-
Verfahren zur,Gewinnung eines neuen Antibiotikums Die Erfindung bezieht
sich auf die Züchtung unter kontrollierten Bedingungen des bisher noch nicht beschriebenen
Organismus Streptomyces vinaceus-drappus, auf ein Verfahren zur Gewinnung und Konzentrierung
der bei der genannten Züchtung gebildeten antibiotischen Substanzen aus die Gärungsprodukte
enthaltenden Rohlösungen und auf die dabei erhaltenen Substanzen und ihre Salze.
-
Die Erfindung betrifft insbesondere ein neues Antibiotikum, dem der
Name Antibiotikum D-13 gegeben wurde, dessen Salze und ein Verfahren zu ihrer Herstellung,
Konzentrierung und- Isolierung.
-
Der bisher noch nicht beschriebene Organismus, der die neuen antibiotischen
Substanzen erzeugt, wurde aus Erde in Kalamazoo (Michigan) isoliert und mit dem
Namen Streptomyces vinaceus-drappus belegt. Die Artbezeichnung vinaceus-drappus
wurde gewählt, um auf die gelbbraune Weinfarbe (vinaceous) gemäß Ridgeways Farbnormen
des Luftmycels und der Sporen dieser Organismen hinzuweisen, die bei der Züchtung
der letzteren auf verschiedenen Medien, die im folgenden noch beschrieben werden,
beobachtet wird.
-
Eine sorgfältige Untersuchung der Morphologie und Physiologie von
Streptomyces vinaceus-drappus hat ergeben, daß diese Organismen sich von allen anderen
bisher beschriebenen Arten deutlich unterscheiden. Es folgt nun eine Beschreibung
dieser Organismen gemäß den Richtlinien des >>Manual of Determinative Bacteriologya
von Bergey, 6. Auflage, S. 929 bis
933,
wobei die angeführten Farben auf Grund
der in »Color Standards and Nomenclature« von Ridgeway aufgestellten Normen bezeichnet
sind. Das Impfen wurde
mit einer Sporensuspension vorgenommen. Die
Röhrchen wurden auf einer Inkubationstemperatur von
| Streptomyces vinaceus-drappus Sp. nov. |
| Menge der Farbe Lösliches |
| Medium entvAckelten Lu.ftmycel und Sporen Pigment Bemerkungen |
| Organismen |
| Casein-Stärke-Agar reichlich hellgelbbraun- keines Ganze, glatte,
flache Kolonien |
| Weinfarben |
| Czapeks-Dox-Agar mäßig verblichengelb- - Rückseite zimtbraun |
| braun-weinfarben |
| Kartoffeln groß blaßgelbbraun- - Rauhe Oberfläche. Wachstum
und |
| Weinfarben -Sporenbildung außergewöhnlich |
| stark |
| Bataten groß hellgelbbraun- - Warzige Oberfläche. Ausgezeich- |
| weinfarben netes Wachstum und gute Sporen- |
| Bildung |
| Nähragar klein weiß - Rückseite chamoisfarben |
| Dextrose-Agar groß mausgrau - Braunschwarze Rückseite |
| Tyrosin-Agar Spuren keine Sporen-- Negative Tyrosinasereaktion |
| Bildung |
| Apfelsaures Calcium mäßig blaßgelbbraun- - |
| weinfarben |
| Cellulosebouillon klein verblichengelb- - Keine Zersetzung
der Cellulose |
| braun-weinfarben |
| Stärke-Agar mäßig weiß - Teilweise Hydrolyse. Honiggelbe |
| Rückseite |
| Nährbouillon gering weiß bis verblichen- - Vegetatives submerses
Wachstum |
| gelbbraun-wein- |
| farben |
| Dextrosebouillon mäßig Weiß - Vegetatives submerses Wachstum |
| Nitratbouillon mäßig weiß - Reduziert Nitrate zu Nitriten |
| Lackmusmilch klein verblichengelb- - Alkalische Reaktion, ringförmiges |
| braun-weinfarben Wachstum an der Oberfläche. All- |
| - mähliche Reduktion, keine sicht- |
| bare Koagulation |
| Gelatine klein elfenbeinfarben - Langsame Verflüssigung, Häutchen- |
| bildung |
S. vinaceus-drappus bildet ein langes fadenförmiges Mycel, das sich reichlich verzweigt,
und kugelige Konidien in linksdrehenden spiraligen Ketten. Die Spiralen sind einzeln
oder in Büscheln vorhanden und messen 15 bis 2o ,u in der Länge und 3 bis 5 ,u in
der Breite. Die meisten Spiralen bestehen aus drei bis fünf Windungen. Die Hyphen
sind etwa 1 ,u breit, während die Konidien einen Durchmesser von 1,5 bis 2 u aufweisen.
Es wurden zwei Stämme von S. vinaceus-drappus isoliert und gezüchtet, die, sofern
ge-,visse Wachstumsbedingungen eingehalten werden, das Antibiotikum D-13 bilden.
Diese beiden Stämme wurden mit Stamm D-12 und Stamm D-13 bezeichnet. Der Stamm D-13
reduziert Lackmusmilch weniger rasch als der Stamm D-12. Die Sporen des Stammes
D-13 sind zuerst cremefarben und werden allmählich gelbbraun-weinfarben, während
die Sporen des Stammes D-12 fast vom Beginn des sichtbaren Wachstums an gelbbraun-weinfarben
sind. Bei der Züchtung auf Bataten bildet der Staralm D-13 einen glatten Wachstumsfilm
im Gegensatz zum Stamm D-12, der eine warzige Wachstumsschicht bildet. Sonst wurden
zwischen diesen beiden Stämmen keine andern Unterschiede festgestellt.
-
Für die Herstellung des Antibiotikums D-13 soll keine Einschränkung
auf die Verwendung von S. vinaceus-drappus var. D-12 und D-13 oder auf Organismen,
auf welche die obige Beschreibung paßt, die nur als Erläuterung zu gelten hat, getroffen
werden. So soll insbesondere auch die Verwendung von Mikroorganismen eingeschlossen
sein, die aus S. vinaceus-drappus durch Einwirkung von mutationsbewirkenden Mitteln,
24 bis 28° gehalten. Beobachtungen wurden am q.., 7., 15. und 22. Tag gemacht.
wie
z. B. Röntgenstrahlen, Ultraviolettstrahlen, Elektronen von hoher Geschwindigkeit
usw., infolge Mutation entstehen.
-
Das Antibiotikum D-13 ist gegen Mycobakterien besonders wirksam. Es
hemmt auch das Wachstum anderer grampositiver Bakterien, wie z. B. Staphylococcus
aureus und Bacillus subtilis. Im Gegensatz zu den meisten gegenwärtig bekannten,
von anderen Streptomycesarten erzeugten Antibiotika besitzt das Antibiotikum D-13
keinen breiten gramnegativen Bereich, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht.
Gewicht an kristallinem Hydrat des Antibiotikums D-13, das eine vollständige Hemmung
des Wachstums der Testorganismen hervorruft
| Art Mkg,/CIll3 |
| M. tuberculosis (6o7) ATCC . . . . . . . . . . 1,3 |
| M. tuberculosis H 37 Rv . . . . . . . . . . . . . . 0,2 bis
1,0 |
| S. aureus (F. D. A.-209) . . . . . . . . . . . . . . 2,0 |
| B. subtilis (Ill) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 4,0 |
| K. pneumoniae (PCI-6o2) FDA ....... 20,0 |
| ' P. vulgaris (8427) ATCO.............. 20,0 |
| PS aeruginosa (9o29) ATCC . . . . . . . . . . 20,0 |
| E. coli (26) ATCC.................... 20,0 |
| PCI3 .............................. 20,0 |
| B. cereus (9139) ATCC . . . . . . . . . . . . . . . 20,0 |
| S. schottmuellerii (9149) ATCC ....... 20,0 |
Die oben angeführte Wirksamkeit des Hydrates des Antibiotikums D-13 wurde wie folgt
bestimmt: Es wurde ein Nährmedium mit einem Gehalt von 0,75°/o Difco-Bacto-Pepton
und 0,25% von mit Natriumhydroxydlösung auf ein pff von 7,25 eingestelltem Difco-Hefeextrakt
hergestellt, das in sterile Röhrchen eingetragen und dann mit verschiedenen Mengen
des Antibiotikums D-13 versetzt wurde. Jedes Röhrchen wurde mit einem Tropfen einer
24stündigen Kultursuspension der bei 37° gezüchteten Testorganismen in einer Verdünnung
von i : Zoo beimpft. Es wurde beobachtet, ob nach 16stündiger Inkubation bei 37°
im ruhenden Zustand ein Wachstum festgestellt werden konnte oder nicht, außer für
Mycobakterien. Bei Verwendung von M. tuberculosis (6o7) als Testorganismus wurden
die Wachstumsbeobachtungen nach 40stündiger Inkubation vorgenommen. Bei Verwendung
von 142. tuberculosis H 37 Rv wurde die letzte Beobachtung nach 21tägiger Inkubation
vorgenommen.
-
Das Wandern der bei der Gärung von S. vinaceusdrappus entstehenden
antibiotischen Substanzen bei der Papierchromatographie nach der Methode von Peterson
und Reineke, j. Am. Chem. SOC. 72, 3598 (195o), unter Verwendung von mit Wasser
gesättigtem n-Butanol ist in Fig. 3 gezeigt. Im Chromatogramm A sind die Flecke
sichtbar, die entstehen, wenn die filtrierte Kulturflüssigkeit chromatographiert
wird. Das Chromatogramm läßt die Anwesenheit von nach der Butanolextraktion in der
Kulturflüssigkeit zurückgebliebenem antibiotischem Material erkennen. Das Chromatogramm
C bezieht sich auf die im getrockneten Butanolextrakt vorhandenen antibiotischen
Substanzen. Das Antibiotikum D-13 bildet den großen mittleren Fleck in den Chromatogrammen
A und C. Es wurde festgestellt, daß der Rf-Wert des Antibiotikums D-13 (Verhältnis
der Bewegung der Flüssigkeitsfront zur Bewegung des Antibiotikums) etwa
0,55 beträgt, wenn als Entwicklungsmittel mit Wasser gesättigtes Butanol
verwendet wird, und daß der Rf-Wert etwa 0,75 beträgt, wenn als Entwicklungsmittel
ein Gemisch von n-Butanol, Essigsäure und Wasser im Verhältnis von 2 : 1 : 1 verwendet
wird. Diese Rf-Werte sind deutlich verschieden von denjenigen anderer bekannter
und beschriebener antibiotischer Substanzen.
-
Um die Aktivität von Kulturfiltraten, extrahierten Fraktionen, rohen,
gereinigten oder kristallisierten Präparaten des Antibiotikums D-13 leicht und routinemäßig
bestimmen zu können, wurde ein Agarplattenprüfversuch unter Verwendung von M. avium
(7992) als Testorganismus und Streptomycinsulfat als Vergleichssubstanz durchgeführt.
Eine M. avium-Einheit der Aktivität (oder einfacher eine Aktivitätseinheit) ist
laut Definition diejenige Menge der zu prüfenden Substanz, die i Mikrogramm reiner
freier Streptomycinbase äquivalent ist. Die Prüfmethode wurde in Anlehnung an diejenige
von Leo und Mitarbeitern, j. Bact. 50, 701 (1945), entwickelt.
-
Das Agarmedium besteht aus 30 g Trypticase Soy Broth (einem
beständigen Allzweckstoff mit den Bestandteilen 17 g je Liter Trypticase, d. i.
ein dehydriertes, aus Kasein durch Lösung im Saft der Bauchspeicheldrüse hergestelltes
Pepton, 3 g je Liter Phytone, d. i. eine Papainlösung von Sojabohnenmehl [Papain
ist ein pflanzliches Pepsin aus dem Saft von Früchten und Blättern der Carica Papaia],
5 g je Liter Natriumchlorid, 2,5 g je Liter Dikaliumphosphat, 2,5 g je Liter Dextrose)
; 2o g Bactoagar (einem gereinigten Agar, das im wesentlichen von Fremdstoffen,
Pigmentanteilen und Salzen frei ist) ; 3 g Ochsenfleischextrakt; o,i cm3 Tween 8o
(ein Polyoxyalkylenderivat des Sorbitanmonooleats), und Wasser bis auf 1 1.
-
Die Probelösung wird auf Filterpapierscheiben von o,6 cm Durchmesser
aufgebracht. Die Inkubation der Platten wird bei 37° im Verlaufe von 16 bis 18 Stunden
durchgeführt. Der Bereich der Prüfkurve reicht von 6,25 Einheiten je Kubikzentimeter
bis Zoo Einheiten je Kubikzentimeter.
-
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Züchtung von S. vinaceus-drappus,
einer neuen und bisher noch nicht beschriebenen Species von Mikroorganismen, unter
kontrollierten Bedingungen, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 2o bis 28°
durch submerse Gärung unter Rühren und Belüftung und unter Verwendung von Medien,
die enthalten: eine Quelle für Kohlenhydrate, wie z. B. Glycerin, Stärke und Zucker,
eine Quelle für organischen Stickstoff, wie z. B. Sojabohnenmehl, Haferflocken,
Maiseinweichflüssigkeit und Gemische dieser Substanzen, eine Quelle für Wachstumssubstanzen,
wie z. B. Hefe, Alkoholdestillationsrückstände, Gärungsrückstände usw., Mineralsalze,
wie z. B. Ammoniumnitrat, Kaliumnitrat, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat usw., ein
alkalisch wirkendes Puffermittel, wie z. B. Calciumcarbonat,
Natriumdiphosphat
usw., und, wenn die Gärungen im großtechnischen Maßstab durchgeführt werden, ein
ungiftiges Entschäumungsmittel, z. B. ein tierisches oder pflanzliches Öl. Wenn
infolge des Wachstums der Organismen eine befriedigend hohe Menge an antibiotischen
Substanzen gebildet worden ist (was beispielsweise mittels des M. avium-Plattenversuches
festgestellt werden kann), wird das Mycel von der die antibiotischen Substanzen
enthaltenden Kulturflüssigkeit abgetrennt, aus welcher die antibiotischen Substanzen
durch Extraktion mit geeigneten Lösungsmitteln oder durch Adsorption und anschließende
Elution isoliert werden, wie dies im folgenden noch eingehend beschrieben wird.
-
Für den Gebrauch in Schüttelflaschen oder Tanks für submerse Kulturen
für den Versuchs- oder Großbetrieb geeignete Impfmedien können durch Verwendung
einer auf Casein-Stärke-Schrägagar gezüchteten Kultur erhalten werden. Dieses Casein-Stärke-Agar-Medium
kann auch dazu verwendet werden, durch geeignete Übertragung kräftige, antibiotikumerzeugende
Kulturen des Organismus am Leben zu erhalten. Diese Kultur wird zur Impfung des
Inhalts von Schüttelflaschen oder von Tanks für submerse Kulturen verwendet. Man
kann jedoch auch die Tanks mit dem Impfmedium aus den Schüttelflaschen beimpfen.
Es wurde festgestellt, daß das Wachstum der Organismen in Schüttelflaschen im allgemeinen
nach 3 bis 5 Tagen ein Maximum erreicht, während das Wachstumsmaximum in Tanks für
submerse Kulturen in 2 bis 5 Tagen erreicht wird. Es können jedoch auch kürzere
oder längere Zeiten für das Wachstum der Kulturen beansprucht werden. Wenn für die
Antibiotikumherstellung Schüttelflaschen oder Kolben von 1g 1 Inhalt verwendet werden,
wird aus einer Pipette oder unter Verwendung anderer geeigneter Mittel unter sterilen
Bedingungen eine geeignete Menge des Impfmediums zugesetzt, während die Impfung
von Tanks für den Versuchs- oder Großbetrieb vorzugsweise so durchgeführt wird,
daß man den Inhalt eines die S. vinaceus-drappus-Kultur enthaltenden Tanks unter
vollständig aseptischen Bedingungen in den Gärungsbehälter überführt und die Kultur
während etwa 3 bis 5 Tagen Weiterwachsen läßt. In den Gärungsbehältern werden aerobe
Bedingungen äufrechterhalten, indem man durch einen Verteiler bei einer geeigneten
Geschwindigkeit Luft hindurchtreibt, wobei diese Geschwindigkeit von der Größe des
Behälters, der Art des Rührens und der Art des verwendeten Mediums abhängt. Man
verwendet vorzugsweise 1/4 bis 11/2 Volumen j e Volumen des Mediums. Sollten während
der Gärung infolge Schaumbildung Schwierigkeiten auftreten, so kann man ungiftige
Antischaummittel, z. B. tierische oder pflanzliche Öle, in solcher Menge und in
solchen Zeitpunkten zusetzen, daß eine geeignete Verminderung der Schaumbildung
erzielt wird. Während der ganzen Gärung wird die Gärflüssigkeit gerührt, wobei der
Grad des Rührens vom allgemeinen Aufbau des Gärungsbehälters und von der Art des
verwendeten Rührers abhängt. Es ist dabei zu berücksichtigen, daß Anlagen für den
großtechnischen Betrieb für die allgemeine Produktion von Antibiotika gebaut und
im allgemeinen nicht für die Produktion eines besonderen Materials bestimmt sind.
Bei der Erzeugung von antibiotischen Substanzen durch Gärung mit S. vinaceus-drappus,
insbesondere bei der Herstellung von Antibiotikum D-13, wird die Temperatur der
gerührten Gärflüssigkeit zwischen 2o und 30°, vorzugsweise zwischen 2¢ und 28° gehalten.
-
Aus der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Gärflüssigkeit
können die darin enthaltenen antibiotischen Substanzen nach verschiedenen Methoden
gewonnen werden. Die erste Stufe bei der Gewinnung dieser Substanzen beruht vorzugsweise
auf der Abtrennung des Mycels von der Kulturflüssigkeit. Wenn insbesondere Antibiotikum
D-13 aus der Gärflüssigkeit gewonnen werden soll, so wird man die Abtrennung des
Mycels am besten so durchführen, daß man die Gärflüssigkeit beim p$, das am Ende
der Gärung vorliegt und gewöhnlich etwa 7 bis 8 beträgt, mit oder ohne Zuhilfenahme
eines Filters aus Diatomeenerde und eines im Handel erhältlichen Filtrierhilfsmittels
filtriert.
-
Das Antibiotikum D-13 kann durch Adsorption an ein Adsorptionsmittel,
z. B. an aktivierte Kohle (Tier-oder Holzkohle) oder an ein geeignetes Ionenaustauschharz,
aus der filtrierten Gärflüssigkeit isoliert werden. Wenn als Adsorptionsmittel aktivierte
Kohle verwendet wird, so kann die Adsorption beim natürlichen p$ der Gärflüssigkeit
(pH 7 bis 8) und bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Das Antibiotikum kann mit
wäßrigen, mit Wasser mischbaren Alkoholen und Ketonen, die mit einer Mineralsäure
auf ein pu von etwa 2 angesäuert sind, aus der Kohle eluiert werden. Man verwendet
vorzugsweise io°/oiges wäßriges, angesäuertes Aceton. Die Adsorption und die Eluierung
können schubweise oder durch kontinuierliche Chromatographie ausgeführt werden.
Nach Entfernung des eluierten Adsorptionsmittels kann das feste rohe Antibiotikum
D-13 durch Einstellung des p$ auf etwa 7 bis 8 und Trocknen aus dem gefrorenen Zustand
unter vermindertem Druck aus dem geklärten Eluat gewonnen werden. Zur Eluierung
des Antibiotikums D-13 aus Kationenaustauschharzen eignen sich wäßrige, angesäuerte,
mit Wasser mischbare Alkohole und Ketone sowie Salzlösungen.
-
Das Antibiotikum D-13 kann auch direkt und selektiv aus der filtrierten
Gärflüssigkeit bei einem pH von 7 oder darüber in gewisse neutrale, mit Wasser nicht
mischbare Alkohole, Ketone, halogenierte Kohlenwasserstoffe oder Ester, z. B. in
Butanole, Pentanole, Diäthylketon, Methylenchlorid, Äthylessigester, Amylessigester
usw., aufgenommen werden. Man verwendet vorzugsweise Butanol. Nach der Extraktion
des Antibiotikums D-13 mittels des mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels wird
die Lösung unter vermindertem Druck auf einen kleinen Bruchteil ihres Anfangsvolumens
eingeengt, worauf die so erhaltene konzentrierte Lösung mit verdünnter wäßriger
Säure extrahiert wird. Durch Abtrennung der wäßrigen sauren Phase und Einstellung
des pA auf etwa 7 bis g mittels Alkali wird die Abtrennung des Antibiotikums D-13
in Form eines festen Niederschlages bewirkt. Eine andere Methode, die sich zur Isolierung
des Antibiotikums aus dem Extrakt eignet, besteht darin, daß man das Lösungsmittel
durch azeotrope Destillation
entfernt, wobei riian nach Bedarf Wasser
zugibt, bis ein kleines Wasservolumen vorliegt, das eingefroren und aus dem gefrorenen
Zustand verdampft werden kann. Gemäß einer Variante dieser azeotropen Destillation
wird das erhaltene wäßrige Konzentrat mit einem Kristall des Antibiotikums angeimpft,
wodurch die direkte Kristallisation des Antibiotikums D-13 aus der wäßrigen Lösung
bewirkt wird. Das auf diese Weise erhaltene kristalline Produkt weist eine Aktivität
von 6oo bis goo M. avium-Einheiten auf. Dieses Produkt kann für gewisse Zwecke direkt
verwendet werden oder kann durch Umkristallisieren aus Wasser, Methanol und anderen
Lösungsmitteln in ein reineres Produkt übergeführt werden, wie dies im folgenden
noch ausführlich beschrieben wird.
-
Kristallisiertes Antibiotikum D-13 kann aus rohen amorphen Präparaten,
die eine Aktivität von 15o bis 400 M. avium-Einheiten aufweisen, erhalten werden,
indem man die wäßrige Lösung dieses Materials mit Butanol u. dgl. bei einem pu von
7,5 bis 9 extrahiert, die organische Phase abtrennt und die letztere mit verdünnter
Säure extrahiert, wodurch das Antibiotikum in die wäßrige saure Phase übergeführt
wird. Durch Einstellung des p$ dieser Lösung auf 7 bis 9 und Abkühlung wird die
Ausfällung des Antibiotikums D-13 in reinerer und kristalliner Form bewirkt. Eine
weitere Methode zur Erzielung von kristallinem Antibiotikum D-13 von hoher Reinheit
aus amorphem Material beruht auf dem _Gegenstromverteilungsprinzip von Craig, J.
Biol. Chem., 155, 519 (1944)- Das amorphe Antibiotikum wird zwischen Wasser und
Methylenchlorid oder Wasser und Butanol verteilt. Der Inhalt eines Teiles der Röhrchen
wird zur Trockne eingedampft. Durch Umkristallisation der Rückstände aus Wasser
oder verdünntem Methanol wird das Antibiotikum D-13 in hoher Reinheit erhalten.
-
Das Antibiotikum D-13 ist eine schwach basische Verbindung. Durch
Titrationen wurde festgestellt, daß das kristalline Material einen in der Nähe von
7 liegenden pKd Wert besitzt. Die hydratisierte kristalline freie Base ist in destilliertem
Wasser im Ausmaß von nur etwa o,1 °/o, in sauren Lösungen jedoch leicht löslich.
Das kristalline Hydrochlorid kann durch Lösen der freien Base in verdünnter Salzsäure,
Einengen der Lösung auf ein kleines Volumen unter vermindertem Druck und Ausfällung
des kristallinen Hydrochlorids durch vorsichtige Zugabe von Aceton oder eines Gemisches
von Methanol undAceton erhalten werden. Gemäß einer Variante kann man die wäßrige
Lösung des Hydrochlorids einfrieren und aus dem gefrorenen Zustand verdampfen. Das
erhaltene amorphe Produkt kann dann aus Methanol und Aceton kristallisiert werden.
Bei dieser Herstellungsweise wird das kristalline Hydrochlorid ebenfalls als Hydrat
erhalten. In ähnlicher Weise kann man auch andere Salze, z. B. das Acetat, Sulfat
usw., erhalten.
-
Bei der Kristallisation des Antibiotikums D-13 aus seinen wäßrigen
Lösungen oder aus etwas Wasser enthaltenden Lösungen wird im allgemeinen ein hydratisiertes
kristallines Produkt erhalten. Das wasserfreie Produkt läßt sich durch Trocknen
der hydratisierten Formen bei leicht erhöhten Temperaturen im Vakuum oder durch
Kristallisieren aus einem praktisch wasserfreien Lösungsmittel, wie z. B. absolutem
Methanol, leicht herstellen.
-
Die am meisten auftretenden Kristalle des Antibiotikums D-13 scheiden
sich aus wäßrigen oder vorwiegend wäßrigen Lösungen in Form sehr feiner Nadeln oder
Nadelbüschel. ab. Werden diese Kristalle auf einem Filter gesammelt, so greifen
sie eng ineinander unter Bildung eines glänzenden Filzes. Nach dem Trocknen in einem
Vakuumexsikkator über wasserfreiem Magnesiumperchlorat bei Raumtemperatur schmelzen
die hydratisierten Kristalleim Bereich von 16o bis 170°, je nach der Größe der Kristalle
und der Geschwindigkeit des Erhitzens. Die spezifische Drehung der hydratisierten
Kristalle in SA-Alkohol, einer Mischung aus 95 1>/o Äthanol und 5 % Methanol, beträgt
[d] 2D = + 143° (1,o1 °/o in SA-Alkohol). Dieser Wert verändert sich mit der Zeit
nicht, sondern bleibt konstant.
-
Bei der Bestimmung des Ultraviolettabsorptionsspektrums des kristallinen
Antibiotikums D-13 in wäßriger Lösung unter Verwendung eines Beckmannschen Quarzspektrophotometers
(Modell DU) oder eines Careyschen Spektrophotometers wird ein einziges Maximum von
EI, @m = 40o bei 304 mit beobachtet. Ein Minimum wird bei etwa 235 m,u beobachtet:
E,1 m = 148.
-
Die Herstellung des kristallinen Hydrochlorids des Antibiotikums D-13
wurde oben beschrieben. Dieses Produkt kann wie die freie Base entweder in der hydratisierten
oder der wasserfreien Form erhalten werden. Die hydratisierte Form, die die häufigste
ist, schmilzt bei 19o bis 192° und weist eine optische Drehung von [d] Zö = -!-
I17° (c=o,4in3A-Alkohol) auf.
-
Wasserfreie Kristalle der freien Base des Antibiotikums D-13 können
durch Umkristallisation der hydratisierten Kristalle aus praktisch wasserfreien
Lösungsmitteln, z. B. aus absolutem Methanol, oder durch Trocknen des hydratisierten
Produktes im Vakuum zwecks Entfernung des Kristallisationswassers erhalten werden.
Das wasserfreie Antibiotikum kann dann aus praktisch wasserfreiem Methanol umkristallisiert
werden. Die auf diese Weise hergestellten wasserfreien Kristalle des Antibiotikums
D-13 sind klein und dicht und schmelzen bei 243 bis 244°. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum
ist praktisch gleich demjenigen der hydratisierten Kristalle, abgesehen vom Hydratwasser.
Wird das Ultraviolettabsorptionsspektrum einer Probe des wasserfreien kristallinen
Antibiotikums D-13 mit dem Careyschen Spektrophotometer in verdünntem 5o°/oigem
wäßrigem Äthanol bestimmt, so beobachtet man ein einziges Maximum bei 3o6 my, E
; m = 512. Wird das Ultraviolettspektrum des gleichen Materials mit einer in einem
Gemisch von 50 °/o Äthanol und 5o °/o o,1 n-Natriumhydroxyd gelösten Probe bestimmt,
so beobachtet man die folgenden Maxima:
Bei Bestimmung des Spektrums unter Verwendung eines Gemisches von 50 % Äthanol und
5o °/o o, i n-Salzsäure wird ein einziges Maximum von E,11.1. = 451 bei 304 mir.
beobachtet.
Eine in flüssigem Petrolatum angemachte Suspension von
wasserfreiem kristallinem Antibiotikum D-13 weist viele charakteristische Absorptionsbanden
im infraroten Bereich auf. Von diesen Banden seien die folgenden, in cm-' ausgedrückt,
angeführt: 3405, 3230, 1684, 1614, 1567, 1522, 1491, 1252, 1176, 1104, 1072,
1046, xoig, 855, 790, 758 und 692. Das-Infrarotabsorptionsspektrum dieser Suspension
im Bereich der Wellenlängen von 175o bis 70o cm-' ist in Fig. i der Zeichnung dargestellt.
-
Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Suspension des freien Antibiotikums
D-13 in flüssigem Petrolatum weist individuelle Banden bei etwa 3405 und
3250 cm-'
auf, die für 0-H- und N-H-Gruppen charakteristisch sind.
Die Banden bei etwa 2goo, 1380 und 146o cm-' rühren vom flüssigen Petrolatum, einem
Petroleumgelee, her. Die Banden bei 1684, 1654, 1614, 1567, 1522 und 1491 cm-' sind
für ein monosubstituiertes Amidcarbonyl, ein konjugiertes Carbonyl oder ein System
konjugierter Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen charakteristisch. Bei etwa
1252, 1176, 1104, 1072 und 1046 cm-' sind Banden vorhanden, die auf C-0- oder C-O-C-Bindungen
zurückzuführen sind. Die Banden bei 692, 758 und 790 cm-' weisen auf einen
mehrfach substituierten aromatischen Kern hin.
-
Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Suspension von kristallinem
Antibiotikum D-13-hydrochloridhydrat in flüssigem Petroleumgelee (Petrolatum) weist
ebenfalls zahlreiche charakteristische Banden auf, z. B. . die folgenden: 3290,
i7oo,1685,1637,16o6;1523,1480, 1251, 1190, 1105, xogo, 1o63, 1037, 938, 791 und
76o cm-1. Das Infrarotspektrum des Chlorhydrates des Antibiotikums D-13 im Bereich
der Wellenlängen von 175o bis 700 cm-' ist in Fig. 2 gezeigt.
-
Das Infrarotabsorptionsspektrum einer Suspension von kristallisiertem
Chlorhydrat-Hydrat von Antibiotikum D-13 in flüssigem Petroleumgelee (Petrolatum)
weist eine allgemeine Absorption im Bereich von 360o bis 2500 cm-' auf, wobei
ein einzelnes Band bei etwa 3290 cm-' sichtbar ist. Die Banden bei etwa 290o,
1380 und 146o cm-' sind auf die Infrarotabsorption des flüssigen Petroleumgelees
(Petrolatum) zurückzuführen. Die bei 17oo,1685,16o6,1523 und 1480 cm-' vorhandenen
Banden sind für ein monosubstituiertes Amidcarbonyl, ein konjugiertes Carbonyl oder
ein System von konjugierten Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen charakteristisch.
Die Banden bei 1251, 1190, 1105, 1090, 1o63 und 1o37 cm-' sind wahrscheinlich auf
C-0- oder C-O-C-Bindungen zurückzuführen. Es sind ferner Banden bei 76o und 791
cm-' vorhanden, die wahrscheinlich auf einen mehrfach substituierten aromatischen
Kern zurückzuführen sind. Weitere Banden von ungewisser Herkunft sind über das ganze
Spektrum an verschiedenen Stellen verteilt.
-
Die oben angeführten physikalischen Eigenschaften zeigen deutlich,
daß das Antibiotikum D-13 von allen bekannten und bisher identifizierten Antibiotika
verschieden ist.
-
In den folgenden Beispielen wird gezeigt, wie das Antibiotikum D-13
erzeugt, gewonnen, konzentriert, gereinigt, kristallisiert und identifiziert werden
kann. Diese Beispiele tragen ausschließlich erläuternden Chaxakter und sollen in
keiner Weise die Erfindung einschränken. Zur Herstellung des Antibiotikums D-13
wurden Stämme von Streptomyces vinaceus-drappus, die mit D-12 und D-13 bezeichnet
werden, verwendet. Beispiel i Darstellung des Antibiotikums D-13 Fünf Erlenmeyerkolben
von xoo cm3 Inhalt wurden je mit xoo cm3 eines Mediums aus Pepton, Glucose und Hefeextrakt
gefüllt und während 15 Minuten bei i20° im Autoklav behandelt. Nach erfolgter Abkühlung
wurde jeder Kolben mit einer Öse voll einer Sporensuspension von S. vinaceus-drappus,
die aus einem aus Casein, StärkeundAgar bestehenden Schrägagar erhalten worden war,
beimpft und während 48 Stunden bei 24° auf einer Schüttelvorrichtung, die mit einer
Geschwindigkeit von neunzig Ausschlägen von 1o cm Länge je Minute hin und her bewegt
wurde, der Inkubation unterworfen. Erlenmeyerkolben wurden mit je xoo cm3 des folgenden
Mediums gefüllt:
| Medium I Gramm |
| Glukosemonohydrat (Cerelose) ..... . .. 25,0 |
| Hefe (2oig) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2,5 |
| Ammoniumsulfat ................... 5,0 |
| Calciumcarbonat .................... 8,o |
| Kaliumchlorid ............ . ........ 4,0 |
| Kaliumphosphat .................... 0,4 |
| Sojabohnenmehl . . . . . . . . . : . . . . . . . . . . 7,0 |
| Destilliertes Wasser zum Auffüllen auf |
| xooo cm3 |
Die gefüllten Kolben wurden während 2o Minuten bei 12o° sterilisiert, dann abgekühlt
und je mit 5 cm3 des 48stündigen vegetativen Impfmaterials geimpft. Die Kolben wurden
hierauf auf einer hin und her bewegten Schüttelvorrichtung bei 24° der Inkubation
unterworfen. Nach Ablauf von 5 Tagen wies das Filtrat der Kulturflüssigkeit ein
p$ von
6,95 und eine Aktivität von
520 M. avium-Einheiten je cm3 auf.
Beispiel 2 Bildung und Gewinnung des Antibiotikums D-13
| Medium I Gramm |
| Gelber Farinzucker . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1o |
| Glycerin ........................... 5 |
| Lactose ............................ 5 |
| Dextrin ............................ 5 |
| Hefe (201g) . . .. .. . ..... . . . . ...... .. 2 |
| Curbay B. G. (bei der Gärung von |
| Alkohol gewonnener Rückstand) ..... 2 |
| Destillationsrückstände (SVP) ........ 5 |
| Ammoniumnitrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 |
| Maiseinweichflüssigkeit ............. 2 |
| Calciumcarbonat .................... 4 |
| Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5 |
| Destilliertes Wasser zum Auffüllen auf |
| 100 cms |
21;'@ 1 dieses Mediums wurden in Mengen von roo cm3 auf firlenmeyerkolben
von
500 cm3 Inhalt verteilt und während 2o Minuten bei i2o° sterilisiert.
Nach erfolgter Abkühlung wurden die Kolben je mit 5 cm3 eines in der im Beispiel
i beschriebenen Weise hergestellten vegetativen S. vinaceus-drappus enthaltenden,
48stündigen Impfmediums geimpft. Nach einer Inkubation von 5 Tagen bei 24' auf einer
hin und her bewegten Schüttelvorrichtung wurde die Kulturflüssigkeit durch einen
Bausch von Diatomeenfiltererde (Supercel) filtriert, um das Mycel zu entfernen,
wobei 125o cm3 eines dunkelbraunen Filtrates erhalten wurden, das ein p. von 7,5
und eine Aktivität von etwa 470 M. avium-Einheiten aufwies. iooo cm3 der filtrierten
Kulturflüssigkeit wurden ohne Änderung des pl, zweimal mit je 5oo cm3 n-Butanol
extrahiert, die vereinigten Butanolextrakte wurden durch Filtrieren durch einen
Bausch von Diatomeenfiltererde (Supercel) hindurch geklärt und im Vakuum zum Trocknen
eingedampft. Der Destillationsrückstand wurde in ro cm3 Wasser gelöst und aus dem
gefrorenen Zustand getrocknet, wodurch 1,232 g eines festen gelben Produktes erhalten
wurde, das eine Aktivität von 335 M. avium-Einheiten je Milligramm aufwies.
-
Bei Extraktion der Kulturflüssigkeit mit Pentanol, Diäthylketon, Äthylessigester,
Amylacetat oder Methylenchlorid wird das Antibiotikum D-13 in der organischen Phase
erhalten. Beispiel 3 Bildung des Antibiotikums D-13
| Medium Gramm |
| Dextrin ............................ 20,0 |
| Hafermehl.......................... 20,0 |
| Kaliumdiphosphat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 |
| Ammoniumsulfat ................... 10,0 |
| Kaliumchlorid ...................... 4,0 |
| Galciumcarbonat .................... 16,o |
Destilliertes Wasser zum Auffüllen auf iooo cm3 Dieses Medium wurde in Anteilen
von Zoo cm3 auf Erlenmeyerkolben von 5oo cm3 Inhalt verteilt und während 2o Minuten
bei 12o° im Autoklav behandelt. Den abgekühlten Kolben wurden je 5 cm3 eines in
der im Beispiel i beschriebenen Weise hergestellten 48stündigen, vegetativen, S.
vinaceus-drappus enthaltenden Impfmediums zugesetzt. Die Kolben wurden hierauf zwecks
Inkubation auf einer hin und her bewegten Schüttelvorrichtung bei 24° geschüttelt.
Nach 4 Tagen wurde die Kulturflüssigkeit filtriert, wobei ein Kulturfiltrat erhalten
wurde, das ein pl, von 7 und eine Aktivität von 61o 1I. avium-Einheiten je Kubikzentimeter
aufwies. Beispiel 4 Bildung und Gewinnung des Antibiotikums D-13 Eine Schüttelflasche
von in der im Beispiel i beschriebenen Weise hergestellten S. vinaceus-drappus-Impfmedium
wurde zur Beimpfung eines Gärbehälters, der 12 1 eines Ochsenfleische xtralct-Pepton-Mediums
der folgenden Zusammensetzung enthielt und ein Fassungsvermögen von rg 1 aufwies,
verwendet.
| Medium I Gramm |
| Glucose ............................ 10 |
| Pepton (der Difco Labs Detroit USA) . 6 |
| Ochsenfleischextrakt (der Difco Labs |
| Detroit USA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . io |
| Natriumchlorid................... . . . 6 |
| Leitungswasser zum Auffüllen auf |
| iooo cm3 |
Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von 61 je Minute zugeführt. Der Rührer wurde
mit einer Geschwindigkeit von 28o Umdrehungen je Minute angetrieben.
-
Nach 48stündiger Inkubation bei 24° wurde der Inhalt des Gärbehälters
zur Beimpfung eines Tanks von 3781 Fassungsvermögen, der 240 1 des im Beispiel 2
beschriebenen Mediums enthielt, verwendet. Vor der Impfung wurden der Tank und sein
Inhalt durch Erhitzen während 2o Minuten bei 12o° sterilisiert. Während der Gärung
wurde die Temperatur auf 26° gehalten, wobei Luft zugeführt und gerührt wurde. Nach
88 Stunden wurde die Gärung unterbrochen. Die Kulturflüssigkeit wies ein pH von
7,9
und eine Aktivität von 153 M. avium-Einheiten je Kubikzentimeter auf.
-
Die Kulturflüssigkeit wurde zwecks Entfernung des Mycels filtriert,
worauf das Filtrat mit '/,Volumen n-Butanol ohne Veränderung des pl, unter Verwendung
eines Podbielnialextraktors extrahiert wurde. Der Butanolextrakt wurde durch azeotrope
Destillation zu einer wäßrigen Lösung eingeengt, die eingefroren und aus dem gefrorenen
Zustand eingedampft wurde, wobei 56 g eines dunklen Pulvers erhalten wurden, das
eine Aktivität von etwa Zoo M. avium-Einheiten je Milligramm aufwies.
-
5o g des rohen Präparates wurden mit Zoo cm3 Wasser aufgerührt. Das
Gemisch wurde auf ein pl, von g eingestellt und mit vier Portionen von je Zoo cm3
von mit Wasser gesättigtem n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte
wurden durch Filtrieren durch einen Bausch von Diatomeenfiltererde (Supercel) hindurch
geklärt und mit fünf Portionen von je Zoo cm3 o,i n-Salzsäure extrahiert. Die vereinigten
wäßrigen Extrakte wurden durch Verwendung von 7,5 g Darco-G-6o entfärbt, worauf
das pH der Lösung durch Zugabe von N atriumhydroxydlösung auf 8,6 eingestellt wurde.
Nach Abkühlung im Kühlschrank während i5 Stunden wurde die erste Ausbeute an Kristallen
gewonnen, die nach dem Waschen mit Wasser und dem Trocknen ein Gewicht von 4,34
g aufwiesen. Die Mutterlauge wurde auf etwa 75 cm3 eingeengt. Beim Abkühlen wurde
eine zweite Ausbeute von 2,52 g Kristallen erhalten. Die Kristalle waren nahezu
weiß und wiesen eine Aktivität von goo M. avium-Einheiten je Milligramm auf.
Beispiel
5 Gewinnung des Antibiotikums D-13 aus Kulturflüssigkeit durch Adsorption Zoo cm3
von Antibiotikum D-13 enthaltender Kulturflüssigkeit, die durch einen Bausch von
Diatomeenfiltererde (Supercel) hindurch filtriert worden war, wurden mit 2 g Aktivkohle
während 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und der
Kohlenkuchen für die Eluierung beiseite gelegt. Prüfungen ergaben, daß die filtrierte
Kulturflüssigkeit vor der Behandlung mit Kohle etwa 400 Einheiten je Kubikzentimeter
und nach der Behandlung mit Kohle etwa 5o Einheiten jeKubikzentimeter enthielt.
Zwecks Eluierung wurde der Kohlekuchen in 5o cm3 1o°/,igem Aceton suspendiert und
das p" der Suspension mit 6 n-Salzsäure auf 2 eingestellt. Die Suspension wurde
während 20 Minuten gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde neutralisiert und
aus dem gefrorenen Zustand zur Trockne eingedampft. Es wurden 158 mg eines nahezu
weißen Pulvers erhalten, das eine Aktivität von 7o M. avium-Einheiten j e Milligramm
aufwies.
-
Eine ähnliche Aktivitätserhöhung wird bei Verwendung in ähnlicher
Weise des Kationenaustauschharzes IRC-5o erzielt.
-
Beispiel 6 Herstellung von kristallinem Antibiotikum D-13 durch Gegenstromverteilung
5oo mg eines in der im Beispiel 2 beschriebenen Weise hergestellten amorphen Präparates,
das eine Aktivität von 420 Einheiten je Milligramm aufwies, wurden in
50 cm' Wasser gelöst. Die Lösung wurde unter Verwendung von fünf Scheidetrichtern
und gleichen Volumina Wasser und Methylenchlorid einer Gegenstromverteilung unterworfen.
Das Methylenchlorid wurde aus den einzelnen Röhren abgedampft, worauf die erhaltene
wäßrige Lösung auf ihre Aktivität und ihren Gehalt an Feststoff hin geprüft wurde.
Die aus dem Trichter Nr. 1 erhaltene Lösung wurde eingefroren und aus dem gefrorenen
Zustand zur Trockne eingedampft, wodurch 69 mg eines weißen Pulvers erhalten
wurden. Ein Teil dieses Pulvers (39 mg) wurde in 5,5 cm3 Wasser durch Rühren und
Erwärmen auf 55° gelöst. Die Lösung wurde filtriert. Beim Abkühlen des Filtrates
schieden sich feine farblose Nadeln ab, die nach erfolgter Trocknung ein Gewicht
von 13,3 mg aufwiesen. Dieses kristalline Produkt wies eine Aktivität von 1240 M.
avium-Einheiten je Milligramm auf. -Beispiel Gewinnung von Antibiotikum D-13 aus
Kulturflüssigkeit durch Extraktion und Kristallisation aus dem Extrakt 21o 1 Antibiotikum
D-13-Gärungsflüssigkeit wurden ohne Verwendung eines Filterhilfsmittels filtriert.
Das Filtrat wurde bei einem pH von 7,2 unter Verwendung von -n-Butanol im Verhältnis
von 5 : 1 von Gärungsflüssigkeit zu Lösungsmittel in einem Podbielniakextraktor
extrahiert. Der Butanolextrakt wurde durch azeotrope Destillation im Vakuum auf
ein Volumen von 180o cm3 eingeengt. Die Lösung wurde mit kristallinem Antibiotikum
D-13 geimpft. Nach mehrtägiger Kühlung wurden zwei Ausbeuten von insgesamt
8,74 g rohen Kristallen erhalten. Praktisch reines kristallines Antibiotikum
D-13 wurde durch Umkristallisieren der rohen Kristalle aus verdünntem wäßrigem Methanol
erhalten. Das umkristallisierte Material wies eine Aktivität von i:o2o M. avium-Einheiten
je Milligramm auf. Die Elementaranalyse einer Probe dieses kristallinen Antibiotikum
D-13-hydrates ergab die folgenden Analysenwerte: Kohlenstoff ....................
56,g1 11/0 Wasserstoff . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6,97 °/o Stickstoff.
.. . . . .. . . . . . ... . . . . . . . 13,51 (Ja Sauerstoff (Differenz) . . . .
. . . . . . . . 22,61 °/" Beispiel 8 Herstellung von wasserfreiem kristallinem Antibiotikum
D-13 Eine Probe von 4,88 g der kristallwasserhaltigen Kristalle des Antibiotikums
D-13 (von Beispiel 7) wurde zweimal aus Methanol und Wasser umkristallisiert, wobei
3,7 g des reinen Hydrates erhalten wurden. Die kristallwasserhaltigen Kristalle
wurden in 25 bis 30 cm3 wasserfreiem Methanol bei etwa 35° gerührt, bis die
Kristalle nahezu vollständig gelöst waren. Die Wände des Kolbens wurden mit einem
Glasstab gekratzt, wodurch die Abscheidung der wasserfreien Kristalle (2,3q. g)
bewirkt wurde. Die dichten, körnigen Kristalle wiesen in einem Koflerblock einen
Schmelzpunkt von 238 bis 24o° und eine Aktivität von 1o25 14I. avium-Einheiten je
Milligramm auf. Beim Erhitzen bei 6o° im Hochvakuum über wasserfreiem Magnesiumperchlorat
erlitten diese Kristalle einen Gewichtsverlust von weniger als o,i °/o.
-
Bei Verwendung des Materials von Beispiel 4 wurde in ähnlicher Weise
kristallisiertes Antibiotikum D-13 vom Schmp. 243 bis 244° erhalten.
-
Beispiel 9 Herstellung des kristallisierten Chlorhydrates von Antibiotikum
D-13 1,88 g kristallwasserhaltige Kristalle von Antibiotikum D-13 wurden in Zoo
cm3 o,o5 n-Salzsäure gelöst. Die Lösung wurde filtriert und aus dem gefrorenen Zustand
zur Trockne eingedampft. Das trockene Pulver wurde in io cm3 Methanol, 8 cm' Wasser
und 2 cm3 o,o5 n-Salzsäure gelöst. Insgesamt Zoo cm3 Aceton wurden tropfenweise
zugesetzt, wodurch die Abscheidung von Kristallen bewirkt wurde. Nach Kühlung über
Nacht im Kühlschrank wurden die Kristalle aufgenommen und aus dem gleichen Lösungsmittelgemisch
umkristallisiert. Es wurden 1,77 g feiner weißer Kristalle erhalten, die einen Schmp.
von 1go bis 192° und eine Aktivität von goo M. avium-Einheiten je Milligramm aufwiesen.
Beim Trocknen bei 6o° über einem Trockenmittel im Hochvakuum erlitt dieses Präparat
ebnen Verlust von 13,8 °/o seines Gewichtes.
-
Das Verhältnis von Aktivität zu Toxizität des Antibiotikums D-13 ist
verglichen mit demjenigen anderer Antibiotika sehr günstig. Bei der Prüfung gegen
den virulenten menschlichen Stamm des Tuberkelbazillus
lI. tuberculosis
H 37 Rv erweist sich das Antibiotikum D-13 aktiver als Streptomycin oder Viomycin.-
Bei Versuchstieren ist das Antibiotikum D-13 in vernünftigem Ausmaß frei von toxischen
Nebenreaktionen. Tägliche Dosen von qoo mg je Kilogramm Körpergewicht wurden über
eine Periode von 14Tagen subkutan an Mäuse verabreicht, ohne daß eine toxische Reaktion
hätte beobachtet werden können.