DE1768965B1

DE1768965B1 - (-)-(cis-1,2-Epoxypropyl)-phosphonsaeure und deren Salze und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen

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Publication number: DE1768965B1
Application number: DE19681768965
Authority: DE
Inventors: David Hendlin; Stapley Edward Olley; Mata Justo Martinez Del Val
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Pharmacia Antibioticos Farma SA
Priority date: 1967-07-25
Filing date: 1968-07-18
Publication date: 1971-12-23
Also published as: YU176368A; FR7683M; ES356487A1; GB1223923A; FR1574556A; DK124336B; NL143130B; FI45863B; NO127758B; IL30384A0; MTP565B; LU56580A1; US3639590A; SE367020B; FI45863C; AT290011B; NL6810011A; IL30384A; IT1008508B; BE718507A

Description

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Die Erfindung betrifft eine neue, antibiotisch wirk- Die freie Säure in kristalliner Form ist ein weißer

same Verbindung. Feststoff, der bei oder oberhalb etwa 94° C schmilzt,

Die Aktivität der bekannten Antibiotika, wie Penicil- wenn er in ein Bad mit dieser oder höheren Temperatulin, Streptomycin, Chlortetracyclin oder Oxytetracyclin, ren gebracht wird.

ist gewöhnlich auf einige pathogene Mikroorganismen 5 (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäureistinwäßbegrenzt. rigen Lösungen bei alkalischen Bedingungen bis zu

Gegenstand der Erfindung sind (—)-(cis-l,2-Epoxy- etwa pH-Wert von 11 mit Ammoniak oder organischen propyl)-phosphonsäure und deren Salze sowie ein Ver- Aminen sehr stabil. 15 Minuten Erhitzen von wäßrigen fahren zur Herstellung dieser Verbindungen, das da- Lösungen mit einem pH-Wert von 8 bis 9 auf 100° C durch gekennzeichnet ist, daß man einen Stamm von io scheint das Antibiotikum nicht zu inaktivieren. Unter Streptomyces fradiae (ATCC 21 096, 21 097, 21 098 etwa pH 3 ist es unstabil. Bei pH 1,5 beträgt die Halboder 21 099 oder NRRL 3417), Streptomyces virido- wertszeit bei Raumtemperatur weniger als 24 Stunden, chromogenes (NRRL 3413, 3414, 3415, 3416 oder 3427) Instabilität, auch bei einem höheren pH, ist in Berüh- oder Streptomyces wedmorensis (ATCC 21 239) in rung mit Sulfonsäure- oder Phosphonsäureionenauseinem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingun- 15 tauscherharzen beobachtet worden. Auch bei relativ gen kultiviert, bis das Medium eine beträchtliche anti- kurzem Kontakt mit Harzen dieses Typs bei pH 3 wird biotische Aktivität besitzt, die gebildete (—)-(cis- eine unvollständige Rückgewinnung erhalten. l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure in an sich bekannter Die Verbindung ist ausgeprägt polar. Auf der Basis

Weise isoliert und gegebenenfalls in an sich bekannter von Papierstreifenuntersuchungen ist die Substanz Weise in ein entsprechendes Salz überführt. 20 Gluconsäure ähnlich.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind antibio- Sie wird durch polare Lösungsmittel, wie Phenol,

tisch wirksam und inhibieren das Wachstum von ver- auch in Gegenwart von organischen Aminen nicht schiedenen gramnegativen und grampositiven Mikro- leicht extrahiert. Chromatographie an Kationenausorganismen. tauscherharzen in der Wasserstofform zeigt ebenfalls

Die erfindungsgemäße l-cis-l^-Epoxy-l-propyl- 25 polare Eigenschaften an. So wird auf derartigen Harzen phosphonsäure kann strukturell folgendermaßen dar- das Antibiotikum viel weniger verzögert als Zitronengestellt werden: säure. Die polare Natur des neuen Antibiotikums zeigt

sich auch an dem fast vollständigen Fehlen von Ad-O OH sorption aus wäßrigen Lösungen durch Aktivkohle bei

H Hi/ 3° einem pH von 5.

H₃C C- -C P Das Antibiotikum wird auf sauren Tonen nicht

\q/ \ adsorbiert, während Aluminiumoxid, sowohl basisch

OH als _auch sauer gewaschen, ein gutes Adsorbens für das

Antibiotikum darstellt. Aus wäßriger Lösung wird die

Diese Substanz ist eine saure Verbindung, die nun- 35 Verbindung bei pH 5 stark adsorbiert, bei pH 9 jedoch mehr in Übereinstimmung mit der gegenwärtigen ehe- eluiert. Bei pH 9 ist die Adsorption aus 75% Methamischen Nomenklatorpraxis wohl richtiger als (-)-(cis- nol/Wasser stark, jedoch relativ schwach in 25% 1,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure bezeichnet wird, wo- Methanol/Wasser. Die Zugabe von Barium- oder bei das Symbol (—) ebenso wie der Buchstabe 1 an- Kalziumsalzen zu wäßrigen Lösungen fällt das Antizeigt, daß diese Phosphonsäure linear polarisiertes 40 biotikum nicht aus. Das Ammoniumsalz des Antibio-Licht im Gegenuhrzeigersinn (vom Betrachter aus ge- tikums scheint begrenzte Löslichkeit in wasserfreiem sehen nach links) dreht, wenn die Rotation ihres Di- Methanol zu besitzen, jedoch ist das Natriumsalz in natriumsalzes in Wasser (Konzentration 5%) bei 90%igem Methanol/Wasser löslich. 405 πιμ gemessen wird. Die bei der Beschreibung der Die (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure ist

1,2-Epoxypropylphosphonsäureverbindung verwendete 45 eine wasserlösliche saure Substanz, die mit salzbilden-Bezeichnung »eis« sagt aus, daß die an die Kohlenstoff- den Stoffen, wie anorganischen und organischen Basen, atome 1 und 2 der Propylphosphonsäure gebundenen unter Bildung von Salzen reagiert. So wird bei der Wasserstoffatome auf der gleichen Seite des Oxidringes Umsetzung mit Alkalimetall- und Erdalkalimetallsitzen, hydroxiden, -carbonaten, -bicarbonaten das entspre-Die Strukturformel dieser antibiotischen Substanz 50 chende Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz erhalten, ist der Bequemlichkeit halber in der planaren Formel Andere Metallsalze, beispielsweise von Silber, Alugezeigt. Das Antibiotikum kann jedoch auch folgender- minium oder Eisen können ebenso durch doppelte maßen räumlich dargestellt werden: Umsetzung oder nach anderen Arbeitsweisen herge- H H stellt werden, die dem Fachmann geläufig sind. Ebenso

55 werden Salze von organischen Basen, wie primären,

C Q.' ο OH sekundären und tertiären Aminen, beispielsweise

Monoalkylaminen, Dialkylaminen, Trialkylaminen, Alkyldiaminen und stickstoffhaltigen heterocyclischen \ Aminen, gemäß dem Fachmann geläufigen Methoden

OH ^6o hergestellt. Die Salze können Monosalze, wie das Mound nonatriumsalz, erhalten beispielsweise durch Umset

zung von 1 Äquivalent Natriumhydroxid mit 1 Äqui-

O OH valent Säure, Disalze, erhalten beispielsweise durch

j / Umsetzung von 2 Äquivalenten Natriumhydroxid mjt

CH₃ P ⁶S 1 Äquivalent der Säure, gemischte Disalze, erhalten

/' \ durch Umsetzung von 1 Äquivalent des Monosalzes

C C OH mit 1 Äquivalent einer zweiten Base, Diphosphonatsalze,

/ \ / \ erhalten beispielsweise durch Umsetzung von 1 Äqui-

H⁰H

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valent Kalziumhydroxid mit 2 Äquivalenten der Säure Die obenerwähnten vier Pilzstämme erfüllen diese

oder gemischte Salze, wie Kalziumhydrogenlactat, er- allgemeine Beschreibung mit der Ausnahme, daß oft

halten durch Umsetzung von 1 Äquivalent Milch- auf organischen Medien das Luftmycel beobachtet wird,

säure mit dem Kalziumdiphosphonatsalz, sein. Die Streptomyces-fradiae-Kultur der Hinterlegungs-

Repräsentative Beispiele von Salzen von organischen 5 nummer NRRL 3417 wurde aus der Erde isoliert.

Basen, die erwähnt werden können, sind Salze mit Die Streptomyces-viridochromogenes-Kulturen mit

Aminen, wie «-Phenäthylamin, Diäthylamin, Chinin, den Hinterlegungsnummern NRRL 3413 bis 3416 und

Brucin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanol- 3427 wurden ebenfalls aus der Erde isoliert .Die Kultur

amin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, N,N'-Di- NRRL 3415 ist auch unter der Nummer ATCC 21 240

benzyläthylendiamin, Diäthanolamin, Piperazin, Di- io hinterlegt worden. Die Kulturen mit den Nummern

methylaminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-l-propanol, NRRL 3413 bis 3416 und 3427 unterscheiden sich

Thiophyllin, Ester von Aminosäuren und N-Methyl- von der veröffentlichten Beschreibung von Streptomy-

glucamin. Gewünschtenfalls kann der basische Teil des ces viridochromogenes nur durch das Fehlen der grauen

Salzes aus biologisch aktiven Aminen bestehen, wie bis schwarzen Mycelfärbung bei Wachstum auf synthe-

Erythromycin, Oleandomycin oder Novobiocin. 15 tischem Agar. Da dies der einzige bedeutende Unter-

Die Salze der (—Hcis-l^-EpoxypropyO-phosphon- schied ist, wird es nicht als berechtigt angesehen, diesen

säure, die pharmazeutisch verträglich und im wesent- Kulturen einen neuen Artnamen zuzuordnen. Die

liehen nicht toxisch sind, sind besonders wertvoll und Untergruppe viridochromogenes der Streptomyceten

können bei der Herstellung von geeigneten pharma- umfaßt eine Gruppe von eng verwandten Kulturen,

zeutischen Dosierungseinheitsformen verwendet wer- 20 Manche Fachleute verwenden getrennt Artnamen,

den. Alle Salze sind als Zwischenprodukte bei der unter anderem S. chartreusis, S. cyaneus, sowie bicolor,

Herstellung der freien Säure und zur Herstellung von coeruleofuscus, coeruleorubidis, coerulescens und

anderen Salzen brauchbar. Die Salze von optisch akti- longisporus, den russische Klassifizierungsfachleute bei

ven Basen, wie Aminen, sind brauchbar bei der Tren- Actinomyces einordnen, was der Streptomyces-Gruppe

nung der optisch aktiven Enantiomeren der Phosphon- 25 anderer Wissenschaftler äquivalent ist.

säuren. Die Kultur mit der Nummer ATCC 21 239 gehört

Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ver- eindeutig zur Art Cinereus, wie sie in S. A. W a k swendeten Streptomyces-Stämme waren bislang unbe- man, »The Actinomycetes«, Bd. II, definiert ist. Auf kannt. Die ATCC-Nummern beziehen sich auf die der Grundlage der sporophoren Morphologie fällt Kultursammlung der American Type Culture Collec- 30 die Kultur in die Untergruppe Rectus-Flexibilis, wie tion, die NRRL-Nummern auf die Sammlung der von Pridham, Hesseltine und Benedict Northern Utilization Research and Development in »Applied Microbiology«, Bd. 6, S. 52 (1958), be-Branch des US. Department of Agriculture in Peoria, schrieben. Sie unterscheidet sich in mancher Hinsicht Illinois, USA. Die Kulturen von Streptomyces fradiae von allen bisher beschriebenen Streptomyces-Arten. mit den Hinterlegungsnummern ATCC 21 096, 21 097, 35 Sie ist Streptomyces wedmorensis am nächsten ver-21 098 und 21 099 sind auch unter den Nummern wandt. Eine relativ schnelle Peptonisierung von Milch NRRLB-3357, NRRLB-3358, NRRLB-3359 bzw. und die Erzeugung eines weichen Koagulums sind NRRL-B 3360 hinterlegt worden. Von diesen ist die bedeutende Unterschiede, werden jedoch nicht für ausKultur ATCC 21 096 die Stammkultur, während die reichend betrachtet, um eine neue Art festzulegen. Aus Kulturen ATCC 21 097, 21 098 und 21 099 Subisolate 40 diesem Grund ist die Kultur der Art S. wedmorensis davon sind. zugeordnet worden. Diese Kultur ist nicht nur unter

Die Klassifizierung dieser vier Kulturen als Strep- der Nummer ATCC-21 239 hinterlegt, sondern auch

tomyces fradiae erfolgte auf der Basis von ausgedehn- unter der Nummer NRRL 3426.

ten Klassifizierungsuntersuchungen. Hierzu wurden die Das erfindungsgemäße neue Antibiotikum wird

Stammkultur und die Kolonieisolate durch das Lyo- 45 während der aeroben Fermentation in geeigneten wäß-

philisierungsverfahren von Sporenmaterial stabilisiert, rigen Nährmedien durch die angegebenen Stämme von

um reproduzierbare Erbgenisse sicherzustellen. Die Mikroorganismen erzeugt. Man kann wäßrige Medien

für die Untersuchung der morphologischen und physio- verwenden, wie sie für die Herstellung von anderen

logischen Eigenschaften verwendeten Kulturen wurden Antibiotika üblich sind. Derartige Medien enthalten

aus diesem stabilen Sporenmaterial gezogen. Bestimmte 5° Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff, die für die

einzelne Kolonieisolate unterscheiden sich so stark von Mikroorganismen assimilierbar sind, und anorganische

der Standardbeschreibung von S. fradiae, daß sie für Salze. Außerdem enthalten die Fermentationsmedien

sich allein als neue Art bezeichnet werden könnten. Spuren von Metallen, die für das Wachstum der Mikro-

Die Tatsache, das alle einzelnen Kolonieisolate von Organismen notwendig sind und im allgemeinen als zu-

einem einzigen Sporenmaterial stammen, und die 55 fällige Verunreinigungen bei der Zugabe von anderen

Tatsache, daß die Stammkultur eine höhere Größen- Bestandteilen des Mediums zugeführt werden.

Ordnung der Variabilität zeigt, rechtfertigen die Be- Als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff können

zeichnung der Kultur und ihrer Varianten im weitesten z. B. Kohlehydrate, wie Zuckerstoffe, beispielsweise

Rahmen ihrer Eigenschaften als Stämme von S. fra- Saccharose, Maltose, Fructose und Lactose oder

diae. In »The Actinomycetes«, Bd. II, S. 212, ist 6° Stärkestoffe, wie Getreide, beispielsweise Hafer und

S. fradiae allgemein folgendermaßen definiert: Roggen, Maisstärke und Maismehl in dem Nährme-

»Die Art hat die Eigenschaften, daß sie nicht-chromo- dium verwendet werden. Im allgemeinen beträgt die

gen und stark proteolytisch ist und das charakteristi- Kohlehydratmenge zwischen etwa 1 und 6 Gewichts-

sche Luftmycel mit der rosa Farbe der Schale von Mee- prozent des Mediums.

resweichtieren auf verschiedenen synthetischen Medien 65 Zu befriedigenden Stickstoffquellen gehören proteinerzeugt, wobei auf organischen Medien ein organe- haltige Stoffe, beispielsweise verschiedene Formen von farbenes Wachstum ohne ein Luftmycel hervorgerufen Hydrolysaten von Casein, Sojabohnenmehl, Maiswird.« quellflüssigkeit, lösliche Schlempebestandteile, Hefe-

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hydrolysate und Tomatenpaste. Die Stickstoffquellen Die Aktivität wird in Einheiten ausgedrückt, wobei werden in Mengen von etwa 0,2 bis 6 Gewichtsprozent eine Einheit als die Konzentration des Antibiotikums des wäßrigen Mediums verwendet. pro Milliliter definiert ist, die auf einer 1,27-cm-Papier-Die Temperatur der Fermentation kann etwa 25 bis scheibe einen Zonendurchmesser von 28 mm erzeugt. 38 C, vorzugsweise 26 bis 30 C betragen. Der geeig- ₅ Vier Konzentrationen von (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl> nete pH-Wert der Nährmedien beträgt etwa 5,5 bis 7,5. phosphonsäure werden zur Herstellung der Eichkurve Das erfindungsgemäße neue Antioiotikum wird so- verwendet, nämlich 0,3, 0,4, 0,6 und 0,8 Einheiten pro wohl durch Obertlächenkulturen als auch durch Sub- Milliliter, wobei jede Konzentration durch Verdünnen merskulturen erzeugt, bevorzugt ist die Fermentation in tris-(Hydroxymethyl)-aminomethanpuffer, eingestellt im Submerszustand. Fermentationen in kleinem Maß- ₁₀ auf pH 8,0, erhalten wird. Vier Scheiben werden auf jede stab werden zweckmäßig durchgeführt, indem das der fünf Schalen für die Herstellung der Eichkurve auf-Nährmedium in Kolben gegeben, die Kolben und der gebracht, so daß jede Schale eine Scheibe mit jeder der Inhalt durch Erhitzen auf ΪΔ) C sterilisiert, die Kolben obigen vier Konzentrationen des Antibiotikums ententweder mit Sporen oder einem vegetativen Zeil- hält, Die Schalen werden bei 37⁰C 18 Stunden lang wachstum eines (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphon- ,₅ inkubiert, und die Durchmesser der Inhibierungszonen säure erzeugenden Stammes von Streptomyces moku- in Millimeter werden gemessen. Es wird für jede Konliert, die Kolbenhälse lose mit Baumwolle verschlossen zentration ein durchschnittlicher Zonendurchmesser werden und die Fermentation in einem Raum mit kon- berechnet, woraus eine Eichkurve auf halblogarithstanter Temperatur bei etwa 28"C 3 bis 5 Tage auf mischem Papier hergestellt wird. Die Neigung der einer Schütteleinrichtung durchgeführt wird. Für die ₂₀ erhaltenen Linie liegt zwischen 4 und 5.
Durchführung in größerem Maßstab ist es bevorzugt, Proben des zu untersuchenden Antibiotikums werdie Fermentation in geeigneten Tanks durchzuführen, den in 0,05 molarem Puffer bei pH 8,0 auf eine gedie mit einem Rührer und Einrichtungen versehen sind, eignete Konzentration verdünnt. Scheiben werden in um das Fermentationsmedium zu belüften. Bei dieser die Testlösung eingetaucht und auf die Oberfläche der Arbeitsweise wird das Nährmedium in dem Tank ge- ₂₅ Testschale gebracht, wobei normalerweise zwei Scheibildet und durch Erhitzen auf 120° C sterilisiert. Nach ben für jede Probe auf einer Schale entgegengesetzt zu-Abkühlen wird das sterilisierte Medium mit einer ge- einander angeordnet werden. Zwei Scheiben, eingeiigneten Quelle eines vegetativen Zellwachstums des taucht in (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure-Streptomysec inokuliert, und die Fermentation wird lösung mit 0,4 Einheiten pro Milliliter, werden in ab-2 bis 4 Tage vorgenommen, während das Nährmedium ₃₀ wechselnder Stellung zu der Probe auf die Schale gegerührt und/oder belüftet und die Temperatur bei etwa bracht. Die Schalen werden bei 37°C 18 Stunden lang 28 C gehalten wird. inkubiert, und die Zonendurchmesser in Millimeter

Bei der Durchführung der Erzeugung des Antibioti- werden bestimmt. Die Stärke der Probe wird mit Hilfe

kums im Submerszustand kann eine kleine Menge eines eines Nomogramms oder aus der Eichkurve bestimmt,

geeigneten Antischaummittels, beispielsweise Soja- ₃₅ 1 _mg reine (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure

bohnenöl. Rizinusöl, 1 ^u/o Octadecanol in Mineralöl enthält 357 Einheiten.

oder ein polymerisiertes Propylenglykol, wie Polyglykol Die gemäß den hier beschriebenen Arbeitsweisen er-

2000, zu der Fermentationsbrühe gegeben werden, um zeugten Fermentationsbrühen, die das Antibiotikum

übermäßiges Schäumen während der Fermentation zu enthalten, besitzen Aktivitäten im Bereich von etwa 1

bekämpfen. 40 bis 20 Einheiten pro Milliliter, wenn sie gemäß dem

(-)- (eis-1,2 -Epoxypropyl) - phosphonsäure wird oben beschriebenen Standardtest unter Verwendung zweckmäßig unter Verwendung von Proteus vulgaris von Proteus vulgaris getestet werden. Das Antibioti-MB-838 (ATCC 21 100 und NRRL B-3361) als lest- kum kann durch eine Anzahl von Arbeitsweisen georganismus mittels einer Scheibenschalenarbeitsweise reinigt und in einer reineren Form gewonnen werden, untersucht. Die Testkultur wird als Schrägkultur auf ₄₅ Eine derartige Arbeitsweise umfaßt die Adsorption Nähragar plus 0,2% Hefeextrakt gehalten. Die inoku- des Antibiotikums an Anionenaustauscherharzen, lierten Schrägkulturen werden bei 37^: C 18 bis 24 Stun- beispielsweise Harzen, die sich aus quaternären Ammoden lang inkubiert und bei Eisschranktemperaturen niumaustausch- oder Polyalkylamingruppen, verknüpft 1 Woche gelagert, wobei frische Schrägkulturen jede mit einem Styrol-Divinylbenzol-Polymerisatgerüst, zuWoche hergestellt werden. 50 sammensetzen. Das adsorbierte Antibiotikum wird aus

Das Inokulum für die Versuchsschalen wird jeden dem Harzadsorbat leicht mit wäßrigen oder wäßrig-Tag durch Inokulieren eines 250-ml-Erlenmeyer-Kol- alkoholischen Lösungen von Salzen, wie Ammoniumbens, der 50 ml Nährbrühe plus 0,2% Hefeextrakt ent- chlorid, Natriumchlorid oder Natriumacetat, eluiert. hält, mit abgeschabtem Material aus der Schrägkultur Das so erhaltene Eluat kann gewünschtenfalls durch hergestellt, Der Kolben wird bei 37 ^z C 18 bis 24 Stun- 55 andere Reinigungsverfahren weiter gereinigt werden, den lang auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. Die So kann das Eluat gereinigt werden, indem es durch Kulturbrühe wird dann durch Zugabe von 0,2%iger ein Polyacrylamidgelbett mit Porengrößen geleitet Hefeextraktlösung zu dem Wachstum auf 40 % Durch- wird, die die Fraktionierung von Substanzen mit Molelässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 ηιμ eingestellt. kulargewichten zwischen 200 und 2000 erlauben. Die Nichtinokulierte Brühe wird für diese Bestimmung als 60 Reinigung des Antibiotikums kann auch erreicht wer-Leerprobe verwendet. 30 ml der eingestellten Brühe den, indem die unreine Antibiotikumlösung durch ein werden verwendet, um 11 Medium zu inokulieren. Als stark saures Kationenaustauscherharz geleitet wird, Versuchsmedium wird Nähragar plus 0,2% Hefe- das sich aus Kern-Sulfonsäureaustauschgruppen, verextrakt verwendet. Dieses Medium wird hergestellt, knüpft mit einem Styrol-Divinylbenzol-Polymerisatgedurch Autoklavenbehandlung sterilisiert und auf 50^c C 65 rüst, zusammensetzt, und das Harz mit Wasser entabkühlen gelassen. Nach dem Inokulieren des Mediums wickelt wird.

werden 10 ml in sterile Petrischalen gegeben, und das Alternativ kann das Antibiotikum durch Adsorption

Medium wird fest werden gelassen. auf Aluminiumoxid gereinigt werden, wobei für diese

Reinigung entweder basisch oder sauer gewaschenes Aluminiumoxid geeignet ist. Das adsorbierte Antibiotikum kann von dem Aluminiumoxid am zweckmäßigsten durch wäßrige oder wäßrig-alkoholische Ammoniumhydroxidlösungen mit einem pH von etwa 11,2 eluiert werden, wobei das Eluat fraktioniert gesammelt wird. Die Reinigung der unreinen festen Fraktionen, die das Ammoniumsalz der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure enthalten, kann auch erreicht werden, indem dieses Material in Methanol gelöst, ein gleiches Volumen n-Butanol zugesetzt, das Methanol abgedampft, etwaiges butanolunlösliches Material abfiltriert und eine Butanollösung gewonnen wird, die das Ammoniumsalz des Antibiotikums mit erhöhter Reinheit enthält. Das Ammoniumsalz kann dann in fester Form durch Eindampfen der Butanollösung bei vermindertem Druck zur Trockne erhalten werden. Alternativ kann das Ammoniumsalz mit Wasser aus der Butanollösung extrahiert werden, wobei eine wäßrige Lösung des Ammoniumsalzes der (—)-(cis-l,2-Epoxy- so propyl)-phosphonsäure erhalten wird. Das Kalziumsalz des Antibiotikums wird hergestellt, indem Kalziumhydroxid zu der wäßrigen Lösung des Ammoniumsalzes gegeben und die sich ergebende Lösung bei vermindertem Druck erwärmt wird. Alternativ wird das Kalizumsalz auch erhalten, indem eine Lösung eines anderen Salzes des Antibiotikums über ein Kationenaustauscherharz in der Kalziumform geleitet wird. Das Kalziumsalz kristallisiert aus wäßrigen Lösungen mit einer Konzentration von 10 mg/ml beim Stehen oder beim Rühren.

(—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure und ihre Salze sind z. B. wirksam gegen die pathogenen Erreger Bacillus, Escherichia, Staphylococci, Salmonella und Proteus. Beispiele derartiger Pathogene sind Baccillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella schottmuelleri, Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Proteus Morganii, Staphylococcus aureus und Staphylocossus pyogenes.

(—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure und ihre Salze können somit als antiseptische Mittel zur Entfernung von empfänglichen Organismen von pharmazeutischer, dentaler und medizinischer Ausrüstung verwendet werden, die der Infektion durch derartige Organismen ausgesetzt sind. Ebenso können sie zur Abtrennung von bestimmten Mikroorganismen aus Mischungen von Mikroorganismen verwendet werden. Salze der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure sind auch bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Mensch und Tieren von Nutzen, sie sind auch gegen resistente Stämme von pathogenen Erregern wirksam. Das Antibiotikum und seine Salze können als Desinfektionsmittel in Waschmittelpräparaten und in Gebieten verwendet werden, die der Infektion durch Salmonella ausgesetzt sind. Die Salze der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure sind auch als Bakterieide in verschiedenen industriellen Anwendungen von Wert, beispielsweise bei der Inhibierung von unerwünschtem Bakterienwachstum in dem Weißpapier in Papiermühlen und in Anstrichen, wie Polyvinylacetatlatex-Anstrich.

Wenn (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure oder ihre Salze zur Bekämpfung von Bakterien beim Menschen oder bei niedrigeren Tieren verwendet werden, können sie oral, beispielsweise als Kapseln oder Tabletten, oder in Lösung oder Suspension verabreicht werden. Alternativ kann das Antibiotikum parenteral durch Injektion verabreicht werden. Diese Formulierungen können unter Verwendung von geeigneten Verdünnungsmitteln, Streckmitteln, Granulierungsmitteln, Konservierungsstoffen, Bindemitteln, Geschmacksstoffen und Überzugsmitteln hergestellt werden, die dem Fachmann geläufig sind.

Die (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure wird als antibakterielles Mittel vorzugsweise in Form eines Salzes verwendet. Bei der Behandlung und Bekämpfung von bakteriellen Infektionen bei erwachsenen Menschen werden gute Ergebnisse durch Verabreichung von etwa V₄ bis 4 g/Tag (—Mcis-l^-EpoxypropylJ-phosphonsäure-Äquivalent erhalten, wobei das tatsächliche Gewicht von dem speziellen Salz abhängt.

Die Wirkung des erfindungsgemäßen Antibiotikums zeigen die folgenden Versuche.

Weibliche weiße Mäuse mit einem Durchschnittgewicht von 21 bis 24 g wurden intraperitoneal mit 3 bis 30 LD₅₀-Dosen des Testorganismus infiziert und zur Zeit der Infektion und nochmals 6 Stunden später mit dem Wirkstoff oral behandelt. Die ED₆₀ wurde berechnet aus der Überlebensrate 7 Tage nach der Infektion.

Erreger

	ED₅₀ ^g/Dosis)	Chloramphenicol
Dinatriumsalz
der (—Μαβ ί ,2-Epoxypropyl)-	Tetracyclin	160
phosphonsäure		160
330	125	320
760	2020	5000
220	>5000	500
1110	>10000	275
80	1110	570
4	690	675
90	250
1130	130

Escherichia coli 2017

Klebsiella pneumoniae 3068 ...

Proteus vulgaris 1810

Pseudomonas aeruginosa 3210 .
Salmonella schottmuelleri 1814
Salmonella schottmuellerie 3010
Staphylococcus aureus 2949
Streptococcus pyogenes 3009

Die Toxizität des erfindungsgemäßen Dinatriumsalzes ist äußerst gering. Die LD₅₀ bei Mäusen beträgt intraperitoneal 4000 mg/kg.

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Beispiel 1

Eine lyophilisierte Kultur von Streptomyces fradiae ATCC 21 096 wird verwendet, um 50 ml sterilisiertes Medium zu inokulieren, das die folgende Zusammensetzung besitzt:

Hefeextrakt 10 gl/

Glucose 10 g/l

MgSO₄-7H₂O 0,5 g/l

Phosphatpuffer* 2 ml

Destilliertes Wasser Rest

* 91 g KH..PO, und 95,0 g Na₂HPO₄, mit destilliertem Wasser auf 1 ί gebracht.

Der inokulierte Kolben wird dann auf einen Drehschüttler mit 220 UpM und 5,08 cm Ausschlag gebracht und 48 Stunden bei 28^c C inkubiert.

Ein Inokulum von 10 ml des sich ergebenden vegetativen Wachstums wird dann verwendet, um einen 2-1-Erlenmeyer-Kolben mit Stopfen zu inokulieren, der 500 ml sterilisiertes Medium mit der gleichen, oben angegebenen Zusammensetzung enthält. Der inokulierte Kolben wird dann auf einen Drehschüttlermit220 UpM gebracht und 48 Stunden bei 28 "C inkubiert.

Die sich ergebende Fermentationsbrühe wird verwendet, um einen 189-1-Fermenter aus rostfreiem Stahl zu inokulieren, der 160 1 steriles Medium mit der gleichen, oben angegebenen Zusammensetzung enthält. Das inokulierte Medium wird unter Rühren bei 28 C inkubiert, während ein Luftstrom von 0,08496m³/ Min. durch die Fermentierungsbrühe geführt wird. Während der Fermentationsperiode werden kleine Mengen Polypropylenglykol zugesetzt, um das Schäumen der Charge zu regeln.

Ein Inokulum von 25 1 der sich ergebenden Fermentationsbrühe wird dann \erwendet, um einen 757-1-Fermenter aus rostfreiem Stahl zu inokulieren, der 510 1 steriles Medium mit folgender Zusammensetzung enthält:

Haferflocken 20 g/l

Schlempebestandteile

(Distillers Solubles) 10 g/l

Sojabohnenmehl 20 g/l

Natriumeitrat 2 g/l

Natriumascorbat 0,5 g 1

Destilliertes Wasser Rest

Das pH dieses Mediums wird vor der Sterilisierung auf 6.5 eingestellt. Die inokulierte Brühe wird dann bei einer Temperatur von 28 C unter Rühren inkubiert, während ein Luftstrom von 0.2832 m³ _; Min. 3 Tage lang durchgeleitet wird. Während der Fermentation wird Polypropylenglykol als Antischaummittel in kleinen Mengen zugesetzt, um übermäßiges Schäumen der Fermentationsbrühe zu verhindern. Die Fermentationsbrühe wird dann mit Hilfe von Diatomeenerde filtriert. Die filtrierte Brühe hat einen pH von 7,9 und enthält 13.4mg'ml Gesamtfeststoffe. Die Untersuchung der filtrierten Brühe nach dem Scheibenschalentestverfahren mit Proteus vulgaris zeigt, daß die Brühe 0,8 Einheiten/ml (— )-(cis-l ,2-EpoxypropyD-phosphonsäure enthält, was einer Aktivität der Feststoffe der Brühe von 0.06 Einheiten mg entspricht.

379 1 der filtrierten Brühe werden auf pH 7 gestellt und durch eine Säule geleitet, die ein stark basisches Anionenaustauscherharz vom quaternären Ammoniumtyp mit einer Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat-Grundsubstanz enthält. Das sich ergebende Harzadsorbat wird mit einer 3°/„igen Lösung von Ammoniumchlorid in 90%'gem Methanol eluiert und das Eluat wird in Fraktionen von 7,57 1 gesammelt. Die Fraktionen 4, 5 und 6, die die Hauptmenge des Antibiotikums enthalten, ergeben die folgende Analyse:

Fraktion Nr. IO	Gesamt- feststoffe mg/ml	Prüfung Einheiten/ml	Stärke Einheiten/mg
4 5 6	15,1 21,7 36,2	14 14 4	0,93 0,65 0,11

Die Fraktionen 4 und 5 werden getrennt bei vermindertem Druck zur Entfernung von Methanol bis zu einer Konzentration von etwa 200 mg/ml Gesamtfebtstoffe konzentriert. 275 ml des Konzentrats der Fraktion 5 mit einem Gesamtgehalt von etwa 51 g Feststoffen werden durch 8,9 1 kugelförmiges Polyacrylamidgel mit 0,3 bis 0,15 mm Teilchengröße geleitet, die die Fraktionierung, Entsalzung und Konzentrierung von Stoffen mit Molekulargewichten von 200 bis 2000 erlauben. Das sich ergebende Geladsorbat wird mit Wasser mit der Geschwindigkeit von 50 ml pro Minute entwickelt, während das Eluat mit einem Refraktometer überprüft wird. Das Eluat wird in Fraktionen gewonnen, geprüft und die geeigneten aktiven Fraktionen werden vereinigt. Die 635 ml Eluat zwischen 5600 ml und 6230 ml enthalten 19,1 mg/ml Gesamtfeststoffe und haben eine Aktivität von 68 Einheiten/ml, wenn sie in dem oben beschriebenen Scheibentestverfahren mit Proteus vulgaris untersucht werden. Dies entspricht (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure mit einer Stärke von 3.6 Einheiten/mg.

Auf die gleiche Weise werden vier weitere Chromatogramme durchgeführt, wobei Anteile von 275 ml bzw. 287 ml des Konzentrats von Fraktion 5 und zwei Anteile von 285 ml des Konzentrats von Fraktion 4 verwendet werden. Die reichen Fraktionen von allen fünf Chromatogrammen werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf etwa 100 mg/ml konzentriert.

Die 660 ml des sich ergebenden Konzentrats haben eine Stärke von 4,1 Einheiten/mg.

100 ml dieses Konzentrats werden durch eine Säule geleitet, die 2480 ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes des Sulfonattyps mit einer Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat-Grundsubstanz in der Wasserstofform enthält. Das sich ergebende Harzadsorbat wird mit Wasser mit der Geschwindigkeit von Γ9 ml pro Minute entwickelt, und es werden 20,5-ml-Fraktionen des sich ergebenden Eluats gesammelt, wobei das Eluat durch ein Aufzeichnungsrefraktometer überprüft wird. Die Fraktionen 45 bis 65 werden getrennt mit Ο,ΐη-Natriumhydroxid auf pH 7 titriert. Die Fraktionen 52 und 62 werden dann untersucht und vereinigt, um eine wäßrige Lösung des Antibiotikums zu erhalten.

In der gleichen Weise werden fünf weitere 100-ml-Anteile des Konzentrats auf dem stark sauren Kationenaustauscherharz chromatographiert, und die aktivsten Fraktionen der sich ergebenden Harzeluate werden mit den Fraktionen 52 bis 62 vereinigt, wobei insgesamt 1870 ml erhalten werden. Diese wäßrige Lösung der (—)-(cis-1.2-Epoxypropyl)-phosphonsäure hat ein pH von 6,8. einen Gesamtfeststoff gehalt \on 2.9 mg/ml

und zeigt 70 Einheiten/ml. Die Stärke des Natriumsalzes des Antibiotikums in dieser wäßrigen Lösung beträgt somit 24 Einheiten/mg. Die wäßrige Lösung wird dann bei vermindertem Druck konzentriert und gefriergetrocknet, wobei 4,7 g Produkt erhalten werden.

Das so erhaltene getrocknete Produkt zeigt folgendes antibakterielles und Cross-Resistenz-Spektrum:

Antibakterielles Spektrum

	Durchmesser der
Test-Organismus	Inhibierungszone, mm (Scheibe ----- 7 mm)
	4 mg/ml
Escherichia coli Mß-60	25
Bacillus sp. MB-833	7
Proteus vulgaris M B-1012	42
Pseudomonas aeruginosa MB-979	7
Serratia marcescens MB-252 ...	15
Staphylococcus aureus MB-108	17
Bacillus subtilis MB-965	29
Sarcinalutea MB-1101	20
Staphylococcus aureus MB-698	29
(Streptothricin-resistent)
Streptococcus faecalis MB-753 ..	12
Alcaligenes faecalis MB-K) ....	13
Bruceila bronchiseptica MB-965	7
Salmonella gallinarum MB-1287	35
Vibrio percolans MB-1272	34
XanthomonasvesicatoriaMB-815	7

Cross-Resistenz-Spektrum

Test-Organismus*

Escherichia coli MB-60

(empfindlicher Mutterstamm)
Streptomycin-resistenter Stamm
Streptothricin-resistenter Stamm
OXAMYCIN-resistenter Stamm
Pleocidin-resistenter Stamm ....
Chloramphenicol-resistenter

Stamm

Chlortetracyclin-resistenter

Stamm

Oxytetracyclin-resistenter Stamm
Neomycin-resistenter Stamm ...
Tetracyclin-resistenter Stamm ..
Viomycin-resistenter Stamm ...
Polymyxin-resistenter Stamm ...
Grisein-resistenter Stamm

Durchmesser der

Inhibierungszone,

mm (Scheibe ----- 7 mm)

4 mg/ml liehe Verbindung mit einem RF = O ist. Papierstreifenelektrophorese, 2'I₂ Stunden bei 600 Volt mit 0,165 m Phosphatpuffer vom pH 7,0 in einer gekühlten Vorrichtung entwickelt, zeigt einen ungewöhnlich beweglichen sauren Fleck 11,5 cm von der Ursprungsstelle entfernt. Das Vorhandensein der Aktivität wird sowohl für die Papierstreifenchromatographie als auch für die Papierstreifenelektrophorese durch Bioautographie auf Agarschalen, beimpft mit Escherichia coli MB-60, ίο sichtbar gemacht.

Beispiel 2

500 ml einer vegetativen Kultur von Streptomyces fradiae ATCC 21 096, hergestellt durch Ziehen des Mikroorganismus in einem 2-Liter-Erlenmeyer-Kolben mit Stopfen gemäß der im Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise, werden verwendet, um einen 757-1-Fermenter aus rostfreiem Stahl zu inokulieren, der 4671 steriles Medium mit folgender Zusammensetzung enthält:

Hefeextrakt 10 g/I

Glucose 10 g/l

MgSO₄ ■ 7 H₂O 0,05 g/l

Phosphatpuffer* 2 ml

Destilliertes Wasser Rest

*91g KHJ¹O₁ und 95,0g Na₂HPO₁, mit destilliertem Wasser auf 1 I gebracht.

Das inokulierte Medium wird bei 28 C 24 Stunden lang unter mechanischer Rührung inkubiert, während ein Luftstrom von 0,2832 m³/Min. durch das Fermentierungsmedium geleitet wird, wobei eine kleine Menge Polypropylenglykol zur Schaumbekämpfung zugesetzt wird. 2151 der sich ergebenden Fermentationsbrühc werden verwendet, um einen 5680-1-Fermentcraus rostfreiem Stahl zu inokulieren, der 4540 1 steriles Nährmedium mit der folgenden Zusammensetzung enthält:

25

23 18 18 39

12

17 7

45 33 17 15 24

* Die Versuche werden gegenüber einer Reihe von gegen Antibiotika resistenten Stämmen von II. coli durchgeführt, die durch Einwirkung von inhibierenden Konzentrationen des Antibiotikums auf den Mutterstamm (MN-60) isoliert worden sind.

Papierstreifenchromatographie auf Whatman-3-mm-Filterpapier, getrocknet nach Sättigung mit 0,033 m Phosphatpuffer vom pH 7.0 und entwickelt mit n-Butanol, gesättigt mit 0.033 m Phosphatpuffer vom pH 7,0, zeigt, daß das Antibiotikum eine wasserlös-

Haferflocken 20 g/l

Lösliche Schlempebestandteile 10 g/l

Sojabohnenmehl 20 g/l

Natriumeitrat 2 g/l

Natriumascorbat 0,5 g/l

Destilliertes Wasser Rest

Das Medium wird vor der Sterilisierung auf pH 6,5 eingestellt.

Die inokulierte Brühe wird bei einer Temperatur von 28^JC unter Rühren inkubiert, während 2 Tage lang ein Luftstrom von 1,55 m³/Min. durchgeleitet wird, wobei Polypropylenglykol in kleinen Mengen zugegeben wird, um das Schäumen zu regeln.

Die sich ergebende Fermentationsbrühe wird mit Hilfe von Diatomeenerde filtriert. 2082 1 der filtrierten Brühe mit einer Aktivität von 0,34 Einheiten/ml werden durch eine Säule mit vorher verwendetem Anionenaustausclierharz vom quaternären Ammoniumtyp auf einer Styrol-Divinylbenzol-Polymerisat-Grundsubstanz in der Chloridform geleitet. Das sich ergebende Harzadsorbat wird mit einer 3%igen wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert, und das sich ergebende El uat wird in Fraktionen von 18,9 1 gesammelt. Die erschöpfte Brühe nach Durchlaufen der Säule ist inaktiv, wie durch den Versuch mit Proteus vulgaris bestimmt wird. Die Fraktionen 5 bis 12, die die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität enthalten, werden vereinigt.

Weitere 20821 der filtrierten Fermentationsbrühe werden durch eine Säule geleitet, die 1511 eines neuen Anionenaustauscherharzes vom oben beschriebenen Typ enthält, und das sich ergebende Harzadsorbat wird mit einer 3°/_oigen wäßrigen Natriumchloridlösung eluiert, wobei das Eluat in Fraktionen von 18,9 1 gesammelt wird. Die Fraktionen 2 bis 11, die die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität enthalten, werden mit den Fraktionen 5 bis 12 aus der ersten Chromatographie vereinigt und bei vermindertem Druck auf etwa 26,5 1 konzentriert. Das sich ergebende Konzentrat hat einen pH von 8,5 und eine Stärke von 0,2 Einheiten/mg, bestimmt nach dem oben beschriebenen Standardversuchsverfahren gegen Proteus vulgaris. Dieses Harzeluatkonzentrat wird auch durch ein modifiziertes Testverfahren unter Verwendung von Proteus vulgaris als Testorganismus untersucht. Bei diesem modifizierten Verfahren werden 5 ml des inokulierten Mediums in der Petri-Schale verwendet, und das zu untersuchende Antibiotikum wird auf eine 1,27-cm-Papierscheibe gebracht. Die Schale mit den Testscheiben wird dann 18 Stunden bei 37⁰C inkubiert, und die Inhibierungszonen werden gemessen. Die Stärke wird ausgedrückt als die Menge Feststoff pro Millimeter, die unter diesen Bedingungen eine Inhibierungszone von 25 mm erzeugt. Es wird gefunden, daß das Harzeluat (25,85 1) 10,4 kg Feststoffe enthält und eine Inhibierungszone von 25 mm bei einer Konzentration von 2,7 mg/ml ergibt.

Zu diesen 25,85-1-Eluatkonzentrat werden 15 kg sauer gewaschenes Aluminiumoxid gegeben, und die Mischung wird 30 Minuten bei einem pH von 5,7 gerührt. Die Mischung wird dann filtriert, und es wird gefunden, daß das Filtrat 9,5 kg Feststoffe enthält und eine Inhibierungszone von 25 mm bei einer Konzentration von 6,1 mg/ml ergibt, wenn das oben beschriebene modifizierte Test verfahren verwendet wird. Das auf dem Aluminiumoxid adsorbierte Antibiotikum wird mit 25 1 Wasser eluiert, wobei die Aluminiumoxidaufschlämmung durch Zugabe von konzentriertem Ammoniumhydroxid auf pH 11,1 gestellt wird. Nach 40 Minuten Rühren wird das Aluminiumoxid abfiltriert, und das sich ergebende Eluat wird bei vermindertem Druck auf 11 konzentriert. Dieses Konzentrat enthält 361 g Feststoffe und ergibt eine Inhibierungszone von 25 mm bei einer Konzentration von 0,17 mg/ml.

Zu 850 ml dieses reichen Konzentrats werden 7650 ml Methanol gegeben und die unlöslichen Stoffe werden durch Filtrieren entfernt. Das Filtrat, das praktisch das gesamte Antibiotikum enthält, wird durch eine Säule geleitet, die 1 kg sauer gewaschenes Aluminiumoxid enthält. Dann werden ein Methanolgradient, der 2n-Ammoniak in 75°/o'ge^m> 50%igem und 25%igem Methanol enthält, und schließlich 2 normales wäßriges Ammoniak verwendet, um das Aluminiumoxidadsorbat zu eluieren, wobei 4000 ml von jeder Methanolkonzentration und das gleiche Volumen wäßriges Ammoniak für die Elution verwendet werden. Das Eluat aus der Elution mit 2n-Ammoniak in 75°/_oigem Methanol wird in vier 1-1-Fraktionen gesammelt und untersucht. Die Untersuchungen zeigen, daß diese Fraktionen unbedeutende Aktivität enthalten, und sie werden deshalb verworfen.

Das Eluat aus der Elution mit 2n-Ammoniak in 50%igem Methanol wird ebenfalls in vier Fraktionen mit jeweils 1 1 gesammelt. Der Feststoffgehalt und die Prüfung dieser Fraktionen ergeben sich wie folgt:

Fraktion	Gesamtfeststoffe g	Prüfung mg/ml pro 25 mm Inhibierungszone
1 2 3 4	15 31 16 5	0,75 0,24 0,13 0,06

Das Eluat aus der Elution mit 2n-Ammoniak in 25^o/o'gem Methanol wird in vier Fraktionen von jeweils 11 gesammelt. Der Feststoffgehalt und die Prüfung jeder dieser Fraktionen ergeben sich wie folgt:

15 Fraktion	Gesamtfeststoffe g	Prüfung mg/ml pro 25 mm Inhibierungszone
1 20 2 3 4	4,99 8,1 4,4 2,0	0,10 0,04 0,03 0,04

Das Eluat aus der Elution mit wäßrigem 2n-Ammoniak wird in vier Fraktionen von jeweils 11 gesammelt. Die erste Fraktion enthält insgesamt 2,9 g Feststoffe mit einem Gehalt von 0,12 mg/ml pro 25 mm Inhibierungszone, und die zweite Fraktion enthält 4,0 g Feststoffe und einen Gehalt von 0,16 mg/ml pro 25 mm Inhibierungszone. Die restlichen zwei Fraktionen enthalten nur geringe Mengen antibiotischer Aktivität und werden verworfen.

Jede der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Eluatfraktionen wird lyophilisiert. Die Feststoffe aus den letzten drei Fraktionen, die bei der Elution mit 2n-Ammoniak in 50°/₀igem Methanol erhalten worden sind, werden vereinigt und dreimal mit 500 ml aufgeschlämmt und dann filtriert. Die Methanolextrakte werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 500 ml konzentriert. Das sich ergebende Konzentrat enthält 7,5 g Feststoffe und ergibt eine 25-mm-Inhibierungszone bei einer Konzentration von 0,006 mg/ml.

134 ml dieses Konzentrates werden an 100 g sauer

gewaschenem Aluminiumoxid unter Verwendung eines kontinuierlichen (exponentiellen) Gradienten chromatographiert, wobei mit 21 2n-ammoniakalischem 75°/oig^em Methanol mit der Geschwindigkeit von 1 ml/Minute begonnen wird und kontinuierlich die 21 Elutionslösung durch Zugabe von 2n-wäßrigem

50^ Ammoniak bei dem gleichen Volumen gehalten werden. Das sich ergebende Eluat wird in Fraktionen von 20 ml gesammelt. Die aktivsten Fraktionen 10 bis 25 werden vereinigt und bei vermindertem Druck auf 1 ml konzentriert, wonach in 12 ml Methanol gelöst und ein gleiches Volumen n-Butandol zugegeben wird. Das Methanol wird bei vermindertem Druck verdampft. Das in Butanol unlösliche Material wird entfernt. Die Prüfung der Butanollösung des Antibiotikums durch das im vorliegenden Beispiel beschriebene modifizierte Testverfahren ergibt eine 25 mm Inhibierungszone bei einer Konzentration von 0,005 mg/ml.

Die vereinigten Eluate aus 2n-ammoniakalischem 50%igem und 25%igem Methanol aus der Aluminiumoxidchromatographie werden bei vermindertem Druck auf 500 ml konzentriert. Zu diesem Konzentrat werden 1500 ml Methanol gegeben, und die sich ergebende Lösung wird filtriert. Das Filtrat wird bei vermindertem Druck eingedampft, wobei eine wäßrige Lösung

des Antibiotikums erhalten wird, die bei der Prüfung gemäß dem oben in diesem Beispiel beschriebenen modifizierten Testverfahren mit Proteus vulgaris eine 25-mm-Inhibierungszone bei einer Verdünnung von 0,0055 mg/ml ergibt.

Zu 2 ml des obigen Konzentrats werden 20 ml Methanol gegeben, und die sich ergebende Lösung wird filtriert. Das Filtrat wird mit 60 ml n-Butanol verdünnt und die unlöslichen Stoffe werden durch Filtrieren ent-

210 ml eines stark basischen Anionenaustauscherharzes in der Chloridform enthält, das sich aus quaternären Ammoniumaustauschgruppen, verknüpft mit einem Styrol-Divinylbenzol-Polymerisatgerüst, zusammensetzt. Das sich ergebende Harzadsorbat wird mit 300 ml Wasser gewaschen und zuerst mit 11 3%iger wäßriger Ammoniumbicarbonatlösung und dann mit 11 3%igem Ammoniumbicarbonat in 70%igem Methanol eluiert. Die Eluate werden in 100-ml-

fernt. Das Filtrat, das das Antibiotikum enthält, ergibt io Fraktionen gesammelt, und jede der Fraktionen wird eine 25-mm-Inhibierungszone bei einer Verdünnung geprüft. Das wäßrige Eluat enthält 20% der Aktivität, von 0,0025 mg/ml. Das Filtrat wird auf 8 ml eingedampft, und das unlösliche Material wird durch Filtrie

ren abgetrennt. Die sich ergebende n-Butanollösung

und das Methanoleluat enthält 30% der Aktivität, bestimmt durch die Standardprüfung unter Verwendung von Proteus vulgaris MB-838. Die wäßrigen Eluat-

des Antibiotikums ergibt bei dem modifizierten Test- 15 fraktionen werden direkt gefriergetrocknet, während verfahren mit Proteus vulgaris eine 25-mm-Inhibie- die Methanoleluatfraktionen im Vakuum konzentriert rungszone bei einer Verdünnung von 0,0014 mg/ml. und dann gefriergetrocknet werden. Die gefriergetrock-_R . -ίο neten Feststoffe werden in Wasser gelöst und wiederum

^e ' ^s P' ^e geprüft, um die Stärke der verschiedenen Fraktionen

Zu 50 ml sterilem wäßrigem Medium mit der fol- 20 zu bestimmen. Lösungen der ersten zwei wäßrigen

100-ml-Eluatfraktionen werden unter Bildung der Probe Nr. 62-2 vereinigt und Lösungen der ersten drei Methanoleluatfraktionen werden unter Bildung der Probe Nr. 62-3 vereinigt. Die Probe Nr. 62-2 mit einem Gesamtvolumen von 45 ml und einem Gesamtfeststoffgehalt von 30 mg/ml ergibt eine Inhibierungszone von 25 mm bei Verdünnung 1: 200, wenn sie nach dem Standardprüfverfahren unter Verwendung von

genden Zusammensetzung:

Caseinhydrolysat (N-Z-Amin) 1 %

Dextrose 1 %

NaCl 0,5%

Fleischextrakt 0,3%

und einem pH von 7,2 vor der Sterilisation wird 1 ml eines Inokulums gegeben, das durch Suspendieren einer Agarschrägkultur von S. viridochromogenes NRRL-

Proteus vulgaris untersucht wird. Die Probe Nr. 62-3

3414 in 10 ml des gleichen Mediums hergestellt worden 30 mit einem Gesamtvolumen von 27 ml und einem Ge

ist. Das inokulierte Medium in einem 250-mI-Erlenmeyer-Kolben mit Stopfen wird 2 Tage bei 28 ⁰C auf einem Drehschüttler inkubiert, und 10 ml der sich ergebenden Fermentationsbrühe werden verwendet, um

samtfeststoffgehalt von 47 mg/ml ergibt eine Inhibierungszone von 25 mm bei einer Verdünnung 1: 400. Die Beweglichkeiten bei der Papierstreifenchromatographie von (1) einer Probe Nr. 62-2 und (2) einer

500 ml steriles wäßriges Medium mit der oben ange- 35 Probe Nr. 62-2, gemischt mit einer gleichen Menge gebenen Zusammensetzung in einem 2-1-Erlenmeyer- Natrium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, wer-Kolben mit Stopfen zu inokulieren. Dieses inokulierte
Medium wird dann 2 Tage bei 28⁰C auf einem Dreh

schüttler gezogen, und die sich ergebende Brühe wird

den bestimmt, indem Streifen von Whatman-Nr.-3-Filterpapier entwickelt werden, die ursprünglich mit Spots der nach 4tägiger Inkubation erhaltenen Brühe ver

verwendet, um einen 189-1-Fermenter aus rostfreiem 40 sehen und mit Lösungsmittel »K« (70% Isopropanol

Stahl zu inokulieren, der 1001 steriles Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie oben enthält. Dieses inokulierte Medium wird 40 Stunden unter Rühren bei 28⁰C inkubiert, während ein Luftstrom

von

und 30% pH 6,0 Phosphatpuffer [0,0Im]) oder Lösungsmittel »C« (2% Natriumchlorid in 75%igem wäßrigem Methanol) entwickelt worden sind. Die Ergebnisse werden durch Bioautographie auf Schalen mit

0,085 m³/Min. durch die Fermentationsbrühe geleitet 45 dünnem Nähragar plus 0,2% Hefeextraktmedium, wird. Während der Fermentation werden kleine Men- beimpft mit bakteriellem Inokulum, sichtbar gemacht.

gen Polypropylenglykol zugegeben, um das Schäumen Die als R. F. bezeichneten Beweglichkeiten des Zen-

des Fermentationsmediums zu regeln. trums der Inhibierungszone, beobachtet nach Inkuba-

Ein Inokulum von 43 1 der sich ergebenden Fermen- tion über Nacht, ergeben sich wie folgt:

tationsbrühe wird dann verwendet, um einen 757-1-Fermenter aus rostfreiem Stahl zu inokulieren, der 5101 eines sterilen wäßrigen Mediums enthält, das 2 %

T d Hfhl h i

(2) Proteus vulgaris MB-838

R. F. in Lösungsmittelsystem

»Κ« ι »C«

0,42 0,44

0,79 0,78

Tomatenpaste und 2% Hafermehl enthält. Die inokulierte Brühe wird 90 Stunden unter Rühren bei

28⁰C gezogen, während ein Luftstrom vom 0,2832 m³/ 55 (1) Proteus vulgaris MB-838 Min. durch das fermentierende Medium geleitet wird.
Eine filtrierte Probe der sich ergebenden Fermentationsbrühe ergibt eine Inhibierungszone von 33 mm, Mit diesen beiden Proben werden Papierstreifenwenn sie nach den oben beschriebenen Standardver- elektrophorese-Tests durchgeführt. Papierstreifen werfahren unter Verwendung von Proteus vulgaris 60 dem mit Spots der Proben versehen, mit 0,165 molarem MB-838 geprüft wird. Phosphatpuffer vom pH 7,0 eingeweicht und in einer Ein Teil dieser Brühe wird nach 48 Stunden aus dem gekühlten Einheit 2V₂ Stunden mit 600 Volt ent-Fermenter entfernt und filtriert. Die filtrierte Brühe wickelt. Die Ergebnisse werden durch Bioautographie ergibt eine Inhibierungszone von 25 mm, wenn sie un- auf Schalen mit dünnem Nähragar plus 0,2% Hefeter Verwendung von Proteus vulgaris MB-838 mit dem 65 extrakt sichtbar gemacht und die Stellung des aktiven Standardverfahren geprüft wird. 10,5 1 der filtrierten
Brühe werden mit verdünntem Natriumhydroxid auf
pH 8,5 gestellt und an einer Säule adsorbiert, die

Materials wird in Form der Bewegung vom Ursprungspunkt zum Zentrum der Inhibierungszone aufgezeichnet. Auf einer mit Erwina atroseptica beimpften bio-

109552/435

17

autographischen Schale zeigt die Probe Nr. 62-2 eine Bewegung von 13,0 cm und die Probe Nr. 62-2 plus das Natriumsalz der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure eine Bewegung von 12,4 cm.

Die Probe Nr. 62-2 zeigt das folgende antibakterielle und Cross-Resistenz-Spektrum bei Versuchen, die gleichzeitig mit Kalzium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat durchgeführt werden:

Test-Organismus

Inhibierungszone, Durchmesser in mm

(Scheibe = 7 mm) Kalzium-(—)-(cis-l^-epoxy- | _p ■ propyl)-phos- ι _{Nr fi7} -,

phonat ^Nr>
62'²

Escherichia coli MB-60 ..

Bacillus sp MB-833

Proteus vulgaris MB-1012 Pseudomonas aeruginosa

MB-979

Serratia marcescens

MB-252

Staphylococcus aureus

MB-108

Bacillus subtilis MB-965 Sarcina lutea MB-1101 ... Staphylococcus aureus MB-698 (Streptothricin-

resistent)

Streptococcus faecalis

MB-753

Alcaligenes faecalis MB-IO Brucella bronchiseptica

MB-965

Salmonella gallinarum

MB-1287

Vibrio percolans M B-1272 Xanthomonas vesicatoria

MB-815

Escherichia coli MB-60 empfindlicher Mutterstamm

Streptomycin-resistenter

Stamm

Streptothricin-resistenter

Stamm

OX A M YCI N-resistenter

Stamm

Pleocidin-resistenter

Stamm

Chloramphenicol-resisten-

ter Stamm

Chlortetracyclin-resisten-

ter Stamm

Oxytetracyclin-resistenter

Stamm

Neomycin-resistenter

Stamm

Tetracyclin-resistenter

Stamm

Viomycin-resistenter

Stamm

Polymyxin-resistenter

Stamm

Grisein-resistenter Stamm

26

39

17

18 36 25

29

12 11

34 37

15

26

23

21

26

36

11

13

45

31

15

12 23

19

36

13

12 19 19

30

28 32

19

18

12

15

36

13

40 29 15

10 19 Die Ergebnisse der Papierstreifenchromatographie, der Papierstreifenelektrophorese und das antibakterielle und Cross-Resistenz-Spektrum zeigen, daß die antibiotische Aktivität der Probe Nr. 62-2 auf der ⁵ (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure beruht.

Beispiel 4

Eine lyophilisierte Kultur von Streptomyces wedmorensis ATCC 21 239 wird verwendet, um 50 ml ίο steriles Hefeextrakt-Glucosemedium der im folgenden angegebenen Zusammensetzung in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben mit Stopfen zu inokulieren.

Hefeextrakt 10 g/l

Glucose 10 g/l

MgSO₄-7H₂O 0,05 g/l

Phosphatpuffer* 2 ml

_ Destilliertes Wasser bis auf das Volumen

* 91 g KH₂PO₄ plus 95,0 g Na₂PO₄, in destilliertem Wasser auf 11 gebracht.

Dieses negative Inokulum wird durch 3tätige Inkubation bei 28°C auf einem Drehschüttler mit 220 UpM entwickelt. Das sich ergebende Inokulum wird verwendet, um 50 ml steriles Caseinhydrolysat-Fleischextraktmedium der im folgenden angegebenen Zusammensetzung in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben unter Verwendung von 3% Inokulum (1,5 ml/Kolben) zu inokulieren:

Caseinhydrolysat (N-Z-Amin) 1%

Dextrose 1 %

NaCl 0,5%

Fleischextrakt 0,3 %

Die inokulierten Kolben werden 4 Tage bei 28⁰C auf einem Drehschüttler mit 220 UpM gezogen. Die sich ergebende Brühe wird zentrifugiert, und die geklärte Brühe ergibt eine Inhibierungszone von 25 mm mit 7-mm-Papierscheiben, wenn sie mit dem Standardverfahren unter Verwendung von Proteus vulgaris MB-838 als Testorganismus geprüft wird.

Weitere Untersuchungen an dieser Brühe unter Verwendung des gleichen Scheibenager-Diffusionsverfahrens, die bei 25^CC und 37⁰C 20 Stunden lang durchgeführt werden, zeigen Inhibierungszonen von 7 mm (die Zone der Scheibe) bzw. 26 mm. Dieser Unterschied in den Inhibierungszonen bei den beiden Temperaturen ist charakteristisch für (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure.

Die Beweglichkeiten bei der Papierstreifenchromatographie, bestimmt an der geklärten Brühe gemäß der in Beispiel 3 beschriebenen Arbeitsweise unter Verwendung von Proteus vulgaris MB-838 als biographischer Organismus, zeigen einen R. F. von 0,25 in dem Lösungsmittelsystem »K« und von 0,75 in dem Lösungsmittelsystem »C«.

Beispiel 5

Ein Eluat aus 2n-ammoniakalischem 25%igem Methanol, erhalten nach der im Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise, wird gefriergetrocknet, wobei 250 mg Feststoffe erhalten werden, die bei dem im Beispiel 2 beschriebenen modifizierten Testverfahren gegen Proteus vulgaris eine 25-mm-Inhibierungszone bei einer Verdünnung von 0,028 mg/ml ergeben. Der getrocknete Feststoff wird in 5 ml Methanol gelöst, und zu der Methanollösung werden 5 ml n-Butanol gegeben. Die sich ergebende Lösung wird nitriert, und das Filtrat

wird bei vermindertem Druck zur Entfernung des Methanols eingedampft. Die Butanollösung wird mit 0,3 Raumteilen Wasser extrahiert und die wäßrige Schicht abgetrennt.

Zu 20 ml einer derartigen wäßrigen Lösung des Ammoniumsalzes der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, die 1020 mg Feststoffe enthält und nach der Bestimmung gemäß dem im Beispiel 2 beschriebenen modifizierten Proteus-vulgaris-Test eine Aktivität von 204 000 Einheiten besitzt, werden 440 mg Kalziumhydroxid gegeben; die sich ergebende Lösung hat ein pH von 10,2. Die Lösung wird dann im Vakuum unter Erhitzen auf etwa Y₂ Volumen eingedampft, wonach das pH mit 7,4 gefunden wird. Zu diesem Konzentrat werden etwa 10 ml Wasser und 100 mg Kalziumhydroxid gegeben, und die sich ergebende Mischung wird wiederum im Vakuum auf etwa V₂ Volumen mit einem

15

phonsäure enthält, mit einem F. 139 bis 142°C ergeben. Dieses Produkt wird in 40 ml heißem Äthanol aufgenommen, das ungelöste Material wird abfiltriert, und das sich ergebende Filtrat wird auf 10 ml konzentriert. Diese Lösung wird zur Wiederauflösung von etwa ausgefallenem Material erwärmt, gekühlt und dann mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das kristalline Benzylaminsalz der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, das sich aus der Lösung absetzt, wird abfiltriert, mit Äthanol gewaschen und getrocknet, wobei sich 0,170 g Benzylaminsalz mit einem F. 156 bis 160°C ergeben. Wenn dieses Produkt aus 2,5 ml einer Äthanol-Methanol-Mischung umkristallisiert wird, so werden 0,15 g des Benzylaminsalzes der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure mit einem F. 153 bis 158°C erhalten. Die Elementaranalyse des Produkts bestätigt die empirische Formel C₁₀Hi₆NPO₄. Weiteres Monobenzylaminsalz wird bei

y der Aufarbeitung der Mutterlaugen erhalten.

Beispiel 7

Zu 4 ml einer Methanollösung, die 60 mg Ammonium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat (erhalten

pH von 7,5 eingedampft. Dieses Konzentrat wird mit Wasser auf etwa 40 ml verdünnt und dann filtriert. Das klare Filtrat wird im Vakuum auf 15 ml einge- 20 dampft, und das Konzentrat wird über eine Säule mit stark saurem Kationenaustauscherharz in der Kalziumform geleitet. Die Harzsäule wird mit Wasser entwickelt, und es werden 10-ml-Fraktionen des sich ergebenden Abstroms abgenommen und mit dem modi- 25 durch Extraktion einer Butanollösung des Salzes mit fizierten Proteus vulgaris-Test geprüft. Die Fraktionen Wasser wie im Beispiel 5 beschrieben und Gefrier-3 bis 9, die die Hauptmenge der antibiotischen Aktivi- trocknen des sich ergebenden wäßrigen Extrakts) enttät enthalten, werden vereinigt und im Vakuum unter hält, werden 48 mg d-ft-Phenyläthylamin gegeben. Die Erhitzen auf etwa 8 ml konzentriert. Das sich ergeben- sich ergebende Lösung wird unter einem Stickstoffde Konzentrat wird filtriert und unter Rühren etwa 30 strom eingedampft, und es wird eine kleine Menge 3 Stunden kristallisieren gelassen. Das kristalline Kai- Methanol zu dem teilweise kristallinen Rückstand geziumsalz der (—Mcis-l^-EpoxypropyO-phosphonsäure wird durch Filtrieren entfernt und mit Wasser und dann mit Methanol gewaschen, bevor es im Vakuum getrocknet wird. Das so erhaltene Produkt wiegt 35 240 mg und besitzt bei der Prüfung nach dem modifizierten Proteus vulgaris-Testverfahren eine Aktivität von 220 Einheiten/mg. Die optische Drehung des Pro

duktes beträgt [A]₅₈₉ = —5,7°, [-V]₅₄₆ = —6°, [Xj₄₃₆ = —12.5^L und [x]₄₀₅ = —14,8°. Die Elementaranalyse nach 2stündigem Trocknen im Vakuum bei 125⁰C ergibt: C 22,51%, H 4,2% und P 15,3%.

Zu dem Filtrat wird eine kleine Menge Methanol gegeben, und es werden weitere 96 mg des kristallinen Kalziumsalzes erhalten.

Beispiel 6

g geben. Nach Zugabe eines geringen Volumens Aceton und nachfolgend eines kleinen Volumens Äther, um weitere Kristallisation des d-*-Phenyläthylaminsalzes der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure einzuleiten, wird das kristalline Produkt abfiltriert und getrocknet, wobei sich ein Produkt mit einem F. 139 bis 140^JC ergibt.

Beispiel 8

Zu 118 ml einer wäßrigen Lösung des Ammonium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonats mit einem Feststoffgehalt von 7,2 mg/ml und einer Aktivität von 250 Einheiten/mg (erhalten durch Wasserextraktion eines Butanolkonzentrats wie im Beispiel 5 beschrieben) werden 2 g Benzylamin, gelöst in etwa 5 ml Äthyläther gegeben, und die sich ergebende Lösung wird im Vakuum zur Trockne konzentriert. Zu dem Rückstand werden etwa 5 ml Methanol und anschließend etwa 5 ml Benzol gegeben, und die Lösung wird wiederum konzentriert und im Vakuum getrocknet. Zu dem sich ergebenden, getrockneten, partiell kristallinen Produkt werden 6 ml Äthanol und 2 ml Benzol gegeben. Die Lösung wird dann gekühlt und es werden weitere 10ml Benzol zugesetzt. Es beginnen sich Kristalle zu bilden, und es wird eine Mischung von Benzol/Äthyläther 5:1 zugegeben. Die Kristalle werden abfiltriert und mit 4 ml einer Mischung von Benzol/Äthyläther 1: 1 gewaschen, wobei sich 1,082 g Produkt, das das Monobenzylaminsalz der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phos-Zu 27,7 g Mono-(-|-)-x-phenäthylammonium-(—)-(eis -1,2 - epoxypropyl) - phosphonat werden 87 ml !,lSn-methanolische Natriummethylatlösung gegeben, und die Mischung wird gerührt, bis alle Feststoffe gelöst sind. Die Lösung wird auf W" gekühlt und filtriert. Zu dieser Lösung werden 87 ml l,15n-äthanolische Natriummethylatlösung (hergestellt durch Auflösen von 57,87 g Natriummethylat in 900 ml wasserfreiem

Äthanol) unter Rühren unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. Zu dieser Lösung werden 81 ml absolutes Äthanol gegeben, und die Mischung wird bei O⁰C 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Die Mischung wird dann filtriert und das feste Dinatrium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat wird mit 200 ml Äthanol gewaschen und im Vakuum bei 60° C zur Gewichtskonstanz getrocknet. Eine 5%'ge Lösung des Dinatriumsalzes hat ein pH von 8,85, ein t*]",^ = —13,9° und ein [*] = -5,1°.

Beispiel 9

Eine Lösung von 4,9 g des Monobenzylaminsalzes der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure in 50ml Wasser wird auf 0 bis 5°C gekühlt und mit 2 bis 4 ml pro Minute über eine Säule geschickt, die 33 ml eines Sulfonsäurekationenaustauscherharzes vom Polysty-

roltyp in der sauren Form enthält, wobei das Harz vorher auf 0 bis 2° C gekühlt worden ist. Die Harzsäule wird dann mit 225 ml Wasser mit 0 bis 5°C mit der gleichen Geschwindigkeit gewaschen. Die Abströme werden direkt in einer gerührten Lösung von 1,50 g Natriumhydroxid in 10 ml Wasser gesammelt, und das pH der sich ergebenden Lösung wird dann durch Zugabe von verdünntem Natriumhydroxid auf pH 8,7 gestellt. Diese Lösung wird im Vakuum bei 25⁰C oder darunter auf ein Nettogewicht von etwa 15 bis 20 g konzentriert und zu diesem in weitem Maß verfestigten Produkt werden unter Rühren 30 ml Methanol gegeben. Zu der sich ergebenden Aufschlämmung werden 125 ml Isopropanol gegeben, und die Mischung wird im Vakuum bei unter 25°C auf etwa 75 ml konzentriert. Das VoIumen wird dann mit Isopropanol wieder auf 125 ml gebracht, es wird 15 Minuten gerührt und filtriert. Der feste Filterkuchen, der aus Dinatrium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat besteht, wird über Nacht im Vakuum bei 6O⁰C getrocknet. Eine 5°/_oige Lösung des Dinatriumsalzes in Wasser hat ein pH von 8,5 und ein

15

Wenn die vorstehende Arbeitsweise unter Verwendung einer äquivalenten Menge an Kaliumhydroxid an Stelle des Natriumhydroxids wiederholt wird, so wird das Dikalium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat erhalten. Eine 5%ige wäßrige Lösung dieses Produktes in Wasser hat ein pH von 8,8 bis 9,0 und ein [<x]lolw = -12,0°.

Beispiel 10

Zu 3,6 g des Dinatriumsalzes und 4,28 g des Dikaliumsalzes wird ausreichend Wasser gegeben, um die Salze zu lösen. Die sich ergebende Lösung wird im Vakuum bei unter 25⁰C zur Trockne konzentriert, wobei das gemischte Mononatriummonokaliumsalz der (—) - (eis -1,2- Epoxypropyl)- phosphonsäure erhalten wird. Eine 5°/_oige Lösung dieses gemischten Salzes hat ein pH von 8,8 bis 9,0 und ein [a]^ = -12,8°.

Beispiel 11 Eine gekühlte Lösung (0 bis 5°C) von 32 g Mono-

35 Amins verwendet wird, so werden die folgenden Aminsalze erhalten:

Mono-(+)-amphetammonium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 163,5 bis 165⁰C, Monoäthylammonium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 152 bis 153°C, Monodiäthylammonium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 120,5 bis 122,5°C, Mono-o-threo-l-phenyl-l^-dihydroxy^-propylammonium-(--)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 103 bis 105 ⁰C,

Äthylendiaminsalz der(—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, F. 98 bis 100⁰C, Mono-piperazinsalz der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, F. 188 ⁰C, Diäthylentriaminsalz der (■—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, F. 177 bis 179⁰C, Hexamethylen-l,6-diaminsalz der (—)-(cisl,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, F. 194°C, Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiaminsalz der (—)-(cisl,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, F. 151 bis 152⁰C,

Bis-guanidinsalz der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure, F. 235 bis 260° C, Äthylendiamin-N,N'-bis(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 175 bis 210° C, Mono-L-(+)-lysin-(~-)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 165 bis 195° C, Mono-(—)-brucin-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 210 bis 22O⁰C und Monoprocain-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat, F. 121 bis 125⁰C.

Beispiel 13

Eine gekühlte Lösung (0 bis 5⁰C) von 11,08 g Mono-(+)-«-phenäthylammonium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosphonat in 160 ml Wasser wird über ml eines Sulfonsäure-Kationenaustauscherharzes vom Polystyroltyp in der Wasserstofform mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 5 ml pro Minute geleitet. Der Abstrom und die nachfolgenden 125 ml kaltes Waschwasser werden gesammelt, und es

werden 7,5 g Aluminiumnitratmonohydrat zugesetzt. (+M^-phenäthylarnmoniurrH—)-(cis-l,2-epoxypro- 45 Das pH der Lösung wird dann mit 50%igem Natriumpyl)-phosphonat in 480 ml Wasser wird über 200 ml hydroxid auf 6,0 gestellt, dann wird im Vakuum bei uneines Sulfonsäurekationenaustauscherharzes des Poly- ter 25°C auf etwa 32,3 g eingedampft. Zu diesem Konstyroltyps in der Wasserstofform mit einer Fließge- zentrat werden 58 ml Äthanol gegeben, und die Lösung sch windigkeit von etwa 15 ml pro Minute geleitet. Der wird 1 Stunde gerührt. Es werden 25 ml Äthanol zuge-Abstrom und die nachfolgenden 400 ml kaltes Wasch- 50 geben und die Lösung wird filtriert. Das feste Alumiwasser werden in einer Lösung von 4,6 g Natrium- niumsalz der (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphon-

säure wird mit Äthanol gewaschen und bei 6O⁰C im Vakuum getrocknet.

hydroxid in 50 ml Wasser gesammelt. Das pH der sich ergebenden Lösung ist 5,4 und wird mit 6n-Natriumhydroxidlösung auf 7,0 gestellt. Die sich ergebende Lösung wird im Vakuum bei 25⁰C auf ein Volumen von etwa 75 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wird dann filtriert, wobei eine 20°/₀ige Lösung von Sesquinatrium-(—)-(cis-l,2-epoxypropyl)-phosponat erhalten wird. Eindampfen der Lösung im Vakuum bei einer Temperatur unter 25⁰C liefert das Sesquinatriumsalz als weißen Feststoff. Eine 2%ige Lösung dieses Produkts in Wasser hat einen pH von 6,8 und ein [«gj,. -- -14,9°.

B e i s ρ i e 1 12

Folgt man den Arbeitsweisen von Beispiel 11, wobei jedoch eine äquivalente Menge des entsprechenden

Claims

Patentansprüche:

1. (—)-(cis-l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure und deren Salze.

2. Dinatriumsalz der Verbindung nach Anspruch 1.

3. Kalziumsalz der Verbindung nach Anspruch 1.

4. Verfahren zur Herstellung der (—)-(cisl,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure und ihrer Salze gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Streptomyces fradiae (ATCC 21 096, 21 097, 21 098 oder 21 099 oder NRRL 3417), Streptomyces viridochromogenes (NRRL 3413, 3414, 3415, 3416 oder 3427) oder Streptomyces wedmorensis (ATCC 21 239) in einem

23 24

wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen bekannter Weise in ein entsprechendes Salz überkultiviert, bis das Medium eine beträchtliche anti- führt.

biotische Aktivität besitzt, die gebildete (—)-(cis-

5. Antibiotisches Mittel, gekennzeichnet durch

l,2-Epoxypropyl)-phosphonsäure in an sich be- einen Gehalt an einer Verbindung nach Anspruch 1

kannter Weise isoliert und gegebenenfalls in an sich 5 und einem inerten Stoff.

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