DE2652681C2

DE2652681C2 - N-Acetylthienamycin, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltende Mittel

Info

Publication number: DE2652681C2
Application number: DE2652681A
Authority: DE
Inventors: Robert Thomas Linden N.J. Goegelman; Sebastian Madrid Hernandez; Frederick Marvin Rahway N.J. Kahan; Jean Sawyer Kahan; Edward Olley Metuchen N.J. Stapley
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1975-11-21
Filing date: 1976-11-19
Publication date: 1985-04-25
Also published as: NL7612931A; CH630118A5; AU1964676A; HU175265B; JPS5265294A; GB1561107A; DK143713B; FR2332018A1; ZA766940B; GR60782B; PT65844B; DK497276A; FR2332018B1; NL186867B; ES453507A1; DE2652681A1; AU514309B2; DK143713C; BE848346A; AR214305A1

Description

Die Entdeckung der bemerkenswerten antibiotischen Eigenschaften von Penicillin hat großes Interesse auf diesem Gebiet wachgerufen, das zur Auffindung vieler anderer wertvoller antibiotischer Stoffe geführt hat; solche Antibiotica sind z. B. andere penicilline, Cephalosporine, Streptomycin, Bacitracin, Tetracycline, Chloramphenicol, Erythromycine υιά dergleichen. Im allgemeinen erstreckt sich die antibakterielle Aktivität eines jeden dieser Antibiotica nicht auf ge? isse klinisch wichtige pathogene Bakterien. So wirken einige hauptsächlich nur gegen gram-positive Arten vcn Bakterien. Ferner hat im Verlaufe der weitverbreiteten Anwendung bisher bekannter Antibiotica zur Behandlung von bakteriellen Infektionen die erworbene Resistenz zum Auftauchen schwieriger Resistenzprobleme geführt.

Daher haben die Mängel der bekannten Antibiotica eine weitere Forschung zur Auffindung anderer Antibiotica angeregt, die gegen einen weiteren Bereich von Krankheitserregern sowie auch gegen resistenie Stämme besonderer Mikroorganismen aktiv sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues und wertvolles Antibioticum zur Verfügung zu stellen, das in hochgradig wirksamer Weise das Wachstum verschiedener gram-negativer und gram-positiver Mikroorganismen hemmt Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung dieses neuen Antibioticums durch Fermentation von Nährmedien mit einem Mikroorganismus oder durch Acetylierung von Thienamycin zur Verfügung zu stellen.
Gegenstand der Erfindung ist das im Anspruch 1 definierte N-Acetylthienamycin.

Die Herstellung dieser Verbindung kann nach dem im Anspruch 2 angegebenen Verfahren erfolgen.
Die Züchtung von Streptomyces cattleya in einem Nährmedium führt auch zur Bildung von Thienamycin. Die Acetylierung von Thienamycin stellt sin weiteres Verfahren zur Herstellung vcn N-Acetylthienansycin dsr. Die Herstellung von Thienamycin durch Fermentation von Streptomyces cattleya ist nachstehend auch beschrieben.

Auf Grund umfangreicher klassifizierender Untersuchungen wurde der aus einer Bodenprobe isolierte

Mikroorganismus Streptomyces cattleya als Actinomycete identifiziert. Eine Kultur dieses Mikroorganismus ist permanent in der Kultursammlung der Northern Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria,

55 Illinois, hinterlegt worden und hat die Kennzeichnungsnummer NRRL 8057 erhalten.

Die charakteristischen morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften von Streptomyces cattleya sind in Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I
⁶⁰ Morphologie

Die Sporophoren sind kompakte Spiralen, die als Seiten- und Endverzweigungen an dem Luftmycel auftreten. Die Sporen sind ellipsoidal bis zylindrisch in der Form, haben eine Größe von 0,9 μΐη x 1,2 μίτι und kommen in Ketten von mehr als 10 vor.

Kulturmerkmale

Tomatenbre i-Hafermehl- Agar

Vegetatives Wachstum - Rückseite - bräunlich, flach, sich ausbreitend:

Luftmycel - orchideenfarben (10 ge), gemischt mit Weiß;

Lösliches Pigment - keines. Czapek-Dox-AgariSaccharose-Nitrat-Agar)

Vegetatives Wachstum - farblos, flach, sich ausbreitend; Luftmycel — spärlich, weiß mit rosa Stich; 5

Lösliches Pigment - keines. Eieralbumin-Agar

Vegetativss Wachstum - bräunlich mit grau-orchideenfarbenem Anflug, flach, sich ausbreitend; Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit helleren Tönen von Orchideenfarbe und etwas Weiß; Lösliches Pigment - keines. io Glycerin-Asparagin-Agar Vegetatives Wachstum - Rückseite - bräunlich mit grau-rosa Anflug, flach, sich ausbreitend; Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit etwas Weiß;

Lösliches Pigment - keines.
Hefeextrakt-Glucose + Salz-Agar 15

Vegetatives Wachstum -bräunlich mit grau-rosa Anflug; Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit Rosa-Weiß;

Lösliches Pigment - keines. Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich; 20 Luftmycel - orchideenfarben (10 gc), gemischt mit Rosa-Weiß;

Lösliches Pigment - keines. Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar

Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luftmycel - keines; 25 Lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums; Melanin - negativ;

H₂S-Entwicklung - negativ. Nähragar

Vegetatives Wachstum - hellbräunlich; 30 Luftmycel - keines;

Lösliches Pigment - keines. Nährstärke-Agar

Vegetatives Wachstum - rahmfarben bis bräunlich; Luftmycel - keines; 35 Lösliches Pigment - keines;

Hydrolyse von Stärke - mäßig. Nährgelatine-Agar

Vegtiatives Wachstum - rahmfarben; Luftmycel - keines; 40 Lösliches Pigment - keines;

Verflüssigung von Gelatine - mäßig. Senkrechtes Gelatineröhrchen

Vegetatives Wachstum - bräunlich; Luiimycel - keines; 45

?$ Lösliches Pigment - keines;

3. Verflüssigung von Gelatine - mäßig.

U Kartoflfelnfropfen

Kj Vegetatives Wachstum - mäßig, bräunlich;

ψ. luftmycel - spärlich, gräulich-rosa-weiß; 50

% Lösliches Pigment - keines.

Loefflersches Blutserum

Si Vegetatives Wachstum - rahmfarben;

U Luftmycel - keines;

f| Lösliches Pigment - keines; 55

I Verflüssigung - keine.

\\ Magermilch-Agar

f: Vegetatives Wachstum - bräunlich;

' j Luftmycel - spärlich, weißlich;

Lösliches Pigment - schwache Bräunung des Mediums; 60

Hydrolyse von Casein - positiv. Lackmusmilch

Vegetatives Wachstum - bräunlich bis braun; Luftmycel - keines; Farbe - kein lösliches Pigment, Lackmusindikator wird bläulich; 65

Koagulation unJ.'oder Peptonisierung - teilweise Peptonisierung, wird alkalisch.
Magermilch

Veaetatives Wachstum - bräunlich:

Luftmycel - keines;
Lösliches Pigment - keines;

Koagulation und/oder Peptonisierung - teilweise Peptonisierung, wird alkalisch. Tyrosin-Agar
5 Vegetatives Wachstum - bräunlich;

Luftmycel - Mischung aus Orchideenfarben (10 gc) und Weiß; Lösliches Pigment - keines;
Zersetzung von Tyrosin - positiv.

ίο Alle oben angegebenen Merkmale wurden, falls nichts anderes gesagt ist, nach dreiwöchiger Inkubation bei 28⁰C festgestellt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren ungefähr neutral (pH-Wert 6,8 bis 7,2). Die in der Beschreibung verwendeten Farbbezeichnungen entsprechen den Definitionen in »Color Harmony Manual«, 4. Auflage (1958), herausgegeben von der Container Corporation of America, Chicago, Illinois. Streptomyces cattleya NRRL 8057 wurde ferner auf seine Fähigkeit untersucht, verschiedene Kohlehydrate auszunutzen oder zu assimilieren. Zu diesem Zweck wurde der Mikroorganismus drei Wochen bei 28⁰C auf basalem synthetischem Medium (Pridham und Gottlieb) gezüchtet, das das betreffende Kohlehydrat in einer Köüxcütfätiöü Von 1% enthielt. Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien waren uiigefiüir neuirai (pH 6,8 bis 7,2). Tabelle II zeigt die Ausnutzung dieser Kohlehydrate durch Streptomyces cattleya NRRL 8057, wobei + ein gutes Wachstum, ± ein schlechtes Wachstum und - kein Wachstum auf dem betreffenden Kohle-

20 hydrat bedeutet.

Tabelle Π

Glucose + Maltose ±

25 Arabinose - Mannit +

Cellulose - Mannose ± Fructose ± Rafflnose Inosit - Rhamnose Lactose - Saccharose ±

30 Xylose ±

Für das Ausmaß des Wachstums mit Temperaturänderung, den Sauerstoffbedarf und die Wirkung auf Nitrat des Mikroorganismus gilt folgendes:

„ Temperaturbereich (Hefeextrakt-Glucose + Salzagar):

28⁰C - gut

37°C - mäßig

50°C - kein Wachstum

Sauerstoffbedarf (Nadelimpfkultur in Hefeextrakt-Clucose-Salzagar): aerob.

Nitratreduktion - positiv. Das neue Antibioticum N-Acetylthienamycin gemäß der Erfindung wird bei der aeroben Fermentation ge-

eigneter wäßriger Nährmedien unter gesteuerten Bedingungen durch Beimpfung mit dem Organismus Streptomyces cattleya NRRL 8057 erzeugt. Für die Herstellung von N-Acetylthienamycin eignen sich die gleichen wäßrigen Medien, die auch für die Herstellung anderer Antibiotica geeignet sind. Solche Medien enthalten von dem Mikroorganismus assimilierbare C- und N-Quellen sowie anorganische Salze.
Im allgemeinen können Kohlehydrate, wie Zucker, z. B. Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Xylose, Mannit und dergleichen, und Stärken, wie Getreide, z. B. Hafer, Roggen, Maisstärke, Maismehl und dergleichen, allein oder zusammen mit anderen Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff in dem Nährmedium verwendet werden. Die genaue Menge der Kohlehydrate in dem Medium richtet sich teilweise nach den übrigen Bestandteilen des Mediums; im allgemeinen variiert jedoch die Menge der Kohlehydrate zwischen etwa 1 und 6 Gew.-% des Mediums. Diese C-Quellen können einzeln verwendet werden, oder mehrere derartige C-Quellen können in dem Medium kombiniert werden. Im allgemeinen können viele Proteinstoffe als N-Quellen bei dem Fennentaticnsverfshrss vsnvcsdct "erden. Geeignete N-Qücüea sind z. B. Hefehydrolysaie, Frimlrnefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Hydrolysate von Casein, Maisquellwasser, lösliche Schlempebestandteile oder Tomatenbrei und dergleichen. Die N-Quellen werden allein oder in Kombination miteinander in Mengen von etwa 0,2 bis 6 Gew.-% des wäßrigen Mediums angewandt

Zu den anorganischen Nährsalzen, die den Kulturmedien zugesetzt werden können, gehören die üblichen Salze, die Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlor-, Carbonationen und andere Ionen liefern. Hierher gehören auch Spurenmetalle, wie Kobalt, Mangan, Eisen und Magnesium.

Die in den Beispielen beschriebenen Kulturmedien dienen nur zur Erläuterung; »na" kann die verschiedensten Medien verwenden.

Die Fermentation wird bei Temperaturen von etwa 20 bis 37⁰C durchgeführt; zur Erzielung der besten Ergebnisse führt man die Fermentation jedoch vorzugsweise bei Temperaturen von etwa 22 bis 3O⁰C durch. Der pH-Wert des für die Züchtung der Kultur von Streptomyces cattleya NRRL 8057 und für die Erzeugung von N-Acetylthienamycin geeigneten Nährmediums kann im Bereich von 6,0 bis 8,0 variieren.

Das neue Antibioticum N-Actylthienamycin entsteht zwar sowohl in Oberflächenkultur als auch in Submerskultur; vorzugsweise wird die Fermentation jedoch in Submerskultur durchgeführt.

Die Fermentation zur Erzeugung des Antibioticums erfolgt zweckmäßig in kleinem Maßstab durch Beimpfen eines geeigneten Nährmediums mit der das Antibioticum erzeugenden Kultur und Fortführen der Fermentation nach der Übertragung auf ein Produktionsmedium über mehrere Tage hinweg in einer Schüttelmaschine bei konstanter Temperatur von etwa 24⁰C.

Nf;*) beginnt die Fermentation in einem mit Nährmedium beschickten sterilisierten Kolben über eine oder mehrere Stufen der Impfgutentwicklung. Als Nährmedium für die Impfgutstufe kann man jede geeignete Kombination von C- und N-Quellen verwenden. Der Impfkolben wird einen Tag oder zwei Tage in einer konstanten Temperaturkammer bei etwa 28°C geschüttelt, bis die Kultur zufriedenstellend ist, und ein Teil der entstehenden Kultur wird verwendet, um entweder ein zweistufiges Impfgut oder das Produktionsmedium zu beimpfen. Zwischenstufige Impfkolben werden, wenn sie verwendet werden, im wesentlichen in dergleichen Weise entwickelt, d. h. ein Teil des Kolbeninhalts der letzten Impfstufe wird verwendet, um das Produktionsmedium zu beimpfen. Die beimpften Kolben werden mehrere Tage bei konstanter Temperatur geschüttelt, und am Ende der Inkubationsperiode wird der Kolbeninhalt zentrifugiert oder nitriert.

Für in großem Maßstab durchgerührte Arbeiten erfolgt die Fermentation vorzugsweise in geeigneten Fermentern, die mit einem Rührer und einer Anlage zum Belüften des Fermentationsmediums versehen sind. Nach dieser Methode wird das Nährmedium in dem Fermenter angemacht und durch Erhitzen auf Temperaturen bis etwa 120⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit einem zuvor gezüchteten Impfgut der Kultur beimpft und die Fermentation eine Zeitlang, z. B. 3 bis S Tage, unter Rühren und/oder Belüftung des Nährmediums und Innehaltung einer Temperatur von etwa 24⁰C fortgeführt. Diese Methode zur Herstellung von N-Acetylthienamycin eignet sich besonders für die Herstellung großer Mengen des Antibioticums.

Physikalische und chemische Eigenschaften von N-Acetylthienamycin Ein NMR-Spektrum von N-Acetylthienamycin bei 100 MHz zeigt die folgenden Maxima:

δ 1,27, d, 3 H, J « 6,5; «51,98, S, 3 H; <52,94, m, 2 H; 53,17, m, 2 H; «53,38, t, 2 H; J =6,5; <53,38, m, 1 H; «54,20, m, 2 H.

Das NMR-Spektrum einer vereinigten Lösung von durch Fermentation erhaltenem N-Acetylthienamycin und durch Acetylierung erhaltenem Thienamycin ist von den Spektren der einzelnen Lösungen nicht zu unterscheiden. Aus der Abhängigkeit des Wertes für X_n^ von dem pH-Wert wurde ein pK, von 3,3 ±0,1 für die COOH-Gruppe in N-Acetylthienamycin bestimmt.

Bei der Papierelektrophorese in 0,1 molarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7) unter Verwendung von Papier Nr. 2043-B der Firma Schleicher und Schuell bei einem Spannungsgefälle von 50 V/cm wandert sowohl das durch Fermentation gewonnene N-Acetylthienamycin als auch das durch Acetylierung von Thienamycin gewonnene N-Acetylthienamycin im Verlaufe von 20 Minuten bei 10°C über eine Strecke von 2,7 cm zur Anode. Das Antibioticum wird durch Bioautographie an Vibrio percolans ATCC 8461 (ohne zwischenzeitiges Trocknen des Papiers) lokalisiert, und die Wanderung wird von dem Punkt des Auftragens bis zur Mitte der Hemmzone gemessen.

Die Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von mit Cellulose beschichteten Blättern und einem Lösungsm ittelgemisch aus 70% Äthanol und 30% Wasser zeigt ein Rf sowohl für das durch Fermentation als auch für das durch Acetylierung von Thienamycin gewonnene N-Acetylthienamycin von 0,7, nachgewiesen durch Bioautographie an Vibrio percolans ATCC 8461. Der Rf-Wert bezieht sich auf den Abstand vom Ursprungspunkt bis zum Mittelpunkt der Bioaktivität, dividiert durch den Abstand vom Ursprungspunkt bis zur Lösungsmittelfront.

Das IR-Spektrum von N-Acetylthienamycin ist in der Abbildung dargestellt.
Es wird angenommen, daß N-Acetylthienamycin die folgende Molekularstruktur aufweist:

50 O

S-CH₂-CH₂-NH-C-CH₃ (J)

COOH

N-Acetylthienamycin kennzeichnet sich ferner durch das folgende antibiotische Spektrumprofil. Dieser Test wird nach der Scheibendiffusionsmethode von Bauer-Kirby durchgeführt, der nur in bezug auf die Tiefe der Agarschicht abgeändert ist, die in diesem Falle 2 mm beträgt Die als Durchmesser der Hemmzone in Millimeter angegebenen Ergebnisse finden sich in Tabelle ΙΠ. In Tabelle III ist das antibiotische Spektrumprofil für N-Acetylthienamycin und auch für die Verbindung angegeben, die durch Acetylieren von Thienamycin erhalten wird.

Tabelle III Prüforganismus

Merck Nr.

ATCC Nr.

Antibiotische
Resistenz*)

N-Acetylthien- N-Acetylthienamycin") amyeirr)

9,85 y pro Scheibe*·)

10,35 y pro Scheibe")

Staphylococcus aureus	MB 2985 MB 2314
Bacillus subtilis	MB 964
Escherichia coli	MB 2884 MB 2964 MB 2482
K!?-bsi?-Ü2 pneujüoniae	MB 2921 MB 2922
Enterobacter cloacae	MB 2646 MB 2647
Proteus mirabilis	MB 2830
Proteus morganii	MB 2833
Serratia	MB 2840
Pseudomonas aeruginosa	MB 2824 MB 2835 MB 3286

6633

P, C
P

P
P

P.C

P, C
P,C
P₁C

P₁C
P.C
P₁C

37 37

43

31,5 28,5 28

26,5 29

25,5

11 (unscharf) 0

37 37

44,5

31,5 29,5 28

28,5 30

27 29

26 25 27

24

11 (unscharf) 0

und einer Auslöschbarkeit durch

P - Penicilline, vertreten durch Ampicillin. C - Cephalosporine, vertreten durch Cephalothin.

*·) Die Gewichtäherechnungen beruhen auf einem angenommenen £|*_π, 3οι nm ^:

Hydroxylamin von 96% für das reine Material.

*) Hergestellt durch Fermentieren« von Strentnmyces catüeya NRRL 8057.
^b) Hergestellt durch Acetylieren von Thienamycin.

N-Acetyltbienamycin zeigt in vivo-Aktivität gegen gram-negative und gram-positive Organismen und eignet sich daher zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei Menschen und Tieren. Zur Bestimmung de, in vivo-Aktivität wird N-Acetyiihienamycin in 0,01 molarer Natriumphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 gelöst und mit dieser Lösung zu fünf vierfachen Konzentrationen des Antibioticums für die Untersuchung verdünnt Weibliche weiße Schweizer Mäuse mit einem durchschnittlichen Gewicht von etwa 21g werden intraperitoneal mit dem ta Fleischbrühe suspendierten Prüforganismus infiziert. Die Anzahl der injizierten Organismen wird nach genormten Platten-Zählmethoden bestimmt Zum Zeitpunkt der Infektion und 6 Stunden später werden einige der Mäuse intraperitoneal mit dem Antibioticum behandelt. Für jede Konzentration des untersuchten Antibioticums werden fünf Mäuse verwendet. Zu jedem Test gehören Kontrollen von je fünf Mäusen für jede der verschiedenen Verdünnungen der infizierenden Kultur, um die Anzahl der Organismen zu berechnen, die auf 50% der infizierten, unbehandelten Mäuse lethal wirken (LDso)· Diese Berechnung wird auf Grund von Überlebensdaten am siebenten Tag nach der Infektion durchgeführt, und zu diesem Zeitpunkt wird auch die Menge des Antibioticums berechnet, die 50% der infizierten Mäuse schützen sollte (ED₅₀).

Alle so infizierten und nicht mit dem Antibioticum behandelten Mäuse sterben innerhalb 48 Stunden nach der Infektion. Die Wirksamkeit von N-Acetylthienamycin ist in Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV Wirksamkeitsuntersuchungen an Mäusen") Organismus

Staphylococcus
aureus 2949

Nr. Lp₅₀

Darreichungsart, Dosen ED₅₀, mg/kg/Dosis⁰)

13

i.p.x2^b)

0,050

CD-I, weibliche Mäuse, Körpergewicht 21g.
Gibt die Behandlung zum Zeitpunkt der Darreichung der infizierenden Dosis und 6 Stunden danach an.
Gewicht von N-Acelytthienamycin auf der Basis des geschätzten Wertes E[^_n, 301 nm - 290 und einer Auslöschbarkeit durch Hydroxylamin von 96% für das reine Material.

N-Acetylthienamycin ist ein wertvolles Antibioticum, das gegen die verschiedensten gram-positiven und gram-nefcjtiven Bakterien aktiv ist und daher sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin Verwendung findet. Die Verbindung gemäß der Erfindung kann als antibakterielles Arzneimittel zur Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive oder gram-negative Bakterien verursacht werden, z. B. gegen Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae und Entero- s bacter cloacae. Das antibakterielle Mittel gemäß der Erfindung kann ferner als Zusatz zu Tierfutter, zum Konservieren von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel verwendet werden. Zum Beispiel kann es in wäßrigen Mitteln in Konzentrationen von etwa 0,1 bis 100 Teilen Antibioticum je Million Teile Lösung oder vorzugsweise in Konzentrationen von etwa 1 bis 10 Teilen Antibioticum je Million Teile Lösung verwendet werden, um das Wachstum von schädlichen Bakterien auf ärztlichen und zahnärztlichen Ausrüstungsgegenständen zu zerstören ; und zu hemmen, sowie als Bactericid für technische Anwendungszwecke, z. B. in Anstrichfarben auf wäßriger

: Basis, in dem Siebwasser von Papierfabriken und zur Hemmung des Wachstums schädlicher Bakterien.

. Das Antibioticum gemäß der Erfindung kann in den verschiedensten pharmazeutischen Präparaten als alleiniger Wirkstoff oder selbstverständlich auch in Kombination mit einem oder mehreren anderen Antibiotica oder fi mit einem oder mehreren pharmakologisch aktiven Stoffen verwendet werden. Als Beispiel für den erstgenann- is

\' ten Fall kann ein Aminocyclitol-Antibioticum, wie Gentamicin, gleichzeitig dargereicht werden, um das anti-

. be kterielle Spektrum zu erweitern und die Möglichkeit des Auftretens von resistenten Organismen auf ein Mini-

·: rnum zu beschränken. Als Beispie! für den letzteren Fall kann man Diphencxyiat und Atropin in Bcsisfcnscn

fj für die Behandlung von Magen-Darmerkrankungen kombinieren. Das Antibioticum kann in Form von Kapseln,

4 Tabletten, Pulvern, flüssigen Lösungen oder als Suspensionen oder Elixiere verwendet werden. Es kann oral,

i lokal, intravenös oder intramuskulär dargereicht werden.

i-\ Tabletten und Kapseln für die orale Darreichung können in Einheitsdosisform vorliegen und herkömmliche

I Streckmittel, wie Bindemittel, z. B. Sirup, Akazienharz, Gelatine, Sorbit, Tragantharz oder Polyvinylpyrrolidon, I Füllstoffe, wie Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin, Gleitmittel, z. B. Magne-

% siumstearat, Talkum, Polyäthy'englykol, Siliciumdioxid, den Zerfall fördernde Mittel, z. B. Kartoffelstärke oder

v> unbedenkliche Netzmittel, wie Natriumlaurylsulfat, enthalten. Die Tabletten können nach an sich bekannten

;| Methoden beschichtet sein. Oral darzureichende flüssige Präparate können in Form von wäßrigen oder öligen

If Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren usw. vorliegen oder als trockenes Produkt zum Ij Anmachen mit Wasser oder anderen geeigneten Trägern vor der Verwendung hergestellt werden. Solche flüssi-

Γ: gen Präparate können herkömmliche Zusätze, wie Suspendiermittel, z. B. Sorbitsirup, Methylcellulose, GIu-

I cose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder [I hydrierte genießbare Fette, Emulgiermittel, z. B. Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Akazienharz, nicht-wäßrige P Träger, wie genießbare Öle, z. B. Mandelöl, fraktioniertes Kokosnußöl, ölige Ester, Propylenglykol oder Äthyl-% alkohol, Konservierungsmittel, z. B. p-Hydroxybenzoesäuremethyl- oder -propylester oder Sorbinsäure, enthal-

j| ten. Zäpfchen enthalten herkömmliche Zäpfchenbasen, wie Kakaobutter oder andere Glyceride.

3i Mittel für die Injektion können in Einheitsdosisform in Ampullen oder in Mehrfachdosisfarm in Behältern

ft unter Zusatz von Konservierungsmitteln zur Verfugung gestellt werden. Die Mittel können die Form von

;■■ Suspensionen, Lösungen, Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern aufweisen und' Formulierungsniittel, wie

«Ι Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel enthalten. Der Wirkstoff kann auch in Pulverform vorliegen

~v und vor der Verwendung mit einem geeigneten Träger, z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, angemacht werden.

Die Mittel können auch in für die Absorption durch die Schleimhäute der Nase und des Rachens oder der

_r,: Bronchialgewebe geeigneter Form hergestellt werden, z. B. als Pulver oder flüssige Sprüh- oder Inhaliermittel,

$ Pastillen, Rachenanstrichmittel usw. Zur Behandlung der Augen oder Ohren können die Präparate als einzelne

r. Kapseln, in flüssiger oder halbflüssiger Form zur Verfügung gestellt oder als Tropfen usw. verwendet werden. Für

■;; die lokale Applikation können sie in hydrophoben oder hydrophilen Basen als Salben, Cremes, Lotionen,

Κι Anstrichmittel, Putver usw. vorliegen.

ί| Außer einem Träger können die Mittel gemäß der Erfindung andere Bestandteile, wie Stabilisatoren, Binde-Mi mittel, Oxidationsverzögerer, Konservierungsmittel, Gleitmittel, Suspendiermittel, die Viscosität beeinflus-

II sende Mittel oder Geschmacksstoffe und dergleichen, enthalten.

tß In der Veterinärmedizin, wie bei der Behandlung von Hühnern, Kühen, Schafen, Schweinen und dergleichen, so

können die Mittel z. B. als Präparate zum Injizieren in die Brust formuliert werden, die auf Langzeitwirkung abgestellt sind oder den Wirkstoff schnell in Freiheit setzen.

Dosierungsplan und Darreichungsart richten sich weitgehend nach dem Zustand des zu behandelnden Tieres, dem Gewicht desselben, der Empfindlichkeit des infizierenden Mikroorganismus und dem Stadium der Infektion, wobei die parenteral Darreichung bei allgemeinen Infektionen und die orale Darreichung bei Darminfektionen bevorzugt wird.

Zur Behandlung von bakteriellen Infektionen beim Menschen wird die Verbindung gemäß der Erfindung oral oder parenteral nach herkömmlichen Methoden für die Behandlung mit Antibiotica in Mengen von etwa 2 bis 600, vorzugsweise etwa 5 bis 100 mg/kg/Tag dargereicht und vorzugsweise in Einzeldosen unterteilt, die z. B. drei- bis viermal pro Tag dargereicht werden. Es können Einheitsdosisformen verwendet werden, die z. B. 25, 250,400,800 oder 1000 mg Wirkstoff zusammen mit physiologisch unbedenklichen Trägern oder Streckmitteln enthalten. Die Dosiseinheiten liegen in Form von flüssigen Präparaten, wie Lösungen oder Suspensionen, oder als feste Stoffe in Tabletten oder Kapseln vor. Die optimale Dosis richtet sich für jeden einzelzen Fall nach Art und Schwere der Infektion, wobei für die Behandlung von Kindern kleinere Dosen angewandt werden; alle derartigen Bemessungsregeln sind dem Fachmann bekannt

Die Erfindung umfaßt auch die nicht-toxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Salze von N-Acetylthienamycin, z. B. die pharmakologisch unbedenklichen Salze, die mit anorganischen oder organischen Basen eirtstehea Hierzu gehören z. B. Metallsalze, die von Alkali- oder Erdalkalihya^xidei^-carbopatenoder-bicarbonaien

abgeleitet sind, wie z. B. Natrium·, Kalium-, Ammonium- und Calciumsalze, sowie Salze von primären, sekun- > dären oder tertiären Aminen, wie von Monoalkylaminen, Dialkylaminen, Trialkylaminen, niederen Alkanolamines; niederen Dialkanolaminen, niederen Alkyleiufiaminen, Ν,Ν-Piaralkyl-nied.alkylendiaminen, Aralkylaminen, aminosubstituierten niederen Alkanolen, durch niedere Ν,Ν-Dialkylaminogruppen substituierten

S niederen Alkanolen amino-, polyamino-und guanidinosubstituierten niederen Alkansäuren und sticksto
tigen heterocyclischen Aminen. Typische Beispiele sind Salze, die von Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid, Calciumcarbonat, Trimeihylamin, Tüäthylamin, Piperidin, N-Äthylpiperidin, Morpholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiamin, Diäthanolamin, Piperazin, Dime-

thylaminoätnänol, 2-Amino-2-methylpropanol-(l), Theophyllin, N-Methyiglucamin und dergleichen abgeleitet sind.

Die Salze der Verbindung gemäß der Erfindung können nach bekannten Methoden hergestellt werden. So erhält man z. B. die Monosalze, wie das Mononatriumsalz, durch Umsetzung von 1 Äquivalent Natriumhydroxid mit 1 Äquivalent des Produkts G) ^m einem geeigneten Lösungsmittel. Auch Mischsalze mit zweiwertigen

is Kationen können hergestellt werden, indem man 1 Mol einer zweiwertigen Base mit 1 Mol des Produkts 0) und 1 Äquivalent einer anderen Säure kombiniert. Salze können auch hergestellt werden, indem man 1 Äquivalent einer Base mit einem zweiwertigen Kation, wie Calciumhydroxid, mit 1 Äquivalent des Produkts (I) umsetzt Die Salze gemäß der Erfindung sind pharmakologisch unbedenkliche, nicht-toxische Derivate, die als Wirkstoffe in geeigneten pharmazeutischen Einheitsdosisformen verwendet werden können. Sie können selbstver-

zu erhalten.

Die nach den bier beschriebenen Verfahren erhartenen, das Antibioticum enthaltenden Fermentationsflüssigkeiten haben Aktivitäten im Bereich von etwa 0,1 bis 4 y/mL Die Reinigung der antibiotischen Präparate und die Gewinnung des Antibioticums kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden. Ein solches Verfahren besteht darin, daß man filtrierte Fermentationsflüssigkeit, die N-Acetvlthienamycin enthält, durch eine Kolonne eines starken Kationenaustauschharzes filtriert Beispiele für solche Harze sind diejenigen vom Sulfonattyp mit einem Styrol-Divinylbenzolgerüst, z. B. das kernständige Sulfonsäuregruppen aufweisende PolystyroUiarz Dowex-50 x 2 in der Natriumform. Andere repräsentative Vertreter der Klasse von starken Kationenaustauschharzen sind die folgenden: Dowex-S0 X 4, Dowex-50 x 8, Amberlite IR120, Duolite C 25 D, Permutit Q, Ionac C-249 und Amberlite 200.

Der das Antibioticum N-Acetylthienamycin enthaltende Ablauf von dem Kationenaustauschharz kann gegebenenfalls nach anderen Reinigungsmethoden weiter gereinigt werden. Das Thienamycin selbst bleibt an dem starken Kationenaustauschharz adsorbiert Demgemäß ist das Verfahren zum Trennen dieser beiden Verbindungen klar unterscheidbar.

Eia solches Verfahren besteht darin, daß man N-Acetylthienamycin an einem stark basischen Anionenaustauschharz adsorbiert Beispiele für solche stark basischen Anionenaustauschharze sind diejenigen mit einem Styrol-Divinylbenzolgerüst, z. B. das im Polystyrolkern quaternisierte Ammoniumharz Dowex-1 x 2 in der Chloridform. Andere repräsentative Glieder dieser Klasse von stark basischen Ionenaustauschharzen sind: Duolite A-40, A-42, A-101, A-102 und A-114; Amberlite IRA-400, IRA-401 und IRA-410. Das in dem Eluat ent·

AO haltene Antibioticum N-Acetylthienamycin kann weiter gereinigt werden, indem man es durch eine Kolonne

leitet, die mit einem Acrylsäureesterpolymerisat von mittlerer Polarität beschickt ist, wie XAD-7 oder 8, oder durch eine Kolonne, die mit einem unpolaren, hydrophoben, vernetzten Polystyrol-Divinylbenzolpolymerisat

beschickt ist, wie XAD-I, 2 und 4, vorzugsweise XAD-2. %

Weiter gereinigtes N-Acetyithienamycin erhält man durch Gelfiltration durch Polyacrylsäureamidgel mit 'Ά

einer Porengröße, die Moleküle mit Molekulargewichten von mehr als 1800 ausschließt, wie Bio-Gel P-2. jfy

Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung von gereinigtem N-Acetylthienamycin besteht darin, eine Lötung 'f]

des Antibioticums, wie die filtrierte; Fermentationsflüssigkeit, deren pH-Wert auf 4 bis 5 eingestellt worden ist, |

durch eine Kolonne zu leiten, die ein starkes Kationenaustauschharz vom Sulfonattyp in der Natriumform ent- fj

hält (Dowex-50 x 4). Der aufgefangene Ablauf kann weiter nach einer Reihe von Verfahrensstufen gereinigt |i

werden, in denen die folgenden chromatographischen Medien verwendet werden: Anionenaustauschharze vom <:<

Polystyrol-Trimethylammoniumtyp (z. B. Dowex-1 x 2 in der Chloridform), polymere Adsorptionsmittel (z. B. f. XAD-2, ein Polystyrolharz), Dowex-1 X 4 in der Chloridform und Gelfiltrationsharze (z. B. Bio-Gel P-2, ein U

Polyacrylsäureamidharz). Die Bioaktivität der Eluate wird gemessen, indem man das Eluat unter Verwendung von Staphylococcus aureus ATCC 6538 P als Testorganismus oder, falls die Reinheit dies gestattet, auf Grund

der von Hydroxylamin ausgelöschten Extinktion analysiert Eine bevorzugte Methode zur Gewinnung von N- ':

Acetylthienamycin aus Fermentationsflüssigkeiten ist in Tabelle V angegeben. Das Antibioticum N-Acetylthienamycin gemäß der Erfindung kann auch durch Acetylieren von Thienamycin ,·

hergestellt werden. Die Acetylierung wird mit einem Acetylhalogenid oder vorzugsweise mit Essigsäureanhy- i

drid durchgeführt. Thienamycin wird in einem geeigneten inerten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, gelöst und die Lösung bei einer Temperatur von -10 bis +25⁰C, aber vorzugsweise bei etwa 0⁰C, mit überschüssigem Acetylierungsmittel behandelt. In etwa 1 Minute bis 1 Stunde ist die Reaktion vollständig. Gewöhnlich genügt bei O⁰C eine Reaktionszeit von etwa 10 Minuten. Das durch Acetylieren von Thienamycin erhaltene rohe N-Acetylthienamycin kann nach den gleichen Verfahren gereinigt werden, die für die Reinigung der N-Acetylthienamycin enthaltenden filtrierten Fermentationsflüssigkeiten beschrieben worden sind.

Eine bevorzugte Methode zur Reinigung des durch Acetylierung erhaltenen N-Acetylthienamycins besteht darin, das Rohmaterial an ein Anionenaustauschharz, wie Dowex-1 X 4 in der Chloridform, zu adsorbieren und mit einer wäßrigen Salzlösung zu eluieren. Eine geeignete wäßrige Salzlösung enthält Natriumchlorid, Ammoniumchlorid und Ammoniak, vorzugsweise in Konzentrationen von etwa 0,07molar, OOOSmolar bzw.

IB 52 681

0,0001 molar. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingeengt Das Konzentrat kann
weiter durch Gelfiltration durch ein Poiyacrylsäureamidgel gereinigt werden. Ein bevorzugtes Gel ist Bio-Gel
P-2, das mit entmineralisiertem Wasser eluiert wird. .......--

In den nachstehenden Beispielen werden Verfahren erläutert, nach denen die Produkte gemäß der Erfindung
erhalten werden können. s

,Tabelle V
FlieBdiagramin dei Reinigungsverfahrens für das Antibioticum N-Acetylthienamycin

Fermentations-

nüuigkeit von N-Acetylthienamycin

(1) Filtrieren

(2) Zusatz von EDTA

Filtrierte Flüssigkeit

(1) Aufgeben auf

XAD-2-Eluat

(1) Konzentrieren

(2) Adsorbieren an XAD-2 (salzgewaschen)

(3) Eluieren mit Wasser

(1) Kühlen auf 6⁰C

(2) Einstellen des pH-Wertes auf 4,5

Dowex-1 χ 2-Eluat (150-300 μ) Dowex-50 χ 4 Na⁺
(300-840 μ)

(2) Adsorbieren an

Dowex-1 χ 2 (150-300 μ)

(3) Waschen in 25μΐηοΐ8Γ EDTA

(4) Eluieren mit 5% NaCl,
25|iinolar EDTA,

10 mmolar Puffer, pH 7

(1) Adsorbieren an Dowex-1 χ 4 Cl" (<37 μ)

(2) Eluieren mit 0,07molar NaCl + 0,005 molar NH₄Cl + O.lmoiar NH₄OH

Dowex-1 χ 4-Eluat

(1) Konzentrieren

(2) Adsorbieren an Bio-Gel l>-2 (1800 Dalton)

(3) Eluieren mit Wasser

Bio-Gel P-2-Eluat

(1) Konzentrieren

(2) Adsorbieren an XAD-2

Dowex-50 x 4-Ablauf

(3) Eluieren mit einem Gemisch aus
50% Wasser und 50% Methanol

/ Anderes Verfahren

Gefriergetrocknetes

N-Acetylthienamycin

(1) Konzentrieren

(2) Gefriertrocknen

Zweites XAD-2-Eluat

(1) pH des Ablaufs auf 7 einstellen

TM 52 681

Analysenverfahren auf Antibioticum N-Acetylthienamycin I. Bioanalyse

Analysen auf die antibakterielle Aktivität werden nach der folgenden ScheibendifFusionsmethode unter Verwendung von Vibrio percolans ATCC 8461 oder Staphylococcus aureus ATCC6538 P als Prüforganismus durch- s geführt.

Platten mit Vibrio percolans ATCC 8461 werden folgendermaßen hergestellt:

Eine gefriergetrocknete Kultur von Vibrio percolans ATCC 8461 wird in 15 ml eines sterilenMediums suspendiert, welches Difco-Nährbrühe 8 g/l und Hefeextrakt 2 g/l in destilliertem Wasser enthält (nachstehend als NBYE abgekürzt). Die Kultur wird über Nacht in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 28°C inkubiert Diese Kultur wird verwendet, um die Oberfläche von Schrägröhrchen zu beimpfen, die 1,5% Agar in NBYE enthalten, und die beimpften Schrägröhrchen werden über Nacht bei 28°C inkubiert und dann im Kühlschrank aufbewahrt

Die aus einer einzigen gefriergetrockneten Kultur hergestellten gekühlten Schrägröhrchen werden für einen Zeitraum bis zu 4 Wochen nach ihrer Herstellung folgendermaßen verwendet: Eine Öse mit Impfgut aus dem. is Schrägröhrchen wird in einem 250-ml-Etlenmeyerkolben ία 50 ml NBYE dispergiert. Die Kultur wird über Nacht in einer rotierenden Schüttelmaschine bei 28°C inkubiert und dann auf eine Dichte verdünnt, die eine 50prozentige Lichtdurchlässigkeit bei 660 um ergibt 33,2 ml dieser verdünnten Kultur werden zu einem Volumen von 1 1 NBYE zugesetzt, das 15 g Agar enthält und auf 46⁰C gehalten wird. Das beimpfte, agarhaltige Medium wird in Petrischalen aus Kunststoff von 100 x IS mm in Mengen von 5 ml je Schale gegossen, gekühlt und bis zu einem Zeitpunkt von 5 Tagen vor der Verwendung auf 2 bis 4°C gehalten.

Platten mit Staphylococcus aureus ATCC 6538 F werden fclgendermaSen hergestellt:

Eine über Nacht entwickelte Kultur des Analysenorganismus Staphylococcus aureus ATCC 6538 P in Nährbrühe, die O7/o Hefeextrakt enthält, wird mitO,2% Hefeextrakt enthaltender Nährbrühe zu einer Suspension mit einer optischen Durchlässigkeit von 55% bei einer Wellenlänge von 660 mn verdünnt Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar zugesetzt, das durch 2,0 g/l Difco-Hefeextrakt ergänzt worden ist und sich auf einer Temperatur von 47 bis 48⁰C befindet, wobei man eine Mischung erhält, die 33,2 ml der Suspension je Liter Agar enthält 5 ml dieser Suspension werden in Petrischalen von 85 mm Durchmesser gegossen, und diese Platten werden gekühlt und bis zur Verwendung (höchstens 5 Tage) auf 4°C gehalten.

Proben des zu analysierenden Antibioticums werden mit Phosphatpufferlösung vom pH 7 auf eine geeignete Konzentration verdünnt Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 6,35 oder 12,7 mm werden in die Testlösung getaucht und auf die Oberfläche der Analysenplatten gelegt. Die Platten werden über Nacht bei 37⁰C inkubiert, worauf man den Durchmesser der Hemmzone in Millimeter bestimmt Der Durchmesser der Hemmzone in Millimeter bestimmt die relative Stärke.

35 II. Durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion

Der Anteil der bei 301 nm gemessenen Extinktion, der auf den Gehalt unreiner Proben an dem Antibioticum zurückgeführt werden kann, wird durch die selektive Ausiöschung dieser Extinktion (unter gleichzeitiger Inaktivierung der antibiotischen Aktivität) durch Reaktion mit verdünntem Hydroxylamin bestimmt. 4C

Proben, die das zu untersuchende Antibioticum enthalten, werden in O.Olmolarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7) so hergestellt, daß sie eine anfängliche Aj₀₁ zwjjchen 0,1 und I₁O aufweisen. Frisch hergestelltes^ neutralisiertes Hydroxylamin (NH₂OH · HCl + NaOH bfczu_einem End-pH-Wert vonT)yird-Jbkizft^er^ndkonzentration von lOmmolar zugesetzt, worauf man die Reaktion bei Raumtemperatur mindestens 30 Minuten ablaufen läßt. Wenn man den so erhaltenen A₃₀rWert von der ursprünglichen Ablesung (nach Korrektur für die Verdünnung durch das zugesetzte Reagens) subtrahiert, erhält man die durch Hydroxylamin auslösctibare Extinktion. Lösungen von reinem N-Acetylthienamyän zeigen eine durch Hydroxylamin auslöschbare Extinktion von 96,0%.

Beispiel 1 so

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya NRRL 8057 wird aseptisch geöffnet, und der Inhalt wird in einem Rohr suspendiert, das 0,7 ml sterile Davis-Salze der folgenden Zusammensetzung enthält:

Davis-Salze Natriumeitrat 0,5 g

K₂HPO₄ 7,0 g

KH₂PO₄ 3_ä0 g

(NRO₂SO₄ 1,0 g

MgSO₄ · 7H₂O 0,1 g

destilliertes Wasser 1000 ml.

OJ ml dieser Suspension werden verwendet, um ein Kulturschrägröhrchen mit Medium A (mit Agar) der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:

11

Medium A	10,Og
Hefeautolysat	10,0 g
Glucose	2,0 ml
PhosphatpufTer*)	0,05 g
MgSO₄ · 7H₂O	1000 ml
destilliertes Wasser
pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt.
*) Phosphatpufferlösung	91,0 g
KH₂PO₄	95,0 g
Na₂HPO₄	1000 ml
destilliertes Wasser

Für Schrägröhrchen setzt man 25,0 g Agar je Liter zu.
15

Das beimpfte Schrägröhrchen wird 8 Tage bei 28°C inkubiert und dann bei 4⁰C gelagert.
Ein Teil der Sporen und des Luftmycels dieses Schrägröhrchens wird verwendet um einen mit Umlenkorgan versehenen 25ö-ml-Erienmeyer-impfkoiben zu beimpfen, der 50 mi Medium A (ohne Agar) enthält. Dieser Impfkolben wird 2 Tage bei 28°C mit 220 U/min (Hub 5,1 cm) geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat

Fünfzehn 250-ml-Erlenmeyerkolben, die je 40 ml Medium B enthalten, werden mit je 1 ml der Kultur aus dem Impfkolben beimpft. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

Medium B	20,0 g
Maismehl	10,0 g
lösliche Schlempebestandteile	15,0 g
Soj abohnenmehl	4,0 g
Natriumeitrat	0,5 g
CaCl₂-2H₂O	0,1g
MgSO₄ · 7H₂O	0,01g
CoCl₂ · 6H₂O	0,01g
FeSO₄ · 7H₂O	0,25 Vol.-%
Polyglycol 2000	1000 ml
destilliertes Wasser

Aktivität gegen ATCC 6538 P Aktivität gegen ATCC 8461
Hemmzone, mm Hemmzone, mm

"~

39/44 SH 35/44 SH

SH = etwas unscharf.

200 ml der filtrierten Fermentationsflüssigkeit werden auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und an 10 ml Dowex-1 x 2-Harz in der Chloridform mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min adsorbiert, wobei man den Abiauf in Form von iü Fraktionen zu je 20 ml auffingt

Das Adsorbat wird mit einem Gemisch aus 90 VöL-% Methanol und 10 Vol.-% Wasser eluiert, das 3 Gew.-% Ammoniumchlorid enthält, und das Eluat wird in 10 Fraktionen zu je 5 ml aufgefangen. Die Eluatfraktionen Nr. 1 bis 6 werden vereinigt und im Vakuum eingeengt, um das Methanol abzutreiben. Das Konzentrat wird nach der Scheibendiffusionsmethode unter Verwendung von Scheiben von 12,7 mm Durchmesser, die 100 μ] antibiotische Lösung enthalten, gegen Staphylococcus aureus MB-2985 analysiert, wobei man eine Hemmzone von 28 mm erhält

Die Analysenplatten von MB-2985 werden folgendermaßen hergestellt: Eine über Nacht unter Schütteln bei 37°C entwickelte Kultur von MB-2985 in Hirn-Kerz-AufguSsnediurn

wird auf das 20 OOOfache verdünnt und auf die Oberfläche von 10 ml Hirn-Herz-Aufguß-Agar in einer Petrischale mit 85 mm Durchmesser aufgebracht Auf die Platten werden Scheiben von 1,27 mm Durchmesser, die 100 μΐ antibiotische Lösung enthalten, aufgelegt, worauf die Platten 18 Stunden bei 37°C inkubiert werden. Die

Hemmzonen werden in Millimeter abgelesen.

12

MSO 7HO 01 I

³⁵ pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

Diese 15 Produktionskolben werden 53 Stunden bei 28°C mit 220 U/min (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Zum Zeitpunkt des Aberntens (nach 53 Stunden) werden die Fermentationsfiüssigkeiten der 15 Kolben vereinigt, und eine Probe wird zur Analyse zentrifugiert. Vor der Analyse wird der pH der zentrifugierten Fermentationsflüssigkeit mit Natronlauge von 6,5 auf 5,9 eingestellt.

Auf Analysenplatten werden Analysen mit Staphylococcus aureus ATCC 6538 P und Vibrio perccisr.s ATCC 8461 unter Verwendung von 12,7-mm-Scheiben durchgeführt, die in die überstehende Flüssigkeit der zentrifugierten Fermentationsflüssigkeit getaucht werden.

45 Die Analysenergebnisse sind die folgenden:

Beispiel 2

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya NRRL 8057 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt verwendet, um einen mit Umlenkorgan versehenen 250-ml-Erlenmeyer-Impfkolben zu beimpfen, der SO ml Medium A der folgenden Zusammensetzung enthält:

Medium A	10,Og
Hefeautolysat	10,0 g
Glucose	2,0 ml
Phosphatpuffer·)	0,05 g
MgSO₄- 7H₂O	1000 ml
destilliertes Wasser
pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt.
*) Phosphatpufferlösung	91,0 g
KH₂PO₄	95,0 g
Na₂HPO₄	1000 ml
destilliertes Wasser

IS

Dieser Impfkolben wird zwei Tage bei 28°C mit 22Ü ü/min (Hub 5,i cm) geschüttelt, worauf sich eine zufric- ic denstellende Kultur entwickelt hat.

25 30

35 pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

Diese Kolben werden 3 Tage bei 2S"C mit 220 U/rain (Hub 5,! cm) geschüttelt* und während der Fermentation werden Analysen durchgeführt Die Analysen werden auf Standard-Analysenplatten mit Staphylococcus aureus ATCC 6538 P und Vibrio percolans ATCC 8461 unter Verwendung von 1,27-cm-Scheiben durchgeführt, die in die überstehende Flüssigkeit des ZentrifugaU der Fermentationsflüssigkeit getaucht werden. Vor der Analyse wird das pH dieser Fermentationsflüssigkeit, wie in der nachstehenden Tabelle angegeben, eingestellt Die Ergebnisse sind die folgenden:

Medium B	20,0 g
Maismehl	10,0 g
lösliche Schlempebestandteile	15,0 g
Scjabohnenmehl	4,0 g
Natriumeitrat	0,5 g
CaCl₂-2H₃O	0,1g
MgSO. · 7H₂O	0,01g
CoCl₂ · 6H₂O	0,01g
FeSO₄ ■ 7H₂O	0,25 VoL-%
Polyglycol 2000	1000 ml
destilliertes Wasser

33/39 h	31/38 h	21/27 h
35 sh/46 h	36sh/44h	33 sh/38 h
5,2	5,1	4,8
6,1	6a	6,9

Aktivität gegen ATCC 6538P Aktivität gegen ATCC 8461 pH anfänglich pH eingestellt auf

jh - etwas unscharf. ■

h - unscharf.

Nach 53 Stunden werden die Fermentationsflüssigkeiten vereinigt und filtriert. Man erhält 590 ml Ffltrat (pH 5,9). Der pH-Wert des Filtrats wird auf 7,0 eingestellt, worauf man 5,9 mg Äthylendinitriltetraessigsäure (EDTA) zusetzt.

580 ml dieses Filtrats (pH 7,0) werden an 130 ml Dowex-1 x 2-Harz in der Chloridform adsorbiert, wobei man den Ablauf in Form von 2 Fraktionen zu je 290 ml auffangt Dann wird das Adsorbat mit 130 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das gewaschene Adsorbat wird über Nacht im Kühlraum aufbewahrt und dann mit 5%iger Kochsalzlösung eluiert, wobei man 6 Fraktionen zu je 50 ml auffängt

Die prozentuale Gewinnung der anfanglichen Bioaktivität, bestimmt nach der Scheibenplattenmethode, ist nachstehend angegeben:

13

Fraktion

Vibrio percolans ATCC 8461

Staph. aureus ATCC 6538 P

Eluatfraktionen Nr. 1 bis S

26%

1%

Das Antibiotikum N-Acetylthienamycin findet sich in den Fraktionen Nr. 1 bis 5 des NaCl-Eluats. Die Fraktion Nr. 4 wird nach der Scheibendiffusionsmethode unter Verwendung von Scheiben von 1,27 cm Durchmesser, die 100 μΐ antibiotische Lösung enthalten, gegen Staphylococcus aureus MB-298S analysiert, wobei man einen Hemmzonendurchmesser von 29 mm erhält. Die Platten mit MB-298S werden nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt.

Beispiel 3

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya NRRL 8057 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 0,8 ml sterilen Davis-Salzen der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

Davis-Salze	0,5 g
Natriumeitrat	7,0 g
K₂HPO₄	3,0 g
KH₂PO₄	1,0 g
(NH₄)JSO₄	0,1g
MgSO₄ · 7H₂O	1000 ml
destilliertes Wasser

Diese Suspension wird verwendet, um vier Schrägröhrchen mit Medium A (mit Agar) der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:

Medium A Hefeautolysat Glucose

Phosphatpuffer*) MgSO₄-7H₂O destilliertes Wasser

10,0 g
10,0 g
2,0 ml
0,05 g
1000 ml

pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt. *) Phosphatpufferlösung

KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,0 g

destilliertes Wasser 1000 ml

FQr Schrägröhrchen setzt man 25,0 g Agar je Liter zu. Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 28°C inkubiert und dann bei 4°C gelagert.

10 ml Medium A (ohne Agar) werden aseptisch auf eines dieser Schrägröhrchen übertragen, die Sporen und das Luftmycel werden in Suspension geschabt, und 1,2 ml dieser Suspension werden verwendet, um drei mit Umlenkorganen versehene 2-1-Erlenmeyerkolben zu beimpfen, die je 500 ml Medium A (ohne Agar) enthalten. Diese Impfkolben werden 24 Stunden bei 28⁰C mit 160 U/min geschüttelt, worauf sich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat.

Die Kulturen aus diesen Impfkolben werden vereinigt und verwendet, um 467 1 Medium A (ohne Agar) in einem 7561 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. Dieser Fermenter arbeitet 24 Stunden bei 28°C, wobei man mit 130 U/min rührt und 2831 Luft je Minute hindurchleitet Nach Bedarf wird Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000), jedoch nicht in Mengen von mehr als 0,1%, zugesetzt Die pH-Bestimmungen haben die folgenden Ergebnisse:

Alter, h
0

24

pH

6,3

6,4

4541 der Kultur in diesem Impffermenter werden verwendet, um 40821 Medium E in einem 56701 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. Medium E hat die folgende Zusammensetzung:

Medium E

Dextrose 25,0 g

Maisquellwasser (auf Naßbasis) 15,0 g

lösliche Schlempebestandteile 10,0 g

Baumwollsaatmedium 5,0 g

CoCl,-6H₂O 0,01g

CaCO₃ (nach pH-Einstellung) 3,0 g Polyglycol 2000 0,25%

Leitungswasser 1000 ml pH mit NaOH auf 7,3 eingestellt.

Dieser Fermenter wird 138 Stunden bei 24⁰C unter Rühren mit 70 U/min und Hindurchleiten von Luft mit einer Geschwindigkeit von 1,54 m³/min betrieben. Nach Bedarf wird weiteres Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000), aber nicht in Mengen von mehr als 0,1%, zugesetzt. Es werden antibakterielle Analysen mit den folgenden Ergebnissen durchgeführt:

Alter, h	pH	ATCC Nr. 6633
		(9,5-mm-Scheiben),
		Hemmzone, mm
Q		0
24		0
36	6,0	0
48	5,9	0
60	6,0	23
72	5,9	-
84	6,0	21
96	6a	-
108	6,5	35
120	6,6	36
13?.	6,7	41
138	6,7	39

Die 4082 1 Fermentationsflüssigkeit werden durch eine 76-cm-Filterpresse unter Beimischung eines FfiterhÜfemittels in βϊηςΓ Menge von 4 GewichtsteÜen je 100 Raumteile filtriert. Zu dem Filtrat werden 46 g Natriumsalz von Äthylendinitriltetraessigsäure (EDTA) zugesetzt. Das Filtrat wird auf 6⁰C gekühlt, auf einen pH-Wert von 4,5 ± 0,2 eingestellt und auf 6°C gehalten. Das kalte Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit von 48 l/min in eine 4801 fassende Kolonne mit Dowex-50 x 4 Na⁺ (300-840 μ) eingegeben. Nach einem Vollauf von 14001 wird ein Ablauf von 18,91 aufgefangen, dessen pH-Wert mit Natronlauge auf 7,08 eingestellt wird, und der bei 5°C gelagert wird.

Eine Kolonne von 3,8 cm Durchmesser, die mit 300 ml Dowex-1 x 2 (150-300 μ) in der Chloridfcnn gefüllt ist, wird mit 600 ml entmineralisiertem Wasser von 5⁰C gewaschen. 41 des kalten Ablaufs von der Dowex-50 x 4-Kolonne werden mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/min durch diese Kolonne geleitet Dann wird die Kolonne mit 300 ml 25[unolarer EDTA-Lösung gewaschen. Das Antibioticum N-Acetylthienamycin wird mit eineT Geschwindigkeit von 15 ml/min bei 5⁰C mit 900 ml 5%iger Kochsalzlösung eluiert, die 0,01me?ar an Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) und 25 fimolar an EDTA sind. 14 Fraktionen zu je 75 ml werden aufgefangen und nach der Scheibendiffusionsmethode auf ihre biologische Aktivität analysiert. Die Eluatfraktionen Nr. 3 bis 9, deren Menge 525 ml beträgt, werden vereinigt und im Vakuum zu 115 ml eingeengt Das Konzentrat enthält 65% des gesamten, in die Dowex-1 X 2 CP-Kolonne eingebrachten bioaktiven Materials.

Das Konzentrat des Dowex-1 x 2 CP-Eluats wird bei 5⁰C in eine Kolonne mit einem Durchmesser von 3,8 cm eingegeben, die mit 450 ml vorgewaschenem XAD-2 beschickt ist Das XAD-2 wird kolonnenweise nachein- so ander mit je 4 Kolonnenvolumina 1) 0,00 lmolarer EDTA-Lösung, 2) In NaOH, 3) entmineralisiertem Wasser, 4) In HCl, 5) entmineralisiertem Wasser, 6) Methanol, 7) Aceton, 8) entmineralisiertem Wasser uad vor der Verwendung mit 2250 ml 5%iger NaCl-Lösung vorgewaschen, die 25fj«nolar an EDTA ist

Nach dem Einbringen der Probe in die Kolonne gibt man ?wei Anteile zu je 25 ml Wasser auf.Jjie Kolonne wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 ml/min bei 5°C mit entmineralisiertem Wasserentwiäelt. Es werden eine erste Fraktion von 400 ml und dann 11 weitere Fraktionen zu je 75 ml aufgefangen. Der pH-Wert einer jeden Fraktion wird mit In Natronlauge bzw. In Salzsäure zwischen 6,9 und 7,13 eingestellt Die Fraktionen Nr. 3 bis 9, die 46% des gesamten, in die XAD-2-Kolonne eingegebenen bioaktiven Materials enthalten, werden zu einem Gesamtvolumen von 490 ml vereinigt Eine Probe von 45 ml wird für Bioanalysen nach, der Standard-Scheibendiffusionsmethode gegen Staphylococcus aureus ATCC 6538 P entnommen. Die verbleibenden 445 m! werden unter Vakuum auf 50 ml eingeengt

Die 50 ml Konzentrat des XAD-2-Eluats werden bei 5⁰C mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min in eine Kolonne von 1,5 cm Durchmesser eingegeben, die mit 40 ml vorgewaschenem Dowex-1 x 4 Cl" (Teilchengroßen <37 μ) beschickt ist Das Dowex-1 x 4 CP-Harz (<37 μ, bestimmt durch Dekantieren von Wasser) wird vor der Verwendung mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min kolonnenweise mit 240 ml 0,2molarer Kochsalzlösung, die 0,005rno!ar an NH₄Cl and 0,1 rnmolar an NH₄OH ist, und dann mit der gleichen Geschwindigkeit mit 120 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen.

Im Anschluß an diese Probe werden zwei Anteile zu je 5 ml entmineralisierten Wassers in die Kolonne ein-

15

gegeben. Die Kolonne wird bei 5°C mit einer Geschwindigkeit vonO,92 ml/min mit 0,07molarer Kochsalzlösung entwickelt, die 0,005molar an NH₄Q und 0,lmmolar an NH₄OH ist Dabei werden Fraktionen zu 8,6 bis 9,3 ml aufgefangen. Die Fraktionen, die mit einem Ablaufvolumen von 600 ml beginnen und mit einem Volumen von 710 ml enden, weiten vereinigt; de enthalten 98% des gesamten, in die Dowex-1 x 4-Kolonne eingebrachten

s bioaktiven Materials. Diese Flüssigkeit wird im Vakuum auf 2 ml eingeengt

Das Dowex-1 X 4-Konzentrat wird in eine Kolonne mit einem Durchmesser voa 2,2 cm eingegeben, die mit 225 ml Bio-Gel P-2 (37-74 μ) mit einer Ausschlußgrenze von 1800 Dalton (zuvor bestimmt durch Dekantieren von destilliertem Wasser) beschickt ist -

Vor der Verwendung wird die Bio-Gel P-2-Kolcnne mit 22S ml lmolarer Kochsalzlösung und dann mit 100 ml

ίο entmineralisiertem Wasser gewaschen. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min bei 5⁰C mit entmineralisiertem Wasser entwickelt, wobei Fraktionen zu je 2 ml aufgefangen werden. Die von 104 bis 128 ml aufgefangenen Eluatfraktionen enthalten 83% der in die Bio-Gel P-2-Kolonne eingebrachten Bioaktivität und werden vereinigt und zu 1,58 ml eingeengt

Eine Kolonne mit 50 ml XAD-2 (1,6 cm x 27 cm) wird hergestellt und kolonnenweise mit je 200 ml Immolarer

is EDTA-Lösung, In Natronlauge, entmineralisiertem Wasser, In HCl, entmineralisiertem Wasser, Methanol, Aceton und entmineralisiertem Wasser vorgewaschen. Das Konzentrat des Bio-Gel P-2-Eluats, das 44,4 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält, wird bei 5⁰C in die XAD-2-Kolonne eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 2 ml entmineralisierten Wassers nachgießt Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser gewaschen, bis die UV-Extinktion (absorbance) der Waschflüssigkeiten bei 300 mn auf 0,060 abgenommen hat Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit 50%igem Methanol in entminerrMsiertem Wasser gewaschen, wobei Fraktionen zu je 1 ml aufgefangen werden. Die Fraktionen mit einer Extinktion (absorbance) bei 300 mn von mehr als 0,1 werden vereinigt und im Vakuum eingeengt Als Produkt erhält man N-Acetylthienamycin mit 11,6 durch Hydroxylamin auslöschbaren optischen Dichteeinheiten.

Beispiel 4

Davis-Salze Natriumeitrat 04 g

K₂HPO₄ 7,0 g

KH₂PO₄ 3,0 g

(NH₄^SO₄ 1,0 g

MgSO₄ · 7H₂O 0,1 g

destilliertes Wasser 1000 ml.

Medium A

Hefeautolysat 10,0 g

Glucose 10,0 g ,.,

Phosphatpuffer*) 2,0 ml Ö

MgSO₄ · 7H₂O 0,05 g

destilliertes Wasser 1000 ml |

pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt. |

*) Phosphatpufierlösung |

KH₁PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,0 g *i

destilliertes Wasser 1000 ml _,,;

FOr Schrägröhrchen setzt man 25,0 g Agar je Liter zu. Cj Die beimpften Schrägröhrchen werden eine Woche bei 28°C inkubiert und dann bei 4⁰C gelagert. r

10 ml Medium A werden aseptisch auf eines dieser Schrägröhrchen übertragen, die Sporen und das Luftmycel ΐ

werden in Suspension geschabt, und 1,2 ml dieser Suspension werden verwendet, um drei mit Umlenkorganen "

¹ versehene 2-1-Erlenmeyerkolben zu beimpfen, die je 500 ml Medium A (ohne Agar) enthalten. Diese Impfkol· ben werden 24 Stunden bei 28°C mit 160 U/min geschüttelt, worauf »ich eine zufriedenstellende Kultur entwickelt hat.

Die Kulturen aus diesen Impfkolben werden vereinigt und verwendet, um 467 1 Medium A (ohne Agar) in

einem 7561 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. Dieser Fermenter arbeitet 24 Stunden bei 28⁰C, wobei man mit 130 U/min rührt und 2831 Luft je Minute hindurchleitet. Nach Bedarf wird Schaumverhütungsmittel (Polyglycol 2000), jedoch nicht in Mengen von mehr als 0,1%, zugesetzt. Die pH-Bestimmungen haben die folgenden Ergebnisse:

Aber, h

O 24

pH 6,3 6,4

.Medium E

Dextrose 25,0 g

Maisquellwasser (auf Naßbasis) 15,0 g

lösliche SchlempebestandteOe 10,0 g _ls

Baumwollsaatmedium 5,0 g

CoCI₂-6H₂O 0,01g

CaCO₃ (nach pH-Einstellung) 3,0 g . " Polyglycol 2000 0,25% Leitungswasser 1000 ml

pH ffitt NaOH auf 7,3 eingestellt

Dieser Fermenter wird 138 Stunden bei 24°C unter Rühren mit 70 U/min und Hindurchleiten von Luft mit einer Geschwindigkeit von 1,54 nrVmin betrieben. Nach Bedarf wird weiteres Schaumverhütunasmittel (Polyglycol 2000), aber nicht in Mengen von mehr als 0,1%, zugesetzt Es werden antibakterielle Analysen mit den fol- _u gendsn Ergebnissen durchgeführt:

Die 40821 Fermentationsflüssigkeit werden durch eine 76-cm-Filterpressc unter Beimischung eines Filterhilfsrniiiels in einer Menge von 4 GewichtsteUen je 100 Raumteüe filtriert. Zu dem Filtrat werden 46 g Natriumsalz von Äthylendinitriltetraessigsäure (EDTA) zugesetzt. Das Filtrat wird auf 6⁰C gekühlt, auf einen pH-Wert von 4,5 ± 0,2 eingestellt und auf 6⁰C gehalten. Das kalte Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit von 4S l/min in eine 4801 fassende Kolonne mit Dowex-50 x 4 Na⁺ (300-840 μ) eingegeben. Nach einem Vorlauf von 14001 wird ein so Ablauf von 18,9 I aufgefangen, dessen pH-Wert mit Natronlauge auf 7,08 eingestellt wird, und der bei 5°C gelagert wird.

Eiw Kolonne von 3,8 cm Durchmesser, die mit 300 ml Dowex-1 X 2 (150-300 μ) in der Chloridform gefüllt ist, wird mit 300 ml entmineralisiertem Wasser von 5°C gewaschen. 41 des kalten Ablaufs von der Dowex-50 X 4-Kolonne werden mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/min durch diese Kolonne geleitet Dann wird die Kolonne mit 350 ml 25μΐηοΐΒΓβΓ EDTA-Lösung gewaschen und bei 5⁰C mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/ min mit 900 ml 5%iger NaCl-Lösung eluiert, die 0,01 molar an Iris · HCl (pH 7) und 25μΐηο1ίΐΓ an EDTA ist. Es werden Fraktionen zu je 75 ml aufgefangen und nach der Scheibendiffusionsmethode gegen Staphylococcus aureus ATCC 6538 P analysiert Die Fraktionen Nr. 4 bis 10, die 47% der eingebrachten Bioaktivität enthalten, werden zu 42,1 ml der Probe zugesetzt, die in Beispiel 3 aus den vereinigten Fraktionen von der ersten XAP-2- eo Adsorption für d ie Analyse entnommen worden waren. Diese vereinigten Fraktionen werden im Vakuum zu 100 ml eingeengt und mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,32 eingestellt.

Eine Kolonne mit einem Durchmesser von 3,8 cm, die mit 450 ml XAD-2-Harz beschickt ist, wird kolonnenweise nacheinander mit je 4 Kolonnenvolumina 1) O.OOlmolarer EDTA-Lösung, 2) In NaOH, 3) entmineralisiertem Wasser, 4) 1 η HCI, 5) entmineralisiertem Wasser, 6) Methanol, 7) Aceton, 8) entmineralisiertem Wasser vorgewaschen und vor der Verwendung mit 2250 ml 5%iger NaCl-Lösung gewaschen, die 25μπιο1βτ an EDTA ist. Das obige Konzentrat wird in die XAD-Kolonne eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 5 ml entmineralisiertem Wasser nachgießt. Die Kolonne wird bei 5⁰C mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min mit entminerali-

17

Alter, h	pH	ATCC Nr. 6633
		(9,5-mm-Scheiben),
		Hemmzone, mm
0	6,9	0
24	6,3	0
36	6,0	0
48	5,9	0
60	6,0	23
72	5,9	-
84	6,0	21
96	6a	-
108	6,5	35
120	6,6	36
132	6,7	41
138	6,7	39

siertem Wasser entwickelt Es werden eine erste Fraktion zu 40 ml und weitere Fraktionen zu je 75 ml aufgefangen und nach der Scheibendiffusionsmethode analysiert Die Fraktionen Nr. 9 bis 15, die 22% der in die XAD-2-Kolonne eingegebenen Bioaktivität enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zu 56 ml eingeengt

Eine 21 cm x 1,7 cm messende Kolonne, die mit 40 mlDowex-1 X4-CT (<37 μ, bestimmt durch Dekantieren von Wasser) beschickt ist, wird vor der Verwendung mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit 240 ml O^molarer NaCl-Lösung, die 0,005molar an NH₄Cl und O.lmmolar an NH₄OH ist, und <*a"" mit der gleichen Geschwindigkeit mit 120 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen.

Das XAD-2-Konzentrat wird in die Kolonne eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 2 ml entmineralisiertes Wasser und dann zwei Anteile zu je 2 ml Eluierungspuffer nachgießt Die Kolonne wird mit einer Geschwin-

digkeit von 1 ml/min bei 5°C mit einer O^molarenNaCl-Lösung, die 0,005molar an NH₄Cl und O.lmmolar an NH₄OH ist, eluiert Es werden Fraktionen zu je 10 ml aufgefangen und nach der Scheibendiffusionsmethode analysiert Die von 544 bis 647 ml aufgefangenen Eluatfraktionen enthalten scheinbare 100% der eingegebenen Bioaktivität und werden miteinander vereinigt und im Vakuum auf 23 ml eingeengt Das Konzentrat enthält 36,4 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten.

Eine 2^ cm x 62 cm messende Kolonne, die mit 225 ml Bio-Gel P-2-Harz (37-74 μ) mit einer Ausschlußgrenze von 1800 Dalton beschickt ist, wird vor der Verwendung mit 225 ml lmolarer Kochsalzlösung und damn mit 100 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen. Das Dowex-1 x 4-Konzentrat wird in die Kolonne eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 2 ml entmineralisierten Wassers nachgießt Die Kolonne wird bei 5⁰C mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser entwickelt wobei Fraktionen zu je 2 ml auf-

gefangen werden, die dann nach der Scheibendifrusionsmethode analysiert werden. Die Fraktionen von 124 bis 129 ml, die 7,04 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthalten, werden vereinigt und im Vakuum zu 2 ml einer wäßrigen Lösung des Produkts N-Acetylthieaamycin eingeengt Die von 117 bis 123 ml und von 130 bis 139 ml Eluat aufgefangenen Fraktionen werden zu einer Lösung des Produkts N-Acetylthienamycin vereinigt, die 13,7 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält.

Beispiel 5 Herstellung von Thienamycin

Ein Rohr mit einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces cattleya NRÄL 8057 wird aseptisch geöffnet und der Inhalt in 60 ml sterilem Medium A in einem mit Umlenkorgan versehenen 250-ml-Erlenmeyerkolben suspendiert Medium A hat die folgende Zusammensetzung:

Medium A

Hefeautolysat 10,0 g

³⁵ Glucose 10,0 g

Phosphatpuffer*) 2,0 ml

MgSO₄ · 7H₂O 0,05 g

destilliertes Wasser 1000 ml

40 pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt.

*) Phosphatpuflerlösung

KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,0 g

destilliertes Wasser 1000 ml

Der beimpfte Kolben wird bei 28⁰C 48 Stunden mit 220 U/min (Hub 5,1 cm) geschüttelt. Aus der 48 Stunden alten Fermentationsflüssigkeit werden 40 ml aseptisch entnommen und mit 40 ml sterilem, 20vol.-%igem wäßrigem Glycerin gemischt Mengen von je 2 ml dieses Gemisches werden in sterile, 3,53 ml fassende Ampullen einpipettiert, dann ausgefroren und in der Dampfphase einer mit flüssigem Stickstoff betriebenen Gefriervorrichtung gelagert.

Der gefrorene Ampulleninhalt wird verwendet, um einen mit Umlenkorgan versehenen 250-ml-Erlenmeyerkolben zu beimpfen, der 50 ml Medium A enthält. Dieser Impfkolben wird 24 Stunden bei 28°C mit 160 U/min geschüttelt

Aus diesem Impfkolben entnommene Anteile von je 10 ml werden verwendet, um mit Umlenkorgan versehene 2-1-Erlenmeyerkolben zu beimpfen, die je 500 ml Medium A enthalten. Diese Impfkolben werden 24 Stunden mit 160 U/min bei 28°C geschüttelt.

1000 ml des vereinigten Inhalts dieser Impfkolben werden verwendet, um 4671 Medium A in einem 7561 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. In diesem Fermenter wird die Fermentation 24 Stunden bei 28⁰C, einer Rührgesehwindigkeit von 130 U/min und einer Lüftströmungsgeschwindigkeit von 283 l/min durchgeführt. Nach Bedarf wird Polyglycol 2000 (Dow Chemical Corp.) als Schaumverhütungsmittel, jedoch nicht in größerer Menge als 0,1%, zugesetzt. pH- und Dextrosegehaltmessungen haben die folgenden Ergebnisse:

Alter, h 65 0 12 24

pH 6,4 6,4 6,6

Dextrose, mg/ml 8,1 8,1 8,1

18

453 1 dieser Kultur werden verwendet, um 40821 Medium E in einem 56701 fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl zu beimpfen. Medium E hat die folgende Zusammensetzung:

Medium E

Dextrose -' 25,0 g

Maisquellwasser (auf Naßbasis) 15,0 g

lösliche Schlempebestandteile 10,0 g

Baumwollsaatmedium 5,0 g

CoCl₂ 6H₂O 0,01g

CaCO₃ (nach pH-Einstellung) 3,0 g Polyglycol 2000 0,25% Leitungswasser 1000 ml

pH mit NaOH a«f 7,3 eingestellt

In diesem Fermenter wird die Fermentation 144 Stunden bei 24⁰C mit einer Rührgeschwindigkeit von 70 U/min und einer Luftströmungsgeschwindigkeit von 144 mVmin durchgeführt Nach Bedarf wird als Schaumverhütungsmittel Polyglycol 2000, aber nicht in größeren Mengen als 0,1%, zugesetzt Die zentrifugierte Fermentationsflüssigkeit wird nach der Standard-Scheibendiffusionsmethode gegen Staphylococcus aureus ATCC 6538 P analysiert. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tauelle unter der Überschrift »Antibiotische Aktivität gegen ATCC 6538 P«. Forner werden Analysen nach der Scheibendiffusionsmethixie unter Verwendung von 9,5-nMn-Filterpapierscheiben und10-ml-Analysenplatten durchgeführt; die Ergebnisse dieser Analysen sind in der nachstehenden Tabelle unter der Überschrift »Antibiotische Aktivität (10-ml-Platten)« angegeben.

Die 10-ml-Analysenplatten werden folgendermaßen hergestellt: Eine über Nacht in Nährbrühe mit einem Hefeextraktgehalt von 0,2% entwickelte Kultur des Analysenor^anismus Staphylococcus aureus ATCC 6538 P wird mit Nährbrühe, die 0,2% Hefeextrakt enthält, zu einer Suspension verdünnt, die bei einer Wellenlänge von 660 nm eine optische Durchlässigkeit von 40% aufweist Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar zugesetzt, das durch 2 g Difco-Hefeextrakt je Liter ergänzt ist und sich auf einer Temperatur von 47 bis 48°C befindet; das so erhaltene Gemisch enthält 33,2 ml der Suspension je Liter Agar. Je 10 ml dieser Suspension werden in Petrischalen von 85 mm Durchmesser gegossen, und diese Platten werden gekühlt und bis zur Verwendung (höchstens 5 Tage) auf 4⁰C gehalten.

Alter	pH	Dextrose, mg/ml	Antibiotische	Antibiotische
			Aktivität gegen	Aktivität (10-mm-
			ATCC 6538 P,	Platten),
			mm Hemmzone	mm Hemmzone

	0
I	12
ft	24
ff	36
I	48
fs	60
	72
t	84
S\|	96
ψι	108
%3 Si-ί	120
	132
*5	144

6,6
6,3
5,8
6,0
6,0
5,7
5,3
6,2
6,4
6,4
6,3
5,8
5,9

22,2 204 18,0

na

8,6 6,4 2,7 0,3 OJ 0

_JL_

414
43,0

264
25p
274
36,0
35,0
37,0
37,5
37,5

Die 40821 Fermentationsflüssigkeit werden durch eine 76-cm-Filterpresse nach Zumischung von 5 Gewichtsteilen Filterhilfsmittel je 100 Raumteile filtriert. Das Filtrat wird mit 12 g Natriumsalz von Äthylendinitrilotetraessigsäure versetzt. Das Filtrat wird auf 6⁰C gekühlt, auf einen pH-Wei< von 4,5 ±0,2 eingestellt und auf 6⁰C gehalten. Das kalte Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit von 481/nin an 4801 Dowex-50 X4 Na⁺ (300-840 μ) adsorbiert. Das Adsorbat wird mit 4801 entmineralisiertem Wasser gewaschen und dann mit einer Geschwindigkeit von 24 l/min mit 2%igem wäßrigem Pyridin eluiert. Dabei werden drei Fraktionen zu 3001,5201 bzw. 2401 aufgefangen und bei einem pH-Wert von 7,0 analysiert. Die Analysen zeigen, daß die Eluatfraktionen 4%, 16% bzw. 6% der in die Dowex-50 X 4 Na⁺-Kolonne eingegebenen Bioaktivität enthalten. Die Eluatfraktion Nr. 2 wiird auf 48 1 eingeengt und auf einen pH-Wert von 7 eingestellt.

Die 481 Konzentrat werden auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt und mit einer Geschwindigkeit von 7,6 l/min an 761 Dowex-1 x 2 ic der Chloridform (150-300 μ) adsorbiert. Das Harz wird mit dergleichen Geschwindigkeit mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Es werden vier Fraktionen, zwei zu je 481, eine zu 701 und eine zu 481,

aufgefangen. Die Fraktionen werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Analysen zeigen, daß 68% der Ausgangsbioaktivität in der 70-1-Fraktion enthalten sind. Diese Fraktion wird bei einem pH-Wert von 7,0 auf 181 eingeengt und durch ein »Millipore«-Filter mit Poren von 0,45 μ filtriert. Das Filtrat wird in Schalen gefriergetrocknet; man erhält 99 g Produkt mit einer Stärke von 310 Einheiten/mg, wobei eine Einheit als diejenige S Menge definiert ist, die nach der Scheibendiffusionsmethode gemäß einer Berechnung gegen Staphylococcus aureus ATCC 6538 P die gleiche Hemmzone erzeugt wie 1 y Cephalothin/ml, wobei die Hemmzone einen Durchmesser zwischen 16 und 21 mm hat.

10 g der gefriergetrockneten Feststoffe werden in 0,1 molarem 2,6-Lutidinacetat-Puffer (pH 6,3) aufgenommen. 125 ml dieser Lösung werden mit Essigsäure wieder auf einen pH-Wert von 6,3 eingestellt und in eine

ίο Kolonne von Dowex-50 Χ 8 in der 2,6-Lutidinform (Teilchengröße 37-74 μ, Abmessungen 7,6 x 142 cm) eingegeben, die zuvor mit dem Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit voe 25 ml/min mit 0,lmolarer Pufferlösung entwickelt. Nach einem Verlauf von 3 1 werden 200 Fraktionen zuje 20 ml aufgefangen. Jede vierte der Fraktionen Nr. 36 bis 192 wird bei einer Verdünnung von 1 : 200 analysiert. Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen Nr. 56 bis 192 und erreicht ein Maximum in den Frak-

IS tionen Nr. 92 bis 96. Die Fraktionen Nr. 80 bis 136 werden vereinigt und durch Zusatz von 590 ml entmineralisiertem Wasser auf ein Volumen von 1760 ml gebracht. Die vereinigte, verdünnte Lösung, die 62% der in die Dowex-50 X 8-KoIonne eingebrachten Ausgangsbioaktivität enthält, wird gefriergetrocknet.

Die gefriergetrockneten Feststoffe werden in ö.Imoiarer 2,6-Luiidinacecaiiösung (pH 7,0) geiöst. Die Lösung (27 ml) wird in eine 5 X112 cm messende Kolonne mit Bio-Gel P-2 (37-74 μ) eingegeben, die zuvor mit O.lmolarer Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Dann wird das Gel mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min mit der gleichen Pufferlösung entwickelt.

Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer überwacht. Die Entwicklung wird fortgesetzt, bis 105 Fraktionen zuje 20 ml aufgefangen worden sind. Jede der Fraktionen Nr. 70 bis 93 wird bei einer Verdünnung von 1:300 analysiert. Die Bioaktivität Findet sich in den Fraktionen Nr. 73 bis 82 und erreicht ein Maximum in den Fraktionen Nr. 77 und 78. Die Fraktionen Nr. 75 bis 80 werden zu 90 mg Antibioticum mit einer mittleren Stärke von 10 000 Einheiten/mg gefriergetrocknet.

Die 90 mg gefriergetrockneten Feststoffe werden in 4 ml O.Olmolarev Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7) aufgenommen. Diese Lösung, die 596 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält (dieses MaB für den Thienamycingehalt ist in dem Abschnitt über Analyse beschrieben) wird in eine Kolonne mit einem Durchmesser von 1,7 cm eingegeben, die mit 90 ml vorgewaschenem XAD-2 beschickt ist und vor der Verwendung bei 5°C mit 180 ml 0,01 molarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7) ins Gleichgewicht gebracht worden ist Das XAD-2 wird vor der Verwendung nacheinander mit 1)5 Raum teilen 1 n NaOH und anschließend entmineraJisiertem Wasser, bis der Ablauf neutral reagiert, 2) 5 Raumteilen In HCI und anschließend entmineralisiertem Wasser, bis der Ablauf neutral reagiert, 3) je 5 Raumteilen Methanol, Aceton, 0,001 molarer Tetranatrium-EDTA-Lösung und schließlich destilliertem Wasser gewaschen. Vor der Verwendung wird an alle diese Lösungsmittel eis Vakuum angelegt.

Nach dem Einbringen der Probe in die Kolonne gießt man zwei Anteile zu je 2 ml Phosphatpufterlösung nach. Die Kolonne wird bei 5°C mit der Pufferlösung mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min entwickelt. Es werden Eluatfraktionen zuje 4 ml aufgefangen. Die nach Durchlauf von 100 ml Eluat bis zum Durchlauf von 253 ml aufgefangenen Fraktionen werden miteinander vereinigt «and in einem rotierenden Verdampfer unter Vakuum bei einer Temperatur unterhalb 1O⁰C auf 6 ml eingeengt.

Diese Lösung, die 436 mit Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält, wird in eine Kolonne mit 1,7 cm Durchmesser eingegeben, die mit 90 ml, wie oben beschrieben, vorgewaschenem XAD-2 beschickt und bei 5⁰C mit destilliertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Nach Aufgabe der Probe gießt man zwei Anteile zu je 2 ml destillierten Wassers nach. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min mit destilliertem Wasser entwickelt. Dabei werden Eluatfraktionen zuje 4 ml aufgefangen. Die Fraktionen, die nach Durchlauf von 100 ml Eluat bis zum Durchlauf von 151 ml aufgefangen werden, werden miteinander vereinigt und in einem rotierenden Verdampfer auf ein Volumen von 2,73 ml eingeengt, und diese Lösung wird gefriergetrocknet Man erhält 6,49 mg Thienamycin. Die zwischen 152 ml und 345 ml erhaltenen

so Eluatfraktionen werden vereinigt und in einem rotierenden Verdampfer auf sin Volumen von 3,34 ml eingeengt und gefriergetrocknet. Sie ergeben 1143 mg Thienamycin. Diese Fraktionen enthalten insgesamt 369 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten. Dies entspricht einer 3,1 fachen Reinigung des in die erste XAD-2-Kolonne eingegebenen Materials und liefert eine berechnete Stärke von 31000 Einheiten/mg. Die spektrophotometrische Analyse einer Probe dieses Produkts zeigt £{*„, = 253, gemessen in Phosphatpuffer-

55 lösung (pH 7) bei 297 nm.

Eine Probe von 10 g der 99 g gefriergetrockneter Feststoffe, die bei der oben beschriebenen Reinigung mit Dowex-1 x 2 erhalten worden sind, wird in 0,1 molarem 2,6-Lutidinacetatpnffer (pH 6,3) aufgenommen. Die Lösung (125 ml) wird mit Essigsäure wieder auf einen pH-Wert von 6,3 eingestellt und in eine 7,6 X142 cm messende Kolonne mit Dowex-50 x 8 in der 2,6-Lutidinform eingegeben, die zuvor mit der Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 35 ml/min mit 0,1 molarer Pufferlösung entwickelt. Nach einem Vorlauf von 3,61 werden 200 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen. Jede vierte der Fraktionen Nr. 6 bis 194 wird bei einer Verdünnung von 1: 200 analysiert Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen Nr. 18 bis 178 und erreicht ein Maximum in den Fraktionen Nr. 62 bis 82. Die Fraktionen Nr. 42 bis 102 werden vereinigt und durch Zusatz von 640 ml eatmineralisiertcm Wasser auf ein Volumen von 1920 ml gebracht Die vereinigte, verdünnte Lösung enthält 63% der in die Dowex-50 x 8-Kolonne eingebrachten Bioaktivität und wird gefriergetrocknet

Die gefriergetrockneten Feststoffe werden in O,lmolarer2,6-Lutidinacetat-Pufferlösung (pH 7,0) gelöst Diese Lösung (25 ml) wird in eine 5 x 112 cm messende Kolonne mit Bio-Gel P-2 (37-74 μ) eingegeben, die zuvor mit

0,1 molarer Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Dann wird das Gel mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/min mit der gleichen Pufferlösung entwickelt.

Der Ablauf wird mit einem registrierenden Differentialrefraktometer überwacht. Die Entwicklung wird fortgesetzt, bis 125 Fraktionen zu je 20 ml aufgefangen worden sind. Jede der Fraktionen Nr. 70 bis 89 wird bei einer Verdünnung von 1 : 300 analysiert. Die Bioaktivität findet sich in den Fraktionen Nr. 72 bis 81 und erreicht ein s Maximum in der Fraktion Nr. 77. Die Fraktionen Nr. 75 bis 79 werden zu 100,5 mg Antibioticum mit einer Stärke von 8320 Einheiten/mg gefriergetrocknet.

Di* 100,5 mg gefriergetrockneter Feststoffe werden in 4 ml 0,01molarer Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7) aufgenommen. Diese Lösung, die 692 mit Hydroxylamin auslöschbare optische Einheiten enthält, wird in eine Kolonne mit 1,7 cm Durchmesser eingegeben, die mit 90 ml vorgewaschenem XAD-2 beschickt ist und vor der Verwendung mit 180 ml 0,01 molarer fcliumphosphatpufferlösung (pH 7) bei 5°C ins Gleichgewicht gebracht wird. Vor der Verwendung wird das XAD-2 nacheinander mit 1) 5 Raumteilen In Natronlauge und anschließend mit entmineralisiertem Wasser, bis der Ablauf neutral reagiert, 2) 5 Raumteilen In HCl und anschließend mit entmineraluiertem Wasser, bis der Ablauf neutral reagiert, 3) je 5 Raumteilen Methanol, Aceton, 0,001 molarer Tetranatrium-EDTA-Lösung und schließlich destilliertem Wasser gewaschen. An alle diese Lösungsmittel wird is vor der Verwendung Vakuum angelegt.

Nach dem Eingeben der Probe in die Kolonne werden zwei Anteile zu je 2 ml Phosphatpufferlösung nachgegossen. Die Kolonne wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/min bei 5⁰C mit der Pufferlösung entwickelt. Dabei werden Fluatfraktionen zu je 4 ml aufgefangen. Die nach Durchlauf von 109 ml Eluat beginnenden und mit dem 309ten Milliliter endenden Fraktionen werden gesammelt und miteinander vereinigt. Zu diesem vereinigten Eluat werden die 11,53 mg des oben beschriebenen, mit XAD-2 gereinigten Antibioticums zugesetzt, die 186 mit Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthalten. Das vereinigte Eluat wird zusammen mit dem zugesetzten Antibioticum in einem rotierenden Verdampfer unter Vakuum bei einer Temperatur unter 10⁰C auf 7 ml eingeengt.

Diese Lösung, die 720 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält, wird in eine Kolonne mit 1,7 cm Durchmesser eingegeben, die mit 90 ml, wie oben beschrieben, vorgewaschenem XAD-2 beschickt ist und vor der Verwendung bei 5⁰C mit destilliertem Wasser ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Nach der Probe werden zwei Anteile zu je 2 ml destillierten Wassers in die Kolonne eingegossen. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min mit destilliertem Wasser entwickelt, wobei Eluatfraktionen zu je 4 ml aufgefangen werden. Die vom Durchlauf von 109 ml Eluat bis zum Durchlauf von 301 ml Eluat aufgefangene'. Fraktionen werden miteinander vereinigt und in einem rotierenden Verdampfer auf 10,3 ml eingeengt. Diese Lösung, die 589 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthält, wird zu 23,6 mg Antibioticum mit einer berechneten Stärke von 30 140 Einheiten/mg gefriergetrocknet.

Das so hergestellte Antibioticum Thienamycin ist ein weißer amorpher fester Stoff von faseriger Konsistenz. Eine Probe erleidet, wenn sie in einer Glaskapillare mit einer Geschwindigkeit von 3°C/min erhitzt wird, Zer-Setzung, ohne daß eine flüssige Phase auftritt. Es werden die folgenden Stufen beobachtet: Erweichen findet bei 130 bis 140⁰C unter Volumenkontraktion des festen Stoffes statt und setzt sich bis 170 bis 174°C fort; im letztgenannten Bereich färbt sich das Material gelb; Sintern und fortschreitende Farbvertiefung bis zu rötiichbraun wird im Bereich von 180 bis 200°C beobachtet, und schließlich kommt es bei 205⁰C zur Verkohlung, wobei restliche Feststoffspuren hinterbleiben.

Eine weitere Probe dieses Materials zeigt bei der spektrophotometrischen Analyse ein Extinktionsmaximum bei 196,5 nm mit einem Ef^_n = 268,2. Die Elementaranalyse liefert die folgenden Ergebnisse: 1) Gewichtsverlust von 5,67% bei 4 Stunden langem Trocknen bei Raumtemperatur unter Vakuum und 2) Zusammensetzung: 47,68% Kohlenstoff, 6,22% Wasserstoff, 11,48% Stickstoff. Diese Ergebnisse stimmen mit der empirischen Formel C)₁H)₆N₂O₄S - (NH₃)oji überein; die dieser empirischen Formel entsprechende, berechnete Zusammen-Setzung beträgt C = 47,68%, H = 6,13%, N = 11,52%, S = 11,57% und O = 23,1%. Die polarimetrische Analyse einer Probe von 1 mg/ml in lOmmoIarer Kaliumphosphatpufferlösung zeigt eine spezifische optische Drehung [«JiT⁰ + 80. Das Infrarotspektrum einer Suspension dieser Probe in Nujol zeigt charakteristische Absorptionsmaxima bei 1765 cm"¹,1650-1550 cm"¹,2800-2500 cm'¹ und 3500-3100 cm"¹. Ein NMR-Spektnim bei 100 MHz einer Probe dieses Produkts, gelöst in D₂O, zeigt ein Dublett bei δ 1,275, ein Dublettenpaar bei 53,39 und so Multiplette bei (!3,15 und (54,20; diese Maxima sind charakteristisch für Thienamycin.

Beispiel 6
Acetylierung von Thienamycin

10,9 mg Thienamycin werden 10 Minuten bei 0⁰C in einem Gemisch aus 1 ml trockenem Dimethylformamid und 2 ml frisch hergestelltem Essigsäureanhydrid gerührt Das Dimethylformamid und das Essigsäureanhydrid werden durch mehrmaliges (5- bis 6maliges) Waschen mit je 25-40 ml Hexan und letztmaliges Waschen mit Hexan nach Zusatz von 1 ml trockenem Athyläther entfernt Die rohe Probe von N-Acetyltbienamycin wird in 20 ml entmineralisiertem Wasser, welches lOOtunolar an Tris-Base [ffis-(hydroxymethyr>aminomethan] und 35μΓηοΐ3Γ an HCl ist, gelöst Nach dem Lösen der Probe beträgt der pH-Wert 7,9. Die Lösung enthält 244 Extinktionseinheiten bei 298 nm, und eine 1,27-cm-Analysenscheibe, die 0,1 ml einer lOOOfachen Verdünnung der Probe enthält, erzeugt beim Inkubieren auf platten mit ATCC 8461 bei 25°C eine Hemmzone mit einem Durchmesser von 23 mm.

Diese Probe wird in eine Kolonne (Bettabmessungen 1,3 cm x 14 cm) von Dowex-1 x 4 (Cl") (Teilchengrößen <37 α) eingegeben. Die Kolonne wird mit 10 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen und das Antibioticum N-Acetylthienamycin mit einer an NaCl 0,07molaren, an NH₄CI 0,005molaren und an NH₃ Q,0001molaren Lösung in entmineralisiertem Wasser eluiert Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,7 ml/min werden

Fraktionen zu je 6,1 ml aufgefangen. Der Hauptgipfel der UV-Extinktion bei 298 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 36 bis 50 mit einem Maximum in der Fraktion Nr. 40. Die Fraktionen Nr. 38 bis 46 werden vereinigt und enthalten insgesamt 107 Extinktionseinheiten bei 298 nm. Die vereinigten Fraktionen werden in einem rotierenden Verdampfer unter vermindertem Druck auf 2 ml eingeengt und mit 5 μΐ lmolarer Natronlauge versetzt. Dieses Konzentrat wird in eine Kolonne (Bettabmessungen 2,2 x 80 cm) mit Bio-Gel P-2 (37-74 μ) eingegeben. Die Probe wird mit zwei Anteilen zu je 1 ml entmineralisierten Wassers hineingewaschen und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,6 ml/min mit entmineralisiertem Wasser eluiert. Dabei werden Fraktionen zu je 3,04 ml aufgefangen.

Der Hauptgipfel der UV-Extiaktion bei 300 nm erscheint in den Fraktionen Nr. 58 bis 64 mit einem Maximum ίο in der Fraktion Nr. 60. Die Fraktionen Nr. 59 bis 62 enthalten 83,7 A₃₀₀-Einheiten und werden miteinander vereinigt. Ein 2,2 A₃₀₀-Einheiten äquivalenter Teil wird als Bezugsprobe entnommen und der Rest auf 1,5 ml eingeengt und in einer 14 ml fassenden Glasampulle zu 3,9 mg N-Acetylthienamycin gefriergetrocknet.

Knax. 301 nm, E_maJE_miH, = 4,45, E%j_Oi in entmineralisiertem Wasser = 208.

15 Beispiel 7

Acetyliemng von Thienamycin Stufe A

9 mg Thienamycin werden 10 Minuten bei O⁰C mit einem Gemisch aus 1 ml trockenem Dimethylformamid und 2 ml frisch hergestelltem Essigsäureanhydrid gerührt. Das Dimethylformamid und das Essigsäureanhydrid werden durch mehrmaliges (5- bis 6maliges) Waschen mit je 25 bis 40 ml Hexan und ein letztmaliges Waschen mit Hexan nach Zusatz von 1 ml trockenem Äthyläther entfernt. Man setzt 10 ml kaltes destilliertes Wasser zu, welche 50 μΐ lmolare Tris-Base und 50 μΐ lmolare Tris ■ HCl enthalten (pH 8). Der pH-Wert dieser Lösung beträgt 7,8; die Lösung enthält insgesamt 102 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten. Man setzt 10 ml kaltes destilliertes Wasser zu und hält die Lösung auf O⁰C.

Eine Kolonne mit einem Durchmesser von 1,7 cm wird mit 30 ml Dowex-1 x 4 Cl" (<37 μ Teilchengröße) beschickt und mit je 90 ml 1) 0,2raolarer HCl, 2) 0,5 η Kochsalzlösung, die 0,01 molar an HCl ist, und 3) entmineralisiertem Wasser gewaschen.

Die 20-ml-Probe wird in die Dowex-1 x 4-Kolonne eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 2 ml entionisierten Wassers und dann zwei Anteile zu je 1 ml Eluierungspuffer nachgießt. Die Kolonne wird mit 0,07molarer NaCl-Lösung, die 0,005molar an NH₄Cl und O.lmmolar an NH₄OH ist, eluiert. Die Geschwindigkeit beträgt 4,3 ml/5 min, und es werden Fraktionen zu 4,3 ml aufgefangen. Die Fraktionen von 555 ml Ablauf bis 594 ml Ablauf werden miteinander vereinigt und bei 5°C gelagert.

Stufe B

27 mg Thienamycin werden 10 Minuten bei 0°C mit einem Gemisch aus 2 ml trockenem Dimethylformamid und 4 ml frisch hergestelltem Essigsäureanhydrid gerührt. Das Dimethylformamid und das Essigsäureanhydrid werden durch ömaliges Waschen mit je 25 bis 4G ml Hexan und ein ietztmaliges Waschen mit Hexan nach Zusatz von 2 ml trockenem Äthyi'other entfernt. Man setzt 10 ml kaltes destilliertes Wasser zu, das 50 μΐ lmolare Tris-Base und 50 μΐ lmolare Tris ■ HCl enthält und einen pH-Wert von 8 aufweist; der pH-Wert des gesamten Gemisches beträgt 6,85. Die Lösung enthält 148 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten. Der oberste Zentimeter der in Stufe A beschriebenen Dowex-1 x 4-Schicht (<37 μ) wird entfernt und die Kolonne mit je 90 ml 1) 0,2molarer HCl, 2) 0,5 η Kochsalzlösung, die 0,01 molar an HCl ist, und 3) entmineralisiertem Wasser gewaschen.

Das oben beschriebene Gemisch (10 ml) wird zu 10 ml destilliertem Wasser von 0⁰C zugesetzt und in eine Kolonne mit Dowex-1 Χ 4 Cl" eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 2 ml entmineralisierten Wassers und dann zwei Anteile zu je 2 ml Eluierungspuffer nachgießt. Die Kolonne wird mit einer 0,07molaren Kochsalzlösung eluiert, die 0,005molar an NH₄Cl und O.lmmolar an NH₄OH ist. Die Geschwindigkeit beträgt 4,3 ml/ 5 min, und es werden Fraktionen zu je 4,3 ml aufgefangen. Die Fraktionen von 497 bis 571 ml Ablauf werden miteinander vereinigt und zu den in Stufe A beschriebenen vereinigten Fraktionen aus der Dowex-1 x 4-Kolonne zugesetzt Zusammen enthalten diese Fraktionen 117,5 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten.

Eine 2,2 cm x 62 cm messende Kolonne, die mit 225 ml Bio-Gel P-2 (37-74 μ) mit einer Ausschlußgrenze von 2600 Daiton (vor der Verwendung durch Dekantieren von destilliertem Wasser bestimmt) beschickt ist, wird mit 50 ml lmolarer Kochsalzlösung und dann mit 225 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen. Die vereinigten Dowex-1 X 4-Eluate werden im Vakuum zu 2,66 ml eingeengt, und das Konzentrat wird in die Bio-Gel P-2-Kolonne eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 2 ml entmineralisierten Wassers nachgießt. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser entwickelt, wobei Fraktionen zu je 2 ml aufgefangen werden. Die Fraktionen von 190 ml bis 204 ml Ablauf werden miteinander vereinigt und zu 2,5 ml eingeengt

Eine 2,2 cm X 62 cm messende Kolonne, die mit 225 ml Bio-Gel P-2-Harz (37-74 μ) mit einer AusschluB-grenze von 1800 Daiton (vor der Verwendung durch Dekantieren von destilliertem Wasser bestimmt) beschickt ist, wird vor der Verwendung mit 225 ml 1 molarer Kochsalzlösung und dann mit 100 ml entmineralisiertem Wasser gewaschen.

Die obigen 2,5 ml Konzentrat, die 1094 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten enthalten, werden in die Kolonne eingegeben, worauf man zwei Anteile zu je 2 ml entmineralisierten Wassers nach-

gießt. Die Kolonne wird mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min mit entmineralisiertem Wasser entwickelt, wobei Fraktionen zu je 2 ml aufgefangen werden. Die von 104 ml bis 132 ml aufgefangenen Eluatfraktionen werden vereinigt und enthalten 97 durch Hydroxylamin auslöschbare optische Dichteeinheiten. 2,4 ml werden bei O⁰C für in vitro-Analysen aufgehoben, während der Rest zu N-Acetylthienamycin gefriergetrocknet wird.

Mittel, die das Antibioticum N-Acetylthienamycin enthalten, können in verschiedenen Dosisforme.n, z. B. in fester oder flüssiger oraler Dosisform dargereicht werden. Die Mittel können, gleich ob sie flüssig oder fest sind, je Einheitsdosis 0,1 bis 99% Wirkstoffenthalten; der bevorzugte Bereich beträgt etwa 10 bis 60%. Das Mittel enthält im allgemeinen etwa 25 bis 1000 mg Wirkstoff, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mittels; im allgemeinen verwendet man jedoch Dosismengen im Bereich von etwa 250 bis 1000 mg oder vorzugsweise im Bereich von 400 bis 800 mg. Für die parenteral Darreichung liegt die Einheitsdosis gewöhnlich als reine Verbindung in schwach angesäuerter steriler wäßriger Lösung oder in Form eines zum Lösen bestimmten Pulvers vor. Typische Gemische können nach den folgenden Verfahren hergestellt werden:

Kapseln je Kapsel

N-Acetyithienamycin 400 mg

Lactose, U.S.P., zum Füllen von

Kapseln Nr. 0 ausreichende Menge,

ungefähr je 475 mg

In dem obigen Beispiel werden Wirkstoff und Verdünnungsmittel zu einem gleichmäßigen Gemisch vermischt, welches dann von Hand oder maschinell in Hartgelatinekapseln Nr. 0 eingefüllt wird. Das Mischen und Füllen erfolgt vorzugsweise in einem Raum mit einer relativen Feuchte von weniger als 40%.

S Tabletten je Tablette

ill, N-Acetylthienamycin 300 mg

r]i Calciumphosphat 192 mg

j-< Lactose, U.S.P. 190 mg

i|| Maisstärke 80 mg

■ Magnesiumstearat 8 mg

S 800 mg

u! In dem obigen Beispiel wird der Wirkstoff mit dem Calciumphosphat, der Lactose und etwa der Hälfte der

|: Maisstärke gemischt. Das Gemisch wird mit einem 15%igen Maisstärkebrei granuliert, grob gesiebt und dann

p wieder durch ein Sieb mit 1,19 mm Maschenweite gesiebt. Nach Zusatz des Restes der Maisstärke und des

;'; Magnesiumstearats wird das Gemisch zu Tabletten verpreßt, die einen Durchmesser von etwa 1,27 cm haben

!■:{ und je 800 mg wiegen.

|| Nach einem anderen Verfahren mischt man den Wirkstoff mit dem Calciumphosphat, der Lactose «nd der

£ Hälfte der Maisstärke. Das Gemisch wird in einer Hochleistungspresse zu verdichteten, tablettenähnlichen

ι] Massen verarbeitet. Diese werden zu Körnern von einem Durchmesser von etwa 1,2 mm zerkleinert. Dann setzt

ej man den Rest der Maisstärke und das Magnesiumstearat zu und verpreßt das Gemisch zu Tabletten von etwa

I; 1,27 cm Durchmesser und 800 mg Gewicht.
S

Lyo-Form (für die Injektion) je Ampulle

Ll N-Acetylthienamycin 25 mg

% Mit Wasser für Injektionen, U.S.P.,

jH aufgefüllt auf 5 ml

|ώ In dem obigen Beispiel wird der Wirkstoffin dem angegebenen Verhältnis in einer genügenden Menge Wasser

v| für Injektionen aufgelöst. Die Lösung wird durch Selas-Kerzen oder »Milliporew-Membranfilter filtriert, um sie

ψ- zu sterilisieren. Die Lösung wird auf sterile Ampullen verteilt Die Ampullen werden mit ihrem Inhalt gefroren,

|: und das Wasser wird aseptisch durch Gefriertrocknung entfernt Die den sterilen trockenen Feststoff enthalte-

|ξ nen Ampullen werden aseptisch verschlossen.

gü Um eine Lösung für die parenteral Darreichung zu regenerieren, setzt man 5 ml steriles Wasser für Injek-

% tionen zu dem Inhalt einer Ampulle zu.

B

m 23

26 52 6Sl

Orale flüssige Formen

10

je 1000 ml

N-Acetylthienamycin 1.0 g Saccharose 600,0 g

Glucose 250,0 g

Natriumbenzoat 1,0 g Konzentriertes Orangenöl 0,2 ml Mit gereinigtem Wasser, U.S.P.,

aufgefüllt auf 1000,0 ml

Die Saccharose und die Glucose weiden in etwa 400 ml Wasser unter Erwärmen gelöst. Die Losung wird gekühlt und zunächst mit Natriumbenzoat und darm mit konzentriertem Orangenöl versetzt Die Lösung wird mit Wasser auf etwa 900 ml aufgefüllt, worauf man das Antibioticum zusetzt. Die Lösung wird durch Filtrieren durch ein grobes Filter geklärt

20

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

25

Sir. rl

Ψ:

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30 35

40

45

50

55

60

65

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Claims

Patentansprüche: 1. N-Acetylthienamycin mit folgenden Eigenschaften:

a) ein NMR-Spektrum bei 100 MHz mit folgenden Maxima:

δϊθ.7, d, 3 H, J « 6JS; $1,98, S, 3 H; «52,94, m, 2 H; 53,17, m, 2 H; 53,38, t, 2 H, J » 6,5; 53,38, m, 1H; i4202H

b) pKa von 3^ ±0,1 für die COOH-Gruppe;

c) bei derPapiereldöroplHHisem 04 nMlarerKaliumphosphatpufferlösung (pH 7) unter Verwendung von Papier Nr. 2043-B der Firma Schleicher und Schüll bei einem Spannungsgefälle von SO V/cm wandert es

im Verlauf von 20 Minuten bei VOPC über eine Strecke von 2,7 cm zur Anode;

d) die Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von mit Cellulose beschichteten Blättern und _ einem Lösungsmittelgemisch aus 70% Äthanol und 30% Wasser zeigt ein Rf von 0,7; und

e) einIR-Spektrum gemäß Abbildung, die Bestandteil dieses Anspruchs ist,

und pharmazeutisch unbedenkliche Salze dieser Verbindung.
2. Verfahren zur Herstellung des N-Acetylthienamycins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man unter submersen aeroben Bedingungen Streptomcyes cattleya NRRL 8057 in einem wäßrigen, assimilierbare C- UQ^N-Quellen sowie anorganische Salze enthaltenden Nährmedium züchtet und das so erhaltene N-Acetylthienamycin dadurch gewinnt, daß man filtrierte Fermentationsflüssigkeit durch eine Kolonne eines starken Kationenaustauscherharzes führt und den Ablauf weiter reinigt.
3. Mittel, enthaltend eine antibakteriell wirksame Menge des N-Acetylthienamycins nach Anspruch 1 oder pharmazeutisch unbedenkliche Salze desselben und einen nichttoxischen, pharmazeutisch unbedenklichen Träger.