CH647258A5

CH647258A5 - Verfahren zur herstellung von mildiomycin.

Info

Publication number: CH647258A5
Application number: CH4581/80A
Authority: CH
Inventors: Takashi Suzuki; Hidekazu Sawada; Tsunetomo Asai
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1979-06-21
Filing date: 1980-06-13
Publication date: 1985-01-15
Also published as: NL8003591A; JPS565100A; FR2459288A1; GB2053214A; IN151859B; IT8067976A0; FR2459288B1; DE3022723A1; DE3022723C2; GB2053214B; JPS5933358B2; IT1129094B; US4334022A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Mildiomycin durch Kultivieren eines zu Actinomycetes gehörenden, Mildiomycin bildenden Mikroorganismus der Gat-25 tung Streptoverticillium in einem Kulturmedium, in dem er Mildiomycin bildet und anhäuft. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung in Gegenwart wenigstens einer N-Methylverbindung durchführt.

Mildiomycin ist eine antibiotische Substanz, die als « Anti-30 biotikum B-98891» bezeichnet wird. Seitem sie erstmals entdeckt wurde, sind ihre Eigenschaften untersucht und ihre nachstehend dargestellte Struktur bestimmt worden:

m ymj

\ i

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1

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H0H20-HC-C'HN

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CH2-0H

HgN O

Inzwischen wurde die Aufmerksamkeit der Erfinder auf die Aktivität der Verbindung, insbesondere ihre Wirkungen als Mittel zur Verhinderung und Behandlung des Mehltaus bei den verschiedensten Pflanzen und als Milbenbekämpfungsmittel oder miticides Mittel gerichtet (US-PS 4 007 267, GP-PS 1 507 193 und The Journal of Antibiotic, Band 31, Nr. 6 (1978) 511-518 und 519-524).

In eingehenden Untersuchungen angesichts des vorstehend beschriebenen Hintergrundes mit dem Ziel, Mildiomycin im grosstechnischen Ausmass mit niedrigen Kosten herzustellen, wurde nun gefunden, dass Mildiomycin in erheblicher Menge hergestellt werden kann, wenn ein zu Actinomycetes gehörender Mikroorganismus der Gattung Streptoverticillium, der die Fähigkeit zur Bildung von Mildiomycin hat, in einem Kulturmedium in Gegenwart einer N-Methylverbin-dung gezüchtet wird. Gegenstand der Erfindung ist demge-mäss die Herstellung von Mildiomycin nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen zu Actinomycetes gehörenden Mikroorganismus der Gattung Streptoverticillium, der Mildiomycin zu bilden vermag, in einem Kulturmedium züchtet, das eine N-Methylverbindung in einer Menge von wenigstens 3 m Mol enthält, wobei Mildiomycin im Kulturmedium gebildet und angehäuft wird.

so Als Mikroorganismus, der zu Actinomycetes gehört und Mildiomycin zu bilden vermag, kommt für das Verfahren gemäss der Erfindung ein Actinomycetes, der zur Gattung Streptoverticillium gehört, insbesondere Streptoverticillium rimofaciens FERM-P 2549, hinterlegt am 26. März 1974 bei ss Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Sciene and Technology, 1-4 Yatabecho higashi 1-chôme, Tsukuba-gun, Ibaragi 305, Japan (IFO 13 592, hinterlegt am 21. März 1974 bei Institute for Fermentation, 17-85 Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan; ATCC 31 120, hin-60 terlegt am 20. Januar 1975 bei American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852, USA), in Frage.

Dieser Mikroorganismus wurde ursprünglich nach den in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage 65 (US-PS 4 007 267 und GB-PS 1 507 193) beschriebenen Richtlinien für die Klassifizierung als Streptomyces rimofaciens identifiziert, jedoch wurde dieser Mikroorganismus als Folge einer späteren Änderung der Richtlinien für die Klassi-

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fïzierung als zur Gattung Streptoverticillium gehörend einge- den Mikroorganismen, jedoch kann die N-Methylverbindung stuft. Die neuen Richtlinien sind in Bergey's Manual of De- auch zu einem geeigneten Zeitpunkt während der Kultivie-

terminative Bacteriology, 8. Auflage ( 1974) (The Journal of rung zugesetzt werden.

Antibiotics Band 31, Nr. 6, Seite 511-518) beschrieben. Als Kohlenstoffquellen eignen sich im Nährmedium für

Für die Zwecke der Erfindung können N-Methylverbin- 5 die Kultivierung beispielsweise Zucker, die vom verwendeten düngen verwendet werden, in denen wenigstens ein Stickstoff- Mikroorganismus verwertet werden können, z.B. Stärke,

atom mit 1 bis 4 Methylresten im Molekül substituiert ist. Dextrin, Glucose, Maltose, Saccharose, Sorbit sowie Melas-

Von diesen Verbindungen werden solche, in denen ein Stick- se, Maissirup und Hirsegelee, und organische Säuren, z.B. Es-

stoffatom mit Methylresten im Molekül substituiert ist, be- sigsäure und Bernsteinsäure, und Fette und Öle. Als Stick-

vorzugt. Besonders bevorzugt werden quaternäre Ammoni- 10 stoffquellen eignen sich verschiedene Ammoniumsalze, Nitra-

umsalze mit einer Trimethylammoniogruppe, in der das te, Harnstoff sowie organische natürlich vorkommende Sub-

Stickstoffatom mit drei Methylresten substituiert ist, d.h. stanzen wie Hefeextrakt, Casein, Fleischextrakt, Baumwoll-

■ N+(CH3)3. Ferner können Verbindungen mit einer Gruppe, saatmehl, Maisquellwasser und Sojabohnenmehl. Das Medi-

die im Kulturmedium in eine Gruppe der Formel > N-CH3 um kann ferner als anorganische Salze, falls erforderlich, Sal-

umgewandelt werden kann, z.B. N,N-Methylenbisacrylamid, 15 ze von Eisen, Magnesium, Mangan, Kobalt, Kupfer, Natri-

ebenfalls als N-Methylverbindungen verwendet werden. um, Kalium, Calcium, Zink usw. enthalten. Ferner werden

Die N-Methylverbindungen haben im allgemeinen Mole- dem Nährmedium zweckmässig spezielle Nährstoffe wie kulargewichte im Bereich von etwa 50 bis 1000, vorzugsweise Aminosäuren, Vitamine, Purin- und Pyrimidinbasen u.dgl.

70 bis 200, wobei Molekulargewichte von 90 bis 130 beson- zugesetzt, wenn der Mikroorganismus solche Nährstoffe be-

ders bevorzugt werden. Die N-Methylverbindungen können 20 nötigt.

in Wasser löslich oder unlöslich sein, jedoch werden vorteil- Die Kultivierung kann nach Belieben stationär, als aerobe haft wasserlösliche N-Methylverbindungen verwendet. Bei- Submerskultur, als Schüttelkultur oder nach anderen Kulturspiele solcher N-Methylverbindungen sind N-Methylcarbon- verfahren durchgeführt werden, jedoch wird im allgemeinen säureamide, N-Methylamine, N-Methylammoniumverbin- die aerobe Submerskultur bevorzugt. Die Kultivierungstem-dungen, Polymethylendiamine und N,N-Methylenbisacryl- 25 peratur kann im Bereich von 20° bis 40 °C liegen, beträgt je-amid. Vorteilhaft können N-Methyl-carbonsäureamide, z.B. doch vorzugsweise 24° bis 34 °C. Das Kulturmedium wird N,N-Dimethylacetamid und N- Mwthylacrylamid, N-Meth,- vorzugsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 9 gehal-ylharnstoff und 1,1,3,3-Tetramethylharnstoff, N-Methyl- ten. Zu diesem Zweck wird der pH-Wert des Mediums mit ei-amine, z.B. 2-Dimethylaminoäthanol, Trimethylamin und ner verdünnten wässrigen Lösung von Ätzalkali oder wässri-Dimethylamin, N-Methylammoniumverbindungen, z.B. Le- 30 gern Ammonium oder einer verdünnten wässrigen Lösung cithin, Cholin, Betain, Tetramethylammonium und von Schwefelsäure, Salzsäure o.dgl. während der Kultivie-Äthylen-bis(trimethylammonium)chlorid, und Polymethy- rung eingestellt. Alkalisalze wie Kaliumcarbonat und Natri-lendiamine, z.B. Äthylendiamin, Tetramethylendiamin und umcarbonat können dem Medium ebenfalls zugesetzt wer-Hexamethylendiamin, verwendet werden. Gute Ergebnisse den. Beim Verfahren, gemäss der Erfindung wird die Kultivie-werden mit N-Methylammoniumverbindungen, insbesondere 35 rung fortgesetzt, bis eine wesentliche Menge Mildiomycin ge-Cholin, Betain oder Tetramethylammonium, erhalten. Diese bildet und im Kulturmedium angehäuft worden ist. Im allge-N-Methylverbindungen können allein oder als Mischung von meinen kann die maximale Ausbeute an Mildiomycin in 4 bis zwei oder mehreren Arten verwendet werden. Die Erfindung 12 Tagen erreicht werden.

umfasst ferner ein Verfahren, bei dem man ein Material, das Aus dem in der vorstehend beschriebenen Weise erhalte-eine N-Methylverbindung enthält, beispielsweise Zuckerrü- 40 nen Kulturmedium kann das Mildiomycin, falls erforderlich, benmelasse, die Betain enthält, Sojabohnenmehl, das Leci- nach üblichen Methoden, die normalerweise für die Isolie-thin enthält, oder Hühnereier, die sowohl Cholin als auch Le- rung von basischen wasserlöslichen Antibiotika angewandt cithin enthalten, usw. zu einem Nährmedium in einer grossen werden, isoliert werden. Beispielsweise wird nach der Entfer-Menge gibt, so dass das Medium mehr als 3 mMol N-Methyl- nung der Mikrobienzellen und anderer unlöslicher Stoffe aus Verbindungen enthält. Die Konzentration der N-Methylver- 45 dem Kulturmedium nach einem Verfahren wie Filtration, bindung im Nährmedium wird zweckmässig so gewählt, dass Zentrifugieren o.dgl. das Filtrat oder der Überstand mit Ak-das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus nicht ge- tivkohle oder adsorptionsfähigen Harzen in Berührung gehemmt wird, und auf mehr als 3 mMol eingestellt. Vorzugs- bracht, um das Mildiomycin zu adsorbieren, worauf das Mil-weise beträgt die Konzentration 4 bis 200 mMol, insbesonde- diomycin mit einem wässrigen organischen Lösungsmittel, ei-re 7 bis 50 mMol. Bei einer 200 mMol übersteigenden Kon- 50 ner wässrigen Salz- oder Säurelösung, einer Pufferlösung zentration ist der erzielte Effekt des Zusatzes der N-Methyl- o.dgl. eluiert werden kann. Da das gemäss der Erfindung ge-verbindungen nicht so bemerkenswert wie der unterhalb von bildete Antibiotikum eine basische Substanz ist, wird sie an 200 mMol erzielte Effekt. Die Menge der natürlich vorkom- einem Kationenaustauscherharz gut adsorbiert und kann mit menden Materialien, die N-Methylverbindungen enthalten, geeigneten Säuren, Alkalien oder Pufferlösungen eluiert wer-kann so gewählt werden, dass die vorstehend genannte Kon- 55 den. Diese Methoden können allein und in Kombination an-zentration der N-Methylverbindung eingestellt wird, jedoch gewandt werden. Anschliessend wird das Eluat zur Gewin-würde diese Konzentration natürliche Stoffe in einer grosse- nung von Mildiomycin eingeengt und kristallisiert. Das hier-ren Menge erfordern, als sie üblicherweise verwendet wird, bei erhaltene Mildiomycin kann unbedenklich als Wirkstoff wodurch das Wachstum des Mikroorganismus durch Kom- von antibakteriellen und miticiden Mitteln für Pflanzen ver-ponenten, die ausser den N-Methylverbindungen in den na- 60 wendet werden, wie in der US-PS 4 007 267 und in der GB-PS türlich vorkommenden Substanzen enthalten sind, nachteilig 1 507 193 beschrieben.

beeinflusst werden kann, so dass die Bildung von Mildiomy- Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter ein verhindert wird. In diesen Fällen werden vorzugsweise N- erläutert. In diesen Beispielen bedeuten die Zahlen hinter den

Methylverbindungen in Kombination mit den natürlichen Abkürzungen IFO, FERM-P und ATCC die Hinterlegungs-

Substanzen verwendet. Der Zeitpunkt, zu dem die N-Methyl- ss nummern beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan,

Verbindung dem Nährmedium zugesetzt wird, liegt Vorzugs- beim Fermentation Research Institute of the Agency of Indu-

weise im Hinblick auf die Leichtigkeit der Betriebsführung strial Science and Technology, Chiba, Japan, bzw. bei der und die Wirksamkeit vor dem Impfen des Nährmediums mit American Type Culture Collection, USA.

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Beispiel 1

1) Zu 25 ml eines Nährmediums, das 10% Glucose, 3% Baumwollsaatmehl (Handelsbezeichnung «Proflo», Hersteller Oil Mill Co., USA), 1 % Maisquellwasser, 0,5% Natriumchlorid, 0,001% Eisen(II)-sulfat und 0,5% Calciumcarbonat enthielt, wurde Cholin in der in Tabelle 1 genannten Konzentration gegeben, worauf eine 20% ige wässrige Natriumhydroxidlösung dem Gemisch zugetropft wurde, um den pH-Wert auf 7,0 einzustellen. Das Nährmedium wurde dann sterilisiert und mit einer Platinschleifenmenge einer Schrägkultur von Streptoverticillium rimofaciens FERM-P 2549 (IFO 13 592, ATCC 31 120) geimpft, worauf 120 Stunden bei 28 °C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 200 UpM kultiviert wurde. Die quantitative Bestimmung des Kulturmediums auf Mildiomycin nach der Methode, die in The Journal of Antibiotics, Band 31, Nr. 6 (1978) 511-518 und 519-524 beschrieben wird, hatte die nachstehend in Tabelle 1 genannten Ergebnisse.

Tabelle 1

Zugesetzte Cholin-menge, mMol

0

0.35 1.40 3.5 14.0 35.0 70.0

Relativer Titer von

Mildiomycin,

Gew.-Verhältnis

100 113 133 180 193 200 200

Beispiel 2

Ein Mildiomycin bildender Mikroorganismus wurde auf die in Beispiel 1 geschriebene Weise kultiviert, wobei jedoch die nachstehend in Tabelle 2 genannten verschiedenen N-5 Methylverbindungen dem Kulturmedium in einer Konzentration von 7 mMol an Stelle von 14 mMol Cholin zugesetzt wurden. Die durch quantitative Bestimmung von Mildiomycin erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 genannt.

10 Tabelle 2 Zusatzstoff (7 mMol)

15 Kein Zusatz Cholin Betain Lecithin Trimethylamin 20 Tetramethylammonium N,N-Methylenbisacrylamid

Relativer Titer von

Mildiomycin

(Gewichtsverhältnis)

100 187

186 161 175

187 170

Beispiel 3

Die Kultivierung wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene 25 Weise durchgeführt, wobei jedoch Betain in den in Tabelle 3 genannten verschiedenen Konzentrationen an Stelle von Cholin dem Nährmedium zugesetzt wurde. Die durch quantitative Bestimmung von Mildiomycin ermittelten Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.

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2) 11 des Kulturmediums, das auf die in Abschnitt (1) beschriebene Weise unter Verwendung eines Nährmediums erhalten wurde, dem Cholin in einer Konzentration von 14 mMol zugesetzt worden war, wurde entnommen und zentri-fugiert, wobei ein Überstand erhalten wurde, der durch eine Säule geleitet wurde, die mit 500 ml eines Ionenaustauscherharzes der Handelsbezeichnung «Amberlite IRC-50» (H+-Form) (Rohm & Haas Co., USA) gefüllt war. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, worauf unter Verwendung von 500 ml 0,5%igem wässrigem Ammoniak eluiert wurde. Die aktiven Fraktionen wurden adsorbiert, indem das Eluat durch eine mit 50 ml Aktivkohle für Chromatographiezwecke (hergestellt von der Anmelderin) géfûllte Säule geleitet wurde. Die mit 250 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Aceton und Wasser (3:7) eluierten aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und eingeengt. Dem Konzentrat wurde Aceton zugetropft, wobei rohes Mildiomycin ausgefällt wurde. Das hierbei erhaltene rohe Pulver (1,3 g) wurde in Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule von 25 ml des Ionenaustauscherharzes der Handelsbezeichnung «Amberlite CG-50» (H+-Form) (Rohm & Haas Co., USA) geleitet. Die Säule wurde mit 10 ml Wasser gewaschen, worauf mit 250 ml 0,5%igem wässrigem Ammoniak eluiert wurde. Die aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und adsorbiert, indem sie durch eine Säule von 50 ml Aktivkohle geleitet wurden. Die fraktionierte Elution wurde mit 250 ml Aceton-0,1N-Amei-sensäure (2:8) durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden eingeengt. Dem Konzentrat wurde Methanol zugesetzt, um das Mildiomycin auszufällen. Die erhaltene Fällung wurde unter vermindertem Druck getrocknet, wobei 1,1g Mildio-mycinformiat erhalten wurden. Von den physikalischen und chemischen Kennzahlen stimmten der Schmelzpunkt, die op-24

tische Drehung [a]j-j beic= l,OinH2Oundc = l,0in0,lN-

HC1 und die UV-Extinktionsindices bei 271 nm und 280 nm sehr gut mit den Literaturwerten überein (The Journal of Antibiotics, Band 31, Nr. 6 (1978) 523).

Tabelle 3 Zugesetzte Betainmenge, mMol

35

40

50

Relativer Titer von Mildiomycin (Gew.-Ver-hältnis)

Kein Zusatz 100

0,35 110

1,40 129

3,5 160

14,0 185

35,0 194

70,0 200

Beispiel 4

Die Kultivierung wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt, wobei jedoch Cholin und Tetramethyl-ammoniumhydrochlorid in verschiedenen Kombinationen in den in Tabelle 4 genannten Konzentrationen dem Nährmedium an Stelle von Cholin zugesetzt wurden. Die durch quantitative Bestimmung von Mildiomycin ermittelten Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt.

Tabelle 4 Zusatz von Cholin, mMol

55

kein Zusatz 7 6 5

60 4 3 2 1 0

65

Zusatz von Tetra-methylammonium-hydrochlorid, mMol kein Zusatz

0

1

2

3

4

5

6

7

Relativer Titer von Mildiomycin (Gew.-Verhältnis)

100 187

187

185

186

188

187

188 187

Beispiel 5

Die Kultivierung wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise durchgeführt, wobei jedoch 1,1,3,3-Tetramethylharn-

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Stoff an Stelle von Cholin dem Nährmedium zugesetzt und Tabelle 5

der Zeitpunkt der Zugabe in der in Tabelle 5 genannten Weise Kultivierungszeit, nach der Relativer Titer von variiert wurde. Die durch quantitative Bestimmung von Mil- 1,1,3,3-Tetramethylharnstoff Mildiomycin diomycin ermittelten Ergebnisse sind in Tabelle 5 genannt. zugesetzt wurde (Stunden): (Gewichtsverhältnis)

5 0 140

10 140

kein Zusatz 100

C

Claims

647 258 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Mildiomycin durch Kultivieren eines zur Gattung Streptoverticillium gehörenden, Mildiomycin bildenden Mikroorganismus in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung in Gegenwart einer N-Methylverbindung oder einer im Kulturmedium in eine N-Methylverbindung umwandelbare Verbindung in einer Menge von wenigstens 3 mMol durchführt und hierdurch die Bildung und Anhäufung von Mildiomycin im Kulturmedium veranlasst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine N-Methylverbindung verwendet, in der wenigstens ein Stickstoffatom mit 1 bis 4 Methylresten im Molekül substituiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine N-Methylverbindung, die ein Molekulargewicht im Bereich von 50 bis 1000 hat und aus N-Methyl-carbonsäureamiden, N-Methylaminen, N-Methyl-ammoniumverbindungen und Verbindungen, die eine Gruppe enthalten, die im Kulturmedium in eine Gruppe der Formel > N-CH3 umwandelbar ist, ausgewählt ist, verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine N-Methylverbindung mit einem Molekulargewicht im Bereich von 90 bis 130 verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine N-Methylverbindung verwendet, die ein Molekulargewicht von 50 bis 1000 hat und aus N-Methylaminen, N-Methylammoniumverbindungen und Verbindungen, die eine Gruppe enthalten, die im Kulturmedium in eine Gruppe der Formel > N-CH3 umwandelbar ist, ausgewählt ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,

dass man als N-Methylverbindung Trimethylamin, Lecithin, Cholin, Betain oder ein Tetramethylammoniumsalz verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 5 dass man als N-Methylverbindung eine N-Methylammoni-

umverbindung verwendet, die eine Trimethylammonium-gruppe enthält und ein Molekulargewicht im Bereich von 70 bis 200 hat.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, io dass man als N-Mèthylammoniumverbindung Cholin verwendet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man mit einer Konzentration der N-Methylverbindung im Kulturmedium von 4 bis 200 mMol ar-

15 beitet.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man mit einer Konzentration der N-Methylverbindung im Kulturmedium von 7 bis 50 mMol arbeitet.