verbindung XK-88-3 bzw. XK-88-5 als weißes Pulver aus.

Tabelle III

Die XK-88-2 als Hauptbestandteil enthaltende aktive Fraktion wird eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben. Die Säule wird sodann mit einem Gemisch von Methanol und lOprozentiger wäßriger Ammoniumacetatlösung (1 :1) eluiert. Es wird eine Fraktion mit XK-88-2 erhalten. Diese Verbindung hat R^-Werte von 0,45 bzw. 0,38 bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit dem Entwickler II bzw. dem Entwickler M. Die aktive Fraktion wird auf eine mit einem schwach sauren Kationenharzaustauscher in der Ammoniumform ge füllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die eluierte aktive Fraktion wird eingedampft und auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule gegeben. Die Säule wird sodann mit einem Gemisch von n-Butanol, Äthanol, Chloroform und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (4:5:2:5) eluiert. Die XK-88-2 als einzigen Bestandteil enthaltende aktive Fraktion wird eingedampft und auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Das Konzentrat wird auf eine mit einem schwach sauren Kationenharzaustauscher in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird eingedampft und mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Nach Zugabe von Methanol fällt das Sulfat der Verbindung XK-88-2 als weißes Pulver aus.

Sofern in einem XK-88-Bestandteil oder einem Gemisch der Bestandteile gefärbte Verunreinigungen vorliegen, kann die Entfärbung durch Behandlung mit Aktivkohlegranulat, einem porösen Kunstharz und einem Anionenharzaustauscher in der OH--Form durchgeführt werden. Beispielsweise wird eine wäßrige Lösung die gefärbte Verunreinigungen enthält, auf eine mit einem porösen Kunstharz gefüllte Säule gegeben. Sodann wird mit Wasser eluiert. Das Eluat enthält die entsprechende Verbindung XK-88 und ist frei von gefärbten Verunreinigungen.

Die Eigenschaften der Antibiotika sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Aminoglykosid XK-88-

Sulfat: Aussehen F., ⁰C

Elementaranalyse

C%

UV-Absorptlonssprektrum; Lösungsmittel H₁O

IR-Absorptionsspektrum; KBr-Preßllng

v«« (crrT¹)

weißes, kristallines Pulver

200-240(Zers.) + 77,9° (c - 1,08; H₂O)

C₁₇H₃₄N₄O₁₀-2HjSO₄-3H₂O

ber.: 29,23 ge f.: 29,35

6,35 6,48

8.02 8,35

Fig. 1

keine charakteristischen Absorptionsmaxima zwischen 220 und 360 nm (nur Endabsorption)

FiS. 2

3355, 2900. 2000, 1610, 1505, 1120. 1025.615 weißes Pulvor
225-250(Zers.) + 74,7° (c - 0,56; H₃O) C₁₂Hj₄N₄Oj-2H₂SO₄-3H₂O bor.: 25,90 gor.: 25,47 6,52 6,76 10,07 9,68 Fig. 3 entsprechend XK-88-1

Fig. 4

3400, 3000, 1605, 1490, 1115,1035,605

709 829/413

	Fortsetzung	2450411 ^rr	10	Fig. 7
9				entspr. XK-88-1
Freie Base:		2	Fie R
Molekulargewicht")	Aminoglykosid XK-88- I
Summenformel")		306	3400,2900, 1600, 1500,
NMR-Spektrum	454	C₁₂H₂₆N₄O₅	1390, 1110, 1040,610
C^u-NMR-Spektrum	C₁₇H₃₄N₄O₁₀	Fig. 10
Sulfat:	Fig. 9	Fig. 14 (vom Sulfat)	450
Aussehen	Fig. 13		CiiiHibNaOt
F, "C		weißes Pulver	*IR .ίο " O^ 7 Fig. 12**
H ff	weißes Pulver	215-240 (Zers.)	Fig. 15 (vom Sulfat)
Elenientaranalyse	215-240 (Zers.)	+ 93,9° (c = 0,54; H₂O)
C%	+ 87,3° (c = 0,53; H₂O)	Ci₈H₃₈N₆O₇ -3H₂SO₄ -6H₂O
H	C₁₇H₃₅N₅O₉ · 2,5H₂SO₄ · 5H₂O	ber.: 25,35 gef.: 25,89
N	ber.: 25.89 gef.: 26,02	6,62 6,50
UV-Absorptionsspektrum	6,39 6,72	9,85 9,74
Lösungsmittel, H₂O	8,88 8,61
IR-Absorptionsspektrum,	Fig.5
KBr-Pießling	entspr. XK-88-1
»»»„„(cm'¹)	Fig. 6

Freie Base	3400, 3000, 1615, 1505, 1125, 1030, 620
Molekulargewicht")
Summenformel")
NMR-Spektrum	453
C "-NMR-Spektrum	C₁₇H₃₅N₅O,
") Masscnsncktrogrnphischo Analyse	Fig. 11
-

Das Sulfat von XK-88-1 gibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und eine positive Reaktion beim Rydon-Smith-Test (H. N. P.ydon, Nature, Bd. 169 [1952], S. 922) und eine negative Sakaguchi-, Maltol-, Eisen(lll)-chlorid-, Fehling- und Biuret-Rcaktion.

Das Sulfat von XK-88-1 ist leicht löslich in Wasser, schlecht löslich in Methanol und Äthanol und unlöslich in anderen organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Äthylacetat, Diüthylüther und Chloroform.

Auf Grund der vorstehenden Untersuchungen hat die Verbindung XK-88-1 vermutlich die in Anspruch 1 angegebene Strukturformel.

Das Sulfat von XK-88-2 ergibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und einen positiven Rydon-Smith-Test, sowie eine negative Sakaguchi·, Maltol«, Eisen(IIl)-chlorid·, Fehling- und Bluret-Reaktion.

Das Sulfat von XK-88-2 ist leicht löslich in Wasser, schlecht löslich in Methanol und Äthanol und unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Äthylacetat, Dläthyläther und Chloroform.

Auf Grund der vorstehenden Befunde hat die Verbindung XK-88-2 vermutlich die In Anspruch 2 angegebene Strukturformel.

Das Sulfat von XK-88-3 ergibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smlth-Reaktion und eine negative Sakaguchi·, Maltol·, Elsen(III) chlorid-. Fehling· und Bluret-Reaktion.

Das Sulfat von XK-88-3 ist leicht löslich In Wasser,

schlecht löslich in Methanol und Äthanol und unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Äthylacetat, Dläthyläther und Chloroform.

Auf Grund der vorstehenden Ergebnisse hat XK-88-3 vermutlich die in Anspruch 3 angegebene Strukturformel.

Das Sulfat von XK-88-5 ergibt eine positive Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smith-Reaktion und eine negative Sakaguchi-, Maltol-, Eisen(lll)-chlorid-, Fehling-und Biuret-Reaktion.

Das Sulfat von XK-88-5 ist leicht löslich in Wasser, schlecht löslich in Methanol und Äthanol und unlöslich ASK".?¹¹⁶" ^Losun8«mitteln. wie Aceton. Äthylacetat. Diäthyläther und Chloroform.

Auf Onind der vorstehenden Ergebnisse hat die

™Α^ϋ"^β _e ^XKL⁸⁸'? vermutlich die In Anspruch 4 angegebene Strukturformel.

Die Salze der Verbindungen gemäß Anspruch 1 bis 4 kissen sich in an sich bekannter Welse durch Neutralisation der freien Basen mit einer anorganischen

SS' _h ^Oi?^a?n ^e1. ^{Slure auf β|ηβη} PH·Wert von unterhalb 7.0 und vorzugsweise 2 bis 6 herstellen. Spezielle Beispiele für die zur Salzblldung verwendbaren Säuren sind Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure. Rhodanwasserstoffsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure,

?i 2ufiT^a,^ä«^re· ^K«7¹P^fer8aure· Glutarsäure, Olykolsäu· re, Phthalsäure. Weinsäure, Laurlnsäure, Stearinsäure und Salicylsäure. Die Salze sind weiße Pulver, die In

Wasser löslich und in den meisten organischen Lösungsmitteln schlecht oder unlöslich sind.

Die R/--Werte der Verbindungen der allgemeinen Formel I bei der Papierchromatographie und der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung verschiedener Entwicklungslösungsmittel sind in Tabelle IV zusammengestellt. Diese Werte werden mit den Rc-Werten verschiedener ähnlicher Antibiotika verglichen, die in gleicher Weise entwickelt werden.

1:1; die obere Schicht des

Entwickler I: Chloroform: Methanol : 17prozentige wäßrige Ammoniaklösung (2 Gemisches).

II: Methanol : lOprozentige wäßrige Ammoniumacetatlösung (1 : I).

M: n-Butanol : Äthanol : Chloroform : 17prozentige wäßrige Ammoniaklösung (4:5:2:5).

I: 20prozentige wäßrige Ammoniumchloridlösung

2: Mit Wasser gesättigtes n-Butanol

3: n-Butanol: Essigsäure : Wasser (3 : 1 :.l)

4: Mit Wasser gesättigtes n-Butanol mit 2 Prozent (Gewicht pro Volumen) p-Toluolsulfonsäure und 2 Vol.-Prozent (pro Volumen) Piperidin

5: Chloroform : Methanol : 17prozentige wäßrige Ammoniaklösung (2 : 1 : 1; die untere Schicht des Gemisches).

Tabelle IV	Rι-Wert	U	M	Papierchromatographie (aufsteigende	2	3	Methode)	5
		0,58	0,31		0,00	0,10		0,(4)
		0,45	0,38		0,00	0,08		0,00
	Kieselgel-Dünnschicht-	0,39	0,27		0,00	0,00	4	0,00
	chromalographie	0,20	0,50	Entwicklungslösungsmittel	0,00	0,05	0,00	0,01
		0,39	0,38	1	0,00	0,05	0,00	0,00
XK-88-1	1	0,38	0,28	0,97	0,00	0,08	0,00	0,00
XK-88-2	0,80	0,18	0,52	0,98	0,02	0,08	0,00	0,18
XK-88-3	0,73	0,17	0,59	0,97	0,03	0,08	0,00	0,59
XK-8P 5	0,75	0,18	0,61	0,75	0,02	0,03	0,00	0,38
Gentamicin A	0,81	0,66	-	0,98	0,00	0,06	0,05	0,18
Gentamicin B	0,66	0,76	0,15	0,98	0,00	0,00	0.08	0,02
Gentamicin C\|„	0,75	0,80	0,16	0,98	0,00	0,00	0,09	0,01
Gentamicin C\|	0,86	0,84	0,17	0,98	0,00	0,00	0,10	0,02
Gentamicin C₂	0,87	0,72	0,12	0,98	0,01	0,03	0,00	0,00
Sisomicin	0,86	0,35	0,15	0,98	0,00	0,00	0,00	0,02
Kanamycin A	0,89	0,45	0,16	0,92	0,00	0,05	0,00	0,01
Kanamycin B	0,77	0,45	0,14	0,98	0,00	0,05	0,01	0,00
Kanamycin C	0,80	0,54	0,25	0,96	0,00	0,02	0,00	0,02
Ribostamycin	0,84	0,71	-	0,98	0,00	0,02	0,00	0,00
Apramycin	0,75	0,91	-	0,95	0,00	0,05	0,00	-
Nebramycin, Faktor 4	0,80			0,95		0,02
Nebramycin, Fuktor 5	0,78			0,95		0,02
Tobramycin	0,79			0,97	0,00
Neomycin A	0,80			0,97
NK-1003	0,40			0,93
	0,66

Das antibakterielle Spektrum der XK-88-Antiblotiku, bestimmt nach der Agar-Verdünnungsmethode (pH 8,0), Ist in Tabelle V wiedergegeben.

Tabelle V Untersuchter Mikroorganismus

Minimale Hemmkonzentration, γ/ml XK-88-1 XK-88-2 XK-88-3

XK-88-5

Steptococcus faecalls ATCC 10341

> 416,5

83,3

> 83,3

10,5

13

Tabelle V

24 50 41

Untersuchter Mikroorganismus Minimale Hemm konzentration, y/ml
XK-88-1 XK-88-2 XK-88-3

XK-88-5

Bacilius subtilis No. 10703 Bacillus cereus ATCC 9634 Bacillus cereus var. mycoides ATCC 9463 Staphylococcus aureus ATCC 6538P Staphylococcus aureus KY 8942 (resistent gegenüber Kanamycin, Paromomycin. Streptomycin, Gentamicin und Nebramycin)

Staphylococcus aureus KY 8950 (resistent gegenüber Streptomycin, Tetracyclin, Penicillin und Sulfonamiden Staphylococcus aureus KY 8956 (resistent gegenüber Streptomycin, Paromomycin. Tetracyclin, Kanamycin, Nebramycin, Tobramycin und Erythromycin) Staphylococcus aureus KY 8957 (resistent gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin, Nebramycin, Tobramycin und Tetracyclin) Staphylococcus aureus KY 8953 (resistent gegenüber Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin, Neomycin, Tetracyclin, Erythromycin) Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 Escherichia coli ATCC 26 Escherichia coli KY 8310 (resistent gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin, Kanamycin, Gentamicin, Paromomycin, Nebramycin, Tobramycin, Spectinomycin und Tetracyclin) Escherichia coli (resistent gegenüber Streptomycin) Escherichia coli KY 8327 (resistent gegenüber Kanamycin, Gentamicin, Nebramycin und Tobramycin) Escherichia coli KY 8331 (resistent gegenüber Kanamycin, Ribostamycin, Neomycin, Paromomycin, Lividomycin und Nebramycin) Escherichia coli KY 8334 (resistent gegenüber Kanamycin und Tobramycin) Escherichia coli KY 8348 (resistent gegenüber Streptomycin und Gentamycin) Proteus vulgaris ATCC 6897 Pseudomonas aeruginosa

52,1	0,35	2,7	0,04
6,6	2,7	2,7	1,31
3,3	0,7	2,7	0,66
6,6	0,18	0,18	0,07
52,1	1,4	1,4	0,66
13,1	0,35	0,35	0,17
208,5	0,09	5,3	<0,02

104,2

> 416,5

52,1
13,1

> 416,5

0,09

0,35

1,4
0,18

41,7

5,3

> 83,3

0,35 0,05

41,7

20,8

1,65	5,3	5,3	0,66
13,5	0,18	0,09	2,7
416,5	1,4	1,4	0,53
> 416,5	10,5	> 416,5	8,3

13,1	0,18	0,05	<0,05
26,1	0,35	0,18	0,08
> 416,5	>83,3	> 83,3	>41,6

Fortsetzung

Untersuchter Mikroorganismus

Minimale Hemmkonzentration, y/ml
XK-88-1 XK-88-2 XK-88-3

XK-88-5

Shigella sonnei
ATCC 9290

Salmonella typhosa
ATCC 9992

52,1
26,1

1,4
0,7

0,35
0,18

0,14
0,09

Aus Tabelle V geht hervor, daß die Antibiotika der XK-88-Reihe eine sehr starke antibakterielle Wirkung gegenüber den verschiedensten gram-positiven und gram-negativen Bakterien aufweisen. Insbesondere zeigen XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 und XK-88-5 eine starke antibakterielle Wirkung gegenüber Staphylococcus aureus und Escherichia coli, die normalerweise gegenüber verschiedenen bekannten Antibiotika resistent sind.

Ein Vergleich der Verbindungen der Erfindung mit anderen Antibiotika zeigt ihre Neuheit. Die Antibiotika der XK-88-Reihe sind sämtlich wasserlösliche, basische Antibiotika, die rechtsdrehend sind. Die UV-Absorptionsspektren zeigen lediglich Endabsorption und keine charakteristischen Absorptionsmaxima. Die Molekulargewichte der freien Basen von XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 und XK-88-5 betragen 454, 306, 453 bzw. 450. Auf Grund der angegebenen Werte sind die Antibiotika Gentamicin A, Gentamicin B, Gentamicin Ci_a, Gentamicin Ci, Gentamicin C2, Kanamycin A, Kanamycin B, Kanamycin C, Ribostamycin, Tobramycin, Apramycin, Nebramycin Faktor 4, Nebramycin Faktor 5 und Sisomycin verhältnismäßig ähnlich dem XK-88-1, XK-88-3 und XK-88-5. Neomycin A und NK-1003 scheinen der Verbindung XK-88-2 verhältnismäßig ähnlich zu sein. Die R/-Werte von XK-88-3 bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel und der Papierchromatographie (vergleiche Tabelle IV) kommen den Werten für Gentamicin B sehr nahe. Die Rr-Werte der anderen Glieder der XK-88-Reihe sind jedoch von denen der bekannten Antibiotika völlig verschieden. Das Molekulargewicht der freien Base von XK-88-3 von 453 ist völlig verschieden von dem der freien Base von Gentamicin B von 486. Aus Tabelle V geht hervor, daß nicht immer eine vollständige Kreuzresistenz zwischen XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3, XK-88-5 und den bekannten Antibiotika besteht. Das Beispiel erläutert die Erfindung.

A) Herstellung der aminoglykosidhaltigen Kulturbrühe

Streptomyces hofuensis MK-88 (FERM-P 2216; ATCC 21970) wird als Inoculum verwendet. Eine Platinöse des Einsaatstammes wird in 30 ml eines ersten Einsaatmediums folgender Zusammensetzung in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft und 3 Tage bei 30⁰C unter Schütteln gezüchtet:

Lösliche Stärke 20 g/Liter

Polypepton 5 g/Liter

Hefeextrakt 1 g/Liter

Calciumcarbonal 1 g/Liter
pH-Wert 7,0 vor der Sterilisation

Sodann werden 30 ml der ersten Einsaatkultur in 300 ml eines zweiten Anzuchtmediums in einem 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft,, der mit Prallplatten ausgerüstet ist. Die Zusammensetzung des zweiten Anzuchtmediums ist die gleiche wie die des ersten Einsaatmediums. Die zweite Anzuchtkultur wird 2 Tage bei 3O⁰C unter Schütteln durchgeführt. Sodann werden 1,5 Liter der zweiten Anzuchtkultur (entsprechend 5 Kolben) in 15 Liter eines dritten Anzuchtmediums in einem 30 Liter fassenden Edelstahlfermenter überimpft. Die Zusammensetzung des dritten Anzuchtmediums ist die gleiche wie die des ersten Einsaatmediums.

Die Züchtung in dem Fermenter wird 2 Tage unter Belüftung (15 Liter/min) bei 30⁰C und einer Rührgeschwindigkeit von 350 U/min durchgeführt. Sodann werden 15 Liter der dritten Anzuchtkultur in 100 Liter eines vierten Anzuchtmediums in einem 300 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des vierten Anzuchtmediums ist die gleiche wie die des ersten Einsaatmediums. Die Züchtung in dem Fermenter wird 2 Tage unter Belüftung (100 Liter/min) bei 30⁰C und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min durchgeführt. Schließlich werden 100 Liter der vierten Anzuchtkultur in 1000 Liter eines Nährmediums in einem 2000 Liter fassenden Fermenter überimpft. Dieses Nährmedium hat folgende Zusammensetzung:

Lösliche Stärke	40g/Liter
Sojabohnenmehl	20 g/Liter
Fleischextrakt	5 g/Liter
K2HPO4	0,5 g/Liter
MgSO₄ ■ 7H₂O	0,5 g/Liter
KCl	0,3 g/Liter
CaCO₃	3 g/Liter
(pH 7,0 vor der Sterilisation)

Die Züchtung wird 4 Tage unter Belüftung (400 Liter/min) bei 30⁰C und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min durchgeführt. Nach beendeter Züchtung enthält die Kulturbrühe die Verbindungen XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 und XK-88-5 in einer Konzentration von 3,5 mg/Liter, berechnet auf das Sulfat von XK-88-5.

B) Gewinnung eines Aminoglykosid-Rohpulvers
durch Säulenchromatographie

1000 Liter der in A) erhaltenen Kulturbrühe werden mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Nach Zusatz von 10 kg eines Filterhilfsmittels werden die Zellmasse und unlösliche Stoffe abfiltriert. Das Filtrat wird auf eine mit 100 Liter eines schwach sauren Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Aktive Substanzen werden am Austauscher adsorbiert. Nach dem Waschen mit etwa 300 Liter Wasser wird mit 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die Aktivität des Eluats wird nach der Papierscheibenmethode auf einer Agarplatte mit Bacillus subtilis Nr. 10707 bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden vereiniet und

etwa 250 mg. 200 mg und 1,5 g des Sulfats von X K-88-5.

D) Gewinnung des Aminoglykosids X K-88-1
als Sulfat

Die in C) erhaltene aktive Fraktion mit XK-88-1 als Hauptbestandteil wird konzentriert. Das Konzentrat wird in etwa 50 ml 50prozentigem wäßrigem Methanol gelöst und die Lösung auf eine mit 200 ml Kieselgel gefüllte Säule gegeben, das vorher mit 50prozentigem auf etwa 300 ml eingedampft. Das Konzentrat enthält ι ο wäßrigen Methanol behandelt wurde. Zunächst wird

unter vermindertem Druck auf 6 Liter eingedampft. Das Konzentrat wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einem pH-Wert von 7,5 eingestellt und die entstandene Fällung abfiltriert. Das Filtrat wird auf eine mit 2 Liter des schwach sauren Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit 10 Liter Wasser wird mit 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck

braun gefärbte Verunreinigungen. Es wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und auf eine mit etwa 500 ml Aktivkohlegranulat gefüllte Säule gegeben. Zunächst wird mit 1 Liter Wasser und sodann mit 2 Liter 0,5normaler Schwefelsäure eluiert. Hierbei werden die aktiven Verbindungen in ziemlich reiner Form eluiert. Die durch Eluieren mit 0,5normaJer Schwefelsäure erhaltenen aktiven Fraktionen werden mit einem Anionenharzaustauscher in der OH"-Form neutralisiert und mit den aktiven Fraktionen vereinigt, die durch Eluieren mit Wasser erhalten wurden. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck eingedampft. Es wird ein Rohpulver erhalten, das die Verbindungen der XK-88-Reihe enthält. Die Gesamtaktivität des Rohpulvers entspricht der von etwa 3 g des Sulfats von XK-88-5.

C) Gewinnung einzelner Fraktionen aus dem
Rohpulver

Das in B) erhaltene Rohpulver wird in 3 Liter Wasser gelöst und mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt. Die Lösung wird auf eine mit 500 ml eines schwach sauren Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 4,5 Liter einer 0,2normalen wäßrigen Ammoniaklösung und sodann mit 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung in einer Geschwindigkeit von etwa 1 Liter/Stunde eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 20 ml aufgefangen. XK-88-1 mit 50prozentigem wäßrigem Methanol eluiert. Sodann werden Spuren von XK-88-3 und XK-88-5 mit 50prozentigem wäßrigem Methanol eluiert, das 5 Prozent Ammoniumacetat enthält. Nach der Bestätigung durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit dem Entwicklungslösungsmittel H und dem Entwicklungslösungsmittel M, das die zuerst erhaltene Fraktion als einzigen Bestandteil die Verbindung XK-88-1 enthält, wird die Fraktion unter vermindertem Druck eingedampft und von Methanol befreit. Das Konzentrat wird mit 6normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und auf eine mit 200 ml eines schwach sauren Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 1 Liter einer 0,2normalen wüßrigen Ammoniaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingedampft und von Ammoniak befreit. Sodann wird das Konzentrat mit 6normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und unter Rühren tropfenweise mit 200 ml Methanol versetzt. Die entstandene weiße Fällung wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Ausbeute 12 g gereinigies Sulfat von XK-88-1.

E) Gewinnung des Aminoglykosids XK-88-1
als freie Base

Die in C) erhaltene aktive Fraktion mit der Verbindung XK-88-1 als Hauptbestandteil wird unter

Mit 0,2normaler wäßriger Ammoniaklösung werden die 40 vermindertem Druck auf etwa 50 ml eingedampft.

Verbindung XK-88-1 und ein Gemisch von XK-88-3 und XK-88-5 in den Fraktionen Nr. 50 bis 165 bzw. den Fraktionen 166 bis 230 eluiert. Mit 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung wird die Verbindung XK-88-2 eluiert.

Die in jeder Fraktion enthaltenen aktiven Komponenten werden durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel identifiziert. Die Entwicklung wird bei Raumtemperatur während 3 bis 4 Stunden mit dem Entwicklungslösungsmittel II (lOprozentige wäßrige Ammoniumacetatlösung: Methanol 1:1) und dem Entwicklungslösungsmittel M (n-Butanol: Äthanol !Chloroform : 17prozentige wättrige Ammoniaklösung 4:5:2:5) durchgeführt. Die Komponenten werden durch Farbreaktionen, wie die Ninhydrin- und Rydon-Smith- Reaktion, festgestellt. Die Aktivität der Komponenten wird durch Bioautographie mit einer Agarplatte von Bacillus subtilis Nr. 10707 bestimmt. Mit dem Entwicklungslösungsmittel II zeigen die Verbindungen XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 und XK-88-5 Rf-Werte von 0,58, 0,45, 0,39 bzw. 0,20. Mit dem Entwicklungslösungsmittel M zeigen die Verbindungen XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 und XK-88-5 R/-Werte von 0,31,0,38,0,27 bzw. 0,50.

Die jeweils erhaltenen aktiven Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingedampft. Es werden die entsprechenden Konzentrate von XK-88-1, XK-88-2, XK-88-3 und XK-88-5 erhalten. Die Ausbeute an aktiven Substanzen in jedem Konzentrat entspricht Sodann werden 250 ml Methanol zugegeben, und das Gemisch wird 15 Minuten gerührt. Hierauf wird das Gemisch 15 bis 18 Stunden bei 0⁰C stehengelassen. Die entstandene Fällung wird auf einer Glasfilternutsche abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Hierauf wird die Fällung in 500 ml Methanol suspendiert und unter Erwärmen gelöst. Die Lösung wird filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Die entstandene kristalline Fällung wird 15 bis 18 Stunden bei O⁰C stehengelassen. Die Fällung wird abfiltriert und mehrmals aus Methanol umkristallisiert. Die erhaltenen farblosen Kristalle werden mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 7 g der freien Base XK-88-1.

55

F) Gewinnung des Aminoglykosids XK-88-2
als Sulfat

Die in C) erhaltene aktive Fraktion mit XK-88-2 als Hauptbestandteil wird unter vermindertem Druck eingedampft und sodann mit dem gleichen Volumen Methanol versetzt. Das Gemisch wird auf eine mit 200 ml Kieselgel gefüllte Säule gegeben, das vorher mit 50prozentigem wäßrigem Methanol behandelt wurde. Nach dem Waschen mit 1 Liter 50prozentigem

fts wäßrigem Methanol wird mit 50prozentigem Methanol entwickelt, das 5 Prozent Ammoniumacetat enthält. Zunächst wird die Verbindung XK-88-2 eluiert, die bei der Dünnschichtchromatographie mit dem Entwick-

lungslösungsmittel Il und dem Entwicklungslösungsmittel M Ri-Werte von 0,45 bzw. 0,38 zeigt. Sodann werden Spuren von XK-88-3 und XK-88-5 eltiiert. Durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel wird bestätigt, daß die erste Fraktion die Verbindung XK-88-2 als Hauptbestandteil enthält. Diese aktive Fraktion wird zur Abtrennung des Methanols eingedampft. Das Konzentrat wird zum Entsalzen auf eine mit 100 ml eines schwach sauren Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem to Waschen mit Wasser wird mit 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung aluiert. Die aktive Fraktion wird eingedampft und auf eine mit 300 ml Kieselgel gefüllte Säule gegeben. Die Entwicklung wird mit einem Gemisch von n-Butanol, Äthanol, Chloroform und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (4:5:2:5) durchgeführt. Die eluierte aktive Fraktion wird zur Abtrennung der organischen Lösungsmittel und des Ammoniaks eingedampft. Das Konzentrat wird sodann auf eine mit 100 ml eines schwach sauren Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck zur Abtrennung des Ammoniaks auf etwa 3 ml eingedampft. Das Konzentrat wird sodann in 100 ml Methanol gelöst und die Lösung mit önormaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Die entstandene weiße Fällung wird abfiltriert, mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 250 mg gereinigtes Sulfat von XK-88-2.

G) Gewinnung von Aminoglykosid XK-88-3 und
XK-88-5-Fraktionen

Das in C erhaltene Gemisch von XK-88-3 und XK-88-5 wird auf etwa 10 ml eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine mit 500 ml Kieselgel gefüllte Säule gegeben und mit einem Gemisch von n-Butanol, Äthanol, Chloroform und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (4:5:2:5) entwickelt. Das Eluat wird in Fraktionen von jeweils 20 ml aufgefangen. Die Verbindung XK-88-5 wird in den Fraktionen 95 bis 121 und die Verbindung XK-88-3 in den Fraktionen Nr. 133 bis 158 eluiert. Die Verbindung XK-88-3 in den letztgenannten Fraktionen zeigt Rf-Werte von 0,39 bzw. 0,27 bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit dem Entwicklungslösungsmittel Il bzw. dem Entwicklungslösungsmittel M. Die in den erstgenannten Fraktionen enthaltene Verbindung XK-88-5 zeigt R/-Werte von 0,25 bzw. 0,50 bei der Dünn-Schichtchromatographie an Kieselgel mit den gleichen Entwicklungslösungsmitteln. Hierauf werden die Fraktionen, die die gleichen Verbindungen enthalten, vereinigt.

H) Gewinnung des Aminoglykosids XK-88-3
als Sulfat

In diesem Beispiel wird die in G) erhaltene aktive Fraktion mit der Verbindung XK-88-3 als Hauptbestandteil unter vermindertem Druck zur Abtrennung ⁽⁾⁰ der organischen Lösungsmittel und des Ammoniaks unter vermindertem Druck getrocknet. Der trockene Rückstand wird in 50prozentigem wäßrigem Methanol gelöst und auf eine mit 50 ml Kieselgel gefüllte Säule gegeben. Sodann wird die Säule mit 50prozentigem wäßrigem Methanol gewaschen, um Spuren von XK-88-1 abzutrennen. Hierauf wird die Verbindung XK-88-3 mit 50prozentigem wäßrigem Methanol eluiert, das 5 Prozent Ammoniumacetat enthält. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Abtrennung des Methanols unter vermindertem Druck eingedampft Das Konzentrat wird auf eine mit 50 ml eines schwach sauren Kationenharzaustauscheis in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser zur Abtrennung des Ammoniumacetats wird mit 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert Die erhaltenen aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Abtrennung des Ammoniaks auf etwa 3 ml eingedampft Das Konzentrat wird mit 6normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und in 100 ml Äthanol eingetropft. Die entstandene weiße Fällung wird abfiltriert, die Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 60 mg gereinigtes Sulfat von XK-88-3.

1) Gewinnung des Aminoglykosids XK-88-5
als Sulfat

In diesem Beispiel wird die in G) erhaltene aktive Fraktion mit XK-88-5 als Hauptbestandteil unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird in überschüssigem Methanol gelöst und mit 6normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Die entstandene Fällung des rohen Sulfats von XK-88-5 wird abfiltriert, mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 600 mg. Das erhaltene Rohpulver wird in einem Gemisch von n-Butanol, Äthanol, Chloroform und konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung (4:5:2:4) suspendiert Die Suspension wird auf eine mit 500 ml Kieselgel gefüllte Säule gegeben. Die Säule wird mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch entwickelt. Die in den eluierten Fraktionen enthaltenen aktiven Bestandteile werden auf Grund der Rf -Werte bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel untersucht Die XK-88-5 enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zur Abtrennung der organischen Lösungsmittel und des Ammoniaks unter vermindertem Druck eingedampft. Sodann wird das Konzentrat auf eine mit 200 ml eines schwach sauren Kationenharzaustauschers in der Ammoniumform gefüllte Säule gegeben. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wird mit 0,5normaler wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die aktive Fraktion wird zur Abtrennung des Ammoniaks unter vermindertem Druck auf etwa 10 ml eingedampft. Das Konzentrat wird in 200 ml Methanol gelöst und mit 6normaler Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Die entstandene weiße Fällung wird abfiltriert, mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet Ausbeute 400 mg gereinigtes Sulfat vor XK-88-5.

Hierzu 13 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Aminoglykosid-XK-88-l der Formel CH₂OH

NH,

4, Aminoglykosid XK-88-5 der Formel CH₂NH₂