CN105779360B - 一种枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株从青稞白酒糟醅中分离纯化得到的枯草芽孢杆菌及其生防应用，该菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus.subtilis，完整命名为枯草芽孢杆菌JZ2‑4‑5，已于2015年3月16日保存在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12219。本发明提供的枯草芽孢杆菌JZ2‑4‑5用于春小麦、青稞田中，防除禾本科杂草野燕麦，其不仅能有效抑制野燕麦种子萌发及幼苗生长，并对2叶1心期～4叶1心期野燕麦植株具有较好的生物防除效果。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生态学领域，尤其涉及一株来源于青稞白酒糟醅的枯草芽孢杆菌及其生防应用。
背景技术
农田杂草直接或间接影响着农业生产，影响着农作物的产量、质量和品质。目前，农田杂草控制还是以化学除草剂为主体。随着化学除草剂的广泛使用，带来的负面影响也日益明显。我国在农业“十三·五”规划中提出了“双减(减化肥和农药)”目标。除草剂在整个农药市场中占比超过50％，因此，要想顺利实现这个目标，必须想办法大幅降低化学除草剂的用量。而发展生物除草剂是替代和减少化学除草剂的使用并有效控制草害、保证农作物稳产高产、保障食品安全和公众健康的重要基础。通过研究天然产物，有针对性地发现除草活性物质，鉴定其结构，开发新的除草剂剂型；同时，借助生物技术方法准确、快速确定化合物关键作用靶标，建立化合物和靶标分子互作模型，进而针对靶标进行分子结构修饰和选择合成更多化合物已成为当前除草剂研发的最新思路。目前，全球已经成功商业化或正式获得登记的生物除草剂产品有DeVine、COLLEGOTM、CasstTM、BioMalTM、StumpOutTM、Biochon、Camperico、Myco-Tech PasteTM、ColtruTM、VelgoTM、ChontrolTM、SmolderTM、Sarritor、和 LC以及双丙氨膦等20余个品种，其中Biochon、StumpOut、Camperico、双丙氨膦钠和Myco-Tech Paste已经成为国际化的产品。国内生物源除草剂研究方面进展较快，近年来人们不断从不同来源分离获得高效抑草作用微生物且对其次生代谢产物进行分离鉴定。蒋细良等报道的除草剂M-22，是从福建省土壤中分离到的一株链霉菌(Streptomyces hygroscopicus M-22)产生的一种广谱性苗后抗生素类除草剂。强胜等通过对杂草病原代谢产物的研究，先后成功研制出2种微生物源除草剂。李等先后报导了从不同来源分离获得的微生物菌株代谢产物的除草活性。另外，在农药创制合成研究中，以生物源高活性化合物为先导，结构修饰衍生化后合成结构特性稳定、农用活性高效的除草剂，也是目前农药创制中的热点。
芽孢杆菌作为具有生防应用价值的菌株，能产生耐热、抗逆性的芽孢，具有显著的生防潜力，利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖，为生物防治植物病害研究的热点，国内外已有较多报道。目前已有很多优良的芽孢杆菌菌株应用于生产实践。美国已有4株芽孢杆菌生防菌株(QST 713、GB 03、MB 1600和FZB 24)得到了美国环保署(EPA)商品化或有限商品化生产应用许可；国内利用芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已开发成功并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等。综上所述，芽孢杆菌在生防上的研究仅在植物病害防治方面，关于其在杂草治理方面的研究还未见报导。利用微生物资源防除杂草具有对作物影响小、环境负效应少、安全性高等优点，符合可持续农业的发展，已受到世界各国的高度重视。对微生物除草剂的评价，理论上主要依据两条标准即有效性(药效)和专一性(安全性)。杂草生防菌应具备既对靶标杂草具有强致病性又对作物相对安全两大特点。
青稞是禾本科大麦属的一种禾本科作物，又叫裸大麦、米大麦、元麦，青稞白酒是以青藏高原的特产青稞为原料，以青稞、豌豆两者粉碎后合理配料制得的中低温大曲作为糖化发酵剂，采用一次投料，清蒸清烧四次清工艺生产。由于白酒糟醅中微生物的种类多、数量大其发展不同过程的次生代谢产物多样化，加之青稞的次生代谢产物在酿造过程中的化学变化，使从青稞白酒糟醅中发现抑草活性物质成为可能。通过青稞白酒糟醅发酵液对不同杂草的抑草活性研究和作物安全性评价，旨在发现和解决春小麦田、青稞田难防杂草野燕麦的生物防除问题，同时对青稞糟醅高效利用及保护环境的具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株从青稞白酒糟醅中分离纯化得到的枯草芽孢杆菌及其生防应用，旨在解决的技术问题是针对现有春小麦田、青稞田野燕麦杂草生物除草技术的不足。
本发明的技术方案如下：
一种青稞白酒糟醅菌种，所述菌种其分类命名为为枯草芽孢杆菌Bacillus.subtilis，完整命名为JZ2-4-5。已于2015年3月16日保存在中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12219。
所述青稞白酒糟醅菌种，枯草芽孢杆菌Bacillus.subtilis，分离纯化方法采用稀释平板富集培养法进行分离和纯化得到。
所述芽孢杆菌分离纯化具体方法为：在青稞白酒酒窖中，按上、中、下3个点，用无菌工具将新鲜青稞白酒糟醅取回后，准确称量5g置于45mL无菌水中，充分摇匀。培养基为NYD培养基,其组成为每升含葡萄糖10g，牛肉浸膏8g,酵母膏5g，pH值调至7.0～7.2。置于30℃光照培养箱中3d后，挑去单菌落培养。
所述的枯草芽孢杆菌的应用，是将枯草芽孢杆菌的发酵滤液喷施于春小麦、青稞的田间，应用于田间生物防除杂草野燕麦。
所述的枯草芽孢杆菌的应用，其枯草芽孢杆菌的发酵滤液的制备，是在培养3d后的菌落边缘取菌丝块接种到有200mL NYD培养液的培养瓶中，每瓶接5块，30℃180r/min-1培养5d，培养液真空抽滤，滤液再用0.45μm微孔水性滤膜过滤，得发酵滤液。
所述的枯草芽孢杆菌的应用，其发酵滤液的喷施量为50mL/m2。
所述的杂草为禾本科杂草野燕麦。
本发明针对春小麦、青稞田的禾本科杂草难防杂草野燕麦为靶标，从青稞白酒糟醅中分离筛选到一种枯草芽孢杆菌属菌株JZ 2-4-5，其发酵液可显著抑制野燕麦杂草种子萌发及幼苗生长，且对2～4叶期野燕麦植株有较好的防效，同时对春小麦、青稞安全。本发明能够有效控制和防除春小麦、青稞田难防杂草野燕麦，且原料来源广泛，成本低，对环境安全。
附图说明
图1是本发明实施例提供的本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌JZ2-4-5菌株发育树构建结果图。
图2是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌JZ2-4-5发酵液原液处理下对野燕麦叶片含水量影响变化趋势图。
图3是本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌JZ2-4-5发酵液原液处理下对野燕麦叶片叶绿素含量变化趋势图。
图4是本发明实施例提供的本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌JZ2-4-5发酵液原液处理下对野燕麦叶片丙二醛含量影响变化趋势图。
图5是本发明实施例提供的本发明实施例提供的枯草芽孢杆菌JZ2-4-5发酵液原液处理下对野燕麦叶片超氧化歧化酶SOD含量影响变化趋势图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
1、实验材料和方法
1.1菌株分离纯化及发酵液制备
在青稞酒窖中按上、中、下取回新鲜青稞白酒酒糟，分别取5g青稞白酒糟醅样品，置于45mL无菌水中，常温振荡30min，移液器吸取1mL加入9mL无菌水中配制成10-1的菌悬液。依次类推逐级稀释10-2、10-3。取0.2mL菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，置于30℃培养箱中培养。培养3d后的菌落边缘取菌丝块接种到有200mL NYD培养液的培养瓶中，每瓶接5块，30℃180r/min-1培养5d，培养液真空抽滤，滤液再用0.45μm微孔水性滤膜过滤，得发酵滤液。
1.2初筛及作物安全性
用种植土种植供试作物，每种作物20盆，将从青稞白酒糟醅中分离得到的菌株，液体摇瓶培养，过滤后发酵液配成3个梯度分别为：原液、10-1倍原液，施于3～4叶期春小麦(青春38号)、春油菜、春蚕豆(青海13号)、豌豆(草原26号)、野燕麦，用手持喷壶按20mL/盆茎叶喷施1次。每一处理重复4次，以清水喷施的的植株作为空白对照。
1.3培养皿种子萌发及幼苗生长测定方法
选取大小一致、颗粒饱满的野燕麦(Avenafatua L.)种子，用2.5％的次氯酸钠溶液浸泡，同时用磁力搅拌器搅拌10min，再用无菌水搅拌冲洗3次(每次3min)，吸水纸吸干，25℃的条件下催芽24h。挑选露白一致的供试种子进行测定。
在高压灭菌后的玻璃培养皿(直径9cm)中铺双层滤纸，分别加入过滤好的不同浓度(原液、10-1倍原液)菌株发酵液5.00mL，以清水为CK对照。每皿放置露白一致的供试种子16粒，按4-4-4排列，每个处理3次重复。将培养皿放在25℃恒温培养箱中黑暗条件下培养3天，第4天开始培养箱内的光照周期为18h光照/6h黑暗。培养期间加适量无菌水保持种子及幼苗生长所需要的水分。3d测定种子发芽率，种子发芽的标准为胚根突破种皮2mm，7d同时测定根长、芽长、鲜重、干重及计算抑制率(％)。试验采用完全随机试验，所得数据用spss20.0进行方差分析和显著性分析。
1.4微生物菌株鉴定
1.4.1形态鉴定
将菌株于培养基上进行培养，光学显微镜下观察其菌丝、孢子形态。将直径为8mm菌丝块接种于培养基平皿(Φ＝9cm)，30℃培养，定期观察其菌落生长速度、产孢速度、产孢量、菌落形态及色泽变化。
1.4.2分子鉴定
DNA提取按照上海生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式细菌DNA提取试剂盒的程序操作。选用
细菌通用引物对：F27 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGG-3'，P1541 5'-AAG GAGGTG GTG ATC CAG CCG CA-3'。
选取特定的引物，反应条件为：94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸75s，50μL反应体系30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，经克隆测序得到序列结果。所得到的16SrDNA全序列与从Genbank等数据库中获得的16S rDNA序列进行比对，通过Mega 6.0软件包进行系统发育树的构建。
1.5野燕麦生理生化指标影响测定
MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定；叶绿素测定采取丙酮直接浸提法；超氧化歧化酶SOD活性参照李玲的方法测定，叶片相对含水量按公式：叶片相对含水量＝(初始鲜质量—干质量)/(饱和鲜质量—干质量)×100％。
2、结果
2.1初筛
菌株发酵液喷施于野燕麦植株上后，1、3、5、7、9d观察结果表明：JZ2-1-2、JZ2-1-3、JZ2-1-13、JZ2-3-2、JZ2-4-5、JZ2-5-2这6株细菌菌株的发酵液对野燕麦生长有抑制作用。野燕麦具体症状为叶片失水、褪绿、卷曲直至干枯死亡。7d后观察菌株JZ2-4-5发酵液处理后的野燕麦大部分死亡，除草效果最好。另外5株糟醅细菌次之，可明显看出对野燕麦的植株具有明显的防除效果，所以选取这6株细菌进行复筛。
2.1.2复筛—6株细菌菌株发酵液对野燕麦种子萌发及幼苗生长的影响
由表1可知：6株糟醅细菌的发酵液对野燕麦种子发芽率具有明显的抑制作用，其中菌株JZ2-1-2、JZ2-1-3、JZ2-1-13、JZ2-3-2、JZ2-4-5、JZ2-5-2发酵液处理后野燕麦种子萌发率分别为65％、76.67％、88.33％、95.00％、33.33％、83.33％，稀释后10-1倍发酵液对野燕麦种子萌发无影响。另外，6株糟醅细菌对供试杂草野燕麦幼苗生长同时具有抑制作用，其发酵液及10-1倍发酵液对野燕麦幼苗的根长、芽长、鲜重、干重均有不同程度的抑制作用。尤其对根长的抑制作用最为明显，菌株JZ2-1-2、JZ2-1-3、JZ2-1-13、JZ2-3-2、JZ2-4-5、JZ2-5-2发酵液处理后野燕麦根长抑制率分别为92.48％、72.55％、89.87％、97.06％、100.00％、100.00％。通过结果可知6株供试糟醅细菌发酵液中的次生代谢产物不仅可以抑制野燕麦种子萌发，同时可以影响其幼苗生长，随浓度的增大，影响作用加大，同时具有使种子失水、失重、明显失去萌发潜力的作用。结合初筛及复筛综合结果评定菌株JZ2-4-5对野燕麦种子萌发及幼苗生长抑制效果最好JZ2-1-2、、JZ2-5-2次之，可供后续深入研究，进一步对其安全性进行评价。
表1 6株糟醅细菌发酵液对野燕麦种子萌发及幼苗生长的影响
注：括号内为根长、芽长、鲜重、干重平均数据抑制率，小写字母代表在0.05水平上的差异显著性。
2.23株细菌发酵液对作物植株生长安全性的影响
通过3株细菌发酵液对4种青海主要作物的安全性评价，结果表明：3株细菌对春小麦、青稞表现安全；蚕豆叶片边缘失绿有黑斑出现，药害黑斑叶片部分可恢复，整体叶片与空白对照相比略卷曲，后期可恢复。另外，3株细菌发酵液对蚕豆株高轻微抑制，与空白对照相比平均低3.9％。对春油菜表现为不安全，5d时80％油菜叶片失水蜷曲发干，后逐渐成黑色，7d油菜叶片完全死亡，评价结果见表2。
表2 3株糟醅细菌对作物安全性评价
2.3菌株的鉴定
2.3.1青稞白酒糟醅细菌的形态特征
对杂草野燕麦防除效果最好的青稞白酒糟醅菌株JZ2-4-5为枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis)，革兰氏染色为阳性，直杆状，无荚膜，链状排列，能运动，菌落表面粗糙不透明有褶皱。
2.3.23株细菌的分子生物学鉴定结果
采用细菌通用引物对：F27 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGG-3'，P1541 5'-AAGGAG GTG GTG ATC CAG CCG CA-3'。自菌株的基因组DNA中扩增获得片段大小为所得到的16S rDNA全序列与从Genbank等数据库中获得的16S rDNA序列进行比对后获取登录号为：JZ2-4-5(KU312056)。通过Mega 6.0软件包进行系统发育树的构建(见图1)。
2.4菌株发酵液对对杂草野燕麦生理特性的影响
2.4.1菌株发酵液对对杂草野燕麦叶片叶绿素含量和相对含水量的影响
所诉菌株发酵液每盆10ml喷施于2叶～4叶期野燕麦植株后，1、2、3、5、7、9、11、14d对其叶片相对含水量进行测试，结果表明野燕麦叶片相对含水量总体呈下降趋势。野燕麦叶片对于枯草芽孢杆菌JZ2-4-5菌株发酵液的胁迫效应反应迅速，喷施后1d野燕麦叶片相对含水量即降低。14d后供试野燕麦叶片已全部死亡、腐烂，不宜进行相对含水量的测定(见图2)。喷施枯草芽孢杆菌菌株发酵液后，野燕麦叶片光合作用受到干扰和破坏，叶片叶绿素含量明显降低。供试菌株发酵液处理后的野燕麦植株叶片，在5d时叶片叶绿素含量与对照处理相比分别降低了63.87％。且从图3中可见枯草芽孢杆菌JZ2-4-5菌株发酵液对野燕麦叶片叶绿素含量的影响作用明显，这一结果与初筛时观察结果相吻合。
2.4.2菌株发酵液对对杂草野燕麦叶片MDA含量、超氧化歧化酶的影响
枯草芽孢杆菌菌株发酵液喷施于野燕麦植株上后，其叶片的MDA含量从喷施后1d开始逐渐升高，在7d-9d时达到极值，随后降低(见图4)。而叶片中SOD酶活力在喷施后1d呈下降趋势，后逐渐升高，在5-7d时达到峰值后逐渐降低(见图5)。说明来源于青稞白酒糟醅的枯草芽孢杆菌属菌株JZ2-4-5的发酵液可显著防除野燕麦。
实施例2
按实施例1所述的方法，制备出发酵滤液，测试了枯草芽孢杆菌JZ2-4-5防除春小麦、青稞田杂草室外初步试验。室外试验在青海省农林科学院植物保护研究所试验田内进行，杂草主要以野燕麦(2～4叶期)为主，小区面积约4m2，喷施量200ml，3次重复，喷施后20天、40天调查野燕麦的防效和鲜重效，结果如表3所示。
表3 枯草芽孢杆菌JZ2-4-5对春小麦、青稞田野燕麦的防除效果
利用本发明所述的技术方案，或本领域的技术人员在本发明技术方案的启发下，设计出类似的技术方案，而达到上述技术效果的，均是落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一株青稞白酒糟醅菌株，其特征在于，所述青稞糟醅菌种为枯草芽孢杆菌，保藏编号为CGMCCNo.12219。
2.如权利要求1所述青稞白酒糟醅枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，将枯草芽孢杆菌发酵滤液喷施于春小麦、青稞田间，应用于防除杂草野燕麦，且对作物安全。
3.如权利要求2所述青稞白酒糟醅枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于，在平板培养3d后的菌落边缘取菌丝块接种到有200mL NYD培养液的培养瓶中，每瓶接5块，30℃180r/min-1培养5d，培养液真空抽滤，滤液再用0.45μm微孔水性滤膜过滤，得发酵滤液。
4.根据权利要求2所述的青稞白酒糟醅枯草芽孢杆菌的应用，其特征是，发酵滤液的喷施量为50mL/m2。
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