CN103667083B - 一种枝顶孢霉、其培养方法及其在制备根结线虫杀虫剂孢子原粉中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种枝顶孢霉、其培养方法及其在制备根结线虫杀虫剂孢子原粉中的应用。目前，采用以生物防治为核心的无公害可持续治理方法成为控制根结线虫病害主要方向。本发明取枝顶孢霉JXC224，接种于液体发酵培养基中，得到种子液，按质量比为10%的接种量接入固体培养基中，制成固体发酵物，把固体发酵物干燥至水份低于15%，吸尘粉碎机粉碎，振动筛上分筛，得枝顶孢霉菌JXC224孢子原粉作为根结线虫杀虫剂。本发明提供一种含有对根结线虫有侵染、灭杀生物防治作用的枝顶孢霉孢子的微生物杀虫剂孢子原粉，可用于农业设施蔬菜水果种植过程中危害严重的根结线虫病害的生物防治，对辣椒、西红柿和黄瓜等根结线虫的防治效果可达93%以上。

Description

一种枝顶孢霉、其培养方法及其在制备根结线虫杀虫剂孢子原粉中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枝顶孢霉、其培养方法及其在制备根结线虫杀虫剂孢子原粉中的应用。

背景技术

根结线虫为植物根系专性内寄生动物，是世界性威胁农业生产的主要病原物。据有关研究证实，根结线虫寄主已超过3000种植物，分属114科，包括单子叶植物，双子叶植物，草本植物和禾本科植物。该病害发生会引起严重农作物产量损失，一般造成减产10%～20%，严重的可达75%以上。据不完全统计，线虫危害使世界农业平均每年减产24.5%，所造成农作物经济损失约在1000亿美元。在我国，根结线虫在大部分地区均有发生，侵染作物达百种以上，如水稻、花生、香蕉、柑橘、烟草、甘薯、大豆、棉花、西瓜、马铃薯以及花卉、果树、中药材等，给我国农业生产带来极大损失。在我国该病害致使寄主作物常年减产13～25%，严重时可达70%以上，严重制约了我国蔬菜、果品、花卉等作物的生产和出口创汇，我国农作物每年因根结线虫的危害而遭受的经济损失达数亿元。

陕西于2000年首次发现根结线虫病害，现已在陕西的陕北、陕南及关中地区的不同作物上发现此病害，侵害作物包括设施蔬菜、水果、药用植物、农作物等。研究表明，在陕西一般设施棚室当年发生根结线虫病害引起黄瓜减产5％左右，第2年减产10％～15％，第3年减产20％～30％，4年以上减产超过50％，甚至绝收。除直接侵染危害外，根结线虫还和其它病原物造成复合侵染，使作物病害加重，给陕西农业生产带来了极大的危害。

农作物根结线虫病害防治目前有多种方法，但大多效果不太理想。采用田间轮作和使用非寄主植物或抗病植物是防治根结线虫的主要管理措施，但其具有一定局限性，如大多数根结线虫种类具有较广的寄主范围，同时，田间病源根结线虫种群大部分是几个种的混合群体，防治效果难以持续。此外，化学杀线虫剂如溴甲烷、必速杀、克线磷、呋喃丹、阿维菌素等曾被广泛地使用，并且获得过一定效果，但易造成土壤环境污染，蔬菜残毒超标等影响品质甚至销售。其他措施如日晒、淹水，使用无病苗木、土壤改良在某些情况下虽能取得一些防治效果，但效果甚微或有较大的局限性。因此，采用以生物防治为核心的无公害可持续治理方法成为控制根结线虫病害主要方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种枝顶孢霉（Acremoniumsp.）JXC224、其培养方法及其在制备根结线虫杀虫剂孢子原粉中的应用，从而提供了一种控制根结线虫病害的、以生物防治为核心的无公害可持续方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种枝顶孢霉JXC224，其特征在于：

所述的枝顶孢霉JXC224于2013年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.7457。

所述的枝顶孢霉JXC224的18SrDNA序列为SEQIDNo.1。

一种枝顶孢霉JXC224的培养方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：将液体发酵培养基在121℃的温度条件下灭菌30分钟后，接种枝顶孢霉JXC224，28℃±1℃，180转/分钟振荡幅度培养3天，制得种子液；

步骤二：另将7L步骤一所述的液体发酵培养基置于10L的发酵罐中，将步骤一获得的种子液按体积比15%的接种量接种于液体发酵培养基中，28℃±1℃，搅拌150转/分钟，控制溶氧0.20-0.28M³/M³·min，液体深层发酵72小时，制得种子母液；

步骤三：将步骤二的种子母液按质量比10%的接种量接种于固体培养基中，28±1℃，固体浅层发酵7~10天。

步骤一中，液体发酵培养基的配方为：

胶体几丁质1.0-2.0g，葡萄糖0-1.0g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钙0.2g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.5g，定容于1.0L水。

步骤三中，固体培养基的配方为：

麦麸80-100g，糙米500g，硝酸钠0.3~0.6g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.05~0.1g，氯化钠0.05~0.1g，硫酸铁0.0001~0.0002g，蔗糖2.0-4.0g，加水500g。

一种枝顶孢霉JXC224在制备根结线虫杀虫剂孢子原粉中的应用。

所述根结线虫杀虫剂孢子原粉的制备方法由以下步骤实现：

步骤一：将液体发酵培养基在121℃的温度条件下灭菌30分钟后，接种枝顶孢霉JXC224，28℃±1℃，180转/分钟振荡幅度培养3天，制得种子液；

步骤二：另将7L步骤一所述的液体发酵培养基置于10L的发酵罐中，将步骤一获得的种子液按体积比15%的接种量接种于液体发酵培养基中，搅拌150转/分钟，控制溶氧0.20-0.28M³/M³·min，液体深层发酵72小时，制得种子母液；

步骤三：将步骤二的种子母液按质量比10%的接种量接种于固体培养基中，28±1℃，固体浅层发酵7~10天；

步骤四：把步骤三得到的固体发酵物干燥至水分低于15%，将干燥好的培养物用筛孔为149μm的吸尘粉碎机粉碎，并置于孔径为149μm振动筛上分筛，制得根结线虫杀虫剂孢子原粉。

步骤一中，液体发酵培养基的配方为：

胶体几丁质1.0-2.0g，葡萄糖0-1.0g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钙0.2g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.5g，定容于1.0L水。

步骤三中，固体培养基的配方为：

麦麸80-100g，糙米500g，硝酸钠0.3~0.6g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.05~0.1g，氯化钠0.05~0.1g，硫酸铁0.0001~0.0002g，蔗糖2.0-4.0g，加水500g。

本发明具有以下优点：

本发明提供了一种含有对根结线虫有侵染、灭杀生物防治作用的枝顶孢霉孢子的微生物杀虫剂孢子原粉，可用于农业设施蔬菜水果种植过程中危害严重的根结线虫病害的生物防治，本发明与现有同类技术相比，优点是：

（1）本根结线虫生防杀虫剂孢子原粉主要用于蔬菜水果种植的设施棚室，因其环境条件如温度、湿度可控，有利于生防杀虫剂孢子原粉中微生物孢子的萌发、繁殖；

（2）本生防杀虫剂孢子原粉采用根部洒施使用方法，能在最短时间内在病害植株根部土壤定植，利于发挥侵染、灭杀作用。

（3）本生防杀虫剂孢子原粉使用粉状几丁质为诱导剂，可以诱导杀虫剂中的微生物产生几丁质酶，几丁质是根结线虫虫卵、虫体的成份，孢子原粉中微生物通过产几丁质酶，酶解虫体、虫卵外壁完成对根结线虫的侵染。

（4）本杀虫剂孢子原粉采用的是液固双相发酵工艺生产，前工艺种子、种母生产采用液体深层发酵，确保纯种发酵并利于菌丝萌发，后工艺孢子原粉生产采用利于孢子生长、便于粉碎及筛分、成本低廉的固体发酵工艺。

（5）本杀虫剂孢子原粉符合国家微生物农药组成不得添加化学成分农药的有关质量指标要求。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。

一、枝顶孢霉JXC224的分离、筛选、纯化和培养：

本发明所涉及的枝顶孢霉（Acremoniumsp.）JXC224于2013年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.7457。

菌种枝顶孢霉（Acremoniumsp.）JXC224的分离样品来源于西安市未央区高桥乡爆发根结线虫病的设施蔬菜大棚，无菌法采集西红柿根结线虫发病植株的根部样品。采用梯度稀释涂布法和孟加拉红培养基（0.5%蛋白胨，1%葡萄糖，0.1%磷酸二氢钾，0.05%硫酸镁，孟加拉红0.0014%，琼脂1.7%，水余量）分离样品中的本源微生物，挑选典型菌种进行划线纯化并收集保存，作为下步筛选根接线虫病害防治菌种。

将收集菌种利用几丁质选择性培养基（磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，氯化钙0.02%，氯化钠0.02%，胶体几丁质0.2%，以蒸馏水定容，调整pH为7.0）进行培养，测定菌种几丁质酶活指标，选择生物量大、酶活高的菌种做线虫致死实验，筛选出根接线虫致死率最高的生防菌种JXC224。将菌种JXC224接种于受根结线虫病害侵染的黄瓜植株根部进行定殖诱导驯化，选育得到编号为JXC224的专利菌种。

二、枝顶孢霉JXC224的菌种鉴定：

枝顶孢霉JXC224适合生长温度12-35℃，约5-7天产孢。进行形态观察鉴定：菌落表面疏松、外观似毡状、辐射状沟纹，菌丝白色、菌丝顶端生球形分生孢子，孢子无色。

分子生物学鉴定：用真菌微生物基因组提取试剂盒按照说明书操作提取菌种的DNA，使用18SrDNA的通用引物（ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行的菌种JXC224基因PCR扩增。然后将克隆基因送北京华大基因科技公司测序，将所测得序列在NCBI数据库中用Megablast软件进行相似性搜索，选取其中相似性较高的序列构建系统进化树。在培养特征、显微形态分类鉴定的基础上，确定菌种JXC224分类地位为枝顶孢霉Acremoniumsp.，将序列上传GeneBanK注册获得注册号HQ214631。

枝顶孢霉（Acremoniumsp）JXC224的18SrDNA序列为SEQIDNo.1：

tggacgtaactcctgaccattgtgaacctaccactgttgcttcggcggcctcgccccgggcgcgttcgcgcggcccggacccaggcgtccgccggaggctccaaactcttgtcttttagtgtatttctgagtggcataagcaaataaatcaaaactttcagcaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcaaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtctgagcgtcatttcaaccctcaggacccgttcgcgggacctggcgttggggatcagcctgcccctggcggcggctggccctgaaatccagtggcggttccctcgcgaactcctccgtgcagtaattaaacctctcgcggcaggatagcggttgaaccacgccgttaaaccccccacttctcaaggttgacctcagatcaggtag

三、枝顶孢霉JXC224在制备根结线虫杀虫剂孢子原粉中的应用：

根结线虫杀虫剂孢子原粉的制备方法，由以下步骤实现：

步骤一：将液体发酵培养基在121℃的温度条件下灭菌30分钟后，接种枝顶孢霉JXC224，28℃±1℃，180转/分钟振荡幅度培养3天，制得种子液。

步骤一中，液体发酵培养基的配方为：

胶体几丁质1.0-2.0g，葡萄糖0-1.0g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钙0.2g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.5g，定容于1.0L水。

步骤二：另将7L步骤一所述的液体发酵培养基置于10L的发酵罐中，将步骤一获得的种子液按体积比15%的接种量接种于液体发酵培养基中，搅拌150转/分钟，控制溶氧0.20-0.28M³/M³·min，液体深层发酵72小时，制得种子母液。

步骤三：将步骤二的种子母液按质量比10%的接种量接种于固体培养基中，28±1℃，固体浅层发酵7~10天。

步骤三中，固体培养基的配方为：

麦麸80-100g，糙米500g，硝酸钠0.3~0.6g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.05~0.1g，氯化钠0.05~0.1g，硫酸铁0.0001~0.0002g，蔗糖2.0-4.0g，加水500g。

步骤四：把步骤三得到的固体发酵物干燥至水分低于15%，将干燥好的培养物用筛孔为149μm的吸尘粉碎机粉碎，并置于孔径为149μm振动筛上分筛，制得根结线虫杀虫剂孢子原粉。

实施例1：

根结线虫杀虫剂孢子原粉，由以下方法制备得到：

（1）液体培养：

称取胶体几丁质2.0g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钙0.2g、氯化钠0.2g、硫酸镁0.5g，溶于1000ml蒸馏水，制得液体发酵培养基，调节pH为7.0，按照每瓶100ml分装于500ml三角瓶中，121℃，30min灭菌后，挑取接种枝顶孢霉JXC224，保持27℃，180转/分钟振荡幅度培养3天，制成种子液。

另将7L上述的液体发酵培养基置于10L的发酵罐中，将种子液按15%体积比例接种于液体发酵培养基，调节pH为7.0，121℃，30min灭菌，保持27℃，搅拌150转/分钟，控制溶氧0.20M³/M³·min，液体深层发酵72小时，得种子母液。

所述胶体几丁质通过下述方法制得：将10份细粉几丁质溶于100份浓盐酸中，搅拌均匀，于4℃放置24h，然后取浓盐酸100份研磨均匀，加入500份体积浓度为50%的乙醇搅拌，离心4000r/min，10min除去上清液，再加入蒸馏水搅拌后4000r/min，10min离心除去上清液，重复加水搅拌离心至上清液为pH7.0，即得胶体几丁质。

（2）固体培养：7L液体种母液按照10%重量体积接种于重量配比为糙米35kg，麦麸7kg，硝酸钠21g，磷酸二氢钾7g，硫酸镁3.5g，氯化钠3.5g，硫酸铁0.007g，几丁质3.5g，蔗糖140g，用35L蒸馏水搅拌均匀，经过121℃，30min灭菌的固体培养基中，再分装入700mm（长）×350mm（宽）×150mm（高）的木制带筛底座的浅盘中，或装入脉冲式固体发酵机中，保持27℃固体发酵10天，获得枝顶孢霉JXC224孢子数达1.8×10¹⁰个·g^-1的发酵物。

（3）粉碎：用抽风除湿方式把固体发酵物干燥至水份低于15%，将干燥好的培养物用破碎机破碎结块后，用筛孔为149μm的吸尘式粉碎机粉碎，并置于孔径为149μm振动筛上分筛20min，筛下物即为枝顶孢霉JXC224孢子数达2.0×10¹⁰个·g^-1的孢子原粉。

在发生根结线虫的辣椒大棚中，本发明使用量为75kg/hm²，固体洒施于地表，然后翻埋至20cm的土壤中，施后3天内勿浇水，然后按照常规进行种植管理。辣椒根结线虫的防治效果可达93%。

实施例2：

一种根结线虫生防杀虫剂孢子原粉，由以下方法制备得到：

（1）液体培养：

称取胶体几丁质1.0g、葡萄糖1.0g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钙0.2g、氯化钠0.2g、硫酸镁0.5g，溶解于1000ml蒸馏水，制得液体发酵培养基，调节pH为7.0，按照每瓶100ml分装于500ml三角瓶中，121℃，30min灭菌后，挑取接种枝顶孢霉JXC224，保持28℃，180转/分钟振荡幅度培养3天，制成种子液。

另将7L上述的液体发酵培养基置于10L的发酵罐中，将种子液按15%体积比例接种于液体发酵培养基，调节pH为7.0，经121℃，30min灭菌，保持28℃，搅拌150转/分钟，控制溶氧0.24M³/M³·min，液体深层发酵72小时，得种子母液。

所说的胶体几丁质通过下述方法制得：将10份细粉几丁质溶于100份浓盐酸中，搅拌均匀，于4℃放置24h，然后取浓盐酸100份研磨均匀，加入500份体积浓度为50%的乙醇搅拌，离心4000r/min，10min,除去上清液，再加入蒸馏水洗涤离心，重复洗涤离心至pH7.0制备获得。

（2）固体培养：将此7L液体种母液按照10%重量体积接种于重量配比为糙米35kg，麦麸6.3kg，硝酸钠42g，磷酸二氢钾7g，硫酸镁7g，氯化钠7g，硫酸铁0.014g，几丁质35g，蔗糖280g，用35kg蒸馏水搅拌均匀，经过121℃，30min灭菌的固体培养基中，再分装入700mm（长）×350mm（宽）×150mm（高）的木制带筛底座的浅盘中，或装入脉冲式固体发酵机中，保持28℃±1℃固体发酵7天，获得枝顶孢霉JXC224孢子数达1.8×10¹⁰个·g^-1的发酵物。

（3）粉碎：用抽风除湿方式把固体发酵物干燥至水份低于15%，将干燥好的培养物用破碎机破碎结块后，用筛孔为149μm的吸尘式粉碎机粉碎，并置于孔径为149μm振动筛上分筛20min，筛下物即为枝顶孢霉JXC224孢子数达2.0×10¹⁰个·g^-1的孢子原粉。

在发生根结线虫的西红柿大棚中进行试验，本发明使用量为150kg/hm²，在西红柿定植时，结合整地与有机肥一起均匀穴施在栽移坑中，然后按照常规进行种植管理。西红柿根结线虫的防治效果可达96%。

实施例3：

一种根结线虫生防杀虫剂孢子原粉，由以下方法制备得到：

（1）液体培养：

称取胶体几丁质1.5g、葡萄糖0.5g、磷酸二氢钾1.0g、氯化钙0.2g、氯化钠0.2g、硫酸镁0.5g，定溶于1000ml蒸馏水，制得液体发酵培养基，调节pH为7.0，按照每瓶100ml分装于500ml三角瓶中，121℃，30min灭菌后，挑取接种枝顶孢霉JXC224，保持29℃，180转/分钟振荡幅度培养3天，制成种子液。

另将7L上述的液体发酵培养基置于10L的发酵罐中，将种子液按15%体积比例接种于液体发酵培养基，调节pH为7.0，经121℃，30min灭菌，保持29℃，搅拌150转/分钟，控制溶氧0.28M³/M³·min，液体深层发酵72小时，得种子母液。

所说的胶体几丁质通过下述方法制得，将10份细粉几丁质溶于100份浓盐酸中，搅拌均匀，于4℃放置24h，然后取浓盐酸100份研磨均匀，加入500份体积浓度为50%的乙醇搅拌，离心4000r/min，10min,除去上清液，再加入蒸馏水洗涤离心，重复洗涤离心至pH7.0制备获得。

（2）固体培养：将此7.0L液体种母液按照10%重量体积接种于重量配比为糙米35kg，麦麸6kg，硝酸钠35g，磷酸二氢钾7g，硫酸镁7g，氯化钠7g，硫酸铁0.007g，几丁质7g，蔗糖280g，用35kg蒸馏水搅拌均匀，经过121℃，30min灭菌的固体培养基中，再分装入700mm（长）×350mm（宽）×150mm（高）的木制带筛底座的浅盘中，或装入脉冲式固体发酵机中，保持28℃±1℃固体发酵7天，获得枝顶孢霉JXC224孢子数达1.8×10¹⁰个·g^-1的发酵物。

（3）粉碎：用抽风除湿方式把固体发酵物干燥至水份为13%，将干燥好的培养物用破碎机破碎结块后，用筛孔为149μm的吸尘式粉碎机粉碎，并置于孔径为149μm振动筛上分筛20min，筛下物即为枝顶孢霉JXC224孢子数达2.0×10¹⁰个·g^-1的孢子原粉。

在发生根结线虫的黄瓜大棚中进行试验，本发明使用量为120kg/hm²，在黄瓜定植时，结合整地与有机肥一起均匀穴施在栽移坑中，然后按照常规进行种植管理。黄瓜根结线虫的防治效果可达95%。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCELISTING

<110>陕西省微生物研究所

<120>一种枝顶孢霉、其培养方法及其在制备根结线虫杀虫剂孢子原粉中的应用

<130>2013

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>500

<212>DNA

<213>枝顶孢霉（Acremoniumsp）JXC224

<400>1

tggacgtaactcctgaccattgtgaacctaccactgttgcttcggcggcctcgccccggg60

cgcgttcgcgcggcccggacccaggcgtccgccggaggctccaaactcttgtcttttagt120

gtatttctgagtggcataagcaaataaatcaaaactttcagcaacggatctcttggttct180

ggcatcgatgaagaacgcagcaaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaa240

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gttgacctcagatcaggtag500

Claims (2)

1.一种枝顶孢霉JXC224的培养方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：将液体发酵培养基在121℃的温度条件下灭菌30分钟后，接种枝顶孢霉JXC224，28℃±1℃，180转/分钟振荡幅度培养3天，制得种子液；

所述枝顶孢霉JXC224的保藏编号为CGMCCNO.7457；

所述液体发酵培养基的配方为：

胶体几丁质1.0-2.0g，葡萄糖0-1.0g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钙0.2g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.5g，定容于1.0L水；

步骤二：另将7L步骤一所述的液体发酵培养基置于10L的发酵罐中，将步骤一获得的种子液按体积比15%的接种量接种于液体发酵培养基中，28℃±1℃，搅拌150转/分钟，控制溶氧0.20-0.28M³/M³·min，液体深层发酵72小时，制得种子母液；

步骤三：将步骤二的种子母液按质量比10%的接种量接种于固体培养基中，28±1℃，固体浅层发酵7~10天；

所述固体培养基的配方为：

麦麸80-100g，糙米500g，硝酸钠0.3~0.6g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.05~0.1g，氯化钠0.05~0.1g，硫酸铁0.0001~0.0002g，蔗糖2.0-4.0g，加水500g。

2.一种枝顶孢霉JXC224制备根结线虫杀虫剂孢子原粉的方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：将液体发酵培养基在121℃的温度条件下灭菌30分钟后，接种枝顶孢霉JXC224，28℃±1℃，180转/分钟振荡幅度培养3天，制得种子液；

所述枝顶孢霉JXC224的保藏编号为CGMCCNO.7457；

所述液体发酵培养基的配方为：

胶体几丁质1.0-2.0g，葡萄糖0-1.0g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钙0.2g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.5g，定容于1.0L水；

步骤二：另将7L步骤一所述的液体发酵培养基置于10L的发酵罐中，将步骤一获得的种子液按体积比15%的接种量接种于液体发酵培养基中，搅拌150转/分钟，控制溶氧0.20-0.28M³/M³·min，液体深层发酵72小时，制得种子母液；

步骤三：将步骤二的种子母液按质量比10%的接种量接种于固体培养基中，28±1℃，固体浅层发酵7~10天；

所述固体培养基的配方为：

麦麸80-100g，糙米500g，硝酸钠0.3~0.6g，磷酸二氢钾0.1g，硫酸镁0.05~0.1g，氯化钠0.05~0.1g，硫酸铁0.0001~0.0002g，蔗糖2.0-4.0g，加水500g；

步骤四：把步骤三得到的固体发酵物干燥至水分低于15%，将干燥好的培养物用筛孔为149μm的吸尘粉碎机粉碎，并置于孔径为149μm振动筛上分筛，制得根结线虫杀虫剂孢子原粉。