CN100391965C - 米多霉素衍生物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有结构式(I)的米多霉素衍生物的制备方法，在米多霉素的发酵过程中添加胞嘧啶和5-氟胞嘧啶作为前体，得到两种抑菌效果明显优于米多霉素的新的核苷类化合物，通过结构鉴定确定该化合物为米多霉素类衍生物，分别将其命名为米多霉素5-H衍生物(HIL)和米多霉素5-F衍生物(FIL)。

Description

米多霉素衍生物的制备方法

技术领域

本发明涉及米多霉素衍生物的制备方法，该衍生物作为杀菌剂的有效成分用于防治植物白粉病。

背景技术

白粉病是由粉状霉菌引起的一种世界性的植物主要病害，在世界各地区均有发生，尤其以温暖潮湿的海洋性气候环境的种植区发生较重。目前有效防治白粉病的化学杀菌剂的有效成份多属于三唑酮类。但是由于多年连续使用，这类农药的药效已逐渐降低，白粉菌的耐药性也逐渐增强。

米多霉素(mildiomycin，MIL)(又称氨苷霉素)是1978年日本的Takashi Iwasa等人[Harada S.，Kishi T.，J.Antibiotics，31，519-524，1978.]从一株龟裂链轮丝菌(Streptoverticillium rimofaciens B-98891)的次级代谢产物中分离得到的一种新型核苷类抗生素，属于抗真菌类抗生素，可安全高效的控制和根治植物白粉病的发生。

Takashi Suzuki等人在美国专利US4296107中揭示了在发酵前或发酵过程中添加胞嘧啶、胞苷或胞嘧啶核苷酸结构类似物就有可能得到米多霉素类衍生物，在该专利中代表十分广的一类衍生物，也包括本发明的部分化合物。但是该专利涉及的培养基价格昂贵，分离过程中使用的树脂Amberlite IRC-50和AmberliteCG-50皆为进口树脂，价格昂贵，工业化生产成本较高，而且其中的活性炭吸附洗脱这步过程起到了脱色脱盐的作用，但活性炭柱操作压力高，难以再生，环境污染较大，而且活性炭柱收率较低。

浙江大学的陈勇等人对发酵液中米多霉素的分离纯化条件进行优化，经过粗制和精制过程，最终可以得到纯度大于95％的米多霉素粉末，且材料全部实现了国产化。但是由于米多霉素和衍生物结构过于接近，该工艺并未能将他们彻底分离，得到的粉末是米多霉素和衍生物的混合物。

本发明是在米多霉素的研究基础上开展的，克服了上述所述的制备和纯化过程中的缺陷，研究发现在用龟裂链轮丝菌Zju5119(Streptoverticillium rimofaciensZju5119)发酵生产米多霉素的过程中添加含胞嘧啶结构类似物能够制备出具有比米多霉素更高生物活性的衍生物，并通过下游的分离纯化工作得到纯度大于95％的纯品。解决了米多霉素合成成本高的缺陷，而且能够得到纯净单一的的米多霉素衍生物。

发明内容

本发明的目的是提供具有下面结构式(I)的米多霉素衍生物的制备方法，

其中R可以是H、卤素原子、低链烷基或羟甲基，或它们的盐。其中优选R为H、F或CH₂OH，

当R是CH₂OH时，化合物的名称即为米多霉素(简称MIL)；

当R是F时，化合物命名为米多霉素5-F衍生物(简称为FIL)；

当R是H时，化合物命名为米多霉素5-H衍生物(简称为HIL)；上述结构式(I)的米多霉素衍生物的制备方法是在龟裂链轮丝菌Zju5119(Streptoverticillium rimofaciens Zju5119)的培养过程中向培养基中添加具有如下

结构(II)的胞嘧啶结构类似物：

其中R’是H、卤素原子、低级烷基或羟甲基，或它们的盐。其中优选R’为H、F或CH₂OH，当R’为H时结构式(II)的化合物就是胞嘧啶，当R’为F时结构式(II)的化合物就是5-氟胞嘧啶。

本发明中所用的龟裂链轮丝菌Zju5119是将土壤中筛选到的原始菌种龟裂链轮丝菌再经过诱变筛选后获得的一株高产菌株，在中国专利局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.1503。

经过龟裂链轮丝菌Zju5119在摇瓶中8～10的发酵，可得到含有结构式(I)的米多霉素衍生物的发酵液，将此发酵液经过离子交换层析柱和C₁₈层析柱分离纯化最终得到结构式(I)的米多霉素衍生物纯品。

根据本发明上述结构式(I)的化合物的制备方法，将龟裂链轮丝菌Zju5119在28℃恒温培养8-10天，这样即可得到含有结构式(I)的化合物的发酵液。

根据本发明上述的结构式(I)的化合物的制备方法，在发酵72小时内在摇瓶培养基或发酵罐培养基中添加0.1～2％的胞嘧啶，这样培养后即可从发酵液中得到HIL。而在发酵36～72小时期间，在摇瓶培养基或发酵罐培养基中添加0.1～2％的5-氟胞嘧啶，培养后即可从发酵液中得到FIL。

根据本发明上述的结构式(I)的化合物的制备方法，将含有结构式(I)的化合物的发酵液用离子交换层析柱进行分离纯化，得到含有结构式(I)的化合物的混合物粗品，将此粗品再经过C₁₈层析柱进行精制，最终得到纯度大于95％的衍生物。

根据上述的制备方法，其中在得到混合物粗品后，将混合物粗品溶于适量0.01M的三氯乙酸缓冲液中，并将其以0.5～1树脂体积/小时流速通过C₁₈层析柱吸附，用0.01M的三氯乙酸缓冲液以0.5～3树脂体积/小时流速洗脱，分别收集结构式(I)的化合物的纯度大于95％的粉末。

根据本发明上述的结构式(I)的化合物的制备方法，其中使用的培养基含有碳源、氮源、无机盐、Fe²⁺、Mg²⁺等营养。碳源可以是豆油、木糖、糊精、甘油、米粉、山梨糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖或玉米淀粉，其中玉米淀粉作为碳源时米多霉素的产量最高，其次是葡萄糖和可溶性淀粉。氮源可以是有机氮源：蛋白胨、酵母膏、玉米浆，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子粉、胰蛋白胨、乳酪蛋白、干酪素、酵母粉、豆粕粉、牛肉浸膏或尿素；也可以是无机氮源如NH₄NO₃或(NH₄)₂SO₄，上述氮源可以单独使用，也可以混和使用，其中有机氮源和无机氮源混合使用时米多霉素的产量较高。而乳酪蛋白和干酪素最为有机氮源时米多霉素的产量最高，其次是鱼粉和豆饼粉，考虑到乳酪蛋白和干酪素价格昂贵，本发明中以工业常用的豆饼粉和NH₄NO₃作为混合氮源。

根据本发明上述的结构式(I)的化合物的制备方法，在培养龟裂链轮丝菌Zju5119的过程中依次用到的培养基：斜面培养基、种子培养基、摇瓶培养基、发酵罐培养基。每种培养的组成如下：

斜面培养基(g/L)：可溶性淀粉15.0～25.0，蛋白胨3.0～7.0，KNO₃ 0.5～1.5，NaCl 0.2～0.7，K₂HPO₄·3H₂O 0.2～0.7，MgSO₄·7H₂O 0.2～0.7，FeSO₄·7H₂O0.005～0.02，琼脂粉15.0～25.0，调pH6.5～7.5；

种子培养基的组成(g/L)为：葡萄糖15.0～25.0，黄豆饼粉20.0～40.0，酵母抽提物0.2～0.7，(NH₄)₂SO₄ 0.5～1.5，MgSO₄·7H₂O 0.2～0.7，CaCO₃ 1.0～5.0；

摇瓶培养基的组成(g/L)为：葡萄糖60.0～100.0，黄豆饼粉30.0～50.0，KH₂PO₄ 0.2～0.6，CaCO₃ 5.0～15.0，(NH₄)₂SO₄ 2.0～8.0，N，N-二甲基乙酰胺2.0～8.0。

发酵罐培养基的组成(g/L)为：玉米淀粉80.0～120.0(玉米淀粉先加1～3U淀粉酶/g干淀粉于PH6.06，70℃下保温1hr)，葡萄糖8.0～12.0，黄豆饼粉20～50，硝酸铵2.0～8.0，磷酸二氢钾0.2～0.6，七水硫酸亚铁0.01～0.1，碳酸钙5.0～15.0，消泡剂0.5～2.0，调pH6.5～7.5。

附图说明

图1是衍生物HIL的HPLC图谱；

图2是衍生物FIL的HPLC图谱；

MIL及其衍生物在HPLC下有相对较为固定的保留时间，HIL和FIL在如下色谱条件下可分别得到如图1和图2所示的色谱峰，即色谱柱：Hypersil BDSC₁₈(大连依利特科学仪器公司)；检测波长：279nm；流动相：由10mmol/L的三氯乙酸和8％的甲醇(V/V)组成；流速：1.0ml·min^-1；进样量：10μl；检测器灵敏度：0.02AuFs；柱温：20℃。

图3是HIL的质谱图，通过电喷雾质谱图确定HIL的分子量为485.3；

图4是FIL的质谱图，通过电喷雾质谱图确定FIL的分子量为503.2；

图5是是HIL的核磁共振氢谱；

图6是是FIL的核磁共振氢谱。

本发明的有益效果在于：

本发明方法解决了米多霉素合成成本高的缺陷，采用本发明方法能够制备出具有比米多霉素更高生物活性的衍生物，通过下游的分离纯化工作可以得到纯度大于95％的纯品。

具体实施方式

实施例1

龟裂链轮丝菌Zju5119用斜面培养基28℃活化，培养基组成(g/L)：可溶性淀粉20.0，蛋白胨5.0，KNO₃ 1.0，NaCl 0.5，K₂HPO₄·3H₂O 0.5，MgSO₄·7H₂O 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，琼脂粉20.0，调pH 7.0。在该培养基中培养7天后可见菌落表面产生大量孢子。挖块接种至种子培养基(100ml/500ml)培养，种子培养基组成(g/L)：葡萄糖20.0，黄豆饼粉30.0，酵母抽提物0.5，(NH₄)₂SO₄ 1.0，MgSO₄·7H₂O0.5，CaCO₃ 3.0，消泡剂0.25；在种子培养基中培养40小时后，按10％接种量接入摇瓶发酵培养基(装液量100ml/500ml或30ml/250ml)或发酵罐发酵培养基(装液量6L/10L)，摇瓶培养基组成(g/L)：葡萄糖80.0，黄豆饼粉40.0，KH₂PO₄ 0.4，CaCO₃ 10.0，(NH₄)₂SO₄ 5.0，N，N-二甲基乙酰胺4.7，消泡剂0.5；发酵罐培养基玉米淀粉100(玉米淀粉先加2U淀粉酶/g干淀粉于PH6.06，70℃下保温1hr)，葡萄糖10，黄豆饼粉40，硝酸铵5，磷酸二氢钾0.4，七水硫酸亚铁0.05，碳酸钙10，消泡剂1，调pH 7.0。

在28℃，200rpm下培养。发酵48hr-60hr时添加0.75g/L的5-氟胞嘧啶作为前体，在28℃继续培养5-6天，即可得到含0.7g/L的FIL的发酵液。

实施例2

培养方法和培养基组成同实例一，只是在发酵之前在发酵培养基中添加0.75g/L的胞嘧啶作为前体，在28℃培养7-8天，即可得到含0.6g/L HIL的发酵液。

实施例3

向含米多霉素和衍生物的发酵液中加入草酸，调节pH值至2～3，静置，过滤或离心，得到澄清滤液，然后用碱调至pH7.0～7.5，静置，过滤去沉淀，得到澄清的预处理液。

将预处理的发酵液，用弱酸性阳离子交换树脂以0.5～2树脂体积/小时流速吸附，优选0.5树脂体积/小时流速，用浓度为2～3.5％氨水以0.5～3树脂体积/小时流速洗脱，优选2树脂体积/小时流速，收集活性组分，得到洗脱液。

洗脱液用酸调至pH7.0-7.5后用阴离子交换树脂以2～4树脂体积/小时的流速脱色，优选2树脂体积/小时流速，收集活性组分，得到脱色液，即米多霉素和衍生物的混合物粗品；

将上述混合物再用C₁₈填料柱进行分离纯化。称取粗制得到的衍生物的粗粉1～3g，溶于20ml0.01M的三氯乙酸缓冲液后用C₁₈层析柱以0.5～3树脂体积/小时流速吸附，优选1树脂体积/小时流速吸附后，用0.01M的三氯乙酸缓冲液以0.5～3/树脂体积/小时流速洗脱，优选1.5树脂体积/小时流速进行洗脱，分别收集纯度大于95％的米多霉素和衍生物的粉末。

实施例4

发酵液中衍生物的含量可以用HPLC进行测定，色谱条件如下：色谱柱：Hypersil BDS C₁₈(250×4.6mm I.D.，5um)(大连依利特科学仪器公司)；检测波长：279nm；流动相：由三氯乙酸和甲醇组成；流速：1.0ml·min^-1；进样量：10μl；检测器灵敏度：0.02AuFs；柱温：20℃。FIL和HIL的HPLC的保留时间在柱温20℃时分别为14.5min和21.9min。

实施例5

米多霉素衍生物的体外活性试验根据《中华人民共和国药典》2000版二部，采用二倍稀释发测定了FIL和HIL的MIC。

分别配制0.05％的HIL和FIL水溶液(pH7.0)，进行紫外波长扫描，检测其最大吸收波长。

米多霉素衍生物的一些理化性质如表1所示：

表1HIL和FIL部分理化特性

	HIL	FIL
			MIC(mg/L)	110	105
分子量	485.3	503.2
			紫外最大吸收波长(nm)	279	272
熔点	无明显熔点	无明显熔点

表2HIL和FIL的核磁共振氢谱各原子化学位移

实施例6

薄层色谱法的操作依照《中华人民共和国药典》2000版二部。分别选用了硅胶G板和纤维素板作为薄层色谱的支持介质，所采用的展开剂以及FIL和HIL的Rf值如表3所示：

表3HIL和FIL的薄层层析Rf值

标注：^*溶剂1-3分别指以下试剂混合物(v/v/v)

溶剂1甲醇∶三氯乙酸(10mmol/L)∶水(4∶10∶36)

溶剂2正丁醇∶冰乙酸∶水(1∶1∶3)

溶剂3氯仿∶甲醇∶17％氨水(2∶2∶1)，静置分层取其上清液

实施例7

FIL和HIL室内盆栽活性测定的试验对象为黄瓜白粉病。选择2片真叶期的盆栽黄瓜苗，将不同稀释倍数的原液稀释液分别对黄瓜苗进行喷雾处理，自然晾干，在药剂处理后24h进行接种。接种方法采用孢子悬浮液(浓度控制在1×10⁶个/毫升左右)喷雾接种，喷湿不滴水为宜，自然晾干，然后移至恒温室(22℃左右)中保湿培养，7-8天后视对照发病情况调查防效。

室内盆栽试验结果显示FIL和HIL的EC₉₀值(mg/L)分别为52.89和54.47，对照品米多霉素的EC₉₀值(mg/L)是153.22。而目前农业上防治白粉病常用的三唑酮，浓度为100mg/L时的防效仅为68.89％。可见得到的三种新衍生物的生物活性明显优于米多霉素，也远远高于三唑酮。

HIL小区药效试验是在浙江绍兴市现代农业园区的南瓜田内进行，将0.432g/L的HIL制剂以10倍处理时防效为81.7％，优于对照药剂20％粉锈宁EC1000倍处理的防效(72.9％)，HIL制剂20倍、40倍二个处理的防效(59.4％、43.4％)均低于对照药剂20％粉锈宁EC1000倍处理的防效。

对南瓜的安全性研究结果表明，经药后3、5天观察，未见南瓜有叶色变化、畸形南瓜果产生，可见在本试验条件下和剂量范围内HIL制剂对南瓜安全。

实施例8

对HIL和FIL分别进行急性毒性试验和Ames试验。毒理学试验结果为微毒，无刺激，阴性。详细见表4：

表4：米多霉素衍生物的急性毒性试验

Claims (10)

1.具有结构式(I)的米多霉素衍生物的制备方法，其特征在于在龟裂链轮丝菌Zju5119(Streptoverticillium rimofaciens Zju5119，保藏编号为：CGMCCNo.1503)的培养过程中向培养基中添加结构式(II)的胞嘧啶结构类似物，经过培养得到含有结构式(I)的米多霉素衍生物的发酵液，将此发酵液经过离子交换层析柱和C₁₈层析柱分离纯化最终得到结构式(I)的米多霉素衍生物纯品，其中结构式(I)中的R是H或F，结构式(II)中的R’是H或F，R和R’相同

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是龟裂链轮丝菌Zju5119(保藏编号为：CGMCC No.1503)经过28℃恒温培养8～10天后得到含有结构式(I)的米多霉素衍生物的发酵液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是在发酵72小时内在摇瓶培养基或发酵罐培养基中添加0.1～2％的R’为H的结构式(II)的化合物，培养后得到R为H的式(I)的化合物；或者在发酵36～72小时中在摇瓶培养基或发酵罐培养基中添加0.1～2％的R’为F的结构式(II)的化合物，培养后得到R为F的式(I)的化合物。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是将含有结构式(I)的米多霉素衍生物的发酵液用离子交换层析柱进行分离纯化，得到含有结构式(I)的米多霉素衍生物的混合物粗品，将此粗品再经过C₁₈层析柱进行精制，最终得到纯度大于95％的衍生物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是将含有结构式(I)的米多霉素衍生物的混合物粗品溶于适量0.01M的三氯乙酸缓冲液以0.5～1树脂体积/小时流速通过C₁₈层析柱吸附，用0.01M的三氯乙酸缓冲液以0.5～3树脂体积/小时流速洗脱，分别收集纯度大于95％的米多霉素和衍生物的粉末。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于培养过程中依次使用斜面培养基、种子培养基、摇瓶培养基和发酵罐培养基。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于斜面培养基组成为：可溶性淀粉15.0～25.0，蛋白胨3.0～7.0，KNO₃ 0.5～1.5，NaCl0.2～0.7，K₂HPO₄·3H₂O0.2～0.7，MgSO₄·7H₂O0.2～0.7，FeSO₄·7H₂O 0.005～0.02，琼脂粉15.0～25.0，调pH6.5～7.5，上述各组成的单位是g/L。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于种子培养基组成为：葡萄糖15.0～25.0，黄豆饼粉20.0～40.0，酵母抽提物0.2～0.7，(NH₄)₂SO₄0.5～1.5，MgSO₄·7H₂O0.2～0.7，CaCO₃1.0～5.0，上述各组成的单位是g/L；

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于摇瓶培养基组成为：葡萄糖60.0～100.0，黄豆饼粉30.0～50.0，KH₂PO₄0.2～0.6，CaCO₃5.0～15.0，(NH₄)₂SO₄2.0～8.0，N，N-二甲基乙酰胺2.0～8.0，上述各组成的单位是g/L。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于发酵罐培养基组成为：玉米淀粉80.0～120.0，葡萄糖8.0～12.0，黄豆饼粉20～50，硝酸铵2.0～8.0，磷酸二氢钾0.2～0.6，七水硫酸亚铁0.01～0.1，碳酸钙5.0～15.0，消泡剂0.5～2.0，调pH6.5～7.5，其中，玉米淀粉先加1～3U淀粉酶/g干淀粉于pH6.06，70℃下保温1hr，上述各组成的单位是g/L。

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