CN114908021A - 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治黄瓜棒孢叶斑病上的应用 - Google Patents

一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治黄瓜棒孢叶斑病上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株防治黄瓜棒孢叶斑病并且促进黄瓜生长的解淀粉芽孢杆菌菌株。本发明所提供的防治黄瓜棒孢叶斑病并且促进黄瓜生长的解淀粉芽孢杆菌是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.24581，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24581。盆栽活体试验表明，解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581对黄瓜棒孢叶斑病的防治效果最高可达85.72％，同时解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵液对黄瓜具有促生效果，增加了黄瓜茎长、根长、叶面积及地上部生物量，黄瓜体内生长素增加41.1％，玉米核苷素含量增加30.0％，植物叶绿素含量增加16.7％，在生产应用中具有广阔前景。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治黄瓜棒孢叶斑病上的应用
技术领域
本发明涉及微生物农药技术领域中一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治黄瓜棒孢叶斑病上的应用。
背景技术
黄瓜棒孢叶斑病是由多主棒孢(Corynespora cassiicola)侵染引起的真菌病害，其寄主范围广泛，可危害葫芦科、茄科、豆科等蔬菜。一般发病率为10％-25％，严重时可达60％-70％，甚至100％。目前化学防治依然是防治该病害的主要手段，常用的杀菌剂包括啶酰菌胺(Boscalid)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、百菌清(chlorothalonil)，吡唑醚菌酯(pyraclostrobine)等。然而近几年发现多主棒孢菌对该类杀菌剂的抗药性越来越严重，因此制定合理的抗药性治理方案，对于有效防控棒孢叶斑病至关重要。
生物防治因其具有安全有效，对环境友好且不产生抗药性的优点，在防治蔬菜病害方面越来越受到重视。目前主要用到的生防菌属包括芽孢杆菌属，假单孢杆菌属及木霉属等。许多生防菌除了对病害具有防治作用外，还具有一定的促生长效果。例如从樱花根际土壤中分离出一株对白菜黑腐病具有抑制活性的生防近缘毛壳菌株(Chaetomiumsubaffine)LB-1，采用菌液灌根的方式研究其对大白菜的促生效果，结果显示该菌株对白菜的株高，根长、地上部重量及根重均有一定的促进效果。但是用于防治黄瓜棒孢叶斑病的生防菌很少，因此迫切需要挖掘更多高效稳定的生防菌剂，以符合农业可持续发展的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何抑制果蔬作物棒孢叶斑病原菌和/或防治黄瓜棒孢叶斑病。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株解淀粉芽孢杆菌。
本发明提供的解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.24581，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24581。
本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂含有上述解淀粉芽孢杆菌和/或上述解淀粉芽孢杆菌的代谢物。
上述菌剂可为病原菌抑制剂或病害抑制剂。
上述病原抑制剂中，所述病原菌可为多主棒孢(Corynespora cassiicola)。
上述病害抑制剂中，所述病害可为黄瓜棒孢叶斑病。
上述的解淀粉芽孢杆菌在制备下述1)-3)中任一的产品中的应用也属于本发明的保护范围：
1)用于防治黄瓜棒孢叶斑病和/或提高黄瓜产量的菌剂；
2)病原菌抑制剂，所述病原菌可为多主棒孢(Corynespora cassiicola)；
3)病害抑制剂，所述病害可为黄瓜棒孢叶斑病。
上述菌剂的活性成分可为上述解淀粉芽孢杆菌和/或上述解淀粉芽孢杆菌的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。
上述菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
上述菌剂可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，上述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
上文中，所述代谢物可从所述解淀粉芽孢杆菌的发酵液中获得。所述代谢物可为所述解淀粉芽孢杆菌的无菌代谢物或所述解淀粉芽孢杆菌的含菌代谢物。所述解淀粉芽孢杆菌的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述解淀粉芽孢杆菌，过滤除去液体培养物(发酵液)中的所述解淀粉芽孢杆菌即得到所述解淀粉芽孢杆菌的无菌代谢物。所述解淀粉芽孢杆菌的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养所述解淀粉芽孢杆菌，收集发酵液，该发酵液即为所述解淀粉芽孢杆菌的含菌代谢物。
本发明还提供了含有上述解淀粉芽孢杆菌或含有上述解淀粉芽孢杆菌和/或上述解淀粉芽孢杆菌的代谢物的菌剂的生物有机肥。
本发明还提供了培养上述解淀粉芽孢杆菌的方法，包括将所述解淀粉芽孢杆菌在用于培养芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
上述方法中，所述培养基可由以下原料制成：果糖、水溶性花生饼粉、磷酸二氢钾和水；所述培养基中果糖的质量百分含量可为1％，所述培养基中水溶性花生饼粉的质量百分含量可为1.7％，所述培养基中磷酸二氢钾的质量百分含量可为0.1％。
所述培养基的pH值可7.0。
所述培养在32℃进行。
所述培养条件可为装液量40mL/250mL三角瓶，接种量6％(体积分数)，转速180r/min。
本发明还提供了上述菌剂的制备方法，可包括如下步骤：将上述解淀粉芽孢杆菌作为活性成分，得到所述菌剂。
上述解淀粉芽孢杆菌或上述含有上述解淀粉芽孢杆菌和/或上述解淀粉芽孢杆菌的代谢物的菌剂在栽培黄瓜中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种栽培黄瓜的方法，包括向栽培黄瓜幼苗喷施上述解淀粉芽孢杆菌或上述含有上述解淀粉芽孢杆菌和/或上述解淀粉芽孢杆菌的代谢物的菌剂。
上述方法中，所述解淀粉芽孢杆菌或所述菌剂的用量可为每亩施入2L或者稀释为菌剂的500倍液-1000倍液，所述菌剂的浓度可为1.6×109cfu/mL，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CGMCC No.24581。
上述解淀粉芽孢杆菌在防治黄瓜棒孢叶斑病和/或提高黄瓜产量中的应用也属于本发明的保护范围。
解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581是一株对黄瓜棒孢叶斑病具有较高活性的生防菌株。本研究通过活体盆栽试验比较了该生防菌株发酵液，上清液，菌体悬浮液对黄瓜棒孢叶斑病的预防及治疗效果；并以防效为指标优化了发酵条件，对该菌株发酵液的促生作用进行了评价。菌株发酵液对黄瓜棒孢叶斑病的治疗及预防效果最好，其次为上清液。CGMCCNo.24581发酵液对黄瓜具有促生效果，增加了黄瓜茎长、根长、叶面积及地上部生物量，叶片中含有更多的叶绿素、生长素和玉米核苷素。菌株发酵过程经过优化，最优培养基为果糖1％、水溶性花生饼粉1.7％、磷酸二氢钾0.1％。最佳发酵条件为：装液量40mL/250mL三角瓶，接种量6％(体积分数)、pH值7.0，转速180r/min，温度32℃，发酵时间24h，优化后CGMCCNo.24581对棒孢叶斑病的防效提升了22.4％。CGMCC No.24581对棒孢叶斑病的防治效果远高于同类生防菌剂，具有广阔的商业化前景。
附图说明
图1为基于16S rDNA序列构建的解淀粉芽孢杆菌YB114与相关菌株的系统发育树。
图2为解淀粉芽孢杆菌YB114菌落形态。
图3为发酵培养基组分对CGMCC No.24581发酵液活性的影响。
图4为发酵条件对CGMCC No.24581的发酵活性影响。
保藏说明
菌种名称：解淀粉芽孢杆菌
拉丁名：Bacillus amyloliquefaciens
菌株编号：YB114
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年3月24日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.24581。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的多主棒孢(Corynespora cassiicola)来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所。
下列实施例中的培养基的原料如下：
菌株活化培养基(LB培养基)：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，其余为水。固体培养基需添加琼脂20g/L。
分离培养采用NA培养基：牛肉膏3g、蛋白胨5g、琼脂粉15g，加水至1000mL。
PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH 7.0。
种子液培养基：山梨醇10g/L、棉籽饼粉17g/L、磷酸二氢钠0.5g/L、磷酸氢二钠0.4g/L,其余为水，pH 7.0。
基础发酵培养基：山梨醇10g/L、棉籽饼粉17g/L、磷酸二氢钠0.5g/L、磷酸氢二钠0.4g/L，其余为水，pH 7.0。
对照杀菌剂：75％百菌清可湿性粉剂(允发化工(上海)有限公司，购自市售)，41.7％氟吡菌酰胺悬浮剂(拜耳股份公司，购自市售)。
植物赤霉素(货号：F5680-A)、生长素(货号：F6269-A)、玉米素核苷试剂盒(货号：F4571-B)：购自北京华博德亿生物技术有限公司。
下述实施例中，黄瓜棒孢叶斑病以整株叶片为单位进行调查，病害分级标准如下：
分级标准：0级：无病斑；
1级：病斑面积占整个叶面积的小于5％；
3级：病斑面积占整个叶面积的的5％-25％；
5级：病斑面积占整个叶面积的大于25％-50％；
7极：病斑面积占整个叶面积的大于50％-75％；
9级：病斑面积占整个叶面积的大于75％。
接种后7-10天，待清水对照充分发病后调查病情，计算防效。根据公式计算病情指数和防治效果。病情指数＝100×[∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)]。防治效果＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
实施例1解淀粉芽孢杆菌YB114 CGMCC No.24581的分离鉴定
1.分离
采集山东寿光市多年连续种植黄瓜的大棚中根际土壤，称取10g土壤样品，使其充分悬浮于90mL无菌水中，将其置于37℃、200r/min摇床上振荡15min，使之充分悬浮，80℃水浴处理10min后梯度稀释至10-3、10-4浓度后，分别吸取100μL悬浮液均匀涂布至NA平板，30℃培养2d，每个处理3次重复。挑取不同形态的细菌菌株进行纯化，并进行菌株编号。对其中菌株编号YB114的菌株(又称菌株YB114)进行鉴定。
2.鉴定
2.1分子生物学鉴定
按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书(天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP302)提取菌株YB114基因组DNA。利用16S rDNA序列通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对菌株基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)：2×Rapid Taq Master Mix 25.0μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，DNA模板0.5μL，ddH2O 23.5μL。PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，35个循环，72℃延伸90s，72℃补充延伸5min。扩增产物由北京博迈德基因技术有限公司进行测序，测序结果经NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站的BLAST功能比对后，以一致性排名最高的结果作为该菌株的初步鉴定结果。
经16S rDNA PCR扩增后，得到了1条1440bp的目的条带，并上传NCBI网站(序列登记号ON705119)。对该序列(序列表中序列1)进行系统发育分析，发现菌株YB114与解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens(LY490850.1)一致性达到99％(图1)。菌株YB114具有核苷酸序列是序列表中序列1的16S rDNA。
2.2菌株YB114培养特征及形态学特征
用LB固体培养基于28℃下培养，菌株YB114菌落呈乳白色，菌落周边不规则、湿润，表面有褶皱(图2)。
菌株YB114在含量大于4％NaCl的培养基上不能生长，最适pH范围为5.0～6.0；能使硝酸盐还原，但不能使明胶液化；可以利用α-D-乳糖、D-果糖、D-蜜二糖、D-葡萄糖、D-半乳糖等大多数碳源，但不能利用葡聚糖、麦芽糖和甘露糖；可以利用天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸作为唯一氮源，不能利用羟基脯氨酸、组氨酸、丝氨酸。
表1菌株YB114的生理生化特征
项目 反应 项目 反应
革兰氏染色反应 + 10％NaCl -
半乳糖 + 吐温-40T -
葡萄糖 + 氧化酶 +
淀粉水解 + 硝酸盐还原 +
醋酸盐 - 脂酶 +
肌醇 + 丙三醇 -
注：+为阳性；-为阴性。
结合16S rDNA、生物学特征观察以及生理生化特征分析，将菌株YB114鉴定为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。
3.解淀粉芽孢杆菌YB114菌株的保藏
解淀粉芽孢杆菌YB114已于2022年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.24581。以下简称解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581。
实施例2解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵液组分对黄瓜棒孢叶斑病的防效评价
2.1解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵液制备
将保存在-80℃冻存管中的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581用接种环以划线的方法接入LB平板上，28℃培养箱活化48h，将活化后的菌株挑取单菌落接入种子液培养基中，28℃，180r/min，振荡培养20h，按2％的接种量接入基础发酵培养基中继续振荡培养24h，收集发酵液。该发酵液中的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581的含量为1.6×109cfu/mL。
2.2发酵液稀释液的制备
将步骤2.1的发酵液分别用无菌水稀释100倍和300倍，分别得到名称为发酵液100×和发酵液300×的液体。
2.3发酵上清液的制备
用移液枪吸取1mL步骤2.1的发酵液于1.5mL的离心管中，4℃，12000r/min离心20min，吸取上清液，分别用无菌水稀释100倍和300倍,分别得到名称为上清液100×和上清液300×的液体。
2.4解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵菌体悬浮液的制备
用移液枪吸取1mL步骤2.1的发酵液于1.5mL的离心管中，4℃，12000r/min离心20min，倒掉上清液，加入等量的无菌水，振荡30s，得到菌悬液，将菌悬液用无菌水稀释100倍和300倍,分别得到名称为菌体液100×和菌体液300×的液体。
2.5黄瓜棒孢叶斑病菌孢子悬浮液的制备
取4℃保存的多主棒孢接种于PDA培养基上，在28℃培养箱中培养5d，在菌落边缘使用5mm打孔器打取菌饼接种于PDA培养中，28℃培养15d，使用含有0.1％的吐温-20蒸馏水将平板内的孢子进行冲洗，双层纱布过滤后配制成浓度为105个孢子/mL悬浮液。
2.6解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581不同组分对黄瓜棒孢叶斑病的防效评价
2021年4月在中国农业科学院蔬菜花卉研究所日光温室进行盆栽防治效果试验，将黄瓜(购自中蔬种业科技(北京)有限公司)种子播于育苗穴盘中，待黄瓜长出两叶一心后进行试验。
解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581预防效果评价方法：分别将上述发酵液100×、发酵液300×、上清液100×、上清液300×、菌体液100×和菌体液300×这6种液体分别喷施于黄瓜叶片上，以喷施浓度为0.125mL/L的41.7％氟吡菌酰胺悬浮剂和清水为对照，均匀喷雾，12h后对所有处理喷施浓度为105个孢子/mL黄瓜棒孢叶斑病菌孢子悬浮液。各个处理间，除了喷施的药物不同外，其它操作完全相同。
每个处理设置三个重复。每个重复15株黄瓜植株。
解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581治疗效果评价方法：先喷施浓度为105个孢子/mL黄瓜棒孢叶斑病孢子悬浮液，12h后分别喷施上述发酵液100×、发酵液300×、上清液100×、上清液300×、菌体液100×和菌体液300×这6种液体，同样以浓度为0.125mL/L的41.7％氟吡菌酰胺悬浮剂和清水为对照。接种后将黄瓜苗放入温度28℃，RH 90％的保湿柜中培养，待清水对照充分发病后调查每个处理发病情况。每个处理设置三个重复。每个重复15株黄瓜植株。
接种后7-10天，待清水对照充分发病后调查病情，计算防效。结果如下表2所示：解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵液，上清液及菌悬液对黄瓜棒孢叶斑病均具有较好的治疗和预防效果，其中发酵液稀释100倍液(发酵液100×)的治疗及预防效果可达85.72％及42.29％，上清液100倍液(上清液100×)的治疗及预防效果可达73.11％及39.91％。各组分治疗效果基本上是预防效果的2倍。不同组分中解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵液100×防效最好，其次为上清液，最后为菌体液。各组分100倍稀释液防治效果均好于300倍稀释液(表2)
表2解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581不同组分对黄瓜棒孢叶斑病的防治效果
Figure BDA0003691429760000081
实施例3解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵液对黄瓜的促生长作用评价
3.1解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵培养
将保存在-80℃冻存管中的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581用接种环以划线的方法接入LB平板上，28℃培养箱活化48h，将活化后的菌株挑取单菌落接入基础发酵培养基中，28℃，180r/min，振荡培养36h。收集发酵液。该发酵液中的解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.24581的含量为1.6×109cfu/mL。
3.2解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581对黄瓜植株生物量及形态学指标的影响
试验于2021年5月22日在中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验温室中进行，将黄瓜种子播种于50孔穴盘中，待黄瓜长出两叶一心后选取长势一致的黄瓜幼苗移栽至直径16cm育苗钵中，将其分为两组，分别喷施步骤3.1的解淀粉芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.24581发酵液(菌浓度1.6×109cfu/mL，每株按照10mL喷施量)及清水。待半个月后对黄瓜长势进行调查，测定株高、根长、地下根重、地上鲜重，螺旋测微器测量黄瓜同一生长位置的叶片厚度，扫描仪(LaserJet Pro MFP M126nw HP公司生产)扫描同一位置的黄瓜叶片，然后利用PS软件计算叶面积。试验设置三个重复。每个重复15株黄瓜植株。
结果如表3所示：喷施解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵液后除黄瓜叶片厚度，叶片重量及黄瓜地下重相较于对照没有显著性差异外，黄瓜的茎长、地上部鲜重、叶片面积、根长等指标均较对照处理显著增加(p<0.05)。经解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵液喷施后，黄瓜茎长增加了29.5％，地上部鲜重增加了32.0％，叶片面积增加了19.3％，根长增加了29.0％。
表3解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.24581发酵液对黄瓜生理指标的影响
Figure BDA0003691429760000091
注：表中数据为平均值±标准差。同列不同字母表示在p<0.05水平差异显著。
3.3解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581对黄瓜光合速率和叶绿素的影响
利用LI-6400便捷式光合仪(LI-COR,Inc.,Lincoln,NE)测定黄瓜叶片的光合速率和水分蒸腾速率。选择同一个植株中相同位置的叶片进行测量。测量的时间是在2021年6月8日的上午10:30～12:00。叶片插入仪器的叶室先稳定5s左右后，再进行测量。每一片叶重复测量10次。仪器的工作条件是CO2的流速为500μmol/s，光照强度为1000μmol m-2s-1。计算瞬时水分利用效率(Instantaneous water-use efficiency,WUEinst)，WUEinst＝A/E，其中A是光合速率，E是水分蒸腾速率。
叶绿素的测量与光合指标的测定是在同一时间段。利用SPAD-502手持叶绿素测定仪(柯尼卡美能达，中国)对叶片SPAD值进行测量。测量的叶片是光合指标测量的同一叶片，选取叶片5个部位进行测量，最后取平均值。每个处理设置三个重复。每个重复15株黄瓜植株。
结果如表4所示：喷施解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵液后黄瓜的光合速率(A)，水分蒸腾速率(E)和瞬时水分利用效率(WUEinst)较对照处理均有一定程度的增高，但差异没有达到显著(表1，p>0.05)。喷施解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵液处理后的黄瓜叶片叶绿素SPAD值较对照处理显著增加，增幅为16.8％(表4，p<0.001)。
表4黄瓜叶片的光合生理指标
Figure BDA0003691429760000092
Figure BDA0003691429760000101
注：表中数据为平均值±标准差。同列不同字母表示在p<0.001水平差异显著。
3.4解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581对黄瓜内源激素水平的影响
选用北京华博德亿生物技术有限公司植物激素试剂盒分别测定黄瓜内源性植物激素赤霉素(GA3)，生长素(IAA)及玉米素核苷(ZR)含量。具体步骤按照试剂盒使用说明书进行。试验设置三个重复。每个重复15株黄瓜植株。
喷施解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.2458发酵液处理后黄瓜叶片中内源激素水平发生不同程度的变化，玉米素核苷(ZR)和生长素(IAA)较CK处理显著增大(p<0.001)，分别增加了41.15％和29.93％，但赤霉素(GA3)显著降低，减少了30.34％(p<0.001)(表5)。
表5解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵液对黄瓜激素水平的影响
处理 玉米核苷素(ng/g) 吲哚乙酸(ng/g) 赤霉素(ng/g)
CK 2.09±0.19a 17.84±2.03a 2.34±0.20a
CGMCC No.24581 2.95±0.20b 23.18±2.50b 1.63±0.11b
变化率(％) 41.15 29.93 -30.34
实施例4解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵条件的优化
4.1解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581培养基组分的优化
通过对解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581培养基发酵组分单因素优化，考察了碳源、氮源及无机盐对CGMCC No.24581上清液抑菌活性的影响。
采用单因子变量法，以1％的乳糖、可溶性淀粉、果糖、蔗糖、糖蜜、玉米粉和糊精代替基础发酵培养基中的山梨醇进行最佳碳源的筛选；以1.7％的氯化铵、水溶性花生饼粉(北京索莱宝科技有限公司，货号：FA0230-500g)、酵母浸粉、蛋白胨代替基础发酵培养基中的棉籽饼粉(北京索莱宝科技有限公司，货号：FA0210-500g)进行最佳氮源的筛选；以0.1％的氯化钾、磷酸二氢钠、硫酸钙、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、硫酸镁代替基础发酵培养基中的磷酸二氢钠、磷酸氢二钠进行最佳无机盐的筛选。
碳源、氮源及无机盐的最佳种类均以添加后的发酵培养上清液对黄瓜棒孢叶斑病的防治效果为依据，参照实施例2中2.6的方法分别测定不同处理条件下的CGMCC NO.24581发酵上清液100×对黄瓜棒孢叶斑病防治效果的影响。
结果见图3，在8类碳源中，以果糖作为碳源时上清液对黄瓜棒孢叶斑病防治效果最高，防效可达68.14％，山梨醇和糊精的防治效果次之，乳糖作为碳源时防效最差，因此选用果糖作为发酵最佳碳源(图3中a)；在5类氮源中，以水溶性花生饼粉作为氮源时防效最佳，可达68.28％，氯化铵的防效次之，以酵母浸粉为氮源时上清液防效最差，所以选用花生饼粉为最佳氮源(图3中b)；在7类不同的无机盐中，以磷酸二氢钾作为无机盐时对黄瓜棒孢叶斑病的防治效果最高，达62.09％,磷酸氢二钾效果次之，硫酸钙防治效果最差，因此选用磷酸二氢钾作为发酵最佳无机盐(图3中c)。
4.2解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵过程的优化
在确立最佳培养基组分的基础上，采用单因子变量，考察了CGMCC NO.24581接种量、发酵培养液初始pH值、发酵时间、发酵温度、装液量、转速对防效的影响。
以1％、2％、3％、4％、5％、6％的接种量进行最佳接种量的筛选；以pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0进行最佳pH值的筛选；以发酵时间20h、24h、28h、32h、36h进行最佳发酵时间的筛选；以摇菌温度24、28、32、36℃进行最佳发酵温度的筛选；在规格为250mL的三角瓶中分别加入20mL、40mL、60mL、80mL、100mL、120mL发酵液，进行最佳装液量的筛选；以转速140、160、180、200r/min进行最佳摇瓶转速的筛选，所有指标的筛选均在前一项筛选的基础上进行。
其中CGMCC No.24581接种量的筛选结果如图4中a所示：当接种量为6％时，防效最高，达76.54％；低于此接种量均不能达到最高防效，原因可能是高菌量使相同时间内发酵液中所产抑菌物质增多，从而更好的抑制黄瓜棒孢叶斑病的发生。
发酵培养液初始pH值的筛选结果如图4中b所示：当发酵液pH值为7.0时，防效最高，达65.49％；酸性条件下CGMCC No.24581上清液的防效明显弱于碱性条件表明该菌株在酸性条件下所产抑菌物质能力可能受到抑制。
摇瓶发酵时间的筛选结果如图4中c所示：在发酵时间20-24h的时间段，随着发酵时间的增加，发酵上清液的防治效果逐渐增强，并在24h达到最高，此时防效为77.41％，此后菌株防效开始出现随发酵时间延长逐渐下降的趋势。可能是由于长时间的发酵使得培养基中营养成分消耗过大，对菌株次级代谢物的产生不利。
摇瓶发酵温度的筛选结果如图4中d所示：当发酵温度为32℃时有最高防效，达76.34％。发酵温度低于32℃时，菌株防效随温度升高而增大；当发酵温度大于32℃时，防治效果显著降低。原因可能为前期温度逐渐升高，细菌代谢活动得到增强从而产生了更多的抑菌物质，而一旦温度过高，细菌的代谢活动会随之下降，亦不利于抑菌代谢物的产生。
摇瓶装液量的筛选结果如图4中e所示：CGMCC No.24581摇培时的溶氧量由发酵转速及装液量共同决定，当装液量为250mL规格三角瓶加入40mL发酵液时，该菌株防治多主棒孢叶斑病的效果最高，达55.92％，低于或高于此装液量时都不能达到最佳防效。
摇瓶转速的筛选结果如图4中f所示：当发酵转速为180r/min时防治效果达到最高，达86.65％；当转速继续增加达200r/min时，防治效果明显降低，这可能是由于转速过高导致菌体细胞壁破裂，从而影响了抑菌活性物质的产生。
4.5发酵条件优化后CGMCC No.24581上清液对黄瓜棒孢叶斑病的防治效果
用优化前的培养条件和优化后的培养条件分别培养CGMCC NO.24581，获得的CGMCC NO.24581的发酵上清液对黄瓜棒孢叶斑病的防效分别为41.25％和50.51％(表6)，培养基优化后提高防效22.4％。
表6解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581发酵工艺前后上清100X液活体防效对比
编号 处理 病情指数 防效(％)
1 发酵优化前上清液100× 53.79±4.69 41.25±5.12
2 发酵优化后上清液100× 45.30±2.63 50.51±2.88
3 75％百菌清可湿性粉剂1000× 15.50±1.80 83.07±1.96
4 清水对照 91.55 -
实施例5解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581与同类商品化生防菌剂防治棒孢叶斑病的效果比较
为了评价解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581与同类生防菌剂防治棒孢叶斑病效果差异，采用盆栽试验的方式进行效果评价比较。盆栽试验具体步骤如下：
将4℃保存的黄瓜棒孢叶斑病菌活化，在无菌操作台内打孔，接种于PDA平板上，放真菌培养室培养15天后。用纯净水加入0.1％的吐温20刷下孢子调浓度为1×105接种，接种24h后，解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581稀释500倍喷施黄瓜叶片，其他对照生防菌剂按照表7使用倍数稀释，使用方法同解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581，以接种病原菌后叶面喷施清水为清水对照，另设不接种病原菌，直喷施清水为健康对照。
表7各处理及供试材料来源
Figure BDA0003691429760000121
利用SPSS 20.0(IBM Corporation,USA)进行方差分析，p<0.05时被认为差异显著。经过盆栽试验测定发现(如表8所示)，解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581的防效为76.5％，仅低于化学杀菌剂75％百菌清可湿性粉剂(91.5％)，高于其他同类生防菌剂：10亿活芽孢/g解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂(防效48.5％)、10亿CFU/g解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂(防效49.5％)、1000亿/g解淀粉芽孢杆菌可湿性粉剂(防效64.1％)，100亿孢子/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(防效18.4％)、1000亿/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂(防效40.5％)和5亿芽孢/g荧光假单孢杆菌可湿性粉剂(68.2％)，在防治棒孢叶斑病上具有广阔商业化前景。
表8解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.24581与同类登记生防菌剂生防效果比较
Figure BDA0003691429760000131
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 一株解淀粉芽孢杆菌及其在防治黄瓜棒孢叶斑病上的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）
<400> 1
gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg 60
tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatggt 120
tgtctgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc 180
cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac 240
ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300
cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga 360
aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc aaatagggcg 420
gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct 540
taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt 600
gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 660
gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg 720
gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 780
tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 840
cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 900
ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaatccta 960
gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1020
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc 1080
attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140
tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag 1200
ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt 1260
ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1320
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1380
agtcggtgag gtaaccttta tggagccagc cgccgaaggt gggacagatg attggggtga 1440

Claims (10)

1.解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)CGMCC No.24581，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24581。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌和/或所述解淀粉芽孢杆菌的代谢物；
所述菌剂为病原菌抑制剂或病害抑制剂，所述病原菌为多主棒孢(Corynesporacassiicola)，所述病害为黄瓜棒孢叶斑病。
3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在制备下述1)-3)中任一的产品中的应用：
1)用于防治黄瓜棒孢叶斑病和/或提高黄瓜产量的菌剂；
2)病原菌抑制剂，所述病原菌为多主棒孢(Corynespora cassiicola)；
3)病害抑制剂，所述病害为黄瓜棒孢叶斑病。
4.生物有机肥，其特征在于：所述生物有机肥含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂。
5.培养权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的方法，包括将所述解淀粉芽孢杆菌在用于培养芽孢杆菌的培养基中培养的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述培养基由以下原料制成：果糖、水溶性花生饼粉、磷酸二氢钾和水；所述培养基中果糖的质量百分含量为1％，所述培养基中水溶性花生饼粉的质量百分含量为1.7％，所述培养基中磷酸二氢钾的质量百分含量为0.1％。
7.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌作为活性成分，得到所述菌剂。
8.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂在栽培黄瓜中的应用。
9.栽培黄瓜的方法，包括向栽培黄瓜幼苗喷施权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂。
10.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在防治黄瓜棒孢叶斑病和/或提高黄瓜产量中的应用。
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