NL8003591A

NL8003591A - Werkwijze voor het bereiden van mildiomycine.

Info

Publication number: NL8003591A
Application number: NL8003591A
Authority: NL
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1979-06-21
Filing date: 1980-06-20
Publication date: 1980-12-23
Also published as: IT8067976A0; FR2459288A1; US4334022A; IT1129094B; DE3022723C2; GB2053214B; DE3022723A1; IN151859B; GB2053214A; CH647258A5; JPS565100A; FR2459288B1; JPS5933358B2

Description

.__S 4001-225 P & C

Werkwijze voor het bereiden van mildiomycine.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van mildiomycine. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het bereiden van mildiomycine door kweken van een mildio-mycine-vormend micro-organisme, behorend tot de Actinomycetes, in een kweek-5 medium onder vorming en ophoping van mildiomycine in de kweekbouillon, welke werkwijze tot kenmerk dat ten minste één N-methylverbinding in het kweek-medium aanwezig is.

Mildiomycine is een antibiotisch materiaal dat ook wel wordt aangeduid als "Antibioticum B-98891"; sinds deze verbinding het eerst werd ontdekt, 10 zijn zijn eigenschappen bestudeerd en is de chemische struktuur (die is weergegeven op het bijgevoegde formuleblad) bepaald.

De aandacht van aanvraagster is gevallen op de werkzaamheid van deze verbinding, in het bijzonder de werkzaamheid als middel voor het voorkomen en behandelen van meeldauw bij een grote verscheidenheid van planten, en 15 als miticide.middel[Amerikaans octrooischrift 4.007.267, Brits octrooischrift 1.507.193 en "Journal of Antibiotics", Vol. 31, No.“6, bladzijden 511-518, 519-524 (1978)].

Bij het onderzoek naar het bereiden van mildiomycine in commerciële hoeveelheden tegen lage kosten, is gebleken dat een aanzienlijke hoeveel-20 heid mildiomycine kan worden verkregen in aanwezigheid van een N-methylver-binding in het kweekmedium bij het kweken van een Actinomycetes die mildiomycine kan vormen. De uitvinding heeft derhalve betrekking op een werkwijze voor het bereiden van mildiomycine, welke werkwijze tot kenmerk heeft dat men een tot de Actinomycetes behorend micro-organisme, dat het vermogen be-25 zit mildiomycine te vormen, kweekt in een kweekmedium dat een N-méthylver-binding bevat in een hoeveelheid van ten minste 3mM onder vorming en ophoping van mildiomycine in de kweekbouillon.

Voorbeelden van volgens de onderhavige werkwijze toegepaste Actino-mycetes-micro-organismen die mildiomycine kunnen vormen, zijn Actinomycetes 30 die behoren tot het genus Streptoverticillium, in het bijzonder Streptoverticillium rimofaciens FERM-P 2549 (IPO 13592, ATCC 31120). Dit organisme was oorspronkelijk geïdentificeerd als Streptomyces rimofaciens volgens de classificatie-criteria die beschreven worden in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7e druk (Amerikaans octrooischrift 4.007.267 en Brits octrooischrift 35 1.507.193), maar gezien de latere modificaties van classificatie-criteria is het bovengenoemde micro-organisme geïdentificeerd als behorend tot het genus Streptoverticillium volgens de claasificatie-criteria die beschreven worden in de 8e druk van "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 800 35 91

V

- 2 - (1974)(Journal of Antibiotics, Vol. 31, No. 6, bladzijden 511-518).

De N-methylverbindingen die volgens de uitvinding kunnen worden toegepast, zijn die waarin ten minste één stikstofatoom 1-4 methylgroepen als substituent(en) bevat. Van deze verbindingen wordt de voorkeur gegeven aan 5 die waarin één stikstofatoom methylgroepen als substituenten bevat; in het bijzonder wordt de voorkeur gegeven aan kwaternaire ammoniumzouten met een trimethylammoniogroep, waarin het stikstofatoom 3 methylgroepen als substituenten bevat (-N+(CH^). Verder kunnen als N-methylverbindingen ook verbindingen worden gebruikt met een groep die in het kweekmedium kan worden 10 omgezet in een ^.N-CH^ groep, bijv. Ν,Ν-methyleenbisacrylamide. De N-methylverbindingen bezitten in het algemeen een molecuulgewicht van circa 500-1000, bij voorkeur van 70-200 en nog meer bij voorkeur van 90-130. De N-methylverbindingen kunnen oplosbaar of onoplosbaar in water zijn, maar de voorkeur wordt gegeven aan N-methylverbindingen die in water oplosbaar zijn. Voor-15 beelden van deze N-methylverbindingen zijn N-methyl-zuuramiden, N-methyl-aminoverbindingen, N-methylaminen, N-methylammoniumverbindingen, polymethy-leendiaminen, Ν,Ν-methyleenbisacrylamide, enz. Voorbeelden van geschikte N-methyl-zuuramiden zijn Ν,Ν-dimethylaceetamide, N-methylacrylamide, enz; voorbeelden van geschikte N-methylaminoverbindingen zijn N-methylureum, 20 1,1,3,3-tetramethylureum, 2-dimethylaminoethanol e.d.; voorbeelden van geschikte N-methylaminen zijn trimethylamine, dimethylamine e.d.; voorbeelden van geschikte N-methylammoniumverbindingen zijn lecithine, choline, betaine, tetramethylammonium, ethyleenbis(trimethylammonium)chloride e.d.; voorbeelden van geschikte polymethyleendiaminen zijn ethyleendiamine, tetramethyleen-25 diamine, hexamethyleendiamine e.d. Bevredigende resultaten kunnen worden verkregen met N-methylammoniumverbindingen, in het bijzonder choline, betaine of tetramethylammonium. Men kan deze N-methylverbindingen alleen of als mengsel van twee of meer verbindingen gebruiken. De uitvinding verschaft tevens een werkwijze volgens welke men een grote hoeveelheid van een N-30 methylverbinding bevattend materiaal, bijv. betaine bevattende geslagen melasse, lecithine bevattend sojameel of zowel choline als lecithine bevattend kippeëi, toevoegt aan een kweekmedium ter verschaffing van meer dan 3mM..N-methylverbinding aan het medium. De concentratie van de N-methylver-binding in het kweekmedium kan geschikt gekozen worden in het trajekt dat 35 de groei van het gebruikte micro-organisme niet remt; deze concentratie wordt ingesteld op een waarde van ten minste'3 mM. Bij voorkeur bedraagt de concentratie 4-200 mM en nog meer bij voorkeur 7-50 mM; bij een concentratie die meer dan 200 mM bedraagt, is het effekt, dat verkregen wordt door toevoeging van N-methylverbindingen, niet zo opmerkelijk als het effekt 800 35 91 - 3 - dat verkregen wordt met een hoeveelheid van minder dan 200 mM.

De hoeveelheid natuurlijk voorkomende materialen die M-methyl-verbindingen bevatten, kan zodanig gekozen worden dat de bovengenoemde concentratie van de N-methylverbinding verschaft wordt, maar een dergelijke 5 concentratie zou een grotere hoeveelheid natuurlijk voorkomende materialen 1 dan de gebruikelijke vereisen, waardoor de groei van het micro-organisme nadelig kan worden beïnvloed door andere bestanddelen van het natuurlijk voorkomende materiaal dan de N-methylverbinding, waardoor de vorming van mildiomycine voorkomen zou kunnen worden, in deze gevallen verdient het 10 de voorkeur N-methylverbindingen in combinatie met de natuurlijk voorkomende materialen toe te passen. Het tijdstip waarop de N-methylverbinding in het kweekmedium wordt opgenomen, ligt bij voorkeur vóór het enten van het kweekmedium met het micro-organisme wegens het gemak en de doelmatigheid van deze methode, maar de N-methylverbinding kan ook op een 15 geschikt tijdstip tijdens het kweken worden toegevoegd.

De koolstofbronnen die in het kweekmedium kunnen worden toegepast, zijn onder meer suikers die door het micro-oranisme kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld zetmeel, dextrine, glucose, maltose, saccharose, sorbitol, alsmede, melasse, maissiroop, gierstgelei, enz., en organische zuren zoals 20 azijnzuur, barnsteenzuur e.d., en vetten en oliën. Voorbeelden van stik-stofbronnen die kunnen worden toegepast, zijn verscheidene ammoniumzouten, nitraten, ureum, alsmede organische natuurlijk voorkomende materialen zoals gistextract, caseïne, vleesextract, katoenzaadmeel, maisweekvloeistof, sojameel e.d. Het medium kan zonodig als anorganische zouten zouten van ijzer, 25 magnesium,.mangaan, kobalt, koper, natrium, kalium, calcium, zink, enz.

" bevatten. Verder kan het medium geschikt bepaalde voedingsstoffen bevatten, zoals aminozuren, vitaminen, purine- en pyrimidine-basen e.d., indien het micro-organisme deze voedingsstoffen vereist.

Het kweken kan worden uitgevoerd volgens iedere stationaire, submerS · 30 aerobe- of schud-methode of een andere methode, maar in het algemeen wordt de voorkeur gegeven aan submers aëroob kweken. De kweektemperatuur kan 20°-40°C bedragen; bij voorkeur bedraagt de kweektemperatuur 24-34°C.

Het kweekmedium wordt bij voorkeur öp een pH in een project van 4-9 gehouden, en te dien einde wordt pH-waarde van het medium met een verdunde waterige 35 oplossing van alklailoog of ammonia of een verdunde waterige oplossing van zwavelzuur, zoutzuur of dergelijke, tijdens het kweken ingesteld. Ook kunnen alkali-metaalzouten, zoals kaliumcarbonaat, natriumcarbonaat, enz. aan het medium worden toegevoegd. De onderhavige werkwijze kan worden uitgevoerd door het kweken voort te zetten totdat een aanzienlijke hoeveelheid 800 3 5 91 i - 4 - mildiomycine is gevormd en opgehoopt in de kweekbouillon; in het algemeen kan de maximale opbrengst aan mildiomycine in 4-12 dagen verkregen worden.

Uit de op boven beschreven wijze verkregen kweekbouillon kan mildiomycine desgewenst geïsoleerd worden volgens gebruikelijke methoden die 5 normaliter worden toegepast voor het winnen van basische, in water oplosbare antibiotica. Zo kan bijvoorbeeld na het verwijderen van de microbencellen en ander onoplosbaar materiaal in de kweekbouillon door methoden zoals filtreren, centrifugeren of dergelijke,het filtraat of de zich boven de vaste vloeistof bevindende vloeistof in contact gebracht worden 10 met geactiveerde koolstof of absorberende harsen teneinde mildiomycine te absorberen, en hierna kan mildiomycine geëlueerd worden met een waterig organisch oplosmiddel, een waterige zout- of zuuroplossing, een bufferoplossing of dergelijke.

Daar het volgens de uitvinding verkregen antibioticum een basiseh 15 materiaal is, wordt het goed geabsorbeerd aan een kationen uitwisselende hars en kan het geelueerd worden met een geschikte zuur-, alkali- of bufferoplossing. Deze methoden kunnen geschikt selectief en i-n combinatie toegepast worden; hierna wordt het eluaat geconcentreerd en gekristalliseerd onder verkrijging van mildiomycine. Het aldus verkregen mildiomycine 20 kan veilig gebruikt worden als aktief bestanddeel van een antibacterieel en...miticide -preparaat voor planten zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.007.267 en het Britse octrooischrift 1.507.193.

De uitvinding wordt nader toegelicht in de onderstaande, niet-beper-kende voorbeelden, waarin de volgende afkortingen zijn gebruikt: 25 milliiiter= ml, liter = 1, gram = g, procent (gew./volume) = %, nanometer = nm, omwentelingen per minuut = r.p.m. De afkortingen "IFO", "FERM-P" en "ATCC", die in de deponeringsnummers voorkomen welke in de voorbeelden zijn genoemd, hebben de volgende betekenissen: "Institute for Fermentation, Osaka" (Japan); "Fermentation Research Institute of 30 the Agency of Industrial Science and Technology", Chiba (Japan); en "American Type Culture Collection", Verenigde Staten van Amerika.

VOORBEELD I

(1) Aan 25 ml van een kweekmedium, bevattende 10% glucose, 3% katoen-zaadmeel (handelsnaam "Proflo", een produkt van Trader Oil Mill Co., 35 Verenigde Staten van Amerika), 1% maisweekvloeistof, 0,5% natriumchloride, 0,001% ferrosulfaat en 0,5% calciumcarbonaat,- voegde men choline toe in de in de onderstaande tabel A vermelde concentraties. Aan het mengsel werd druppelsgewijs een 20%'s waterige natriumhydroxyde-oplossing toegevoegd om de pH-waarde op 7,0 te brengen. Vervolgens werd het medium 800 3 5 91 * - 5 - gesteriliseerd en geënt met 1 platinalusje van een schuine cultuur van Streptoverticillium rimofaciens FERM-P 2549 (IFO 13592, ATCC 31120) gevolgd door kweken op een roterende schudinrichting bij 200 omwentelingen per minuut en bij 20° C gedurende 120 uren. Kwantitatieve 5 bepaling van het kweekbouillon op mildiomycine volgens de bekende methode die beschreven wordt in "The Journal of Antibiotics", Vol. 31, No. 6, bladzijden 511-518 en 519-524 (1978), gaf de in tabel A vermelde resultaten.

TABEL· A

10 Toegevoegde hoeveelheid Relatieve titer van mildiomycine ______ _(gew. verhouding)_ 0 100 0,35 113 1,40 133 15 3,5 180 14.0 193 35.0 200 70.0 200 (2) 1 1 van de kweekbouillon die onder (1) was verkregen onder toe-20 passing van het kweekmedium waaraan choline in een concentratie van 14 mM was toegevoegd, werd verzameld en gecentrifugeerd onder verkrijging van een zich boven de vaste stof bevindende vloeistof, die vervolgens door een kolom werd gevoerd die gevuld was met 500 ml van een ionen uitwisselende hars Amberlite IRC-50 (H+-vorm) (een produkt van Rohm & Haas Co).

25 De kolom werd gewassen met water.en hierna geëlueerd met 500 ml 0,5%'s waterige ammoniak. De actieve fracties werden geabsorbeerd door doorleiden door een kolom die gevuld was met 50 ml geactiveerde koolstof voor chroma-tografie (een produkt van Takeda Chemical Industries, Ltd.). De met 250 ml van een oplosmiddelmengsel van aceton en water (3:7) geëlueerde actieve 30 fracties werden verzameld en geconcentreerd; aan het concentraat werd druppelsgewijs aceton toegevoegd onder neerslaan van ruw mildiomycine.

Het aldus verkregen ruwe poeder (1,3 gram) werd opgelost in water en men voerde de oplossing door een kolom van 25 ml Amberlite CG-50 (H+-vorm) (Rohm & Haas Co.). De kolom werd gewassen met 10 ml water en vervolgens 35 geëlueerd met 250 ml 0,5%'s waterige ammoniak. De actieve fracties werden verzameld en geabsorbeerd door ze door een kolom van 50 ml geactiveerde koolstof te voeren. Men voerde een fractionele eluering uit met 250 ml aceton-0,lN mierezuur (2:8); de actieve fracties werden geconcentreerd.

Aan het concentraat voegde men methanol toe onder neerslaan van mildio- 80 0 3 5 91 - 6 - mycine. Het verkregen neerslag werd onder verlaagde druk gedroogd onder verkrijging van 1,1 g mildiomycine-formiaat- Van de fysische en chemische eigen- 24 schappen bleken het smeltpunt, de optische rotatie ([ot]^ bij C = 1,0 in ^0 en C = 1,0 in 0,1 N HC1) en de absorptiewaarden in het ultravioletspectrum 5 bij 271 nm en 280 nm in sterke mate over een te stemmen met de in de literatuur vermelde waarden ("The Journal of Antibiotics", Vol. 31, No. 6, blz. 523, 1978).

VOORBEELD II

Men kweekte het mildiomycine-vormende micro-organisme op dezelfde wijze 10 als beschreven in voorbeeld I, echter met dit verschil dat elk van de verschillende N-methylverbindingen uit de onderstaande tabel B aan het kweek-medium werd toegevoegd in een concentratie van 7 mM in plaats van 14 mM choline. De door kwantatieve mildiomycine-bepaling verkregen resultaten zijn in tabel B vermeld.

15 TABEL B

Toevoegsel Relatieve titer van mildiomycine _ _(gew. verhouding)_

Geen toevoeging 100

Choline 187 20 Betaine 186

Lecithine 161

Trimethylamine 175

Tetramethylammonium 187 N,N-Mehtyleenbisacrylamide 170

25 VOORBEELD III

Men kweekte op dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld I, echter met dit verschil dat men in plaats van choline betaine aan het kweekmedium toevoegde in de concentraties die in de onderstaande tabel C vermeld zijn.'

De door kwantitatieve mildiomycinebepaling verkregen resultaten zijn in 30 tabel C vermeld.

TABEL C

Toegevoegde hoeveelheid betaine Relatieve titer van mildiomycine _(mM)_ _(gew. verhouding)_

Geen toevoeging 100 35 0,35 110 1,40 . 129 3,5 160 14.0 185 35.0 194 40 70'° Λ η n t r* j 200 800 3 5 91 - 7 -

VOORBEELD IV

Men kweekte op dezelfde wijze als beschreven in voorbeeld I, echter met dit verschil dat choline en tetramethylammonium-hydrochloride in verschillende combinaties in plaats van choline aan het kweekmedium werden toegevoegd; de toegepaste concentraties zijn in de onderstaande tabel D vermeld. De door kwantitatieve mildiomycinebepaling verkregen resultaten zijn in tabel D gegeven.

TABEL D

Toegevoegde hoeveelheid choline Toegevoegde hoeveelheid Relatieve titer (mM) tetramethylammonium- van mildiomycine _ hydrochloride (mM)__(gew. verhouding)

Geen toevoeging geen toevoeging 100 7 0 187 6 1 187 5 2 185 4 3 186 3 4 188 2 5 _187 1 6 188 0 7 187

VOORBEELD V

Men kweekte op dezelfde wijze als beschreven, in voorbeeld I, echter met dit verschil dat men 1,1,3‘,3-tetramethylureum in plaats van choline aan het kweekmedium toevoegde en de toevoegingstijd varieerde als aangegeven in tabel E. De door kwantitatieve mildiomycinebepaling verkregen resultaten zijn in tabel E gegeven.

TABEL E

Tijdstip van kweken waarop Relatieve titer van mildiomycine 1,1,3,3-tetramethylureum wordt toegevoegd (uur)_ _(gew. verhouding)_ 0 140 10 140 geen toevoeging 100 800 35 91

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van mildiomycine door kweken van een mildiomycine-vormend micro-organisme behorend tot het genus Streptover-ticillium in een kweekmedium,'.: met bet kenmerk dat men het kweken uitvoert 5 in aanwezigheid van een N-methylverbinding in een hoeveelheid van ten minste 3 mM, onder vorming en ophoping van mildiomycine in de kweek-bouillon.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk dat de N-methylverbinding ten minste één stikstofatoom bezit dat 1-4 methylgroepen als 10 substituent(en) draagt.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk dat men als N-methylverbinding een N-methyl-zuuramide, N-methylaminoverbinding, N-methylamine, N-methylammoniumverbinding of een verbinding met een groep die in het kweekmedium kan worden omgezet in een^N-CH^ groep,gebruikt, 15 welke N-methylverbinding een molecuulgewicht in het traject van 50-1000 bezit.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk dat men een N-methylverbinding met een molecuulgewicht van 90-130 gebruikt.

4 % - 8 -

5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk dat men als N-20 methylverbinding een N-methylamine, een N-methylammoniumverbinding of een verbinding met een groep die in het kweekmedium kan worden omgezet in een^N-CH^ groep, gebruikt.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk dat men als N-methylverbinding trimethylamine, lecithine, choline, betaine of tetra- 25 ethylammonium gebruikt.

7. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk dat men als N-methylverbinding een N-methylammoniumverbinding met een trimethyl-ammonio groep.en een molecuulgewicht van 70-200 gebruikt.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk dat de N-methyl-30 ammoniumverbinding choline is.

9. Werkwijze volgens conclusies 1-8, met het kenmerk dat men een concentratie van de N-methylverbinding in het kweekmedium van 4-200 mM toepast.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk dat men een con-35 centratie van 7-50 mM toepast. 800 3 5 91