CH624956A5 - Verfahren zur entfernung von verunreinigungen aus clavulansaeure. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Clavulansäure und seiner Salze in reiner Form.

Es ist bekannt, dass bei der Fermentierung von Strepto-myces clavuligerus und insbesondere des Stammes NRRL 3585 eine Anzahl von antibiotischen Substanzen gebildet wird. Die britische Patentschrift 1 315 177 beschreibt die Kultivierung von Streptomyces clavuligerus, Stamm NRRL 3585, bis zur Herstellung einer wesentlichen Menge von zwei Antibiotika, die als Antibiotika A 16886 I und A 16886 II bezeichnet werden.

Es wurde nun gefunden, dass ein weiteres Antibiotikum aus diesem Organismus erhalten werden kann, nämlich (2R, 5R,Z)-3-(2-Hydroxy-äthyliden)-7-oxo-4-oxa-l-azabicycIo-

-|3,2,0]-heptan-2-carbonsäure der Formel I

0

'COOH

die im folgenden zweckmässig als «Clavulansäure» («clavu-lanic acid») bezeichnet wird.

Die oben erwähnten Salze umfassen die Alkalimetallsalze, z.B. Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze; Erdalkalimetallsalze, z.B. Calcium-, Magnesium- und Bariumsalze; die Ammoniumsalze; und Salze organischer Basen, beispielsweise Salze, die sich ableiten von primären, sekundären, tertiären, N-quaternären Aminen, z.B. mono-, di- oder tri-Alkyl-ammoniumsalze, wie Methylammonium- und Triäthylam-moniumsalze und Salze heterocyclischer Basen, wie Piperidi-niumsalze.

Die Salze anorganischer Basen und die meisten Salze der organischen Basen sind im allgemeinen in wässriger Lösung stabiler als die freie Clavulansäure. Die Salze können in Form von Solvaten vorkommen, z.B. mit Wasser und/ oder Kristallisationslösungsmittel.

5

io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

"Î5

3

624956

Clavulansäure und ihre Salze wurden zuerst in einer Reinheit von mindestens 75 % und im allgemeinen mindestens 85 % erhalten, d.h. mit nicht über 25 % und im allgemeinen nicht über 15%, bezogen auf das Gewicht, an Verunreinigungen und Isomeren, die von der Herstellung stammen.

Durch das erfindungsgemässe Verfahren ist es aber möglich geworden, Clavulansäuresalze in sogar höherem Reinheitsgrad zu erhalten, die im wesentlichen frei von Verunreinigungen und Isomeren von der Produktion sind und beispielsweise eine Reinheit von 98% oder darüber aufweisen, das heisst, weniger als 2 Gew.-% an Verunreinigungen oder Isomeren von der Herstellung enthalten. Es werden so Lithiumclavulanat und verschiedene andere Clavulanate in kristalliner Form erhalten. Die Salze sind im wesentlichen rein, was ihre molaren Extinktionskoeffizienten, bestimmt bei 259 ± 1 nm in 0,1 m wässrigem Natriumhydroxid von mindestens 16 200 zeigt. Die molaren Drehungen [M]D24-Werte in wässriger Lösung betragen mindestens +137°±5°. Die freie Säure, hergestellt aus ihren Salzen, zeigt einen Extinktionskoeffizienten E in 0,1 m wässrigem Natriumhydroxid bei 259 nm von 590 oder darüber und eine spezifische optische Drehung [a]D24 in Dimethylsulfoxid von etwa + 54°. Es ist ersichtlich, dass die Erzielung von Materialien dieses Reinheitsgrades die Verwendung der Produkte in pharmazeutischen und veterinärmedizinischen Zusammensetzungen ermöglicht und bei der Anwendung der Materialien als Zwischenprodukte äusserst erwünscht ist.

Der hier verwendete Ausdruck «Reinheit» bezieht sich auf den Prozentsatz an Clavulansäure und/oder deren Salz, bezogen auf die vorhandenen Gesamtfeststoffe auf der Basis des Gewichts, jedoch ohne assoziiertes Wasser oder andere Lösungsmittel.

Clavulansäure und ihre Salze haben eine antibakterielle Wirksamkeit gegenüber einem Bereich von gramnegativen und grampositiven Mikroorganismen, beispielsweise gegen Stämme von Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Enterobacter cloa-cae, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Proteus morga-nii, Serratia marcescens, Providencia Species, Citrobacter koseri, Haemophilus influenzae und Bacteroides Species.

Clavulansäure und ihre Salze sind stabil gegen die Einwirkung von ß-Lactamasen, die von grampositiven Organismen erzeugt werden, beispielsweise solche, erzeugt von Staphylococcus aureus und Bacillus cereus, und gegen ß-Lactamasen, die von gramnegativen Organismen erzeugt werden, die in den Klassen I-V, von Richmond, M.H. und Sykes, R.B. (1973) beschrieben werden. («The ß-lactamases of gram-negative bacteria and their possible physiological rôle», Advances in Microbial Physiology, 9, 31-88).

Clavulansäure und ihre Salze besitzen auch die Fähigkeit, ß-Lactamaseenzyme zu hemmen, die von grampositiven Organismen erzeugt werden, beispielsweise solche, die von Stämmen von Staphylococcus aureus und Bacillus cereus erzeugt werden und auch die Enzyme der Klassen II-V aus gramnegativen Bakterien, erzeugt von Organismen wie Stämmen von Proteus mirabilis, Escherichia coli, Proteus mor-ganii, Klebsiella aerogenes, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei und Haemophilus influenzae.

Eine Anzahl der Enzyme der Klasse I werden auch gehemmt, beispielsweise solche, die erzeugt werden von Stämmen von Bacteroides fragilis, Proteus vulgaris, Proteus mor-ganii, Proteus rettgeri, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Providencia Species und Hafnia alvei. So weisen Clavulansäure und ihre Salze die Fähigkeit auf, ß-lactamase-empfindliche ß-Lactamantibiotika vor der ß-Lactamasehy-drolyse zu schützen.

Clavulansäure und ihre Salze sind interessant zur Anwendung in Verbindung mit ß-Lactamantibiotika, die empfindlich gegen ß-Lactamasen sowohl von grampositiven als auch von gramnegativen Organismen sind.

Im allgemeinen wird es bevorzugt, Clavulansäuresalze mit einer Reinheit von mindestens 98 %, d.h. mit einem Gehalt von weniger als 2% Verunreinigungen an Isomeren, die von der Produktion stammen und sich von Lösungsmitteln unterscheiden, in Verbindung mit einem Breitspektrum--ß-Lactamantibiotikum, zu verwenden.

Im allgemeinen können Clavulansäure und ihre Salze in Kombination mit ß-Lactamantibiotika verwendet werden, die normalerweise entweder oral oder parenteral verabreicht werden. Beispiele für oral absorbierbare Breitspektrum-ß--Lactamantibiotika umfassen Cephalexin, Cephaloglycin, Ampicillin und Amoxycillin und ihre oral absorbierbaren Ester, z.B. die Acyloxymethyl- und Phthalidylester und die oral absorbierbaren Ester von Carbenicillin und Ticarcillin, z.B. die Indanyl- und Phenylester. Breitspektrum-ß-Lactam-antibiotika, die oral nicht absorbiert werden, umfassen Carbenicillin, Ticarcillin, Cephalothin, Cephaloridin, Cefazo-lin, Cephacetril und Cephapirin. Beispiele für ß-Lactamantibiotika mit engem Spektrum sind Penicillin G und Penicillin V.

Kombinationen von Clavulansäure und ihren Salzen mit beispielsweise Penicillin G, Penicillin V, Ampicillin, Amoxycillin, Carbenicillin, Cephaloridin oder Ticarcillin zeigen eine synergistische Aktivität gegen ß-Lactamase produzierende Stämme von Staphylococcus aureus. Kombinationen von Clavulansäure und ihren Salzen mit beispielsweise Penicillin G, Penicillin V, Ampicillin, Amoxycillin, Carbenicillin, Ticarcillin, Cephalexin, Cephaloglycin, Cephalothin, Cephaloridin, Cefazolin, Cephacetril und Cephapirin zeigen eine synergistische Aktivität gegen ß-lactamase-produzierende Stämme von Escherichia coli, Klebsiella aerogenes, Proteus mirabilis, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Bacteroides fragilis, Proteus morganii und Proteus vulgaris.

Die Verabreichung erfolgt mit Vorteil in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen (einschliesslich veterinärmedizinischen Zusammensetzungen), die Clavulansäure oder bevorzugter ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, z.B. das Natriumsalz dieser Säure und/oder ein Salz, das weniger als 2% an Verunreinigungen oder Isomeren enthält, die von Lösungsmitteln unterschiedlich sind und aus der Herstellung stammen, enthalten. Aufgrund der vorstehend beschriebenen Schutzwirkung können die Zusammensetzungen vorteilhaft weitere ß-Lactamantibiotika enthalten. Die Zusammensetzungen enthalten normalerweise auch einen pharmazeutischen (einschliesslich veterinärmedizinischen) Träger oder Exzipienten.

Die Zusammensetzungen können zur oralen, parenteralen, rectalen oder topischen Verabreichung formuliert werden.

Die Zusammensetzungen können beispielsweise die Form von Pulvern, Tabletten, Kapseln, Pastillen bzw. Bonbons, Lösungen und Sirups einnehmen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, und können beispielsweise Stärke, Lactose, Talk, Magnesiumstearat, Gelatine, destilliertes Wasser und Suspendiermittel, Dispergiermittel, Emulgiermittel, geschmackgebende oder färbende Mittel enthalten.

Clavulansäure und ihre Salze können auch zur parenteralen Verabreichung formuliert werden, wobei diese Verabreichungsmethode bevorzugt ist. Die Verbindungen können so in Ampullen zur Aufbereitung vor der Anwendung formuliert werden, gegebenenfalls zusammen mit einer weiteren ß-Lactam-Antibiotikum-Verbindung.

Im allgemeinen beträgt das Gewichtsverhältnis von Clavulansäure oder ihrem Salz zu einem zu schützenden ß-Lac-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

624956

4

tamantibiotikum 10:1 bis 1:10, bevorzugt 5:1 bis 1:5 und insbesondere 2:1 bis 1:2.

Das erfindungsgemäss in reiner Form erhaltene Produkt ermöglicht die Bekämpfung von Infektionen, die durch grampositive und/oder gramnegative Organismen bewirkt werden. Dazu wird eine wirksame Menge von Clavulansäure oder bevorzugt eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, wobei diese Säure und/oder das Salz davon weniger als 2% Verunreinigungen oder Isomere enthalten, die von Lösungsmitteln unterschiedlich sind und von der Herstellung stammen, einem Menschen oder einem Tier entweder prophylaktisch oder therapeutisch verabreicht.

Im allgemeinen wird das aktive Material aus den vorstehenden Gründen in Verbindung mit einem weiteren ß-Lac-tamantibiotikum verabreicht.

Die Clavulansäure und/oder das Salz können an Erwachsene in Dosierungen von 100 mg bis 6 g, 2 bis 4mal täglich verabreicht werden. Enthält die Zusammensetzung ein weiteres ß-Lactamantibiotikum, so beziehen sich die vorstehenden Mengen auf die Gesamtmenge des vorhandenen ß-Lactamantibiotikums. Die bevorzugte Dosis für Clavulansäure und/oder deren Salz, allein oder in Verbindung mit einem weiteren ß-Lactamantibiotikum verabreicht, liegt bei 250 mg bis 1 g, verabreicht 2- bis 4mal täglich.

Eine weitere Anwendbarkeit für Clavulansäure und ihre Salze ist die Herstellung von Derivaten, wie Estern, beispielsweise durch Reaktion der Säure mit einem Diazoalkan, wie Diazomethan oder eines Salzes der Säure mit einem Alkyl-halogenid, z.B. Methyljodid.

Reinigung von Clavulansäure und ihren Salzen

Clavulansäure und ihre Salze können aus der Fermentationsbrühe, hergestellt durch Kultur gemäss dem britischen Patent 1 315 177, eines Stammes von Streptomyces clavuligerus, z.B. des Stammes NRRL 3585, oder einer Mutante davon, isoliert werden, wobei die Isolierung unter Anwendung von Fraktioniertechniken zur Entfernung unerwünschter Komponenten aus der Brühe, wie Proteine und Enzyme und insbesondere anderer ß-Lactamantibiotika durchgeführt wird. Jedoch ist eine derartige Reinigung unter Anwendung üblicher Techniken schwierig, insbesondere aufgrund des ähnlichen Verhaltens der verschiedenen vorhandenen ß-Lactam-carbonsäuren, wie die Antibiotika A 16886 I und II, die vorstehend erwähnt wurden. Es wurde nun gefunden, dass die Isolierung des Antibiotikums durch Umwandlung der Clavulansäure oder eines ihrer Salze in Lithiumclavunalat und Ausfällung des letzteren, normalerweise in kristalliner Form, sehr erleichtert wird. Eine derartige Ausfällung kann möglicherweise aufgrund einer überraschend hohen Affinität der Clavulanationen für Lithiumionen, mit einer geringen oder unwesentlichen Kopräzipitation von Verunreinigungen, insbesondere von anderen ß-Lactamen, durchgeführt werden. Darüberhinaus kann durch direkte Isolierung eines Salzes, wobei die Umwandlung von Clavulansäure in organische Derivate, wie Ester, mit anschliessender erneuter Umwandlung in die Säure, z.B. durch Reduktionstechniken, eine Um-Iagerung der Clavulansäure in Isomere verhindert werden. Es hat sich gezeigt, dass die reduktive Spaltung von Estern der Clavulansäure bis zu 15% an isomerem Material erzeugen kann.

Es sei festgestellt, dass in Fermentationsbrühen und anderen Lösungen, die etwa bei neutralem pH-Wert vorliegen, Clavulansäure und Salze, die mit einem oder mehreren Kationen gebildet werden, im Gleichgewicht vorliegen und Iso-lierarbeitsgänge häufig an Clavulansäure und/oder Salzen davon ausgeführt werden, je nach dem pH-Wert und anderen Bedingungen. Im allgemeinen sind Clavulansäure und ihre Salze ziemlich instabil in wässrigen Lösungen ausserhalb des pH-Bereiches 5,5 bis 8 und es ist daher während der nachstehenden Arbeitsgänge erwünscht, den pH-Wert innerhalb dieses Bereiches und vorzugsweise in der Nähe von etwa 6,5 zu halten, falls dies nicht anders angegeben wird.

Gemäss der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Entfernung von verschmutzenden Verunreinigungen aus Clavulansäure der Formel I und/oder einem Salz davon geschaffen, wobei die Säure und/oder das Salz mit einer wässrigen ionischen Lithiumverbindung, welche nicht Lithiumclavulanat ist, umgesetzt wird, wobei man eine wässrige Lösung erhält, die Lithiumclavulanat enthält, das anschliessend ausgefällt wird, worauf die Ausfällung von dieser wässrigen Lösung abgetrennt und das Lithiumclavulanat isoliert wird.

Im allgemeinen ist die ionische Lithiumverbindung ein Salz. Bevorzugt ist Lithiumchlorid, jedoch sind Lithium-bromid, -jodid oder -sulfat oder Lithiumcarboxylate, wie das Acetat, Propionat, Formiat, Benzoat oder Lactat, auch geeignet. Die Wahl des Salzes kann von den anderen vorhandenen Materialien beeinflusst werden. Ist beispielsweise das ursprünglich vorhandene Clavulansäuresalz das Bariumsalz, so kann es bevorzugt sein, Lithiumsulfat zu verwenden, um zunächst eine Ausfällung von Bariumsulfat, vor der Ausfällung des Lithiumclavulanats zu bewirken.

Im allgemeinen ist es bevorzugt, vor der Ausfällung eine Konzentration von Lithiumclavulanat von mindestens 0,1 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 2% zu verwenden und höhere Konzentrationen, beispielsweise bis zu 12% oder sogar bis zu 20%, bezogen auf das Gewicht, ergeben natürlich grössere prozentuale Gewinne.

Das ursprünglich vorhandene Salz der Clavulansäure, das gereinigt werden soll, kann beispielsweise ein Alkalimetall-salz, (wie das Natrium- oder Kaliumsalz oder auch das Lithiumsalz, falls dieses als eine geringere Komponente des Clavulansäurematerials vorliegt), ein Erdalkalimetallsalz (z.B. das Calcium-, Barium- oder Magnesiumsalz) oder das Salz einer organischen Base, wie vorstehend beschrieben,

oder ein Salz, gebildet mit einem basischen Ionenaustauscherharz, sein. Die gefundene Möglichkeit, dass Lithiumclavulanat leicht in hohem Reinheitsgrad ausfällt, kann in verschiedener Weise ausgenutzt werden.

Aussalzen von Lithiumclavulanat

Nach einer Ausführungsform des Verfahrens kann die wässrige Lösung, die Lithiumclavulanat enthält, auch eine ausreichende Menge einer ionischen Lithiumverbindung enthalten, gewöhnlich das Lithiumsalz, das zur Bildung des Lithiumclavulanats verwendet wird, um letzteres durch Anheben der Konzentration der Lithiumionen auszusalzen, so dass das Löslichkeitsprodukt von Lithiumclavulanat bei der jeweiligen Temperatur stark überschritten wird. Da das Cla-vulanat bei niedrigen Temperaturen geringer löslich ist, ist es im allgemeinen zweckmässig, die Temperatur der Lösung zur maximalen Ausfällung zu verringern, beispielsweise auf etwa 0-5°C.

Für ein derartiges Aussalzen liegt die Konzentration der ionischen Lithiumverbindung in der wässrigen Lösung, die das Lithiumclavulanat enthält, vorzugsweise im Bereich von

4 m bis 10 m, obwohl Konzentrationen bis zur Sättigung anwendbar sind; ein besonders bevorzugter Bereich liegt bei

5 m bis 8 m.

Es kann vorteilhaft sein, nach Abtrennung eines ersten Anschusses von Lithiumclavulanat weiter zu konzentrieren, und eine zweite Ausfällung zu gewinnen.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

624956

Umwandlung anderer Clavulanate in Lithiumclavulanat

Die Lithiumclavulanat enthaltende Lösung kann einfach durch Auflösen eines Salzes von Clavulansäure, das sich vom Lithiumsalz unterscheidet, beispielsweise eines Natrium-, Kalium-, Magnesium-, Barium-, Calcium- oder Ammoniumsalzes, in einer wässrigen Lösung und Einbringen eines wasserlöslichen Lithiumsalzes, wie Lithiumchlorid, gebildet werden. Im Falle des Bariumsalzes kann die Anwendung einer hohen Konzentration an Lithiumchlorid zu einer gewissen Kopräzipitation von Bariumchlorid mit dem Lithiumclavulanat führen. Das Bariumchlorid kann jedoch leicht durch erneute Auflösung der Mischung in Wasser und Zugabe von Lithiumsulfat zur Ausfällung von Bariumsulfat entfernt werden, das durch beispielsweise Filtrieren, gefolgt von einem Zusatz von Lithiumchlorid, zur Ausfällung von reinem Lithiumclavulanat, abgetrennt werden kann.

Bildung von Lithiumclavulanat an einem lonenaustau-scherharz

Nach einer besonders nützlichen Anwendung der Erfindung wird als zunächst eingesetztes Salz der Clavulansäure ein Salz mit einem basischen Ionenaustauscherharz verwendet und dieses wird mit einer wässrigen Lösung eines Lithiumsalzes in Kontakt gebracht, um eine wässrige Lösung von Lithiumclavulanat zu ergeben. Das Salz wird normalerweise in Form einer Säule verwendet, die mit verunreinigter Clavulansäure und/oder einem Salz davon beladen wird und von der eine wässrige Lösung von Lithiumclavulanat eluiert wird, unter Anwendung einer wässrigen Lösung eines wasserlöslichen Lithiumsalzes, z.B. von Lithiumchlorid. Das Harz wird normalerweise vor dem Eluieren gewaschen, beispielsweise mit Wasser.

Das Harz trägt im allgemeinen Amino- oder tertiäre Ami-nogruppen (schwach basisch) oder quaternäre Ammoniumgruppen (stark basisch). Das Harz kann beispielsweise ein Polystyrol-, Polyacryl-, Epoxy-polyamin-, phenolisch- Poly-amin- oder quervernetztes Dextranharz sein und kann ma-kroreticulär oder mikroreticulär sein.

Der hier verwendete Ausdruck «Harz» soll zur Erleichterung auch Cellulosederivate und die vorstehenden Dextran-derivate umfassen, die sich von natürlich vorkommenden Polymeren herleiten. Typische schwach basische Ionenaustauscherharze umfassen Amberlite IRA68 (Mikroreticulär: Po-lyacrylat quervernetzt mit Divinylbenzol: tertiäre Amino-gruppen), Amberlite IRA93 (Makroreticulär: Polystyrol quervernetzt mit Divinylbenzol: tertiäre Aminogruppen), jeweils Handelsprodukte der Rohm & Haas (U.K.) Ltd. Typische stark basische Ionenaustauscherharze umfassen Zerolit FF und Zerolit FF(iP) (Handelsprodukt der Zerolit Co.,

Ltd.).

Basische Ionenaustauscherharze liegen vorteilhaft in der Salzform vor, wenn sie mit der verunreinigten Clavulansäure und/oder dem Salz in Kontakt gebracht werden; das Anion ist vorzugsweise das gleiche wie das des als Eluier-mittel verwendeten Lithiumsalzes, zweckmässig das Chloridion, jedoch können unterschiedliche Anionen ohne nennenswerte nachteilige Auswirkungen verwendet werden.

Die Konzentration der als Eluiermittel verwendeten wässrigen Lithiumsalze liegt vorzugsweise im Bereich von 0,02 m bis 8 m. Jedoch ergeben die geringen Konzentrationen sehr verdünnte Lösungen von Lithiumclavulanat und gestalten die anschliessende Ausfällung schwieriger. Im allgemeinen sind Konzentrationen im Bereich von 0,5 bis 2,5 m bevorzugt.

Während die Absorptions-/Elutions-Techniken zweckmässig derart durchgeführt werden, dass das gewünschte Produkt einer chromatographieartigen Abtrennung von anderem adsorbierten Material unterzogen wird, hat es sich gezeigt, dass die nachfolgende Ausfällungsstufe derart wirksam zur Abtrennung von Lithiumclavulanat von unerwünschten Verunreinigungen ist, dass es gewöhnlich bevorzugt ist, die Kolonne unter Anwendung relativ hoher Konzentrationen von Lithiumsalz in dem Eluiermittel im wesentlichen abzustreifen. Dies ergibt ein enges Band von Clavu-lanat auf der Säule, das in ein relativ geringes Volumen von Eluat eluiert werden kann, wodurch die nachfolgende Ausfällung erleichtert wird.

Das Eluat enthält normalerweise das Lithiumsalz, z.B. Lithiumchlorid, in einer Konzentration im Bereich von 0,5 bis 2,5 m, wohingegen, wie vorstehend angezeigt, der Aussalzeffekt am wirksamsten bei Konzentrationen im Bereich von 5 m bis 10m ist. Das Eluat wird daher bevorzugt konzentriert, beispielsweise durch Verdampfen im Vakuum, z.B. um einen Faktor von etwa 5. Die Löslichkeit von Lithiumclavulanat in verschiedenen Konzentrationen von wässrigem Lithiumchlorid wird in der folgenden Tabelle angegeben: (bei etwa 20°C)

TABELLE 1

Moilarität von Li Gl

Löslichkeit von Lithiumclavulanat in mg/ml (etwa)

2,5

23,5

3,75

10,2

5,0

4,1

6,25

1,8

7,5

0,8

Bei der vorstehenden Konzentrationsstufe wird vorzugsweise weiteres Lithiumsalz zugesetzt, da das Lithiumclavulanat ebenfalls konzentriert wird und Verluste in der Mutterlauge so auf ein Minimum herabgesetzt werden.

Um die Eluierung von adsorbierten Verunreinigungen von dem Harz auf ein Minimuro herabzusetzen, kann es vorteilhaft sein, in das Eluiermittel ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel in hoher Konzentration einzubringen. Alternativ kann nach dem Eluieren in Abwesenheit eines derartigen Lösungsmittels, dieses zu dem Eluat gefügt werden, um eluierte Verunreinigungen auszufällen und die Ausfällung kann vor der Weiterbehandlung abgetrennt werden. Das Lösungsmittel kann beispielsweise ein Keton sein, wie Aceton, ein Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Isopro-pylalkohol oder Äthylenglykol, ein Äther, wie Dioxan oder Tetrahydrofuran, oder ein substituiertes Amid, Imid oder ein Sulfoxidlösungsmittel, wie Dimethylformamid oder Di-methylsulfoxid. Im allgemeinen sind als derartige Lösungsmittel Alkohole bevorzugt, z.B. Äthanol oder Isopropylal-kohol.

Für eine derartige Abtrennung von unerwünschten Verunreinigungen beträgt die bevorzugte Konzentration an Alkohol in dem Eluiermittel oder dem Eluat nach Zugabe des Alkohols 70 bis 97 Vol.-%.

Ausfällung von Lithiumclavulanat unter Anwendung eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels

Es sei festgestellt, dass, falls die Konzentration von mit Wasser mischbarem organischem Lösungsmittel und Lithiumsalzen bei dem vorstehenden Arbeitsgang zu gross ist, das Lithiumclavulanat vorzeitig ausgefällt werden kann. Es ist tatsächlich möglich, Lithiumclavulanat aus einer wässrigen Lösung durch Anwendung sehr hoher Konzentrationen der5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

624956

6

artiger Lösungsmittel auszufällen, wodurch eine alternative Arbeitsweise geschaffen wird, die aus den Vorteilen der selektiven Ausfällung von Lithiumclavulanat, wie vorstehend angedeutet, Nutzen zieht. So können Clavulansäure und/

oder ein Salz davon mit einem Lithiumsalz in einer relativ geringen Konzentration in Kontakt gebracht werden, entweder durch Eluieren von einer Säule oder durch Auflösen der Salze in einer einzigen Lösung, und die gewünschte Ausfällung wird ohne Konzentrieren durch Zusatz des mit Wasser mischbaren Lösungsmittels durchgeführt. So sind beispielsweise Konzentrationen von Alkohol von mindestens 90 Vol.-%, vorzugsweise mindestens 95%, wirksam zur Ausfällung von Lithiumclavulanat. Es kann notwendig sein,

einen ersten Anschuss von Lithiumclavulanat zu gewinnen und anschliessend im Vakuum zu konzentrieren, z.B. etwa 4fach, um einen zweiten Anschuss zu erzielen.

Herstellimg von Salzen der Clavulansäure, mit einem Ionenaustauscherharz

Das vorstehend erwähnte, basische Ionenaustauscherharz kann mit der Clavulansäure und/oder dem Salz durch direkten Einsatz einer Fermentationsbrühe, aus der das feste Material vorher entfernt wurde, beispielsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren, beladen werden. Diese Möglichkeit besteht aufgrund der beträchtlichen Reinigung, die durch den anschliessenden Lithium-Ausfällungsschritt bewirkt wird. Es kann jedoch bevorzugt sein, die Brühe nach der Entfernung von Feststoffen mit adsorbierender Kohle zu behandeln, um die Clavulansäure und/oder das Salz zu adsorbieren. Dies hilft bei der Abtrennung anderer Salze von dem Clavulanat und vermeidet eine unerwünschte Beladung des basischen Ionenaustauscherharzes mit unerwünschtem ionischem Material.

Im allgemeinen kann die geklärte Brühe durch ein Kohlebett, z.B. in einer Säule, geleitet werden, vorzugsweise unter Anwendung einer gerade ausreichenden Aktivkohle bzw. Absorptionskohle, um die gewünschte Clavulansäure und/ oder das Salz zu adsorbieren, gewöhnlich in einer Menge von etwa 1 Vol.-Teil Kohle auf 3-10 Vol.-Teile geklärte Brühe. Gewöhnliche Absorptionskohle ist geeignet und es besteht nicht die Notwendigkeit, hochaktiviertes Material zu verwenden.

Die Absorptionskohle kann anschliessend mit einem wässrigen mit Wasser mischbaren Lösungsmittel abgestreift werden, z.B. einem Keton, wie Methyl-Äthylketon, Methyl-Iso-butylketon oder vorzugsweise Aceton, vorteilhaft in einer Konzentration von 30% bis 95% Keton, bevorzugt 50 bis 70%. Vor dem Abstreifen wird die Kohle vorzugsweise gewaschen, beispielsweise mit Wasser, um restliche Brühekomponenten zu entfernen.

Eine weitere Variation der vorstehenden Arbeitsweise ist die Herstellung eines Harz-Salzes von Clavulansäure, wie vorstehend beschrieben und seine Eluierung mit einem von einem Lithiumsalz unterschiedlichen Salz, z.B. einem Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalz, beispielsweise einem Chlorid oder Acetat, oder einem Ammoniumoder Pyridiniumsalz, z.B. Ammoniumformiat oder -acetat oder Pyridinhydrochlorid, um eine wässrige Lösung des entsprechenden Clavulanats zu ergeben; ein Überschuss eines wasserlöslichen Lithiumsalzes kann anschliessend zu dem Eluat gefügt werden und Lithiumclavulanat wird wie vorstehend beschrieben ausgefällt.

Fermentation von Streptomyces clavuligerus

Mit Ausnahme der sehr genauen Kontrolle des pH-Wer-tes, kann die Herstellung von Clavulansäure auf übliche Weise erfolgen, d.h. durch Kultivieren des Streptomyces clavuligerus in Anwesenheit von assimilierbaren Quellen für

Kohlenstoff, Stickstoff und von Mineralsalzen. Die Kultivierung wird vorzugsweise in submerger Kultur (Tauchkultur) unter aeroben Bedingungen durchgeführt.

Assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralien können entweder durch einfache oder komplexe Nährmittel geliefert werden. Quellen für Kohlenstoff umfassen im allgemeinen Glukose, Stärke, Glycerin, Melasse, Dextrin, Lactose oder Sucrose.

Quellen für Stickstoff umfassen im allgemeinen Sojabohnenmehl, Maisquellflüssigkeiten (corn steep liquors), Distilliers' solubles (distilliers' solubles), Hefeextrakte, Baumwollsamenmehl, Peptone, Kasein oder Aminosäuregemische. Harnstoff oder andere Amide können auch verwendet werden.

Nähr-Mineralsalze, die in das Kulturmedium eingearbeitet werden können, umfassen die allgemein verwendeten Salze, die dazu geeignet sind, Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Eisen-, Magnesium-, Zink-, Nickel-, Cobalt-, Mangan-, Calcium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid- und Carbonationen zu liefern.

Zur Steuerung von übermässigem Schäumen setzt man im allgemeinen ein Antischaummittel zu; dieses kann je nach Erfordernis in Intervallen zugesetzt werden.

Die Kultivierung von Streptomyces clavuligerus wird im allgemeinen bei einer Temperatur von 20 bis 37°C, vorzugsweise von 25 bis 30°C, durchgeführt und erfolgt bevorzugt unter Bewegung, d.h. durch Schütteln oder auch Rühren und Belüften. Das Wachstumsmedium kann zunächst mit einer geringen Menge einer sporulierten Suspension des Mikroorganismus angeimpft werden. Um jedoch eine Wachstumsverzögerung zu vermeiden, kann ein vegetatives Inocu-lum des Organismus durch Inoculieren einer geringen Menge von Kulturmedium mit der Sporenform des Organismus hergestellt werden und das erhaltene vegetative Inoculum kann in das Fermentationsmedium übergeführt werden oder vorzugsweise in eine Aufzuchtstufe, wo ein weiteres Wachstum stattfindet, bevor in das Hauptfermentationsmedium übergeführt wird.

Der Mikroorganismus ist ein Stamm von Streptomyces clavuligerus. Es wurde gefunden, dass sich der Stamm NRRL 3585 und Mutanten davon als besonders zufriedenstellende Stämme für die Produktion von Clavulansäure erweisen.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Fermentation kann daher eine Schrägkultur (slope) von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 oder eine Mutante davon zur Animpfung eines Mediums verwendet werden, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, z.B. Sucrose oder Glycerin, assimilierbaren Stickstoff, z.B. Tryptone oder komplexe Mischungen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff, z.B. Distillers' solubles und Hefeextrakte und Nährmineralien enthält. Dieses Medium kann man bis zu 3 Tage bei 25 bis 30°C unter Rühren wachsen lassen.

Das so gebildete entwickelte Inoculum kann anschliessend zum Animpfen (in einer Menge bis zu etwa 10%) eines Nährmediums verwendet werden, das ähnliche Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, Stickstoff und Mineralien enthält. Die Fermentation wird vorteilhaft bei 25-30°C während 2 bis 10 Tagen unter Bewegen und Belüftung in einem pH-Bereich von 6 bis 7,5 durchgeführt.

Bildung von Lithiumclavulanat und anderen Clavulanaten durch Extraktion einer phenolischen Lösung von Clavulansäure

Nach einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann die Lithiumclavulanat enthaltende wässrige Lösung durch Extrahieren einer phenolischen Lösung von Clavulansäure mit einer wässrigen Lösung von Lithiumhydroxid erhalten werden, wobei die Ausfällung des Lithiumclavulanats

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

anschliessend, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt wird, vorzugsweise nach Entfernung von restlichem phenolischem Lösungsmittel, durch Extrahieren der wässrigen Lösung mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Äther, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff.

Die vorstehende Technik kann auch zur Herstellung von anderen Salzen als den Lithiumsalzen der Clavulansäure verwendet werden, durch Extrahieren der phenolischen Lösung mit einer entsprechenden Base, z.B. einem Erdalkalimetallhydroxid, wie Calcium- oder Bariumhydroxid. Eine Ausfällung, die sich bildet, z.B. Bariumsulfat, sollte entfernt werden und anschliessend kann das Salz isoliert werden, z.B. durch Gefriertrocknung. Die Reinigung durch Umwandlung in das Lithiumsalz kann anschliessend wie vorstehend beschrieben durchgeführt werden.

Im allgemeinen wird die Extraktion des phenolischen Lösungsmittels vorzugsweise derart durchgeführt, dass sich eine wässrige Phase bei einem pH-Wert von etwa 6,5 ergibt.

Die phenolischen Extrakte können durch Extrahieren eines wässrigen Eluats aus einem Entfärbungskohle- bzw. Aktivkohle- oder Harzadsorbat der vorstehend beschriebenen Art, mit einem phenolischen Lösungsmittel hergestellt werden, gewöhnlich nach Konzentrieren des Eluats und,

falls gewünscht, nach Ausfällung von unerwünschten organischen Verunreinigungen durch Zusatz von ein oder mehreren mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln und/oder Entfernung solcher Verunreinigungen durch Extrahieren mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel.

So wird beispielsweise bei dieser Art von Arbeitsweise das Eluat entweder mit Entfärbungskohle oder einem Harz vorteilhaft durch Verdampfen unter vermindertem Druck konzentriert. Im allgemeinen werden Arbeitsgänge während der Reinigung bevorzugt bei einem pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 7,0, z.B. etwa 6,5, durchgeführt, um eine Zersetzung auf ein Minimum herabzusetzen. Das Eluat kann anschliessend weiter durch Ausfällen von unerwünschtem Material mit einem mit Wasser mischbaren Keton, wie Aceton, vorzugsweise unter Bildung einer Ketonkonzentration von 50 bis 90 Volumen- %, bevorzugt etwa 85%, gereinigt werden. Der pH-Wert bei dieser Stufe beträgt vorzugsweise etwa 6,5 und falls die wässrige Flüssigkeit bereits mit Wasser mischbares Keton enthält, wird dieses vorzugsweise entfernt, um die pH-Wertmessung zu erleichtern. Der pH-Wert kann durch Zugabe einer Base, z.B. eines Alkalimetallhydroxids, wie Natriumhydroxid, eingestellt werden.

Die weitere Reinigung kann durch eine Lösungsmittelextraktionsstufe zur Entfernung von unerwünschten Komponenten erfolgen, z.B. durch Konzentrieren und Einstellen des pH-Wertes des Filtrats der Ketonausfällung auf etwa 4 durch Zugabe einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure oder Chlorwasserstoffsäure und Extrahieren mit n-Butanol oder einem flüssigen Alkohol mit höherem Molekulargewicht. Zweckmässig können 1 bis 8 Volumen Lösungsmittel verwendet werden.

Nach dieser Extraktion wird die wässrige Phase vorzugsweise bei etwa pH-Wert 6,5 konzentriert und kann noch weiter durch Extrahieren des gewünschten Antibiotikums in ein phenolisches Lösungsmittel, z.B. Phenol selbst oder ein Kresol, vorzugsweise nach Verringern des pH-Werts auf etwa 4, mit Mineralsäure, gereinigt werden. Das phenolische Lösungsmittel enthält vorteilhaft eine Base, wie N,N-Dime-thylanilin und ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel wie Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff. Die Extraktion wird vorteilhaft mehrfach unter Anwendung von etwa 2/s Volumen Lösungsmittel für jede Extraktion durchgeführt. Die Extrakte können anschliessend vereint werden und Wasser, vorzugsweise etwa V,5 des Lösungsmittelvolumens kann zur Bildung einer separaten Phase zugesetzt werden. Das Antibiotikum kann anschliessend durch Zugabe einer Base zu der wässrigen Schicht, vorzugsweise eines Alkalimetallhydroxids, z.B. Lithiumhydroxid, oder eines Erdalkalimetallhydroxids, z.B. Barium- oder Calciumhydroxid, bis auf einen pH-Wert von etwa 6,5, rückextrahiert werden,. Die wässrige Schicht wird von der phenolischen Schicht abgetrennt und der Rückextraktionsarbeitsgang wird vorteilhaft wiederholt, wonach die wässrigen Extrakte vereint werden. Nach der Abtrennung von jeglichem Niederschlag, z.B. Bariumsulfat, kann jegliches zurückbleibende phenolische Lösungsmittel aus der wässrigen Lösung durch Extrahieren mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie Äther, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff entfernt werden und zur Gewinnung des Antibiotikum-Salzes kann die wässrige Phase gefriergetrocknet oder sprühgetrocknet werden, bei einem pH-Wert von 6,5.

Die weitere Reinigung kann nach üblichen Techniken, wie Chromatographie, insbesondere unter Anwendung von Materialien wie Sephadex (Handelsprodukt der Pharmacia Ltd.) durchgeführt werden. So kann das Antibiotikum, das in dieser Stufe normalerweise in Form eines Salzes vorliegt, z.B. in Form des Bariumsalzes, auf eine Sephadexkolonne (z.B. Sephadex G 15) aufgebracht und mit Wasser eluiert werden, wobei die Fraktionen, die eine beträchtliche antibiotische Wirkung zeigen, vereint werden zur anschliessenden Wiedergewinnung des Salzes, z.B. durch Gefriertrocknen.

Umwandlung von Lithiumclavulanat in Clavulansäure und andere Salze

Gereinigtes Lithiumclavulanat, hergestellt nach der vorstehenden Arbeitsweise, kann in andere Salze durch Ionenaustausch, z.B. unter Anwendung eines Ionenaustauscherharzes, umgewandelt werden. So kann beispielsweise das wässrige Lithiumsalz auf ein Kationenaustauscherharz, z.B. Bio Rad AG50X8 (Handelsprodukt der Bio Rad Laboratories, Richmond, California) in der Kationenform aufgebracht werden, wobei das Kation das des Clavulansäuresalzes, das gewünscht wird, z.B. Natrium oder Kalium, ist, worauf Eluieren, z.B. mit Wasser, folgt.

Freie Clavulansäure kann durch Ansäuern einer wässrigen Lösung des Lithiumsalzes, vorzugsweise mit grosser Ionenst^rke, z.B. gesättigt mit Natriumchlorid oder Ammo-niumsuljfat, in Anwesenheit eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels für Clavulansäure, beispielsweise eines Esterlösungsmittels, wie Äthylacetat, z.B. auf einen pH-Wert von etwa 2,6, gebildet werden. Falls notwendig, kann die wässrige Phase mit weiterem Lösungsmittel extrahiert werden und die Lösungsmittel können vereint werden. Im allgemeinen genügt jegliche Säure, die einen ausreichend niedrigen pH-Wert ergibt, zum Ansäuern, z.B. eine Mineralsäure, wie Chlorwasserstoffsäure. Das Lösungsmittel kann anschliessend unter Bildung der freien Säure, gewöhnlich in Form eines Öls, entfernt werden.

Die Lösung der freien Säure im mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel kann zur Herstellung eines weiten Bereiches von Salzen durch Extraktion mit einer wässrigen Lösung einer geeigneten Base und Isolieren des Salzes hieraus verwendet werden. Es kann notwendig sein, festes Material aus der wässrigen Phase vor der Isolierung des Salzes abzu-filtrieren.

Da die freie Säure ziemlich instabil ist, sollte sie vorzugsweise sobald wie möglich nach ihrer Bildung verwendet werden, beispielsweise zur Herstellung von Salzen oder anderen Derivaten.

Die folgenden Herstellungsverfahren und Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

624956

8

Die Clavulansäuregehalte von Verfahrensflüssigkeiten und Feststoffen wurden gemessen durch:

1. UV-Spektroskopie

Wässrige Lösungen von Clavulansäure und ihren Salzen zeigen eine sehr geringe UV-Absorption bei über 230 nm und beispielsweise beträgt der molare Extinktionskoeffizient e bei 280 nm etwa 60.

Durch Auflösen in Alkali jedoch entwickelt sich rasch eine intensive UV-Absorption bei XIimx 259 ± 1, und diese kann dazu verwendet werden, die Clavulansäure und/oder ihre Salze zu bewerten. Zur Bewertung wurden Feststoffe genau ausgewogen und in einer verdünnten Natriumhydroxidlösung (0,1 m) unter Bildung eines bekannten Volumens an Lösung entsprechend etwa 0,01 mg/ml Clavulansäure gelöst. Die optische Dichte der Lösung bei einem Absorptionsmaximum bei oder bei etwa 259 nm wurde auf einem geeigneten Spektrophotometer gemessen. Die Reinheiten der Feststoffe können berechnet werden unter der Annahme,

dass der Wert s für Clavulansäure 16 700 beträgt. Molare Extinktionskoeffizienten können aus den E,'-Werten berechnet werden, d.h. den Extinktionskoeffizienten für eine 1 % ige Lösung in einer 1 cm-Zelle. In ähnlicher Weise wurden Verfahrensflüssigkeiten, falls notwendig nach Entfernung von organischen Lösungsmitteln, genau mit verdünnter Natriumhydroxidlösung verdünnt, um ähnliche Konzentrationen von Alkali und Clavulansäure zu ergeben, wenn die Clavulansäurekonzentration in der Originalflüssigkeit wie vorstehend beschrieben bestimmt wurde. Die Werte für rohe Feststoffe und Verarbeitungsflüssigkeiten wurden auf die Absorption von Verunreinigungen hin unter Verwendung von Lösungen der gleichen Konzentration in Wasser korrigiert.

2. Biologische Aktivität

Bestimmt durch Vergleich von Lösungen von Feststoffen von bekanntem Clavulansäuregehalt im Agar-Schalen (agar cup plate) -Versuch gegen Acinetobacter sp., im wesentlichen nach der Methode von Lees und Tootill [Lees, K.A. & Tootill, J.P.R., Analyst, 1955, 80, (947), 95-110; ibid 110-123; 80 (952), 531-535J.

Alle Medien wurden vor der Fermentation mit Dampf destilliert. Die Temperaturen sind in °C angegeben.

Herstellungsverfahren 1 Herstellung des Bariumsalzes a) Entwicklung des Inoculums

10 ml steriles destilliertes Wasser wurden zu einer 14 Tage alten Malz/Hefeextrakt-Agar-Schrägkultur von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 gefügt und es wurde eine Suspension hergestellt.

Ein Teil von 1,5 ml dieser Suspension wurde zum Animpfen von 150 ml eines Mediums verwendet, das enthielt:

% Gew./Vol.

Sucrose 2,0

Distillers' solubles * 1,5

Hefeextrakt 0,5

K.HPO, 0,02

Trypton 0,5

Glycerin 1,0

und Wasser auf 100% in einem 2 I-Kolben (florence flask).

* Rückstand erhalten bei der Destillation alkoholischer Flüssigkeiten bzw. Getränke.

Dieser Kolben wurde 48 Stunden bei 220 U/min bei 26°C auf einem Rotationsschüttler mit einem Auswurf von 5,08 cm (2 inch) inkubiert. 150 ml dieses Inoculums wurden zum Animpfen von 4 1 eines Mediums verwendet, das ent-s hielt:

% Gew./Vol.

Sojabohnenmehl

2,1

Distillers' solubles

0,52

Kaseinhydrolysat

0,52

Fe SO,. 7ILO

0,01

lösliche Stärke

4,7

glukose

0,78

20

und Wasser auf 100% in einem 5 1-Fermentationsgefäss mit Belüftung (0,75 Vol/Vol/Min) und wurde bei 28°C unter Rühren gehalten (750 U/min) während 20 Stunden.

25 b) Fermentation

7,5 1 des 20stündigen Inoculums von (a) wurden in 150 I eines Mediums eingeimpft, das enthielt:

30

% Gew./Vol.

lösliche Stärke

4,7

Sojabohnenmehl

2,1

35

Distillers' solubles

0,52

Kaseinhydrolysat

0,52

Glukose

0,78

40

FeS04. 7H20

0,01

Polyglykol (P. 2000: Dow Chemical Co.)

0,05

und Wasser auf 100% in einem 220 1-Gefäss. Es wurde 90 45 Stunden bei 28°C unter Belüften (2 Vol/Vol/Min) und Bewegen (350 N/min) fermentiert.

c) Isolierung

Die gesamte Brühe der Stufe (b) wurde auf den pH-Wert 50 6,3 eingestellt und durch Zentrifugieren geklärt. Die klare überstehende Flüssigkeit (89 1) wurde auf eine Säule, die Pittsburg CAL-Entfärbungskohle (20 1) enthielt, aufgebracht.

Die Entfärbungskohle wurde mit 40 1 destilliertem Wasser gewaschen und dann so trocken wie möglich von Flüssig-55 keit befreit. Die Entfärbungskohle wurde mit 101 Aceton und anschliessend 40 1 90%igem wässrigem Aceton eluiert. 5x101 Eluatfraktionen wurden gesammelt und jede Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons verdampft.

60 Die Fraktion 1 (5 I wässrige Lösung) wurde durch Gefriertrocknen auf 2,2 I konzentriert und es wurde Aceton auf eine Endkonzentration von etwa 84% Aceton zugefügt. Zu der Fraktion 2 (0,5 1 wässrige Lösung) wurde Aceton auf eine Endkonzentration von etwa 84% Aceton gefügt. Die 65 Fraktionen 1 und 2 wurden anschliessend durch eine Filterhilfe (Celite 535) filtriert und die Filtrate wurden unter vermindertem Druck verdampft, um das Aceton zu entfernen und die resultierenden wässrigen Lösungen wurden vereint.

9

624956

Die wässrigen Lösungen der Fraktionen 3 bis 5 wurden vereint und unter Bildung eines Feststoffs gefriergetrocknet. Die wässrige Lösung der vereinten Fraktionen 1 und 2 wurde anschliessend zu dem Feststoff der vereinten Fraktionen 3 und 5 gegeben, wobei man eine Lösung erhielt, die durch Gefriertrocknen auf 0,76 1 konzentriert wurde. Diese Lösung (pH 4) wurde sofort mit Butan-l-ol extrahiert (1 x 1,52 1, 5x380 ml).

Die wässerige Phase wurde nach Entfernen des Butanols durch Verdampfen unter vermindertem Druck auf den pH-Wert 4,2 (von 5,6) mit Schwefelsäure gebracht und mit einem gleichen Volumen von 72% wässrigem Phenol/N,N--Dimethylanilin/Tetrachlorkohlenstoff (53:5:15, bezogen auf das Volumen) extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde anschliessend mit 500 ml wässrigem Bariumhydroxid extrahiert, wobei man eine wässrige Lösung vom pH-Wert 6,5 erhielt. Suspendiertes Bariumsulfat wurde durch Filtrieren entfernt und das Filtrat wurde mit Diäthyläther gewaschen und gefriergetrocknet, wobei man 11,1 g festes Bariumsalz erhielt; 220.

Herstellungsverfahren 2 Herstellung des Bariumsalzes

Eine Fermentationsbrühe, die auf gleiche bzw. ähnliche Weise wie beim Herstellungsverfahren 1 (a) und (b) erhalten wurde, wurde wie folgt hergestellt: 135 1 Fermentationsbrühe vom pH-Wert 6,5 wurden auf einer Zentrifuge geklärt, wobei man 1121 überstehende Flüssigkeit vom pH-Wert 6,3 erhielt. Diese wurde durch eine Säule von 25 1 Pittsburg CAL-Entfärbungskohle geleitet und die Säule wurde mit 50 1 Wasser durchgewaschen. 10 1 Aceton wurden langsam auf das obere Ende des Bettes gegossen und es wurde mit dem Eluieren begonnen. Anschliessend folgten 601 90%iges wässriges Aceton. Das Eluat wurde in Fraktionen (1X10 I, 2 X 25 1) gesammelt.

Jede Fraktion wurde unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons destilliert. Die zurückbleibende wässrige Lösung wurde mit 1 m-Natriumhydroxid auf den pH-Wert 6,0 eingestellt. Die Fraktionen wurden anschliessend vereint und weiter auf 2,9 1 destilliert, in einen geeigneten Behälter überführt und mit den Waschlösungen des Behälters (Boiler) auf 3,3 1 gebracht. 17 1 Aceton und 500 g Celite 535 wurden zu dem Konzentrat unter kräftigem Rühren gefügt. Die resultierende Suspension wurde filtriert und der Kuchen wurde mit 41 85 %igem wässrigen Aceton gewaschen.

Das vereinte Filtrat und die Waschlösungen wurden unter vermindertem Druck auf 4,0 I destilliert. Der pH-Wert wurde von 5,65 auf 6,0 mit 1 m-Natriumhydroxid eingestellt und es wurde weiter destilliert, bis das Volumen 1,0 1 betrug. Das resultierende Konzentrat wurde mit 20%iger Schwefelsäure auf den pH-Wert 4,0 angesäuert und mit 4x750 ml und 1X500 ml Butan-l-ol gewaschen. Das gelöste Butan-l-ol wurde unter Vakuum aus der wässrigen Phase abdestilliert.

Nach Einstellen des pH-Werts mit 20%iger Schwefelsäure auf 4,2, wurde das Konzentrat 3 x mit einer Mischung von 265 ml verflüssigtem Phenol (B.P.), 75 ml Tetrachlorkohlenstoff und 25 ml N,N-Dimethylanilin extrahiert. Der pH-Wert wurde für jeden Extrakt auf 4,2 eingestellt. Die vereinten Lösungsmittelextrakte wurden mit 250 ml Wasser gerührt und der pH-Wert wurde mit 70 ml gesättigtem wässrigem Bariumhydroxid auf 6,5 eingestellt. Nach Trennung der Phasen wurde das Lösungsmittel mit 200 ml Wasser und 7 ml gesättigtem wässrigen Bariumhydroxid erneut extrahiert.

Die vereinten wässrigen Phasen wurden mit 3 X200 ml Diäthyläther gewaschen, im Vakuum auf 200 ml verringert und gefriergetrocknet, wobei man 29,4 g eines blass-braunen Feststoffs erhielt; E\ = 152.

5

Herstellungsverfahren 3

Herstellung eines Entfärbungskohle- bzw. Aktivkohleeluats, das Clavulansäure enthält io a) Entwicklung des Inoculums

10 ml steriles destilliertes Wasser wurden zu einer 14 Tage alten Malz/Hefeextrakt-Agar-Schrägkultur von Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 gefügt und es wurde eine Suspension hergestellt.

15 Ein Teil von 2,0 ml dieser Suspension wurde zum Animpfen von 150 ml eines Mediums verwendet, das enthielt:

% Gew./Vol.

Sucrose 2,0

Distillers' solubles 1,5

Hefeextrakt 0,5

K2HP04 0,02

Trypton 0,5

Glycerin 1,0 und Wasser auf 100%.

35 Es wurde in einem 2 I-Kolben (florence flask) gearbeitet. Der Kolben wurde 48 Stunden bei 26°C auf einem Rotationsschüttler inkubiert (5 cm Reichweite; 220 U/min).

Der Inhalt von 6 derartigen Kolben (insgesamt 900 ml) wurde zur Animpfung von sechs 5 1-Fermentoren verwendet, 40 die jeweils 4,5 1 eines Mediums enthielten, das enthielt:

% Gew./Vol.

Sojamehl 2,1

Distillers' solubles 0,52

Kaseinhydrolysat 0,52

Eisen-II-sulfat-heptahydrat 0,01

lösliche Stärke 4,7

Glukose ' 0,78

Silikon-Antischaumemulsion 0,05

(Vol/Vol)

und Wasser auf 100%.

60

Die Fermentoren wurden belüftet (0,67 Vol/Vol/Min) und bewegt (750 U/min; zwei Flügelrührer von 7,5 cm Durchmesser), wobei 20 Stunden bei 28°C gearbeitet wurde.

65 b) Fermentation

25 1 Inoculum aus der 5 1-Fermentorstufe wurden zum Animpfen von 475 1 eines Mediums verwendet, das enthielt:

55

624956

10

% Gew./Vol.

Sojamehl 3,00

Eisen-II-suIfat-heptahydrat 0,01

K2HP04 0,01

lösliche Stärke 4,7

Silikon-Antischaumemulsion 0,05

(Vol/Vol)

und Wasser auf 100%.

das in einem 700 1-Fermentationsgefäss aus rostfreiem Stahl enthalten war und mit 350 U/min (25 cm Durchmesser Rührer und vier 7,5 cm Leitbleche bzw. Trennwände) und mit 0,56 Vol/Vol/Min belüftet wurde. Die Fermentation wurde 82 Stunden bei 28°C durchgeführt und je nach Notwendigkeit wurde weiteres Antischaummittel zugesetzt. Die Fermentation wurde bei einem pH-Wert von 6,5 gehalten.

c) Isolierung

Die gesamte Brühe der Stufe (b) wurde mit starker Schwefelsäure auf den pH-Wert 5,45 eingestellt und auf einem Rotationstrommelfilter mit einer Cellulosevorbeschich-tung filtriert. Das Filtrat (4301), das das Antibiotikum enthielt, wurde auf Entfärbungskohle (Pittsburgh CAL; 135 1) in Säulen adsorbiert. Die Aktivkohle wurde mit 90 1 Wasser gewaschen, um die filtrierte Brühe zu ersetzen, und das Antibiotikum wurde mit wässrigem Aceton eluiert (60% Vol/ Vol; 180 1).

Beispiel 1

(i) Herstellung des Calciumsalzes a) 8,83 g des rohen Bariumsalzes des Herstellungsverfahrens 2 wurden zu 50 ml einer gesättigten wässrigen Lösung von (NH,)2SO j gefügt. 50 ml Äthylacetat wurden zugefügt und die Mischung wurde gerührt, ein pH-Wert-Messgerät wurde in die Mischung eingebracht und der pH-Wert wurde mit etwa 15 ml 1 m H2S04 von 6,8 auf 2,6 eingestellt. Die wässrige Lösung wurde von dem Äthylacetat abgetrennt und erneut mit einer frischen Portion von 50 ml Äthylacetat gerührt. Die beiden Äthylacetatextrakte wurden vereint, 100 ml destilliertes Wasser wurden zugesetzt und die Mischung wurde in Anwesenheit des pH-Messgerätes gerührt. Etwa 40 ml einer gesättigten Lösung von Calciumhydroxid wurden zugesetzt, um den pH-Wert der Mischung auf 6,6

zu bringen. Die wässrige Lösung wurde von dem Äthylacetat abgetrennt, durch eine Filterhilfe filtriert und gefriergetrocknet, wobei man 1,44 g festes Calciumsalz erhielt.

b) Der Feststoff von (a) wurde in 15 ml destilliertem Wasser gelöst, durch ein Millipor-Filter filtriert und auf eine Sephadex G15-Kolonne aufgebracht, die in Wasser gepackt war, um eine Betthöhe von 152,4 cm (60 inch) und einen Durchmesser von 2,54 cm (1 inch) zu ergeben. Es wurde mit destilliertem Wasser eluiert und es wurden Fraktionen von 20 ml gesammelt. Die Fraktionen wurden nach Dünnschichtchromatographie (Cellulose, Eastman-Kodak 6065-Platten; Lösungsmittel Acetonitril-Wasser, 7:3 Vol) durch Überlagern mit Nährmedium-Agar, das Staphylococcus aureus enthielt, bewertet. Die Fraktionen 33-37 wurden vereint und unter Bildung von 490 mg gefriergetrocknet. Der Feststoff wurde über P203 im Vakuum während 60 Stunden gehalten. Das Calciumsalz von (b) hatte folgende Charakteristika:

pKa

Der pKa-Wert der entsprechenden Säure erwies sich als etwa 2,4 durch potentiometrische Titration des Salzes.

Optische Drehung

[a]D bei 22°C, +44,9° (c = 0,287 g/100 ml Wasser).

UV-Spektrum

Eine Probe von 0,00148 g wurde in 100 ml 0,1 m NaOH gelöst und zeigte ein Absorptionsmaximum (Amax) bei 258 nm mit einem E VWert von etwa 550.

IR-Spektrum

Das Infrarotspektrum in Nujol einer Probe zeigte Ab-sorptionsmaxima bei den Wellenzahlen (cm-1):

3300

s, br

2330

w

1788

s

1692

m

1604

s

1404

s

1305

s

1190

m

1118

m

1082

m

1060

m

1042

m

1012

m

992

m

968

m

892

m

00 -p»

00

w

790

w

740

m

654

w

(s, m und w bedeuten starke, mittlere bzw. schwache Intensität). br = breit.

Das gesamte Spektrum ist in der beigefügten Figur 3 aufgeführt.

NMR-Spektrum

Das protonenmagnetische Resonanzspektrum einer Lösung der Probe in schwerem Wasser zeigte Gruppen von Peaks (t-Werte), die zentriert waren bei etwa 4,31, 5,10, 5,85, 6,46, 6,91.

Dünnschichtchromatographie

Teile der Probe, gelöst in Wasser, wurden auf den Ausgangspunkt von entweder Eastman-Kodak Cellulose TL-Platten (plastic-backed, EK 6064) oder Eastman-Kodak Sili-ciumdioxid TL-Platten (plastic-backed, EK 6060) aufgebracht. Die Platten wurden mit Lösungsmittel bei Raumtemperatur entwickelt und anschliessend luftgetrocknet und mit einem Agar-Nährmedium, das Staphylococcus aureus enthielt, überlagert. Die Rf-Werte, berechnet als die Entfernung von dem Ausgangspunkt zum Zentrum jeder Zone des inhibierten Bakteriumwachstums, dividiert durch die Entfernung von dem Ausgangspunkt zur Lösungsmittelfront, sind im folgenden für fünf Systeme aufgeführt:

Lösungsmittel

Träger

Rf

Propan-l-ol:Wasser (7:3)

Cellulose

0,60

Butan-1 -ol: Essigsäure: Wasser (3:1:1)

Cellulose

0,64

Acetonitril:Wasser (7:3)

Cellulose

0,68

Acetonitril:Wasser:Propan-2-ol

(1:1:1)

Cellulose

0,87

Butan-l-ol:Essigsäure:Wasser (3:1:1)

Silicium-dioxid

0,63

Papier-Ionophorese

Teile der Probe wurden einer Ionophorese auf Whatman 541-Papier während 1 Stunde bei 400 Volt angelegt an

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

11

624956

20 cm, unterzogen. Die Aktivität, bestimmt durch Überlagerung des luftgetrockneten Papiers mit Staphylococcus aureus enthaltendem Agar-Nährmedium hatte eine Mobilität, bezogen auf Cyanocobalamin, von 4,5 cm gegen die Anode beim pH-Wert 4,8 (0,01 m Acetat), pH 6,9 (0,01 m Phosphat) und pH 9,5 (0,01 m Pyrophosphat).

ii) Herstellung des Lithiumsalzes

1 g Calciumsalz (E1! = 590) rein, gemäss UV-Bewer-tung), hergestellt wie in (i) (b) beschrieben, wurde in 10 ml Wasser gelöst und 10 ml einer gesättigten Lösung von Lithiumchlorid in Wasser wurden zugefügt. Die Kristallisation trat ohne Kratzen oder Animpfen auf. Nach dem Kühlen auf 0° wurden die Kristalle filtriert, mit 5 ml Äthanol, 5 ml Aceton und 2 X 5 ml Diäthyläther gewaschen. Die Kristalle wurden unter vermindertem Druck (0,1 mmHg) über Si-liciumdioxidgel 2 Stunden getrocknet, wobei man 495,5 mg festes Lithiumsalz erhielt. Dieses Salz hatte folgende Eigenschaften:

Elementaranalyse gef.: (die Mittelwerte sind in Klammern angegeben): C 45,5, 45,8 (45,65); H 3,8, 3,8 (3,8); N 7,0, 7,2 (7,1); Li 3,2%.

Schwefel wurde nach der Methode von N.D. Cheronis & J.B. Entrikin (1947), Semimicro Qualitative Analysis, Seite 93, Crowell, New York, nicht entdeckt. Berechnet für C8H8N05Li. V4 H20: C 45,84; H 4,06; N 6,68; Li 3,31 %.

Der vorstehend aufgeführte Wert der Li-Analyse (3,2%) wurde durch Atomabsorptions-Spektrophotometrie bestimmt.

Die Sulfatasche betrug 26,8%, was berechnet als Li2S04 äquivalent 3,38% Lithium entspricht.

pKa

Der pKa-Wert der korrespondierenden Säure erwies sich durch potentiometrische Titration des Salzes als etwa 2,3.

Optische Drehung

Die [a]D-Werte für eine 0,145% (Gew./Vol) wässrige Lösung bei 24° betrug +66,0°.

Ultraviolettspektrum

Das UV-Absorptionsspektrum einer 0,00091 %igen Lösung in 0,1 m Natriumhydroxid hatte eine Absorptionsmaximum (Amax) bei 258 nm mit einem E11-Wert von 788.

Infrarotspektrum

Das IR-Spektrum in Nujol zeigte Absorptionspeaks

(cm-r

) bei etwa:

3420

(m)

1402

(s)

1200

(w)

1026

(m)

880

(w)

3012

(w)

1338

(m)

1129

(m)

992

(m)

850

(w)

1765

(s)

1325

(s)

1101

(m)

976

(m)

734

(m)

1683

(s)

1300

(m)

1062

(m)

950

(s)

708

(w)

1618

(s)

1224

(w)

1048

(s)

900

(m)

Das gesamte Spektrum ist in der beigefügten Figur 1 aufgeführt.

NMR-Spektrum

Ein 100 MHz-kernmagnetisches Resonanzspektrum des Lithiumsalzes, gelöst in schwerem Wasser, zeigte Peaks (x-Werte mit Multiplizitäten und Kopplungskonstanten-Hz-in Klammern) zentriert bei etwa 4,26 (d,3), 5,05 (t,8), 5,06 (s), 5,81 (d,8), 6,43 (dd,3 und 17) und 6,89 (d,17).

(s, d, dd, t und m = Singulett, Dublett, Doppeldublett, Triplett bzw. Multiplett).

Beispiel 2 Umkristallisieren des Lithiumsalzes

0,1 g Lithiumsalz, hergestellt in Beispiel 1 (ii) wurden in 1,0 ml Wasser gelöst und sorgfältig mit 19 ml Isopropa-nol verdünnt. Das Produkt kristallisierte langsam bei 0° und wurde in zwei Anschüssen nach Absieden unter vermindertem Druck auf 5 ml für den zweiten Anschuss gewonnen. Die Kristalle des Lithiumsalzes wurden über Siliciumdioxid-gel im Vakuum 3 Tage lang getrocknet.

Erster Anschluss: 20,0 mg, Xmax 259 nm, E^ = 814 in 0,1 m Natriumhydroxidlösung bei 10 (ig/ml.

Elementaranalyse für C8H8NOsLi. V4 H20:

ber.: C 45,84, H 4,06, N 6,68%

gef.: C 46,2, 46,0, H 4,10, 3,85, N 6,8, 6,7%

Zweiter Anschluss: 67,0 mg, Amax 259 nm, Ej1 = 800 in 0,1 n Natriumhydroxid bei 10 [ig/ml.

Elementaranalyse für S8H8NOr,Li • V4 H20:

ber.: C 45,84, H 4,06, N 6,68, Li 3,31%

gef.: C 46,15, 46,5, H 3,9, 4,0, N 6,65, 6,5,

Lithium 3,4% (Sulfatasche).

Beispiel 3

30 g des Bariumsalzes (E1, 274, hergestellt wie im Herstellungsverfahren 2) wurden in 40 ml Wasser gelöst und 300 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung wurden zugesetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 23,0 ml 20%iger Schwefelsäure auf 2,3 eingestellt und anschliessend wurde mit 2 X 300 ml Äthylacetat extrahiert. 200 ml Wasser wurden zu den vereinten Extrakten gefügt. Die Mischung wurde kräftig gerührt und 89,3 ml 1 m-Natriumhydroxidlösung wurden zugegeben, bis der pH-Wert 6,8 erreichte. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck auf 33 ml destilliert. 770 ml Butan-l-ol wurden zu dem wässrigen Konzentrat gefügt und anschliessend vermischt, erwärmt auf 40°C unter herftigem Schütteln. Unlösliches Material wurde abfiltriert und es wurde erneut mit Wasser:Bu-tan-l-ol (1:23 Vol/Vol) bis alles aufgelöst war, extrahiert. Die vereinten Lösungen wurden über Nacht auf 4°C gekühlt. Der gebildete kristalline Feststoff wurde durch Filtrieren gewonnen, mit Butan-l-ol und Aceton gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei man 3,34 g des Natriumsalzes erhielt (Ei1 648).

2,92 g dieses Natriumsalzes wurden in 20 ml Wasser gelöst und filtriert. Das Filtrat wurde bei 0° gerührt und es wurden 20 ml bei 20° gesättigte Lithiumchloridlösung während 5 Minuten eingebracht. Es wurde eine weitere Stunde gerührt und gekühlt, wonach die Kristalle durch Filtrieren gewonnen, mit 20 ml Äthanol, zweimal 20 ml Aceton und zweimal 25 ml Diäthyläther gewaschen wurden und an der Luft unter Bildung von 2,275 g des Lithiumsalzes in Form von länglichen flachen Prismen (E^ = 770) getrocknet wurden.

Beispiel 4

7,99 g rohes Bariumsalz (E1! = 288), hergestellt wie im Herstellungsverfahren 2 beschrieben, wurden in 60 ml Wasser gelöst und filtriert. Das Filtrat wurde anschliessend portionsweise mit 4,0 g Lithiumsulfat unter Rühren bei Raumtemperatur versetzt, bis sich kein Test mehr für Barium auf einer separaten Testplatte mit Natriumrhodizonat ergab. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren geklärt und die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und unter vermindertem Druck auf etwa 35 ml abgesiedet. 9,0 g Lithium5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

624956

12

chlorid wurden portionsweise unter Rühren und Kühlen zugesetzt; nach 1 Stunde bei 0° wurde das Lithiumsalz durch Filtrieren gewonnen, mit 10 ml Äthanol, 2 x 25 ml Aceton und 2 % 20 ml Diäthyläther gewaschen und an der Luft im Filtertrichter getrocknet, wobei man 1,590 g weisse Prismen erhielt (E1! = 790).

Beispiel 5 Herstellung des Natriumsalzes

3,5 g des wie in Beispiel 1 (ii) hergestellten Lithiumsalzes wurden in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine Säule aufgebracht, die 50 ml AG50x8 Kationenaustauscherharz (Bio-Rad, Na+; Korngrösse 0,074-0,037 mm = 200-400 mesh) enthielt. Es wurde mit Wasser eluiert und es wurden Fraktionen von 8 ml gesammelt. Die Fraktionen wurden nach Auftrag von Teilen auf Papier durch Überlagerung mit Staphylococcus aureus enthaltendem Nähragar bewertet. Aktive Fraktionen (4 bis 13) wurden vereint und gefriergetrocknet.

Der gefriergetrocknete Feststoff wurde in destilliertem Wasser unter Bildung von 19 ml Lösung gelöst, mit 450 ml Butan-l-ol geschüttelt und auf dem Wasserbad erwärmt, bis die Lösung fast klar war. Die warme Lösung wurde durch ein Sinterfilter filtriert, um gelben Feststoff zu entfernen und das Filtrat wurde 60 Stunden bei 4°C gehalten. Die gebildeten Kristalle wurden filtriert, mit 2 X 10 ml Butan-l-ol und anschliessend 2 X 10 ml Aceton gewaschen und unter vermindertem Druck 1 Stunde bei 40°C getrocknet, wobei man 2,18 g Feststoff erhielt. Der Feststoff wurde aus Was-ser-Butan-l-ol (1:23,3 Vol) wie beschrieben umkristallisiert. Die Kristalle wurden unter vermindertem Druck über Sili-ciumdioxidgel 1,5 Stunden bei 44°C getrocknet, wobei man 1,8 g festes Natriumsalz erhielt.

Der Feststoff war hygroskopisch. Er wurde mit Pistill und Mörser vermählen und konnte atmosphärisches Wasser bei 18°C aufnehmen. Nach der Aufnahme von etwa 22% (Gew/Gew) Wasser wurde ein Gleichgewicht erreicht.

Dieses Salz hatte folgende Eigenschaften:

Elementaranalyse (des im Gleichgewicht befindlichen feuchten Feststoffs)

ber. für C8H805N Na . 4 H20 C 32,76, H 5,46, N 4,78, Na 7,8, Wasser 24,57; gef.: (die Mittelwerte sind in Klammern angegeben) C 33,3, 33,2 (33,25); H 4,6, 4,6 (4,6); N 4,6, 4,7 (4,65); Na 7,3 (duch Absorptionsspektrophotometrie), 7,9 (ber. aus der Sulfatasche); Wasser 21,95%.

Metallanalyse

( 1 ) Gefunden durch Atomabsorptionsspektrophotometrie:

Na 7,3 ± 0,2% (dieser Wert ist unter der Elementaranalyse veranschlagt)

(2) Unter der Annahme, dass die Sulfatasche Na2S04 ist, wurde der Na-Gehalt als 7,9% berechnet.

Optische Drehung

Der [a]D-Wert für eine 0,134%ige (Gew/Vol) wässrige Lösung bei 24°C betrug + 47°.

Ultraviolettspektrum

Das UV-Absorptionsspektrum einer 0,00098 %igen Lösung in 0,1 m NaOH hatte ein Absorptionsmaximum (^iiiax) bei 258 nm mit einem E1 ,-Wert von 555.

In frarotspektrum

Das IR-Spektrum in Nujol zeigte Absorptionspeaks (cm-1) bei etwa:

3400 s

1592

s

1288 m

1080 w

986 s

850 w

3300 s

1396

s

1206 w

1060 m

967 m

802 w

1792 s

1348

m

1190 m

1048 m

945 w

753 m

1690 s

1310

s

1138m

1015 s

902 m

1665 m

1302

sh

1120 m

998 m

880 w

Das gesamte Spektrum ist in der beigefügten Figur 2 aufgeführt.

NMR-Spektrum

Das kernmagnetische Resonanzspektrum einer Lösung in schwerem Wasser zeigte Peakgruppen (x-Wer te), zentriert bei etwa 4,28, 5,07, 5,82, 6,44 und 6,88.

Beispiel 6 Herstellung des Kaliumsalzes

3,0 g Lithiumsalz, hergestellt wie in Beispiel 1 (ii) wurden in 100 ml Wasser gelöst und durch eine Dowex 50W x 2-Säule (450 ml, Kaliumzyklus) geleitet. Ein Vorlauf von 150 ml wurde verworfen. Die nächsten 400 ml Eluat wurden gesammelt und unter vermindertem Druck auf 15 ml verdampft. 340 ml Butan-l-ol wurden zugesetzt und die Mischung wurde erwärmt und gut geschüttelt. Etwas unlöslicher Feststoff wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck auf 200 ml destilliert und anschliessend über Nacht bei 4°C stehengelassen. Die kristalline Ausscheidung wurde abfiltriert, mit 2 x 10 ml Butan-l-ol, 2 x 50 ml Aceton und 2 x 50 ml Diäthyläther gewaschen und schliesslich im Vakuum-Exsiccator bei Raumtemperatur getrocknet. Man erhielt 2,34 g Kaliumsalz (E1, = 704). Der EVWert wurde durch Auflösen von 7,1 mg des Kaliumsalzes in 100 ml Wasser bestimmt. Diese Lösung wurde V10 mit 0,1 m Natriumhydroxid unter Bildung einer entgültigen Lösung von 7,1 (ig/ml verdünnt.

Elementaranalyse für CsHsNO;;K . V« H20:

ber.: C 39,7, H 3,5, N 5,8, K 16,2, Wasser 1,96% gef.: (die Mittelwerte sind in Klammern angegeben) C 40,0, 40,14 (40,07); H 3,5, 3,55 (3,53); N 6,0, 5,82 (5,91);

K (durch Absorptionsspektrophotometrie), 16,0 (durch Sulfatasche) 15,9; Wasser 1,75, 1,95 (1,85)%.

Optische Drehung

Der [a]D2!i°-Wert für eine 0,276%ige (Gew/Vol) wässrige Lösung betrug +58,4°.

Die Calcium-, Barium- und Magnesiumsalze der Clavulansäure wurden auf ähnliche Weise aus Lithiumclavulanat hergestellt und zeigten E^-Werte von 530, 576 bzw. 713.

Beispiel 7 Herstellung von freier Clavulansäure

500 mg des Lithiumsalzes, hergestellt wie in Beispiel 1 (ii), wurden zwischen 10 ml Äthylacetat und 10 ml gesättigtem wässrigen Natriumchlorid aufgeteilt. 1 ml 2 n-Chlorwas-serstoffsäure wurden zugesetzt und die Mischung wurde kurz geschüttelt. Die wässrige Phase wurde abgetrennt, mit 10 ml Äthylacetat gewaschen und die vereinten organischen Extrakte wurden mit 15 ml gesättigtem wässrigen Natriumchlorid gewaschen. Die resultierende organische Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet und fast zur Trockne verdampft, wobei man die freie Säure als Öl (352 mg) erhielt, das etwa 0,5 Mol Äthylacetat enthielt. Die Verbindung hatte folgende Charakteristika:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

13

624956

[a]D24 (c 1,0; DMSO) + 54,5°, Amax einer 0,00098%igen Lösung in wässrigem 0,1 n NaOH = 258 nm (E^ 590), Infrarotpeaks in Nujol umfassen 3350, 1790 und 1722 cm-1, NMR-Peaks (DMSO-d,;) umfassen x 4,31 (d, 3 Hz), 4,99 (s), 5,23 (t, 7 Hz), 5,97 (d, 7 Hz), 6,37 und 6,93 (dd, 3 und 17 Hz; d, 17 Hz); Peaks, zentriert bei x 8,82, 8,00 und 5,95 zeigten, dass die Probe etwa 0,5 Mol Äthylacetat pro Mol Clavulansäure enthielt. Diese Werte zeigen an, dass die Probe mindestens 85 Gew.-% Clavulansäure enthielt.

Beispiel 8 Herstellung des Ammoniumsalzes

Eine Säule von 240 ml Dowex 50W wurde durch Behandeln mit Ammoniumsulfat in den Ammoniumzyklus überführt und mit Wasser von Sulfat freigewaschen. 1,0 g Lithiumsalz wurden in 15 ml Wasser gelöst, auf die Säule aufgebracht und die Säule wurde mit Wasser entwickelt. Es wurden 25 ml Fraktionen entnommen und auf die UV-Ab-sorption in 0,1 n Natriumhydroxid untersucht. Aktive Fraktionen (4-7) wurden vereint und fast zur Trockne (2 ml)

unter vermindertem Druck destilliert und es wurden 85 ml n-Butanol zugefügt. Die Mischung wurde sorgfältig bei 25°C unter einem Druck von 0,1 mm destilliert, bis ein kristallines Material ausfiel. Das Ammoniumsalz wurde durch Filtrieren gewonnen, mit sehr wenig Äthanol und Aceton und schliesslich mit Diäthyläther gewaschen und bei 0,1 mm 6 Stunden unter Bildung von 0,54 g fast weisser Kristalle getrocknet; [a]D23 (c 0,39% in Wasser) +60,1°; Xmax 0,1 n Natriumhydroxid, 8,8 [ig/ml) 258 nm (E^ 745); IR-Peaks in Nujol umfassen 3360, 1780, 1700 und 1580 cmr1; x (5% D20)-Werte umfassen 4,27 (d, 3Hz), 5,08(s), 5,09 (t, 7Hz), 5,84 (d, 7Hz), 6,43 (dd, 17Hz, 3Hz) und 6,89 (d, 17Hz).

Analyse für CsHsN05NH4:

ber.: C 44,4 H 5,6 N 13,0%

gef.: C 44,4 H 5,6 N 13,3%

Eine Spur von Wasser (0,6%) ergab sich durch die Karl Fischer-Analyse.

Beispiel 9 Herstellung des Methylaminsalzes

Eine Säule von 200 ml Amberlite IR 120 H+ wurde durch Behandeln mit 0,5 m Methylaminlösung in Wasser in die Methylammoniumform übergeführt. Es wurde mit Wasser zur Neutralität gewaschen und 3,0 g Methylammoniumchlorid in 10 ml Wasser wurden eingebracht. Die Säule wurde mit Wasser, frei von Chlorid, gewaschen und war zur Anwendung bereit.

1,50 g Lithiumsalz wurden in 15 ml Wasser gelöst und von oben her in die Säule eingebracht. Die Säule wurde in Wasser entwickelt und es wurden Fraktionen von 25 ml entnommen.

Die Fraktionen 3-7 wurden vereint (161 ml mit Waschlösungen), es wurde bei 35°/1,0 mm auf etwa 2 ml destilliert und 200 ml n-Butanol wurden zugesetzt. Die klare Lösung wurde unter gleichen Bedingungen auf 20 ml destilliert, worauf eine Kristallisation erfolgte. Die Kristalle wurden durch Filtrieren nach 1 Stunde bei 2° gewonnen, mit 2 X 15 ml Diäthyläther gewaschen und 3 Stunden bei 1 mm getrocknet, wobei man 1,2 g des Methylaminsalzes als Büschel von weissen länglichen Prismen erhielt, [ajj,2" (c 0,23% in Wasser) + 56,1°, Amax (0,1 n Natriumhydroxid, 9,5 [ig/ml) 260 nm (Ei1 584); IR-Peaks in Nujol umfassen 2500, 1790, 1692, 1632 und 1576 cm-1; x (8% D20)-Werte umfassen 6,40 und 6,86 (dd, 17Hz, 3Hz : d, 17Hz), 4,24 (d, 3Hz), 5,06 (t, 7Hz), 5,78 (d, 7Hz), 5,08 (s), 7,42 (s).

Analyse für C„H14N205:

ber.: C 47,0 H 6,1 N 12,2%

gef.: C 46,7 H 6,1 N 12,5%

5 Beispiel 10

Herstellung des Piperidinsalzes

Eine Säule mit 200 ml Ionenaustauscherharz (Bio-Rad Laboratories, AG® 50W X 2, in der H+-Form mit einer io Korngrösse von 0,149-0,074 mm = 100-200 mesh) wurde mit einer Lösung von 75 ml Piperidin in 1500 ml Wasser in die Piperidiniumform umgewandelt. Das Harz wurde mit Wasser zur Neutralität gewaschen und mit 3 g Piperidinium-chlorid in 10 ml Wasser behandelt. Die Säule wurde mit is Wasser, frei von Chlorid, gewaschen und war betriebsbereit. 1,50 g Lithiumsalz wurden am oberen Ende der Säule in 15 ml Wasser eingebracht und die Säule wurde in Wasser entwickelt, wobei 25 ml Fraktionen entnommen wurden. Die Fraktionen 3-6 wurden mit den Waschlösungen vereint 2o (172 ml).

Die Lösung wurde bis fast zur Trockne bei 35°/1,0 mm verdampft und reines Toluol wurde zugesetzt. Die ölige Suspension wurde unter vermindertem Druck wie vorstehend zur Trockne verdampft und der erhaltene kristalline Fest-25 stoff wurde mit 90 ml Äthylacetat trituriert. Das kristalline Piperidiniumsalz wurde abfiltriert, mit 3 X 30 ml Äthylacetat gewaschen und das restliche Lösungsmittel wurde 3 Stunden bei 0,1 Hg mm entfernt, wobei man 1,775 g beinahe weisser Prismen erhielt. [a]D24 (c 0,35% in Wasser) +42,2°; 30 Amal (0,1 n Natriumhydroxid, 10 (ig/ml) 259,5 nm (E,1 474); IR-Peaks in Nujol umfassen 3380, 2540, 1782, 1682 und 1608 cm-1; x (8% D20)-Werte umfassen 6,90 (d, 17Hz), 6,44 (dd, 3, 17Hz), 4,28 (d, 3Hz), 5,08 (s), 5,84 (d, 8Hz), 5,08 (t, 7Hz), 6,84 (komplexes Multiplett), 8,0-8,5 (kom-35 plexes Multiplett).

Analyse für C13H20N.,O5 . 0,6 H20:

ber.: C 52,9 H 7,4 N 9,5%

gef.: 52,8 H 7,2 N 9,3%

40

Beispiel 11 Herstellung des Triäthylaminsalzes

Eine Säule mit Ionenaustauscherharz (Bio-Rad AG® 45 50W, wie in Beispiel 10 beschrieben) wurde mit einer Lösung von Triäthylamin in Wasser (0,5 n, 1,5 Liter) in die Tri-äthylammoniumform umgewandelt und mit Wasser zur Neutralität gewaschen. Eine Lösung von 3 g Triäthylammonium-chlorid in 15 ml Wasser wurde in die Kolonne eingebracht 50 und die Säule wurde mit Wasser von Chlorid frei gewaschen und war bereit zur Anwendung.

1,5 g Lithiumsalz wurden von oben her mit 15 ml Wasser in die Säule eingebracht und die Säule wurde mit Wasser entwickelt, wobei 25 ml Fraktionen entnommen wurden. 55 Die Fraktionen 4-9 wurden vereint (175 ml mit Waschlösungen).

Die Lösung wurde unter vermindertem Druck (35°/1,0 mm) destilliert, wobei man ein Öl erhielt, das 3 x mit Toluol unter den gleichen Bedingungen durch Destillation konzen-60 triert wurde. Die resultierenden Kristalle wurden unter 50 ml Äthylacetat aufgebrochen, filtriert, zweimal mit je 20 ml Diäthyläther gewaschen und vom restlichen Lösungsmittel 3 Stunden bei 0,1 mm in einem Exsiccator befreit, wobei man 1,588 g des Triäthylammoniumsalzes als beinahe weisse 65 Prismen erhielt. [a]j>2r' (c 0,22% in Wasser) +44,3°, Amax (0,1 n Natriumhydroxid, 9,7 ng/ml) 258 nm (En1 485), IR-Peaks in Nujol umfassen 3250, 2080, 1784, 1700 und 1640 cm-1, x (10% D20)-Werte umfassen 6,41 und 6,87 (dd,

624956

14

17Hz, 3Hz: d, 17Hz), 4,26 (d, 3Hz), 5,07 (t, 7Hz), 5,78 (d, 7Hz), 5,07 (s), 8,74 (t, 7Hz) und 6,78 (q, 7Hz).

Analyse für C14H24N2Or>. V4 H20:

ber.: C 55,2 H 8,0 N 9,2%

gef.: C 55,2 H 7,9 N 9,2%

Beispiel 12

Eine Probe des Entfärbungskohleeluats, hergestellt wie beim Herstellungsverfahren 3, wurde unter vermindertem Druck zur Entfernung des Acetons konzentriert. Das resultierende Konzentrat (11, enthaltend 1,28 g Clavulansäure, bestimmt durch Biountersuchung) wurde auf eine Säule von 100 ml IRA68-Harz (Chloridzyklus) aufgebracht. Die Säule wurde mit 300 ml Wasser gewaschen und mit 5% iger (Gew/Vol) wässriger Lithiumchloridlösung eluiert, wobei das Eluat in Fraktionen von 100 ml gesammelt wurde.

Die Fraktionen 1 und 2 wurden vereint (200 ml), unter vermindertem Druck auf 40 ml verdampft und bei 4°C über Nacht stehengelassen. Die gebildeten Kristalle wurden abfiltriert, nacheinander mit 10 ml Äthanol, 50 ml Aceton und 50 ml Diäthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei man 530 mg eines weissen Feststoffes erhielt (Ej1 802), was eine 40,8%ige Ausbeute aus dem Kohle-eluat darstellt. Durch Zugabe eines gleichen Volumens an gesättigtem wässrigen Lithiumchlorid zu den Mutterlaugen, gefolgt von Stehenlassen bei 4°C erhielt man einen zweiten Anschuss, der wie vorstehend aufgearbeitet 178 mg (E^ 740) ergab, was einer weiteren Ausbeute von 12,7% entspricht.

In einer Reihe von gleichen Untersuchungen wurden die Konzentration des Lithiumchlorideluiermittels, des Ionenaustauscherharzes und die Natur des eluierenden Kations und des Gegenanions variiert, wobei man die folgenden Ergebnisse erhielt:

Harz

Zyklus.

Eluiermittel (Molari tat)

Ei1

Produktausbeute % *)

Amberlite IRA 68

Chlorid

Lithiumchlorid (0,5 m)

750

51,8

Amberlite IRA 68

Chlorid

Lithiumchlorid (0,25 m)

760

55,6

Amberlite IRA 93

Chlorid

Lithiumchlorid (1,0 m)

560

50,3

Amberlite IRA 93

Chlorid

Lithiumchlorid (0,5 m)

640

44,5

Amberlyst A 21

Chlorid

Lithiumchlorid (1,0 m)

630

54,3

Amberlite IRA 68

Acetat **

Lithiumacetat (0,5 m)

660

56,8

Amberlite IRA 68

Formiat **

Ammonium-formiat (0,5 m)

520

55,8

*) Produktausbeute bezogen auf das eingesetzte Kohleeluat **) bei diesen Untersuchungen wurde das Lithiumsalz durch Konzentrieren der Bluate (x6) und Zusatz eines gleichen Volumens von 50% (Gew/Vol) Lithiumchloridlösung hergestellt. Die resultierenden Lithiumsalze wurden wie vorstehend aufgearbeitet.

Beispiel 13

Eine Probe von 4 1 von Kohleeluat, hergestellt wie im Herstellungsverfahren 3 ,wurde durch eine Säule von IRA68

(Chloridzyklus 250 ml) nach unten geleitet, die anschliessend mit Wasser (250 ml) gewaschen wurde und mit 5%iger (Gew/Vol) Lithiumchloridlösung eluiert wurde. 200 ml des Eluats, die 73% der eingesetzten biologischen Aktivität enthielten, wurden gewonnen. Eine Probe von 70 ml dieses Eluats wurde mit 5 Volumen von Propan-2-ol unter Rühren behandelt, wobei man einen teerartigen Niederschlag erhielt. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und u.nter vermindertem Druck auf 7 ml konzentriert. Nach Stehen über Nacht bei 4°C wurde das kristalline Produkt abfiltriert, nacheinander mit Äthanol, Aceton und Diäthyläther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Durch biologische Bewertung wurde angenommen, dass der trockene Feststoff (870 mg) rein war und eine Ausbeute von 94% des Harz-Säulen--Eluats darstellte.

Beispiel 14

Eine Säule von 50 ml IRA68-Harz (Chloridzyklus) wurde mit 840 ml Kohleeluat beschickt, wie in Herst. 3 hergestellt, mit 100 ml Wasser gewaschen und mit 5%igem (Gew/Vol) Lithiumchlorid in Propan-2-ol:Wasser (5:1)

eluiert. Die ersten fünf Bettvolumen wurden unter vermindertem Druck konzentriert und das Antibiotikum wurde wie in Beispiel 13 kristallisiert. Der Feststoff wog 292 mg (Biountersuchung 970 mg Lithiumclavulanat/mg Feststoff) und stellte eine Ausbeute von 45 % des Kohleeluats dar.

Beispiel 15

Eine Brühe wurde wie in Beispiel 3 fermentiert und filtriert und eine Probe der filtrierten Brühe von 11, die 0,43 g Clavulansäure (biologische Untersuchung) enthielt, wurde durch eine Säule von 100 ml IRA93-Harz (Chloridzyklus) abwärts geleitet. Die Säule wurde mit 200 ml verdünnter Essigsäure (0,25 m) und 750 ml Wasser gewaschen und mit 1 m wässriger Lithiumchloridlösung eluiert. Die ersten 150 ml des Eluats, die 0,28 g Clavulansäure enthielten (biologische Untersuchung) wurden unter vermindertem Druck auf 15 ml konzentriert und über Nacht bei 4°C gehalten. Das Produkt wurde filtriert, nacheinander mit Äthanol Aceton und Diäthyläther gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei man 668 mg Feststoff (Ej1 245) erhielt, was einer Ausbeute von der filtrierten Brühe von 47 % entsprach.

Beispiel 16

Wie bei der Herstellung 3 wurde eine Brühe fermentiert und filtriert und eine Probe der filtrierten Brühe (2 1), die 1,23 g Clavulansäure enthielt (biologische Untersuchung) wurde abwärts durch eine Säule von 240 ml IRA93-Harz (Chloridzyklus) geleitet. Die Säule wurde mit 500 ml Wasser, 400 ml Propan-2-ol: Wasser (5:1) gewaschen und anschliessend mit 5%igem (Gew/ Vol) Lithiumchlorid in Pro-pan-2-ol: Wasser (5:1) eluiert. Die ersten 970 ml des Eluats wurden unter vermindertem Druck auf 100 ml konzentriert und 2 Tage bei 4°C gehalten. Das Produkt wurde filtriert und wie in Beispiel 15 gewaschen, wobei man 286 mg Feststoff (Ej1 662) erhielt, was einer Ausbeute von der filtrierten Brühe von 19% entsprach.

Beispiel 17

Wie im Herstellungsverfahren 3 wurde eine Brühe fermentiert und filtriert und 500 ml des Filtrats wurden auf 50 ml IRA93 (Chloridzyklus) beladen. Die Säule wurde mit 50 ml Wasser und 100 ml 95%igem wässrigem Äthanol gewaschen, worauf mit Lithiumchlorid (1% Gew/Vol in 95% wässrigem Äthanol; 50 ml-Fraktionen) eluiert wurde, Die Fraktionen 2 und 3 wurden vereint und unter vermindertem Druck bis zur beginnenden Auskristallisation eines Feststoffs

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

verdampft. Das Konzentrat wurde 3/.j Stunden bei +4°C gekühlt und der Feststoff wurde auf einem Sinterfilter gesammelt. Der Feststoff wurde mit Äthanol, Aceton und Diäthyläther gewaschen und Yl Stunde bei Raumtemperatur in einem Vakuumofen getrocknet, wobei man 89 mg Lithiumclavulanat (E,1 770) erhielt, was 32%, bezogen auf die filtrierte Brühe, entsprach.

Beispiel 18

5 I des wie im Herstellungsverfahren 3 hergestellten Koh-leeluats wurden abwärts durch ein Bettvolumen von 500 ml IRA68 im Chloridzyklus mit einer Rate von 1 1/Stunde geleitet. Die Säule wurde mit 11 Wasser gewaschen und mit 0,5 m Natriumchloridlösung eluiert. Der erste Liter des Eluats wurde durch Rotationsverdampfen auf 90 ml konzentriert. Ein Teil des Konzentrats von 10 ml wurde mit 50 ml Propan.-2-ol unter Rühren behandelt. Die überstehende Lösung wurde von der teerigen Ausfällung, die sich gebildet hatte, abdekantiert, durch Rotationsverdampfen auf ein Volumen von 3 ml eingeengt und mit 3 ml 30%iger (Gew/Vol) Lit5 624956

thiumchloridlösung behandelt. Nach Stehen über Nacht bei 4°C wurde das Produkt filtriert, nacheinander mit Äthanol, Aceton und Diäthyläther gewaschen und getrocknet, wobei man 280 mg eines weissen Pulvers vom E^ 770 erhielt.

5

Beispiel 19

2,0 g Lithiumclavulanat (E,1 667), hergestellt wie in Beispiel 15 beschrieben, mit anschliessender Behandlung mit Isopropylalkohol, wurden in 16 ml Wasser gelöst und filtriert, io 64 ml Äthanol wurden sorgfältig zugesetzt und die Mischung wurde bei Raumtemperatur I Stunde gerührt. Der zunächst erhaltene Niederschlag enthielt kein Lithiumclavulanat, was durch UV-Spektroskopie bestimmt wurde, und wurde verworfen. Die überstehende Flüssigkeit wurde mit 16 ml gels sättigter Lithiumchloridlösung verdünnt und 2Stunden zur Kristallisation abgestellt. Die Kristalle wurden durch Filtrieren gewonnen, trocken gesaugt, mit 2 X 15 ml Aceton und 2 X 20 ml Diäthyläther gewaschen und im Vakuum auf konstantes Gewicht getrocknet (1,350 g, Ej1 = 20 735).

v

2 Blätter Zeichnungen

Claims (13)

1. 624956
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ausfällung von Lithiumclavulanat durch Einbringen eines wasserlöslichen Lithiumsalzes in einer zur Aussalzung des Lithiumclavulanates ausreichenden Konzentration in die das Lithiumclavulanat enthaltende wässrige Lösung durchgeführt wird, wobei das Clavulanat ausgesalzt wird.

   2

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Entfernung von Verunreinigungen aus Clavulansäure der Formel:

   H

   CH OH

   COOH

   und/oder eines Salzes davon mit einer Base, dadurch gekennzeichnet, dass man die Säure und/oder das Salz mit einer vvässrigen ionischen Lithiumverbindung, welche nicht Lithiumclavulanat ist, umsetzt, wobei man eine wässrige Lösung erhält, die Lithiumclavulanat enthält, das anschliessend daraus ausgefällt wird, worauf der Niederschlag aus der wiissrigen Lösung, welche Verunreinigungen enthält, abgetrennt und das Lithiumclavulanat isoliert wird.
3. 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als ionische Lithiumverbindung und/oder wasserlösliches Lithiumsalz Lithiumchlorid verwendet.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Clavulansäuresalz, das zunächst umgesetzt wird, ein Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz einsetzt.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als zunächst umgesetztes Salz der Clavulansäure das Natrium-, Kalium- oder Magne-siumsalz oder ein Salz verwendet, das mit einem Ionenaustau-scherharzsalz und Aminsalzen gebildet wird.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als zunächst umgesetztes Salz der Clavulansäure ein Salz verwendet, das mit einem basischen Ionenaustauscherharz gebildet wurde und das Harzsalz mit der wässrigen ionischen Lithiumverbindung kontaktiert, wobei man ein wässriges Eluat erhält, das Lithiumclavulanat enthält, das von dem zurückbleibenden Harz abgetrennt wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Lithiumclavulanat enthaltende Eluat, das auch überschüssige ionische Lithiumverbindung enthält, konzentriert wird, wobei die Konzentration der ionischen Lithiumverbindung ausreicht, um das Lithiumclavulanat auszusalzen.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige ionische Lithiumverbindung als Eluiermittel verwendet, die ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthält, wodurch das Eluieren von Verunreinigungen von dem Harz unterdrückt wird.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Ausfällung von Lithiumclavulanat aus seiner wässrigen Lösung durch Anwesenheit von hohen Konzentrationen eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels bewirkt.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als zunächst umgesetztes Salz der Clavulansäure ein Salz verwendet, das mit einem basischen Ionenaustauscherharz durch Kontaktieren des Harzes mit einer Fermentationsbrühe, welche Clavulansäure und/oder ein Salz davon enthält, gebildet wurde.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als zunächst umgesetztes Salz der Clavulansäure ein Salz verwendet, das mit einem basischen Ionenaustauscherharz durch Kontaktieren des Harzes mit einem Eluat, welches durch Eluieren eines Kohleadsorbats der Clavulansäure und/oder eines Salzes davon mit einem wässrigen, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel entstanden ist, gebildet wurde.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man als zunächst umgesetztes Salz der Clavulansäure ein Salz verwendet, das mit einem basischen Ionenaustauscherharz durch Kontaktieren des Harzes mit einem Eluat, welches durch Eluieren eines Kohleadsorbats, das durch Kontaktieren der Kohle mit einer Clavulansäure und/oder ein Salz davon enthaltenden Fermentationsbrühe hergestellt wurde, mit einem wässrigen, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel entstanden ist, gebildet wurde.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene Lithiumclavulanat in ein anderes Salz mit einer Base oder in die freie Clavulansäure überführt.