DE916904C - Verfahren zur Gewinnung von Streptomycin aus waessrigen Loesungen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Gewinnung von Streptomycin aus wäßrigen Lösungen, insbesondere aus Nährmedien oder Maischen, in denen das Antibioticum durch Fermentierung von Streptomycin produzierenden Stämmen von Streptomyces griseus erzeugt worden ist. Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß die streptomycinhaltige Kulturflüssigkeit in Kontakt mit einem ionenaustauschenden Harz gebracht wird, dessen Austauschfähigkeit auf der Anwesenheit von Carboxylgruppen beruht, und das hierbei von dem Harz adsorbierte Streptomycin dem Harz wieder entzogen wird.

Streptomycin wird industriell hergestellt durch Züchtung Streptomycin produzierender Stämme des Pilzes Streptomyces griseus in Flüssigkeiten, welche Nährmedien für das Wachstum des Mikroorganismus enthalten, wobei die Züchtung unter Belüftung durchgeführt wird. Die betreffenden Flüssigkeiten werden sowohl vor der Fermentation als auch nachher als Nährmedien oder Maischen bezeichnet. Nach erfolgter Fermentation muß die das gebildete Streptomycin neben zahlreichen Stoffwechselprodukten enthaltende Maische von den Fermentierungsorganismen und anderen festen Stoffen befreit werden und alsdann einer für die Gewinnung des Streptomycins geeigneten Behandlung unterworfen werden.

Nach der derzeitigen Praxis erfolgt die Gewinnung des Streptomycins derart, daß die Lösung mit Aktivkohle behandelt wird und das hierbei von Aktivkohle adsorbierte Streptomycin durch Waschen der Aktivkohle mit einer geeigneten Flüssigkeit extrahiert wird. Vom industriellen Standpunkt aus ist dieses Verfahren mit verschiedenen Nachteilen behaftet; es ist verhältnismäßig teuer und erfordert

relativ große Mengen von Α-Kohle für den Adsorptionsvorgang. Mit Rücksicht auf die verhältnismäßig schwache Adsorptionskraft der Α-Kohle für Streptomycin sind im Vergleich zu den der Kulturflüssigkeit zu entziehenden Streptomycinmengen beträchtliche Beträge von Α-Kohle erforderlich. Hinzu kommt ein großer Aufwand an Apparatur für Filter, Eindampfgefäße u. dgl. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß die ziemlich kostspielige

to Aktivkohle nach Vollendung des Adsorptionsvorgangs und Entziehung des aufgenommenen Streptomycins für weitere Adsorptionsvorgänge nicht mehr zu gebrauchen ist. Der Adsorptionsvorgang selbst verläuft ziemlich langsam. Infolge- dessen ist für die Aufarbeitung der verhältnismäßig großen Mengen von Kulturflüssigkeit eine große Ausrüstung und ein erheblicher Zeitaufwand erforderlich. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß nur etwa 60 bis 80% des vorhandenen Streptomyeins mit Hilfe von Aktivkohle wiedergewonnen werden. Das so erhaltene Streptomycin ist von geringer Qualität; es ist infolgedessen nötig, noch eine Anzahl von Reinigungsmaßnahmen vorzunehmen, um ein für pharmazeutische Zwecke geeignetes Produkt zu erhalten.

Es ist auch bereits vorgeschlagen worden, Antibiotica mit Hilfe von ionenaustauschenden Harzen zu adsorbieren. Aber alle diese Vorschläge haben zu befriedigenden Ergebnissen nicht geführt, da die verwendeten Harze nicht nur die antibiotischen Substanzen, sondern außerdem noch andere, in den fermentierten Flüssigkeiten vorhandene, komplexe, organische Verbindungen adsorbieren. Infolgedessen bereitet die Extraktion des adsorbierten Antibioticums aus dem Harz beträchtliche Schwierigkeiten. Diese Operation kann nur unter Verunreinigung des Antibioticums mit beträchtlichen Mengen von Säuren oder Salzen durchgeführt werden. Die Ausbeuten an Streptomycin sind häufig so schlecht, daß die betreffenden Verfahren für industrielle Zwecke nicht in Betracht kommen.

Es wurde nun gefunden, daß das in fermentierten Maischen vorhandene Streptomycin mit überraschender Wirksamkeit und Leichtigkeit gewonnen werden kann, wenn man zur Durchführung des Adsorptionsvorgangs ionenaustauschende Harze verwendet, deren polare Gruppen Carboxylgruppen sind. Diese Harze bieten wesentliche Vorteile gegenüber allen anderen bisher verwendeten Adsorbenzien, insbesondere mit Bezug auf Reinheit des Produkts, Ausbeuten an Streptomycin und Wirtschaftlichkeit. Während bei Anwendung anderer Adsorptionsmittel, wie z.B. Aktivkohle, Fullererde, synthetischer, sulfonsaurer Harze und Zeolithen, die Adsorptionsstufe in erster Linie einen Konzentrationsvorgang darstellt, an den mehrere Reinigungsvorgänge angeschlossen werden müssen, werden erfindungsgemäß durch Verwendung von Harzen mit Carboxylgruppen unmittelbar aus der Nährlösung Produkte von solcher Reinheit gewonnen, daß sie ohne weiteres durch Kristallisieren aus Methanollösung kristalline Calciumchloridkomplexsalze liefern. Die erzielten Vorteile beruhen auf verschiedenen Ursachen. Erstens werden die in der fermentierten Nährflüssigkeit befindlichen, nicht basischen Stoffe infolge der ionenaustauschenden Natur des angewendeten Adsorptionsmittels nicht adsorbiert. Die Wirkung der angewendeten Kunstharze ist, wie gefunden wurde, hoch selektiv, indem praktisch nur Streptomycin adsorbiert wird, während andere in der Flüssigkeit befindliche stickstoffhaltige organische Verbindungen nicht adsorbiert werden.

Zweitens kann das adsorbierte Antibioticum dem Kunstharz durch Extraktion praktisch vollständig entzogen werden, ohne daß die Notwendigkeit besteht, Salze und Säuren in den bisher erforderlichen hohen Konzentrationen in den Vorgang einzuführen. Durch Verwendung von carboxylischen Austauschharzen ist es möglich, Streptomycin in quantitativen Ausbeuten aus der Kulturflüssigkeit zu gewinnen. Der Gewinnungsvorgang ist so zuverlässig und quantitativ, daß ein Schnellverfahren, bestehend aus Adsorption des Streptomycins an Harze, Extraktion und Identifizierung des verhältnismäßig reinen Streptomycinauszugs durch Desaggregationsreaktion, entwickelt werden konnte. Weiterhin ist das vorliegende Verfahren so wirksam, daß auf verschiedene bisher übliche Verfahrensstufen, wie Kristallisation aus Mutterlaugen, Auswaschen der Filterkuchen, Auswaschen der Apparatur usw., verzichtet werden kann. Das Verfahren kann z. B. in einer Spülkolonne derart durchgeführt werden, daß die letzten Spuren des Streptomycins aufgenommen werden. Die Kolonne kann periodisch extrahiert werden und das Streptomycin in üblicher Weise aus den Auszügen gewonnen werden.

Infolge der verschiedenen günstigen Eigenschaften und Wirkungen der carboxylischen Ionenaustauschharze bietet die Erfindung auch große wirtschaftliche Vorteile. Der Ionenaustauschprozeß verläuft so einfach, daß er in seiner Durchführung einem Wasserreinigungsverfahren gleichkommt. Das Streptomycin wird der Flüssigkeit durch Überleiten über das Harz entzogen. Das Harz wird mit verdünnter Säure ausgezogen und ist nach Regenenieren mit Alkali wieder voll gebrauchsfähig. Organische Lösungsmittel sind nicht erforderlich. Das Harz kann immer wieder zu neuen Behändlungen Verwendung finden. Da die Ionenreaktionen sehr rasch verlaufen, kann die Flüssigkeit mit hoher Durchlaufgeschwindigkeit durch das Adsorptionsmittel geleitet werden. Die Durchläufsgeschwindigkeit kann z. B. 3- bis iomal so groß sein als bei Verwendung von Aktivkohle als Adsorptionsmittel. Ein weiterer wichtiger Vorteil besteht in der außerordentlich hohen Adsorptionsfähigkeit für Streptomycin, ι g der beanspruchten Austauschharze vermag etwa 1 g Streptomycin zu adsorbieren. Infolge der hohen Adsorptionsfähigkeit und der großen Durchflußgeschwindigkeit kann die Apparatur im Vergleich zu dem bekannten Verfahren sehr viel einfacher und kleiner gestaltet werden. Für die Behandlung großer Mengen von streptomycinhaltiger Flüssigkeit sind verhältnismäßig kleine

Betten des Adsorptionsmittels erforderlich, die mit verhältnismäßig sehr kleinen Mengen von Säure ausgezogen werden können.

Beim Arbeiten gemäß der Erfindung ist es lediglich erforderlich, die Flüssigkeit in Berührung mit dem Harz zu bringen und anschließend das adsorbierte Streptomycin durch Auswaschen des Harzes mit einem geeigneten Lösungsmittel zu gewinnen. Selbstverständlich muß das Harz zunächst

ίο regeneriert werden, wenn es bereits in einer vorangehenden Operation Verwendung gefunden hat. In gegebenen Fällen kann das Auswaschen des adsorbierten Streptomycins und die Regeneration des Harzes gleichzeitig durchgeführt werden, indem eine Waschflüssigkeit verwendet wird, welche zugleich befähigt ist, das Harz zu regenerieren. Die Regeneration kann in üblicher Weise durchgeführt werden, indem die Regenerationsflüssigkeit in einer Weise durch die Harzteilchen geleitet wird, daß

ao eine innige Berührung gewährleistet ist.

Die Regeneration kann mit Vorteil derart durchgeführt werden, daß das Harz einem Kationenkreislauf unter Verwendung von wäßrigem Ammoniumhydroxyd als Regenerierungsmittel

»5 unterworfen wird. Dies bietet den Vorteil, daß der PH-Wert selbsttätig so eingestellt wird, daß im wesentlichen während der gesamten Adsorption der PH-Wert des Kulturmediums oder einer anderen Behandlungsflüssigkeit innerhalb des Bereiches gehalten wird, der eine Maximalgewinnung von Streptomycin durch Adsorption gewährleistet.

Das Austauschharz wird vorteilhaft in einer Kolonne angewendet, durch welche die streptomycinhaltige Flüssigkeit von oben nach unten oder im Gegenstrom geleitet wird. Es ist aber auch möglich, die Flüssigkeit auf andere Weise mit dem in kleinen Teilchen vorliegenden Harz in Berührung zu bringen. Zum Ausziehen des adsorbierten Streptomycins aus dem carboxylischen Harz können allgemein Lösungen von Elektrolyten Verwendung finden. Gute Ergebnisse wurden unter anderem erzielt durch Verwendung einer sauren Lösung, z. B. von i,5n-Chlorwasserstoffsäure. Sehr befriedigende Resultate wurden auch erhalten durch Verwendung wäßriger Lösungen von Calciumchlorid, z. B. einer io°/oigen Lösung. Die Verwendung einer Calciumchloridlösung gestattet die bequeme Gewinnung eines verhältnismäßig sehr reinen Streptomycins direkt aus dem Harz in kristalliner Form. Allgemein sei bemerkt, daß die Gewinnung des Streptomycins aus dem Harz durch Auswaschen keinerlei Schwierigkeiten bereitet. An Stelle der vorstehend erwähnten Mittel können auch andere Waschflüssigkeiten verwendet werden, in gegebenen Fällen auch wäßrig-organische Lösungen von Elektrolyten. Der p_H-Wert der streptomycinhaltigen Flüssigkeit, z. B. des Kulturmediums, wird vorteilhaft vor Beginn des Adsorptionsvorgangs auf einen für das angewendete Harz besonders geeigneten Grad eingestellt.

Als Austauschharze sind alle unlöslichen Carboxylgruppen enthaltende Harze verwendbar, insbesondere haben sich die verschiedenen Harze vom Divinylbenzol-Methacrylsäure- und vom Resorcylsäure-Formaldehyd-Typ bewährt.

Beispiel

Eine passende Menge eines Copolymeren aus Methacrylsäure und Divinylbenzol mit einem Gehalt von 5% Divinylbenzol wurde mit Wasser aufgeschlämmt und dann in eine Adsorptionskolonne gebracht, die so beschickt wurde, daß ein Bett von Adsorptionsharz von etwa 7 bis 8 cm Tiefe entstand. Das Harz wurde mit 2,5 n-Chlorwasserstoffsäure und anschließend mit Wasser gewaschen. Hierauf wurde es mit einer Lösung von 2,5 n-Ammoniumhydroxyd behandelt und anschließend wieder mit Wasser gewaschen. Nachdem das Harz ausreichend konvertiert war, wurde das Harz mit Wasser rückgewaschen, bis der p_H-Wert der abfließenden Flüssigkeit etwa 10,5 betrug. Die Kolonne war alsdann für den Adsorptionsvorgang bereit. Die aus der Fermentierung von Streptomyces griseus stammende Kulturflüssigkeit wurde nach einer dieselbe klärenden Vorbehandlung in die Adsorptionskolonne eingeleitet, z. B. derart, daß der Flüssigkeitsspiegel etwa 100 cm hoch in der Kolonne stand, und der Durchfluß durch das Harz so geregelt, daß die Berührungsdauer zwischen Flüssigkeit und Harz etwa 1 Minute betrug. Nach Beendigung des Adsorptionsvorgangs wurde die noch in der Harzsäule befindliche Kulturflüssigkeit mit Wasser verdrängt und der Flüssigkeitsspiegel bis auf die Oberfläche des Harzbettes gesenkt. Alsdann wurde die Waschflüssigkeit, z. B. 1 n- bis 1,5 η-Chlorwasserstoff säure in den Oberteil der Kolonne eingeleitet und die aus dem Unterteil der Kolonne abfließende Flüssigkeit gesammelt. Da die späteren Fraktionen sehr sauer sind (unter p_H 1,0), werden sie unmittelbar durch Zufügung von 2,5 n-Natronlauge neutralisiert. Die neutralisierte Flüssigkeit wird konzentriert, mit Methanol verdünnt und die Methanollösung mit Aceton versetzt. Das abgeschiedene feste Produkt wurde durch Filtration entfernt und unter reduziertem Druck bei Zimmertemperatur getrocknet. Das erhaltene Streptomycin besaß einen für die therapeutische Anwendung ausreichenden Reinheitsgrad. Nach Vollendung der Auswaschung des Harzes zur Ausziehung des Streptomycins wurde die Kolonne mit einer zusatz- n° liehen Menge von 2,5 n-Chlorwasserstoffsäure und anschließend mit Wasser gewaschen. Alsdann wurde das in der Kolonne befindliche Kunstharz durch Behandlung mit Ammoniumhydroxydlösung regeneriert und hierdurch wieder verwendungsfähig für den nächsten Adsorptionsvorgang gemacht. Die Ausbeute an Streptomycin, bezogen auf die durch das Harz adsorbierte Streptomycinmenge, betrug q6°/o. Die Potenz des Produkts betrug 500 Einheiten je Milligramm. Der Verlust der abgeflossenen iao Kulturflüssigkeit betrug nur 1,6%.

Claims (4)

1. PATENTANSPRÜCHE:

   i. Verfahren zur Gewinnung von Streptomycin aus wäßrigen Lösungen mittels ionenaustauschenden Harzen, dadurch gekennzeichnet,

   daß die Lösung mit einem solchen ionenaustauschenden Harz, dessen Austauschfähigkeit auf der Anwesenheit von Carboxylgruppen beruht, in Berührung gebracht wird und das hierbei adsorbierte Streptomycin dem Harz durch Auswaschen entzogen wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß an Stelle einer wäßrigen Lösung die mit Streptomyces griseus vergorene Nährflüssigkeit verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß zum Ausziehen des adsorbierten Streptomycins aus dem Harz eine saure Flüssigkeit, z. B. Chlorwasserstoffsäure, verwendet wird.
4. 4. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß zum Ausziehen des Streptomycins aus dem Harz eine Chlorcalcium enthaltende Lösung verwendet wird.

   Angezogene Druckschriften:
   Archives of Biochemistry, Vol. 15 (1947), S. 55 ff; Chemical Engineering, Vol. 55 (1948), S. 163 ff; deutsche Patentschrift Nr. 733 679.

   ι 9550 9.54