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Verfahren zur Gewinnung von Bacitracin Die Erfindung betrifft Verbesserungen
bei der Gewinnung des Antibiotikums Bacitracin. Sie betrifft vor allem die Extraktion
dieses Antibiotikums aus Fermentationsflüssigkeiten, in denen es gebildet wurde,
und zwar besonders aus solchen, die komplexe organische Stcffe enthalten.
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Bacitracin kann bekanntlich durch Züchtung bestimmter Organismen der
B.subtiles-Gruppe in geeigneten Nährflüssigkeiten erzeugt werden. Es können zwar
verschiedenartige Nährmedien zu diesem Zweck verwendet werden, doch ist häufig die
Verwendung solcher Nährmedien, die komplexe organische Stoffe, insbesondere als
Stickstoffquellen, enthalten, zweckmäßig. Beispiele für derartige Stoffe sind Fleischbrühe,
Trypton und Sojabohnenmehl. Es können jedoch auch synthetische Medien zur Erzeugung
des Antibiotikums verwendet werden.
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Nach der Fermentation ist es nötig, das Antibiotikum aus der Gärflüssigkeit
zum Zwecke der weiteren Reinigung zu extrahieren. Diese Extraktion soll eine möglichst
hohe Ausbeute ergeben, wobei es erwünscht ist, eine Arbeitsweise anzuwenden, die
unter Berücksichtigung der großen Volumen der Flüssigkeit, die bei der technischen
Herstellung hantiert werden müssen, sowie der häufig komplexen Natur derselben einfach
durchführbar ist. Bacitracin ist außerdem unter bestimmten Bedingungen in Lösung
offenbar in einem gewissen Grade instabil, weshalb ein Extraktionsverfahren anzustreben
ist, bei welchem ein möglichst geringer Abbau des Antibiotikums erfolgt.
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Es ist bereits bekannt, Bacitracin durch Adsorption an Aktivkohle
aus der Gärmaische zu gewinnen. Obwohl eine derartige Arbeitsweise auf andere Antibiotika
mit gutem Erfolg angewandt werden kann, hat die Erfahrung gezeigt, daß es außerordentlich
schwierig ist, eismal an Kohle adsorbiertes Bacitracin wieder zu desorbieren. Auf
diesen mit der Verwendung von Aktivkohle als Adsorbens verbundenen Nachteil ist
bereits in der USA.-Patentschrift 2 457 887 hingewiesen. Bei dem in der USA.-Patentschrift
2 567 698 beschriebenen Verfahren zurBacitracinerzeugung wird das in der Gärmaische
enthaltene Bacitracin ebenfalls an Aktivkohle adsorbiert, das Adsorbat jedoch mit
einem Zweiphasengemisch aus einer wäßrig sauren Lösung und einem inerten organischen
Lösungsmittel eluiert und damit dei Versuch gemacht, die obenerwähnten, bei der
Desorption des Bacitracins auftretenden Schwierigkeiten zu überwinden.
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Aktivkohle übt nun aber bekanntlich eine unselektive Adsorptionswirkung
aus, so daß es nicht möglich ist, eine bestimmte Klasse von chemischen Substanzen
adsorptiv zu erfassen. Es können sowohl Säuren und Basen als auch neutrale Substanzen
an Aktivkohle adsorbiert werden, wobei das Adsorptionsvermögen der Kohle für alle
diese Substanzen weitgehend vom Molekulargewicht und der tatsächlichen Struktur
abhängt. Die unter Verwendung von Aktivkohle als Adsorbens für Bacitracin gewonnenen
Produkte enthalten daher auch geringere Mengen an Wirksubstanz und weisen eine höhere
Toxizität auf, als wünschenswert ist.
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Auch durch Veiwendung von Zeolithen als Adsorbentien für Bacitracin,
wie sie in der USA.-Patentschrift 2 582 921 beschrieben ist, ist es nicht möglich,
reinere Produkte zu erzielen. Diesei Umstand ist wohl darauf zurückzuführen, daß
auch die Zechthe einen ziemlich weiten Bereich chemischer Substanzen zu adsorbieren
vermögen, weil sich die aktiven Zentren vieler dieser Kieselerden nicht wesentlich
von den aktiven Zentren der Aktivkohle unterscheiden. Bei der Adsorption von Bacitiacin
an Aktivkohle wird eine saure Lösung des zu adsorbierenden Materials verwendet,
um eine gute Koagulation der basischen Eisen- oder Aluminiumsalze der Eiweißsubstanzen,
die bei einer Fermentation unvermeidlich sind, zu erzielen. Als p11-Wert für die
zur Adsorption gelangenden Lösungen wird in der genannten Patentschrift ein wert
von 2,5 angegeben.
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Es wurde nun ein neues und verbessertes Verfahren zur Gewinnung von
Bacitracin aus dieses enthaltenden Gärflüssigkeiten durch Adsorption und Elution
aus dem Adsorbat gefunden, wobei als Adsorbens ein für Bacitracin durchlässiges
carboxylgruppenhaltiges Kationenaustauscherharz im Wasserstoffzustand verwendet
und bei einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 7 gearbeitet wird. Dieses neue Verfahren
stellt eine einfache und zweckmäßige Arbeitsweise zur Gewinnung von Bacitracin in
hohen Ausbeuten insbesondere aus komplexe organische Stoffe enthaltenden Gärflüssigkeiten
dar.
Durch das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ionenaustauscherharz
wird bei der Adsorption eine größere Selektivität erreicht als mit Aktivkohle und
Zeolithen. Dieser Umstand ist insofern überraschend, als das Bacitracin innerhalb
des angegebenen p$-Bereichs offenbar als Zwitterion reagiert und nicht angenommen
werden konnte, daß es auf Grund seiner innerhalb des Moleküls selbst kompensierten
Ionenladungen selektiv adsorbiert wird. Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren
als Endprodukt erhaltene Bacitracin besitzt eine Wirkungsstärke im Bereich von 50
bis 70 Internationalen Einheiten/mg und eine Toxizität (LD") von etwa 30 000 Einheiten/kg.
Mit diesen Eigenschaften ist es dem bei dem Verfahren der USA.-Patentschrift 2 582
921 erhaltenen Produkt überlegen, das eine Wirkungsstärke von nur 40 bis 50 Internationalen
Einheiten/mg und eine Toxizität (LD") von 25 000 Einheiten/kg aufweist. Diese Zahlen
lassen erkennen, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren höhengereinigte Produkte
mit besseren pharmakologischen Eigenschaften als bei den bekannten Verfahren erzielt
werden.
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Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Ionenaustauscherharze
sind solche, deren Ionenaustauschvermögen im wesentlichen auf dem Vorhandensein
von Carboxylgruppen beruht. Derartige Harze werden zweckmäßig als carboxylgruppenhaltige
Harze bezeichnet. Als geeignete Harze dieser bekannten Art können beispielsweise
die vernetzten Polyacrylsäure- und Polymethacrylsäuretypen, z. B. divinylbenzolvernetzte
Polyacrylsäureharze, genannt werden. Beispielsweise können die als IRC-50-Harz und
ER 130 im Handel erhältlichen Harze mit zufriedenstellenden Ergebnissen verwendet
werden. Das Harz soll vorzugsweise zu dem Hochkapazitätsperltyp gehören. Da Bacitracin
ein verhältnismäßig großes :Molekül hat, ist ein Harz mit hochgradiger Vernetzung
nicht geeignet; in diesem Fall kann das Bacitracin die Poren des Harzes nicht durchdringen
und reagiert nur mit den funktionellen Gruppen an der Außenfläche des einzelnen
Harzteilchens. Aus diesem Grunde wird vorzugsweise ein Harz verwendet, das für Bacitracin
durchlässig ist. Ob ein bestimmtes Harz für Bacitracin durchlässig ist, kann durch
dem Fachmann geläufige Vorversuche ermittelt werden. Beispielsweise kann man in
Vorversuchen die Adsorption von Bacitracin an das Harz prüfen und aus der Menge
des unter den weiter unten beschriebenen Bedingungen adsorbierten Antibiotikums
auf die Brauchbarkeit des Harzes schließen. Wenn diese Menge nur gering ist, dann
kann angenommen werden, daß das Harz eine zu geringe Porengröße besitzt und deshalb
nicht geeignet ist. Bei Verwendung eines solchen weniger geeigneten Harzes bei dem
erfindungsgemäßen Verfahren wird zwar eine gewisse Menge an Bacitracin gewonnen,
doch ist das Verfahren nur sehr wenig wirksam.
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Die Adsorption an dem Harz erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert
im Bereich von 3,5 bis 5,5, wobei der optimale Wert bei 4,5 liegt.
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Die Adsorption des Bacitracins wird am zweckmäßigsten in der Weise
durchgeführt, daß man die Gärflüssigkeit durch eine Harzsäule leitet, doch ist es
auch möglich, die Gärflüssigkeit einfach mit dem Harz zu vermischen und das Harz,
das das adsorbierte Bacitracin trägt, aus der Mischung abzutrennen. Im allgemeinen
wird jedoch die Gärflüssigkeit vorzugsweise geklärt, beispielsweise durch Filtrieren
oder Zentrifugieren unter oder ohne Koagulation der Gärflüssigkeit, die beispielsweise
durch Zugabe von Eisen(III)-chlorid vor Anwendung des Harzes erfolgen kann; diese
Stufe kann aber durch Aufbringen der Gärflüssigkeit auf das Harz in einer Säule
in einem von unten nach oben geführten Fluß umgangen werden. Im letzteren Falle
ist eine vollständige Klärung der Gärflüssigkeit nicht erforderlich, da die Klärung
gewöhnlich zur Entfernung größerer Teilchen dient.
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Die Einstellung des p,1-Wertes der Gärflüssigkeit kann in beliebiger
Weise erfolgen, b3ispielsweise mittels Phosphorsäure oder Schwefelsäure.
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Wenn das Harz im Wasserstoffzustand vorliegt, ist im allgemeinen ein
Vorwaschen desselben mit Pufferlösung bei dem pH-Wert, bei welchem die Adsorption
erfolgen soll, nicht nötig, da das Harz durch Aufbringen der Gärflüssigkeit sehr
rasch den richtigen p11-Wert annimmt. In Fällen, wo das Volumen der zu behandelnden
Gärflüssigkeit verhältnismäßig klein ist, kann das Vorwaschen des Harzes mit der
Pufferlösung bei dem ExtraktionspH-Wert zweckmäßig sein.
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Wenn eine Bacitracingärflüssigkeit unter diesen Bedingungen durch
(,ne Harzsäule geleitet wird, dann wird festgestellt, daß die austretende Flüssigkeit
anfänglich kein Bacitracin enthält. Bei weiterem Durchleiten der Gärflüssigkeit
erfolgt ein Durchbruch der Bacitracinaktivität in einer geringen Höhe, der allmählich
zu-nimmt, bis die Konzentration an Bacitracin in der austretenden Flüssigkeit
derjenigen in der zugeführten Gärflüssigkeit gleich ist. Es ist besonders für das
Arbeiten im großen Maßstab zweckmäßig, diese Erscheinung durch den Betrieb von zwei
Säulen in Serie auszunutzen. Dadurch wird der Durchbruch aus der ersten Säule an
der zweiten Säule adsorbiert, und die Adsorption kann so lange fortgesetzt werden,
bis Bacitracin in der aus der zweiten Säule austretenden Flüssigkeit aufzutreten
beginnt. Zu diesem Zeitpunkt kann die erste Säule abgeschaltet, mit Wasser gewaschen
und eluiert werden, während eine dritte Säule an die zweite Säule angeschlossen
wird, die dann ihrerseits zur Aufnahme reicher Gärflüssigkeit dient. In dieser Weise
können beträchtlich höhere Beladungen ohne Verlust in der verbrauchten Gärflüssigkeit
auf das Harz aufgebracht werden.
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Die Geschwindigkeit, mit welcher die Gärflüssigkeit durch das Harz
geleitet wird, kann innerhalb weiter Grenzen schwenken. Es wurde jedoch gefunden,
daß bei höheren Fließgeschwindigkeiten das Ausmaß an Durchbruch in der austretenden
Flüssigkeit erhöht wird und es zweckmäßig ist, die Adsorption so langsam, wie dies
praktisch durchführbar ist, vorzunehmen. Eine zweckmäßige Fließgeschwindigkeit liegt
bei einer Geschwindigkeit von zwei Harzbettoberflächenvolumen je Stunde. Beim Arbeiten
in großem Maßstab, wo beispielsweise Fermentationsgefäße von etwa 23 0001 Fassungsvermögen
verwendet werden, kann jede Säule in der Reihe zweckmäßig 0,84 m3 Harz enthalten,
und die Gärflüssigkeit kann mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 17001/Std. durchgeleitet
werden. Unter den genannten speziellen Bedingungen wird gewöhnlich gefunden, daß
der Durchbruch aus der ersten Säule nach dem Durchgang von etwa 90001 beginnt und
daß bei Anwendung der Serienarbeitsweise insgesamt etwa 23 0001 durchgesetzt werden
können, ehe die Aktivität in der austretenden Gärflüssigkeit eine unwirtschaftliche
Höhe erreicht.
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Im allgemeinen ist es zweckmäßig, das mit Bacitracin beladene Harz
vor der Elution zu waschen, beispielsweise durch Durchleiten von Wasser durch eine
derartige Harzsäule, bis die Waschflüssigkeiten klar und farblos sind.
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Die Elution des Bacitracins kann in einfacher und zweckmäßiger Weise
mit einer verdünnten wäßrigen sauren oder alkalischen Lösung erfolgen, wobei darauf
zu achten ist, daß die Verwendung solcher Lösungen, in denen Bacitracin instabil
ist, vermieden wird. So ist es beispielsweise bekannt, daß durch verdünnte starke
Mineralsäuren, z. B. Salzsäure, eine Inaktivierung von Bacitracin hervorgerufen
wird, weshalb derartige Lösungen im allgemeinen zur Elution nicht geeignet sind.
Man
kann jedoch wäßrige starke Mineralsäuren verwenden, unter der Voraussetzung, daß
die Säurekonzentration verhältnismäßig niedrig ist und sie in Mischung mit einem
mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Aceton oder Propanol, zur Zürückdrängung
der Ionisation angewandt wird. So hat sich beispielsweise 1 n-wäßrige Salzsäure
nicht als geeignete Elutionslösung erwiesen, während eine 1 n 60 °/o Aceton enthaltende
wäßrige Salzsäurelösung verwendbar ist und bei der Elution eine Ausbeute von 60
bis 80 °/o erreichen läßt. Wäßrige schwache Säuren und sehr verdünnte Lösungen starker
Säuren können jedoch verwendet werden. Es ist selb3tverständlich, daß in allen Fällen,
wo Säurelösungen zur Elution verwendet werden, diese Lösungen keinen pH-Wert im
Bereich von 3 bis 7 haben sollen, da dies der Bereich ist, in welchem die Adsorption
stattfindet. Wenn alkalische Elutionsmittel verwendet werden, ist es im allgemeinen
zweckmäßig, auf Grund der Harzquellung wenigstens so lange eine Arbeitsweise mit
von unten nach oben geführtem Fluß anzuwenden, bis kein weiteres Quellen des Harzes
mehr erfolgt. Wäßriges Ammoniak hat sich besonders, und zwar zweckmäßig in einer
Konzentration von 2 n, als sehr geeignetes Eluierungsmittel erwiesen. Bei der Verwendung
von wäßrigem Ammoniak als Eluierungsmittel ist es besonders zweckmäßig, die Eluierungsflüssigkeit
kontinuierlich von unten nach oben durch das Adsorbat im Umlauf zu halten, während
man kontinuierlich Ammoniak, vorzugsweise als konzentrierte wäßrige Lösung, dem
System zuführt. Der Umlauf des Eluierungsmittels und die Einführung von Ammoniak
werden bei einer derartigen Arbeitsweise vorzugsweise so lange fortgesetzt, bis
der pH-Wert des Eluierungsmittels etwa 10 erreicht. Durch dieses Umlaufverfahren
werden lokale hohe pH-Werte und lokale Erhitzungen auf Grund der Reaktionswärme
praktisch vermieden und die Verluste an Bacitracin di.rch Inaktivierung vermindert.
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Die weitere Aufarbeitung der Eluate zu Bacitracin kann in beliebiger
geeigneter Weise vorgenommen werden. Als wichtiger Punkt sei hierbei erwähnt, daß
das Bacitracin unabhängig vom Elutionsmittel zur Zersetzung neigt, wenn das Eluat
stehengelassen wird. Es ist deshalb vorzuziehen, das Bacitracin aus dem Eluierungsmittel
möglichst bald nach der Elution aus der Säule zu extrahieren. Gemäß einem Aufarbeitungsverfahren
wird das wäßrige Eluat mit einem organischen Lösungsmittel, in dem das Baeitracin
löslich ist, beispielsweise mit Butanol, extrahiert. Dabei kann das wäßrige Eluat
z. B. zweckmäßig auf einen p11-Wert von 7,2 eingestellt und zweimal mit Butanol
extrahiert werden.
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Nach der Extraktion wird das Lösungsmittel entfernt und das Bacitracin
isoliert. Bei Verwendung von Butanol als Lösungsmittel zur Extraktion kann die Butanol-Bacitracin-Lösung
beispielsweise mit Wasser gesättigt und das Butanol unter kontinuierlichem Ersatz
des entfernten Butanols durch Wasser im Vakuum abdestilliert werden. Die erhaltene
wäßrige Lösung kann dann im Vakuum eingeengt und schließlich zur Erzielung des festen
Bacitracins lyophilisiert werden.
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Bei einer anderen Aufarbeitungsmethode können die Eluate auf etwa
1600 Einheiten/ml, zur Entfernung gefärbter Verunreinigungen mit Entfärbungskohle
behandelt, auf ein schwach saures pu, z. B. etwa 5, eingestellt und ebenfalls bei
schwach saurem pu mit einem geringen Überschuß an Zinkchloridlösung versetzt werden.
Durch Einstellung des pH-Wertes der Mischung auf etwa 6,5 bildet sich ein Niederschlag
vor- Zinkbacitracin, der abgetrennt und getrocknet werden kann.
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Die folgende Beschreibung einer geeigneten Arbeitsweise soll dem besseren
Verständnis der Erfindung dienen, ohne sie zu beschränken. Adsorption von Bacitracin
an IRC-50-Harz Zunächst wurden Versuche durchgeführt, um das p$-Optimum für die
Adsorption zu bestimmen. In diesen Versuchen wurde eine Reihe von 1,6 cm Säulen
aufgestellt, deren jede 30 ml IRC-50-Harz (Wasserstoffzustand) enthielt. Die Säulen
wurden mit Acetatpuffer bei pH-Werten im Bereich von 3,0 bis 7,0 in Abständen von
0,5 vorbehandelt. Bacitracinerntebrühe mit einem Titer von 65 Einheiten/ml wurde
durch Zentrifugieren geklärt und in Anteilen auf dieselben p,1-Werte wie die Säulen
eingestellt. Es wurde insgesamt 1 1 Brühe mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa
1 ml/Min. durch jede Säule geleitet. Die verbrauchte Brühe aus jeder Säule wurde
zur Gehaltsprüfung aufgefangen.
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Die Ergebnisse werden im folgenden wiedergegeben.
| Adsorptions-PH I Gesamtmenge an adsorbierter Aktivität |
| 3,0 31,000 Einheiten |
| 3,5 50,000 " |
| 4,0 51,000 " |
| 4,5 52,000 " |
| 5,0 50,000 " |
| 5,5 47,000 " |
| 6,0 42,000 " |
| 6,5 35,000 " |
| 7,0 29,000 " |
Aus diesen Versuchen geht hervor, daß der zur Adsorption bevorzugte pu-Bereich zwischen
3,5 und 5,5 mit einem Optimum bei etwa 4,5 liegt. Der optimale p11-Wert kann von
Harz zu Harz in geringem Maße variieren. Elution aus dem Harz Bacitracinerntebrühe
wurde durch Zentrifugieren geklärt. Insgesamt 42,31 wurden bei einem pg . von 4,5
durch ein Bett IRC-50-Harz (Wasserstoffzustand) von 30 cm Höhe und 5 cm Durchmesser
geleitet. Der Titer der zugeführten Brühe betrug 56,5 Einheiten/ml und der der austretenden
Brühe 0,75 Einheiten/ml. Die tatsächlich adsorbierte Bacitracinmenge betrug demnach
2,36 Mega-Einheiten. Nach der Adsorption wurde das Harz mit Wasser gewaschen, aus
der Säule entfernt und auf einer Nutsche so trocken wie möglich abgesaugt. Nach
gründlichem Durchmischen wurde es für Elutionversuche in acht gleiche Anteile aufgeteilt.
| Eluiertes |
| Bacitracin Ausbeute |
| Eluierungsmittel in Mega-Ein- 111 o |
| heften |
| 5°/Qige wäßrige Phosphorsäure . . 0,121 40 |
| 1 °/oige wäßrige Phosphorsäure . . 0,209 69 |
| 1n-Salzsäure ................. 0,018 6 |
| Bezüglich Salzsäure 1 n mit Buta- |
| nol gesättigtes Wasser (etwa |
| 9 0/a Butanol) . . . . . . . . . . . . . . 0,020 61/z |
| Bezüglich Salzsäure n/10 mit |
| Butanol gesättigtes Wasser |
| (etwa 9 °/o Butanol) . . . . . . . . . 0,158 5211, |
| Bezüglich Salzsäure 1 n-60°/oiges |
| wäßriges Aceton . . . . . . . . . . . . 0,262 87 |
| 2n-Natriumcarbonat* ......... - - |
| 2 n-Ammoniumhydroxyd* * ..... 0,251 83 |
| *) Die Elution wurde auf Grund starker CO. -Entwicklung |
| in der Säule eingestellt. |
| **) Die Elution wurde so lange von unten nach oben durch- |
| geführt, bis das Harz vollständig gequollen war, und dann |
| von oben nach unten fortgesetzt. |
Aus diesen Versuchen geht hervor, daß wäßrige Salzsäure sowie bezüglich
Salzsäure 1 n mit Butanol gesättigtes Wasser keine zufriedenstellenden Eluierungsmittel
darstellen. Verdünnte Phosphorsäure kann unter Erzielung mittlerer Ausbeuten verwendet
werden, wohingegen gute Ergebnisse mit 2n-Ammoniumhydroxyd und bezüglich Salzsäure
1 n 60°/oigem wäßrigem Aceton erhalten werden.
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In einer weiteren Versuchsreihe wurden insgesamt 541 Brühe bei p$
4,5 durch Zentrifugieren geklärt und mit einer Fließgeschwindigkeit von 60 ml/Min.
durch eine 5-cm-Säule, die 1,81 IRC-50-Harz (Wasserstoffzustand) enthielt, geleitet.
Die zugeleitete Flüssigkeit enthielt 2,16 Mega-Einheiten, und in der verbrauchten
Brühe wurden insgesamt 0,3 Mega-Einheiten gefunden. Das Harz wurde zur Elution in
der oben beschriebenen Weise auf eine Anzahl von Säulen aufgeteilt. Die im folgenden
wiedergegebenen Ergebnisse von zwei Säulen wurden als ausgezeichnet angesehen.
| Auf dem Harz |
| befindliches Eluat Ausbeute |
| Eluierungsmittel Bacitracin |
| in Mega- in Mega- in o |
| Einheiten Einheiten |
| 2 n-Ammonium- |
| hydroxyd . . . . . . . . . . 0,260 0,252 97 |
| Bezüglich Salzsäure 1 n- |
| 60°/oiges wäßriges |
| Aceton ............ 0,325 0,316 97 |
Bei diesen Versuchen betrug die Fließgeschwindigkeit für das saure Aceton etwa 250
ml/Std. bei einem 315 ml entsprechenden Bettvolumen. Für Ammoniak wurde die Umlaufelutionsarbeitsweise
angewandt, wobei Wasser mittels einer im Kreislauf von unten nach oben durch die
Säule geleitet und konzentriertes Ammoniak langsam in das System eingeführt wurde,
bis der pu-Wert auf 10,0 gestiegen war.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne
sie zu beschränken.
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Beispiel 1 Die Fermentierung wurde mit einem Stamm von B.licheniformis
in einem Sojabohnenmedium geführt. Die Temperatur betrug 37°C. Tieffermentierung
(Submerszüchtung) unter Belüftung und Bewegung. Ernte nach 32 Stunden.
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Die etwa 8601 ausmachende Erntebrühe mit einem Titer von 43 Einheiten/ml
wurde mit Phosphorsäure auf ein pH von 4,5 angesäuert und mit 10/, Kieselgur
versetzt. Die Brühe wurde auf einem mit einem Schabrührer (advancing knife gear)
versehenen vorher bedeckten Drehvakuumfilter abfiltriert. Das Filter war vorher
mit einer Kieselgurschicht bedeckt worden. Das Filtrat und die Waschflüssigkeit
wurden zur Erzielung einer zur Einführung in die Säulen bestimmten hellen Brühe
mittels Durchleiten durch eine Sharples-Ultrazentrifuge weitergeklärt. Die Erntebrühe
enthielt 37,4 Mega-Einheiten und das Filtrat 25,8 Mega-Einheiten. Mit der Gewinnung
weiterer 3,7 Mega-Einheiten konnte -durch Aufarbeiten der Filter gerechnet werden.
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Die helle Brühe wurde durch zwei Säulen mit IRC-50-Harz von 15 cm
Durchmesser geleitet, deren jede 0,022 m3 Amberlit-IRC-50-Harz, gemessen als abgesetztes
Bett im Wasserstoffzustand, enthielt. Die Fließgeschwindigkeit für die Adsorption
lag zwischen 45 und 541/Std. Nach dem Durchleiten der gesamten Brühe wurden die
Säulen in Serie 2 Stunden mit Wasser der gleichen Fließgeschwindigkeit zur Entfernung
der Brühe durchgewaschen. Jede der Säulen wurde unter Anwendung der aufwärts strömenden
Umlaufelution in der oben beschriebenen Weise mit Ammoniak eluiert. Der Verlust
in der verbrauchten Brühe betrug 0,3 Mega-Einheiten; aus der Primärsäule wurden
insgesamt 15,0 Mega-Einheiten und aus der Sekundärsäule insgesamt 2,3 Mega-Einheiten
eluiert.
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Beispiel 2 681 geklärte Brühe mit einem Titer von 50 Einheiten,/ml
wurden durch eine einzige 1,21 IRC-50-Harz enthaltende Säule von 5 cm Durchmesser
geleitet. Die Fließgeschwindigkeit betrug 50 ml/Min. Die aufgebrachte Gesamtmenge
an Bacitracin betrug 3,37 Mega-Einheiten, und in der verbrauchten Brühe wurden insgesamt
1,73 Mega-Einheiten gefunden. Die Elution wurde mit Ammoniak im Verlauf durchgeführt
und ergab insgesamt 1,60 Mega-Einheiten im Eluat. Dies stellt eine Wirksamkeit von
97,5 °/o, bezogen auf das tatsächlich adsorbierte Bacitracin, dar.
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Beispiel 3 Es wurde eine Säule mit ER-130-Harz im Wasserstoffzustand
von 16 mm Durchmesser und 250 mm Höhe aufgestellt. Mit einer Fließgeschwindigkeit
von 1,5 ml/Min. wurden 21 filtrierte Bacitracinbrühe mit einem Titer von 43 Einheiten/ml
durchgeleitet. Die zugeführte Flüssigkeit enthielt 86000 Einheiten, und das Filtrat
wurde in vier aufeinanderfolgenden Fraktionen aufgefangen, die 1500 bzw. 6000 bzw.
9700 bzw. 20100 Einheiten enthielten. Die tatsächliche Gesamtmenge an adsorbierter
Aktivität betrug deshalb 48700 Einheiten. Das Harz wurde durch Aufschlämmen mit
verdünntem Ammoniak in einem geeigneten Behälter eluieit, und das Eluat enthielt
50400 Einheiten (die geringe Diskrepanz ist auf die Ungenauigkeit mikrobiologischer
Prüfungen zurückzuführen).
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Beispiel 4 Es wurden zwei Fermentationen in großem Maßstab angesetzt,
deren jede 182001 eines Soja, Stärke, Calciumcarbonat und Calciumlactat enthaltenden
Mediums enthielt. Diese Fermentationen wurden mit einer Kultur von Bacillus subtilis
var. licheniformis beimpft und 30 Stunden bei 37°C unter Bewegung und Belüftung
7 m3/Min. fermentiert. Die Titer betrugen 77 bzw. 83 Einheiten/ml. Zum Abernten
wurde die Brühe auf p$ 4,5 eingestellt und durch ein Kieselgurbett auf einem vorher
bedeckten Drehfilter mit Schabrührer abfiltriert. Die abfiltrierte Brühe enthielt
insgesamt 2490 Mega-Einheiten.
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Es wurde eine Bank von drei Säulen, deren jede 60 cm Durchmesser hatte
und etwa 0,67 m3 IRC-50-Harz, gemessen im Wasserstoffzustand, enthielt, verwendet.
Dann wurde die oben beschriebene Serienarbeitsweise angewandt, wobei die Primärsäule
nach Durchgang von 18 2001 Brühe entfernt und die dritte Säule in die Reihe eingeschaltet
wurde. Auf diese Weise wurden drei Eluate (zwei reiche Säulen und eine halbreiche
Säule) erhalten, wobei die Elution mit verdünntem Ammoniak unter Anwendung der Umlaufelutionsarbeitsweise
von unten nach oben in der weiter oben beschriebenen Art durchgeführt wurde.
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Die verbrauchten Brühen enthielten insgesamt 650 Mega-Einheiten Bacitracin,
was eine tatsächlich adsorbierte Menge von etwa 1840 Mega-Einheiten ergibt. Aus
diesen Eluaten wurden insgesamt 1700 Mega-Einheiten Bacitracin gewonnen.
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Die Eluate wurden durch Anwendung einer Arbeitsweise aufgearbeitet,
die in der wie oben beschriebenen
Lösungsmittelextraktion und Fällung
'von Zinkbacitracin besteht, und lieferten 11 kg Bacitracinzinksalz mit einer Aktivität
von 55 Einheiten/mg.