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Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von Vitamin B12 aus einem
Verunreinigungen enthaltenden Vitamin-B12-aktiven Konzentrat
Die Erfindung bezieht
sich auf die Behandlung von Vitamin-B12-aktiven Konzentraten, um aus ihnen die Verunreinigungen
zu entfernen und eine im wesentlichen quantitative Abscheidung der aktiven Substanzen
als Vitamin B, 2 zu erreichen.
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Mit dem Ausdruck » Vitamin-Bl2-aktive Substanzen« werden hier einerseits
Vitamin B, 2 selbst, eine Verbindung, die jetzt als ein Kobaltkomplex erkannt ist,
welcher eine charakteristische C N-Gruppe enthält, andererseits eng mit ihm verwandte
Kobaltkomplexe bezeichnet, die als dem Vitamin B12 analoge Substanzen angesehen
werden können und sich von Vitamin B12 dadurch unterscheiden, daß sie an Stelle
der Cyanogruppe einige andere charakteristische Gruppen oder Anionen enthalten.
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Vitamin-B12-aktive Konzentrate, die aus der Leber und aus Gärungsprodukten
gewonnen sind, enthalten im allgemeinen außer Vitamin B12 selbst einen oder mehrere
derartiger analoger Komplexe.
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Es ist auch möglich, Vitamin B12 durch chemische Reaktion in verwandte
oder analoge Komplexe umzuwandeln.
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Die bisher zur Gewinnung von Vitamin B12 aus Vitamin-B12-aktiven
Konzentraten bekannten Verfahren sind verwickelt und umständlich. Sie bestehen im
allgemeinen aus wiederholten Extraktionen mit verschiedenen Lösungsmitteln, der
Konzentration der Extrakte, der Gegenstromverteilung zwischen verschiedenen Lösungsmitteln,
wie Wasser und Benzylalkohol, und der wiederholten Fällung aktiver Substanzen aus
ihrer Lösung mittels Lösungsmitteln wie Aceton, welche auf VitaminB,, im wesentlichen
nichtlösend wirken.
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Erst durch derartige Verfahren wird ein hinreichend gereinigtes Produkt
gewonnen, um die Gewinnung von kristallinem Vitamin B12 zu ermöglichen. Bei diesen
Verfahren werden die Schwierigkeiten um ein Vielfaches erhöht, wenn in den Konzentraten
Vitamin-Bl2-analoge Stoffe anwesend sind, und zwar infolge der Löslichkeitseigenschaften
von Vitamin B, 2 und seinen verschiedenen analogen Verbindungen. Man kann die Gewinnung
wesentlich vereinfachen, indem man ein Vitamin-B12-aktives Konzentrat mit einem
Stoff behandelt, der Cyanionen liefert. Dadurch werden im wesentlichen alle aktiven
Substanzen in Vitamin B, 2 umgewandelt. Selbst wenn das Konzentrat im wesentlichen
die gesamte Vitamin-Bi2-Aktivität in Form von Vitamin B12 enthält, machen die große
Menge und die komplexe Natur der in dem Konzentrat enthaltenen Verunreinigungen
das Abscheidungsverfahren umständlich und unwirksam.
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Es wurde nun gefunden, daß man die Gewinnung von Vitamin B12 aus
Vitamin-Bl2-aktiven Konzentraten dadurch weitgehend abkürzen und vereinfachen kann,
daß man eine die Vitaminsubstanz und die Verunreinigungen enthaltende Lösung in
Gegenwart von Cyanionen mit einem Anionenaustauschharz behandelt. Die aktiven Substanzen,
d. h. Vitamin B12 und bzw. oder die Vitamin-Bl2-analogen Stoffe, die in dem Konzentrat
enthalten sein können, werden normalerweise durch Anionenaustauscher nicht merklich
adsorbiert, obgleich gefunden wurde, daß ein Teil der Verunreinigungen, im allgemeinen
etwa 5 bis 20°/o der gesamten Feststoffe, adsorbiert werden können. tiberraschenderweise
zeigte sich indessen, daß das aktive Material in Gegenwart von Cyanionen durch ein
Anionenaustauschharz erheblich und oft fast quantitativ adsorbiert wird. Es wurde
weiter gefunden, daß die so adsorbierten aktiven Substanzen durch Eluieren des Anionenäustauschers
mit einem sauren Eluierungsmittel gewonnen werden können und daß die in dem entstandenen
Eluat vorhandenen aktiven Substanzen hauptsächlich in Form von Vitamin B12 selbst
vorliegen.
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Wenn auch der genaue Mechanismus dieser Adsorption nicht bekannt
ist, scheint es doch, daß in Anwesenheit von Cyanid ein Komplex aus Anionenaustauscher,
Cyanid und Vitamin B12 gebildet wird. Anscheinend werden ferner zuweilen auch Komplexe
aus Anionenaustauscher, Cyanid und Vitamin-B12-analogen Stoffen gebildet. Gleichzeitig
aber bewirkt das Cyanid die Umwandlung der analogen Substanzen in Vitamin B12, wodurch
die meisten aktiven Substanzen als Vitamin B, 2 adsorbiert werden.
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Der Adsorptionsgrad hängt von einer Anzahl von Einflüssen ab, z.
B. den Eigenschaften des Anionenaustauschers, der Art der in der Lösung anwesenden
Verunreinigungen und der Art, wie die Cyanionen in das System eingeführt werden.
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Diese Bedingungen werden nachfolgend im einzelnen erläutert.
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Bei der Adsorption wird der größte Teil der in der Ausgangslösung
enthaltenen Verunreinigungen mit der abströmenden Flixsstigkeit entfernt, aber bestimmte,
durch ein Anionenaustauschharz adsorbierbare Verunreinigungen können auch in Gegenwart
von Cyanid adsorbiert werden; dies kann die Adsorptionsfähigkeit des Austauschharzes
für Vitamin Bt2 herabsetzen. Es ist deshalb vorzuziehen, die Lösung der aktiven
Substanzen vor dem Zusatz von Cyanid einer Vorbehandlung mit einem Anionenaustauschharz
zu unterwerfen, um durch Adsorption die Verunreinigungen zu entfernen, welche die
Adsorption von Vitamin Blz stören würden.
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Die beschriebene Behandlung einer Vitamin-B12-aktiven Lösung mit
einem Anionenaustauscher in Abwesenheit von Cyanionen ist unabhängig als eine Maßnahme
zur Entfernung von Verunreinigungen, besonders von gefärbten Verunreinigungen, aus
derartigen Vitamin-Bi2-aktiven Lösungen wertvoll. Insbesondere wurde gefunden, daß
die Endstufen der Herstellung von Vitamin-B12-Kristallen vereinfacht werden können,
indem man eine Lösung, die aus Rohkristallen hergestellt ist, mit einem Anionenaustauscher
behandelt, um störende Zusätze und gefärbte Verunreinigungen zu entfernen.
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Zur Durchführung des Verfahrens gemäß Erfindung kann man von Vitamin-B12-aktiven
Konzentraten verschiedener Herkunft ausgehen, die z. B. aus der Leber, aus Gärungsprodukten,
Mutterlaugen, Waschwässern und anderen bei der Gewinnung von Vitamin B12 anfallenden
Nebenprodukten gewonnen werden. Man kann hierfür vorteilhaft von Konzentraten mit
einem verhältnismäßig hohen Vitamin-B12-Gehalt ausgehen, z. B.
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Konzentraten, die 25 bis 50 oder mehr der gesamten Feststoffe als
Vitamin-B12-aktive Stoffe enthalten. Der technische Fortschritt der Verfahren indessen
wird noch stärker, wenn man von Konzentraten ausgeht, in denen die Vitamin-B12-aktiven
Substanzen zu weniger als etwa 5 °/o der gesamten Feststoffe enthalten sind. Beispielsweise
lassen sich sehr zufriedenstellende Ergebnisse erzielen, wenn man von aus Gärungsprodukten
gewonnenen Konzentraten ausgeht, in denen die Vitamin-B12-aktiven Substanzen etwa
0,5 bis I,5 der gesamten Feststoffe ausmachen. Man kann natürlich auch Konzentrate
von einer viel geringeren Wirksamkeit verwenden, z. B. solche, die bis zu 0,05 bis
o,IO/o Vitamin-B12-aktive Substanzen in den gesamten Feststoffen enthalten. Wenn
noch weniger wirksame Konzentrate verwendet werden, neigt indessen der
stärkere
relative Gehalt an Verunreinigungen dazu, die Wirksamkeit des Anionenaustauschers
sowohl bei der Adsorption von Vitamin B, 2 als Komplex mit Cyanid und Austauscher
als auch die vorangehende Adsorption in. Abwesenheit von Cyanionen zu verschlechtern.
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Auch die Art der Verunreinigungen ist zu berücksichtigen. Insbesondere
gefärbte und bzw. oder teerbildende Verunreinigungen können die Wirksamkeit des
Anionenaustauschers selbst bei stärkeren Konzentraten verschlechtern. Wenn man weiß,
daß die EGonzentrate erhebliche Mengen an gefärbten und bzw. oder teerbildenden
Verunreinigungen enthalten, empfiehlt es sich deshalb, eine Vorbehandlung vorzunehmen,
um derartige Verunreinigungen zu entfernen. Ein für diesen Zweck besonders wirksames
Verfahren besteht darin, daß man eine Lösung der Vitamin-Bs2Jaktiven Substanzen
mit Zinkhydroxyd behandelt und letztgenanntes zusammen mit merklichen Mengen der
gefärbten und bzw. oder teerbildenden Verunreinigungen aus der verbleibenden Lösung
abtrennt.
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Die Konzentrate werden bei dem Verfahren nach der Erfindung vorzugsweise
in Form wäßriger Lösungen, d. h. Lösungen in Wasser und wäßrigorganischen Lösungsmitteln,
angewendet. Man kann auch Lösungen in wasserfreiem Alkohol verwenden; dann ist aber
insbesondere die Hauptadsorption in Anwesenheit von Cyanid etwas weniger wirksam,
auch entzieht sich eine größere Menge von Vitamin B12 der Adsorption und muß aus
der abströmenden Flüssigkeit nebst Waschlösungen wiedergewonnen werden. Das Verhältnis
der Gesamtfeststoffe zum Gesamtvolumen der Lösung ist nicht von besonderer Bedeutung.
Es empfiehlt sich aber, bei der Hauptadsorption in Anwesenheit von Cyanid ein zu
großes Volumen der zu behandelnden Lösung zu vermeiden.
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Beispielsweise zeigte sich, daß gute Ergebnisse dann erhalten werden,
wenn die gemäß der Erfindung mit Anionenaustauschharzen behandelten Lösungen anfänglich
etwa I bis 5 0/o Gesamtfeststoffe enthalten. Lösungen dieser Konzentration können
als solche durch die einleitenden Verfahren zur Vitamin-B12-Gewinnung erhalten werden,
man kann auch feste Konzentrate von geeigneter Vitamin-Bl2-Aktivität entweder in
Wasser lösen -oder mit Wasser oder anderen wäßrigen Lösungsmitteln extrahieren,
um die Ausgangs lösungen für das vorliegende Verfahren zu gewinnen.
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Bei der Adsorption der Vitamin-B 2-aktiven Substanzen in Anwesenheit
von Cyanionen sowie bei der Adsorption der Verunreinigungen in Abwesenheit von Cyanionen
wird die gleiche Art von Anionenaustauschern verwendet, Als Anionenaustauscher sind
die organischen stickstoffhaltigen Anionenaustauscher besonders wirksam, deren Austauschkapazität
im wesentlichen auf Gruppen von quaternärem Ammoniunt beruht und welche im allgemeinen
als stark basische Anionenaustauschharze bezeichnet werden. Diese Harze können natürlich
noch andere aktive Austauschgruppen enthalten, wie primäre, sekundäre und tertiäre
Aminogruppen, Guanidingruppen u. dgl. Außer der Basizität des Harzes ist eine verhältnismäßig
poröse Struktur wichtig. Bei der Auswahl des Harzes für seine Verwendung gemäß der
Erfindung soll deshalb sowohl die Basizität als auch die Porosität beachtet werden.
Eine maximale Adsorption und Reinigung von Vitamin B12 wird mit stark basischen
und hochporösen Austauschharzen erzielt, wenn auch zufriedenstellende, aber doch
etwas weniger ausgeprägte Ergebnisse mit stark basischen Harzen geringer Porosität
sowie mit Harzen von geringerer Basizität und hoher Porosität erzielt werden. So
sind diejenigen Austauschharze für die erfindungsgemäße Verwendung als gut brauchbar
anzusehen, welche mäßig bis stark basisch und mäßig bis stark porös sind.
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Anionenaustauschharze, die zur Durchführung der Erfindung mit Erfolg
verwendet werden können, sind im Handel erhältlich. Zu diesen gehören z. B. die
stark basischen und höchporösen Anionenaustauschharze der Handelsbezeichnung »Amberlite
XE-75 « und »Amberlite XE-98« und das stark basische und mäßig poröse Anionenaustauschharz
»Amberlite IRA-400«; diese drei Harze sind Modifikationen stark basischer Anionenaustauschharze,
deren Austauschvermögen auf quaternäre Ammoniumgruppen im Polymerisat zurückgeht.
Zu nennen ist ferner das mäßig basische und hochporöse Anionenaustauschharz »Ionac
A-2g3 «, ein Kondensationsprodukt vom Melanintypus. Die Herstellung dieser Austauschharze
ist in den USA.-Patentschriften 2 597 494, 2 597 440, 2 570 822, 2 567 836 und 2
543 666 beschrieben.
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Mit »Amberlite XE-75 « und »Amberlite XE-98« wurde eine Vitamin-B12-Adsorption
und -Gewinnung von 900/9 und mehr erzielt, während bei Verwendung von »Amberlite
IRA-400« und »Ionac A-2g3 « die Adsorption und Gewinnung von Vitamin B12 annähernd
80 O/o betrug. Andere Harze, die mit Erfolg gemäß der Erfindung verwendbar sind,
obgleich sie eine etwas geringere Wirksamkeit haben, sind z. B. »Amberlite IR-4B«,
ein harzartiges Kondensationsprodukt aus Phenolformaldehyd und Alkylenpolyamin mit
primären, sekundären und, tertiären Aminen und Phenolgruppen als funktionelle Gruppen,
und »Amberlite XE-58«, ein harzartiges Kondensationsprodukt mit primären, sekundären
und tertiären Aminen als tfunktioneMe Gruppen.
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Man kann bei der Hauptadsorption und der Voradsorption und -reinigung
des Gesamtverfahrens das gleiche Harz oder verschiedene Harze verwenden. Es scheint
indessen ein deutlicher Vorteil darin zu liegen, daß man in beiden Adsorptionsstufen
das gleiche Harz verwendet. Dieser Vorteil kann darauf beruhen, daß die durch die
Voradsorption entfernbaren Verunreinigungen von den verschiedenen Harzen in verschiedenem
Ausmaß adsorbiert werden. Da eine Aufgabe dieser Voradsorption darin besteht, die
Verunreinigungen zu entfernen,- welche die Adsorption des Vitamins B, 2 bei der
Hauptadsorption stören würden, werden diejenigen Verunreinigungen, die am wahrschein-
lichsten
störend wirken, dann am besten entfernt, wenn man bei der Voradsorption das gleiche
Harz verwendet.
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Vor der Verwendung in einer der Adsorptionsstufen wird das ausgewählte
Harz in die Salzform umgewandelt, indem man es mit einer Lösung wäscht, die das
gewünschte Anion liefert. Wenn auch bei der Vorbehandlung des Harzes Anionen einer
ganzen Anzahl anorganischer und organischer Säuren wirksam verwendet werden können,
z. B.
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Schwefelsäure, Salzsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Zitronensäure
und Glutaminsäure, lassen sich die besten Ergebnisse durch Verwendung von Essig-
oder Salzsäure erzielen, wodurch das Harz in die Azetat- oder Chloridform umgewandelt
wird.
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Es ist in diesem Zusammenhang darauf hinzuweisen, daß ein deutlicher
Vorteil in der Verwendung eines Harzes für Vor- und Hauptadsorption zu liegen scheint,
das in der Form eines Salzes der gleichen Säure vorliegt, die beim Eluieren verwendet
wird. Wenn man z. B. die Eluierung nach der Hauptadsorption mit Essigsäure vornehmen
will, empfiehlt es sich, daß das Harz in beiden Adsorptionsstufen anfänglich in
Azetatform vorliegt.
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Man kann das Harz auch in Hydroxydform verwenden und zur Eluierung
von Vitamin B12 nach der Hauptadsorption eine Base, wie Natriumhydroxyd, verwenden.
Dieses Verfahren ist indessen sowohl hinsichtlich der Vitamin-B12-Adsorption als
auch der Eluierung desselben weniger wirksam als das oben beschriebene Verfahren,
bei dem das Harz in Salzform verwendet wird und mit einer Säure eluiert wird.
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Das Cyanid kann durch Vorbehandlung des Anionenaustauschers mit einem
ionisierbaren Cyanid und bzw. oder durch Zusatz eines ionisierbaren Cyanids zur
Lösung der aktiven Substanzen, bevor diese mit dem Anionenaustauscher in Berührung
gebracht wird, zugeführt werden.
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Wenn derVitamin-B12-aktiven Lösüng Cyanionen zugeführt werden und
das Harz ganz oder teilweise in ein anderes Salz als Cyanid umgewandelt wird, dient
das zuerst zugesetzte Cyanid sowohl zur Umwandlung des Harzes in die Cyanidform
als auch zur Umwandlung der Vitamin-Bl2-analogen Stoffe in Vitamin B12. Dadurch
wird eine merkliche Adsorption der aktiven Substanzen in Form eines Komplexes aus
Harz, Cyanid und Vitamin Bt2 ermöglicht. Daneben kann auch ein Komplex aus Harz,
Cyanid und den Vitamin-Bl2-analogen Stoffen gebildet werden. Wenn das Harz in Form
eines anderen Salzes als Cyanid vorliegt und die Cyanionen ausschließlich der Vitamin-Bl2-aktiven
Lösung zugesetzt werden, kann ein gewisser Durchbruch der aktiven Substanzen erfolgen,
bevor die Cyanionen ausreichend mit dem Harz in Reaktion getreten sind und dessen
Adsorptionskapazität entwickelt haben. Es zeigte sich indessen, daß eine gute Adsorption
und ein sehr geringer Durchbruch der Vitamin-B12-aktiven- Substanzen erfolgen, wenn
das Harz mit Cyanid vorbehandelt ist, um es zumindest zu 30 0/o in die Cyanidform
umzuwandeln.
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Wenn die gewünschte Menge einer Vitamin-B12-aktiven Lösung dem Harz
zugeführt worden ist, empfiehlt es sich, die Zufuhr von Lösung zu unterbrechen und
Harz und Lösung etwa 2 bis 3 Stunden in Kontakt zu belassen. Während dieser Zeit
werden weitere Vitamin-B12--aktive Substanzen auf dem Harz adsorbiert. Das Harz
wird dann vor der sauren Eluierung mit Wasser ausgewaschen. Bei der angegebenen
Verweilzeit ist die Menge an aktiven Substanzen, die mit der abströmenden Flüssigkeit
entfernt wird, sehr gering, d. h. nur etwa 2 bis 10 0/o gegenüber 5 bis 20 0/o ohne
Verweilzeit. Die abströmende Flüssigkeit, welche aktive Substanzen enthält, wird
zur Wiederverarbeitung gesammelt.
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Bei der Voradsorption wird eine Lösung, welche die Vitamin-Bl2-aktiven
Substanzen und die Verunreinigungen enthält, mit dem säurebehandelten Harz in Kontakt
gebracht. Dies erfolgt vorzugsweise dadurch, daß man die Lösung durch eine Harzsäule
leitet. Dabei hängt die Lösungsmenge, die zugesetzt wird, von der experimentell
ermittelten Adsorptionskapazität des Harzes für die in der Lösung enthaltenen Verunreinigungen
ab.
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Die abströmende Lösung wird verworfen, bis die erste Färbung auftritt,
welche die Anwesenheit Vitamin-B12-aktiver Substanzen anzeigt. Darauf wird die weiter
abströmende Flüssigkeit aufgefangen, während man weiter Lösung und/oder Wasser zuführt,
bis die Farbe der abströmenden Lösung von Rot nach Hellrosa oder Gelb wechselt.
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Das Gesamtvolumen des angereicherten Schnittes der abströmenden Flüssigkeit
kann das Vier- bis Fünffache des Volumens der Ausgangslösung sein, aber es enthält
95 0/o oder mehr der Vitamin-B12-aktiven Substanzen. Das Waschen wird fortgesetzt,
bis die abströmende Lösung wieder im wesentlichen farblos geworden ist. Das Waschwasser
hiervon wird gesondert aufgefangen und zur Aufarbeitung einer früheren Stufe des
Verfahrens zugeführt.
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Die Regenerierung der Austauschsäule läßt sich leicht vornehmen,
indem man zuerst mit Säure auswäscht, wie oben beschrieben, und dann mit Wasser,
um die überschüssige Säure zu entfernen.
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Die ersten Teile der sauren Regenerierungswäsche können auch Spuren
von Vitamin-Bl2-aktiven SuS stanzen enthalten. In diesem Fall können diese Anteile
für die Aufarbeitung gesammelt werden.
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Die in der oben beschriebenen Weise erhaltene angereicherte Flüssigkeit
kann entweder als solche verwendet werden, indem man sie der Hauptadsorption zuführt,
man kann auch aus ihr die aktiven Substanzen als teilweise gereinigtes festes Konzentrat
abtrennen und aus diesem Konzentrat wiederum die Ausgangslösung für die Hauptadsorption
herstellen.
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Das Harz wird für die Hauptadsorption von Vitamin B12 vorbereitet,
indem man eine Lösung von vorzugsweise etwa 3 bis 6g Kalium- oder Natrium-Cyanid
je Ioo g Harz durch das mit Säure ausgewaschene Harz leitet, um es teilweise in
die Cyanidform umzuwandeln. Der aus der Vor-
adsorption abströmenden
angereicherten Flüssigkeit oder der Lösung, die aus dem entsprechenden Konzentrat
hergestellt ist, werden etwa O, I bis 3 g eines löslichen Cyanids, z. B. Kalium-
oder Natrium-Cyanids, je Gramm Vitamin-Bl2-aktiver Substanz in der Ausgangs lösung
zugesetzt. Es werden also 2 bis 60 Mol Cyanid/Mol Vitamin-Bl2-aktiver Substanz (errechnet
unter der Annahme eines durchschnittlichen Molekulargewichtes von 1400) verwendet.
Nach dem Zusatz von Cyanid läßt man die Ausgangslösung 10 bis I5 Minuten stehen
und leitet sie dann durch das Harz, welches man anschließend mit Wasser auswäscht.
Die Menge an Ausgangs lösung, die dem Harz zugesetzt werden kann, ohne daß nennenswerte
Mengen von aktiven Substanzen durchbrechen, variiert in einem gewissen Ausmaß je
nach der relativen Wirksamkeit oder Reinheit der Ausgangslösung und der Adsorptionskapazität
des Harzes. Im allgemeinen indessen ist es bei den bevorzugt verwendeten stark basischen
und hochporösen Harzen möglich, so viel Ausgangslösung zuzusetzen, daß etwa I g
Vitamin-B12-aliver - Substanzen auf 100 g Harz (trocken) kommt, bevor ein merklicher
Durchbruch von aktiven Substanzen erfolgt.
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Während des Durchganges der Ausgangslösung und des Wassers durch
das Harz kann die abströmende Flüssigkeit, die die Masse der Verunreinigungen einschließlich
einiger gefärbter Verunreinigungen enthält, verworfen werden, bis eine rötlichorange
oder purpurne Färbung auftritt, was ein Zeichen dafür ist, daß etwas Vitamin B12
nicht mehr adsorbiert wurde. In diesem Fall müssen die gefärbten Anteile der abströmenden
Flüssigkeit zur Aufarbeitung gesammelt werden. Nachdem die gewünschte Menge der
Ausgangslösung dem Harz zugeführt ist, läßt man dieses mit der Lösung zweckmäßig
etwa 2 bis 3 Stunden stehen, wie oben angegeben wurde, damit sich ein Gleichgewicht
einstellt. Das Harz wird dann mit destilliertem Wasser gewaschen, um die verbleibende
Flüssigkeit und die mit dieser in Kontakt stehenden Verunreinigungen zu entfernen.
Diese Wäsche wird so lange fortgesetzt, bis die abströmende Lösung im wesentlichen
farblos geworden ist und der Feststoffgehalt weniger als 0,05 mg/ccm beträgt.
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Während der Wäsche werden natürlich alle Anteile, die rötlichorange
oder purpurn gefärbt sind urid damit die Anwesenheit Vitamin-Bl2-aktiver Substanzen
anzeigen, für die Aufarbeitung gesammelt.
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An diesem Punkt des Verfahrens sind die Vitamin-Bl2-aktiven Substanzen,
die von ihren meisten Verunreinigungen befreit sind, an das Harz anscheinend in-
Form eines Komplexes aus Vitamin, Cyanid und Harz gebunden.
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Zur Gewinnung von Vitamin B12 aus dem Harzadsorbat dient als Eluierungsmittel
die Lösung einer Säure, da Säuren die obengenannten Komplexe aus Vitamin,, Cyanid
und Harz anscheinend brechen. Man kann auch Salzlösungen zum Eluieren verwenden,
aber sie sind weniger wirksam als Säuren. Man hat eine große Zahl von Säuren zum
Eluieren verwendet, z. B. Schwefel-, Salz-, Phosphor- und Essigsäure. Diese alle
eluieren mindestens goO/o, häufig fast I00°/e des Vitamin B12. Andere Säuren wie
Glutamin- und Zitronensäure oder Salze wie Mononatrium-oder Kaliumphosphat, Natrium-
und Kaliumchlorid und Natrium- und Kaliumsulfat und Basen wie Natriumhydroxyd sind
zwar ziemlich wirksam, entfernen aber im allgemeinen weniger als goO/o des adsorbierten
Vitamins Bl2. Das Eluieren mit einer Base scheint das Vitamin B12 in Form eines
Cyanidkomplexes zu entfernen, wodurch eine Säurebehandlung erforderlich ist, um
das Vitamin B12 in Freiheit zu setzen.
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Die Konzentration der zum Eluieren -verwendeten Säure hängt natürlich
von ihren Eigenschaften ab. Bei starken und weitgehend ionisierten Säuren, wie Salz-,
Schwefel- und Phosphorsäure, können Konzentrationen bis etwa zur Normalität verwendet
werden. Höhere Konzentrationen sollten vermieden werden, um mögliche Schädigungen
des Vitamins B12 während der Eluierung zu vermeiden.
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Bei schwach ionisierten Säuren ist es dagegen möglich, viel höhere
Konzentrationen zu verwenden. Beispielsweise kann man Essigsäure in jeder beliebigen
Konzentration verwenden, sogar Eisessig, ohne daß Vitamin B12 geschädigt wird.
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Es empfiehlt sich, als E, luierungssäure die gleiche Säure zu verwenden,
die zur Vorbehandlung des Harzes verwendet wurde, so daß die Eluierung gleichzeitig
auch der Regenerierung des Harzes für die Wiederverwendung in einem weiteren Adsorptionskreislauf
dient. Hierfür sind g0/oige wäßrige Lösungen von Essigsäure oder Salzsäure als bevorzugte
Eluierungsmittel zu betrachten.
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Bei dieser Eluierung wird Cyanwasserstoff frei gemacht, so daß eine
hinreichende Entlüftung erfolgen muß. Die abströmende Lösung wird so lange verworfen,
bis eine purpurrote Färbung auftritt.
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Dann wird die abströmende Flüssigkeit als angereicherter Schnitt
so lange gesammelt, bis sie ihre Farbe in helles Orange oder Gelb ändert. Von da
an wird die abströmende Flüssigkeit gesondert aufgefangen, bis sie im wesentlichen
farblos geworden ist. Die letztgenannte Lösung kann 2 bis 3 O/cr des Vitamins B12
enthalten und durch Rücklauf zurückgeführt werden zur Gewinnung des Vitamins in
einer früheren Stufe des Verfahrens.
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-Die angereicherte Fraktion kann in bekannter Weise behandelt werden,
um aus ihr das Vitamin B12 abzuscheiden. Beispielsweise kann man hierfür etwa 10
Raumteile Aceton zusetzen und das Gemisch stehenlassen. Dabei kristallisiert die
Masse des Vitamins B12 direkt aus dem Gemisch aus. Die so erhaltenen Kristalle haben
oft eine Reinheit von goO/o oder mehr. Man kann auch die angereicherte Fraktion
zwei- bis dreimal mit Chloroform-Kresol (I: I) extrahieren, wobei man jedesmal I
Volumen des Lösungsmittelgemisches verwendet, das etwa 0,1 Volumen der angereicherten
Flüssigkeit entspricht. Nach Zusatz von etwa 2 Raumteilen Aceton und 2 Raumteilen
Äther zu dem gewonnenen Extrakt wird Vitamin B12 von einer Reinheit von etwa 80
bis goO/o ausgefällt. Produkte höherer
Reinheit lassen sich durch
Umkristallisieren des 80- bis 9-loigen Produktes aus Wasser gewinnen.
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Die Möglichkeit der direkten Gewinnung eines Produktes von einer
Reinheit von 80 bis go°/o aus der angereicherten Fraktion hängt zu einem gewissen
Grad von der Art und Weise der Eluierung sowie davon ab, wie der angereicherte Schnitt
der abströmenden Lösung genommen wird. Die abströmende Flüssigkeit mit der höchsten
Vitamin-Bl2-Wirksamkeit kann häufig auf direkte Gewinnung eines Produktes von einer
Reinheit von 80 bis go°/o aufgearbeitet werden. Andererseits ist die Reinheit des
direkt abgeschiedenen Produktes etwas geringer, wenn angereicherte Schnitte in größerem
Umfang ausgewählt werden, die eine noch stärker quantitative Gewinnung von Vitamin
B12 ermöglichen.
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Ein weiterer Einfluß, der mit der Möglichkeit der direkten Abscheidung
eines hochgereinigten Produktes aus der abströmenden Lösung in Beziehung steht,
ist der Grad und die Art der Reinigung, die vor der Hauptadsorption erreicht wurde.
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In diesem Zusammenhang ist indessen darauf hinzuweisen, daß das oben
beschriebene Verfahren der Adsorption von Vitamin B12 in Form eines Komplexus aus
Cyanid, Harz und Vitamin B12 selbst dann noch einen erheblichen Vorteil für die
technische Durchführung bietet, wenn das direkt aus der abströmenden Flüssigkeit
abgeschiedene Produkt eine Reinheit von nur 20 bis 300/0 hat.
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Wenn auch Vitamin B12 in einer Reinheit von etwa 80 bis go O/o im
allgemeinen selbst aus solchen von der Hauptadsorption abströmenden Flüssigkeiten
hergestellt werden kann, welche eine Wirksamkeit von nur 20 bis 30 ovo haben, indem
man aus dieser Flüssigkeit Cyanwasserstoff entfernt und Vitamin B12 in bekannter
Weise wiederholt ausfällt und/oder kristallisiert, um Produkte von steigender Wirksamkeit
zu erhalten, ist die weitere Reinigung des 80- bis go0/oigen Vitamins B12 zu einem
Produkt von einem Reinheitsgrad bis zu 99 °/o lediglich durch Kristallisation oft
viel schwieriger zu erzielen. Wenn man eine Lösung, die aus einem Produkt hergestellt
ist, in welchem 40 bis 50°/o oder mehr des gesamten Feststoffgehaltes aus Vitamin
Bl2 bestehen, der ergänzenden Behandlung mit einem Anionenaustauschharz in Abwesenheit
von Cyanionen unterwirft, erhält man mittels der üblichen Verfahren zur Kristallisation
von Vitamin B12 leicht Produkte, deren Reinheit gg°/o erreicht oder sogar überschreitet.
Dies beruht anscheinend auf der Entfernung von Verunreinigungen durch das Harz,
welche das Erreichen eines solchen Reinheitsgrades bei der Kristallisation stören.
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Es ist in diesem Zusammenhang zu beachten, daß das oben beschriebene
Verfahren der ergänzenden Behandlung von Vitamin-B12-Lösungen mit Anionenaustauschharz
in Abwesenheit von Cyanionen sich außer auf die hier beschriebene Vitamin-Bl2-Adsorption
allgemein anwenden läßt. So können auch andere Vitamin-B12-Lösungen, deren Feststoffe
40 bis 50°/o oder mehr Vitamin-B12-aktive Substanzen enthalten, gleichgültig, ob
sie mittels des hier beschriebenen Verfahrens oder auf anderem Wege erhalten wurden,
mit einem Anionenaustauschharz in Abwesenheit von Cyanionen in Kontakt gebracht
werden, um durch Adsorption der Verunreinigungen der Vitamin-Bl2-aktiven Substanzen
eine Reinigung zu bewirken.
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Nachfolgend wird die Durchführung der Erfindung an Hand einiger Beispiele
gezeigt.
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Beispiel 1 A. Entfernung der Verunreinigungen durch Harzaustauscher
Eine Harzsäule wird wie folgt hergestellt: Man bringt 10 1 eines stark basischen
Anionenaustausch harzes mit quaternären Ammoniumgruppen in einen Glaszylinder von
einem Innendurchmesser von I0,2 cm und einer Höhe von 2,4 m. Man läßt etwa 36 1
einer wäßrigen 30/oigen Nlatriumhydroxydlösung durch das Harz mit einer Geschwindigkeit
von etwa 500 ccm/min von oben nach unten strömen.
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Dann wird Wasser von oben nach unten durch das Harz geleitet, um überschüssiges
Natmumhydroxvd zu entfernen. Etwa 25 1 einer 250/oigen wäßrigen Essigsäure werden
dann durch das Harz mit einer Geschwindigkeit von etwa 300 ccm/min von oben nach
unten geleitet, worauf man anschließend mit destilliertem Wasser nachwäscht, um
die Essigsäure zu entfernen. Dabei beläßt man genügend Wasser in der Säule, daß
das Harz bedeckt bleibt.
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Nun liegt die Säule in Form des Azetates vor.
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500 g festes Konzentrat, das durch Konzentrierung und Reinigung einer
Gärungsbrühe gewonnen wird, die durch Gärung mit S. griseus auf einem geeigneten
Nährboden erhalten wurde und etwa 150 g Diatomeenerde als Filterungshilfsmittel
sowie Vitamin-B12-aktive Substanzen von maximal etwa 20 g enthält (gemessen durch
die Lichtabsorption in wäßriger Lösung bei 5500 Å), werden mit Wasser extrahiert,
bis man einen farblosen Extrakt erhält. Die Extrakte werden filtriert. Es sind etwa
4 1 Wasser erforderlich. Die vereinigten Extrakte werden durch die Säule von 10
1 Harz mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 ccm/min abwärts strömend geleitet,
worauf man anschließend mit der gleichen Geschwindigkeit mit Wasser nachwäscht.
Die abströmende Flüssigkeit wird verworfen, bis sich eine erste Färbung zeigt. Dann
sammelt man die abströmende Flüssigkeit als angereicherten Schnitt, bis die Farbe
von Rot nach Hellrosa oder Gelb wechselt. Von diesem Zeitpunkt an wird die abströmende
Flüssigkeit gesondert aufgefangen, bis sie im wesentlichen farblos geworden ist.
Die letatgenanute, gesondert aufgefangene Flüssigkeit, deren Volumen etwa 201 beträgt,
enthält einen kleinen Teil der Vitamin-Bl2-aktiven Substanzen und wird zur Aufarbeitung
einer früheren Verfahrensstufe zurückgeführt.
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Aus dem zuerst aufgefangenen angereicherten Schnitt, dessen Volumen
etwa 201 beträgt und der etwa go bis 950/oil der Vitamin-B12-aktiven Substanzen
enthält, wird das aktive Material entfernt
indem man die Lösung
zwei- oder dreimal mit Kresol-Kohlen, stofftetrachlorid (1 : 1) behandelt, wobei
man jedesmal etwa 0,1 Raumteil Lösungsmittel nimmt. Die verbrauchte wäßrige Schicht
ist im wesentlichen farblos. Den vereinigten Extrakten setzt man unter Rühren etwa
100 g Diatomeenerde als Filterungshilfsmittel, etwa 2 Raumteile Aceton und etwa
2 Raumteile Äthyläther zu. Das entstandene Gemisch von Präzipitat und Filterungshilfsmittel
wird durch einen Filter filtriert, welcher zuvor mit etwa 50 g Filterungshilfsmittel
überzogen wird. Der Feststoff wird mit etwa 4 1 Aceton und anschließend etwa I 1
Äthyl äther ausgewaschen und dann bei Raumtemperatur an Luft getrocknet.
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Der gefrocknete Feststoff, etwa 400 g, wird mit Wasser extrahiert,
bis man einen farblosen Extrakt erhält, und die Extrakte werden filtriert. Es sind
etwa 2 1 Wasser erforderlich.
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B. Entfernung von Vitamin B12 durch Harzaustauscher Es wird eine
zweite Harzsäule, wie unter A beschrieben, hergestellt. Es werden etwa 120 g Kaliumcyanid
in etwa 1 1 Wasser gelöst. Man läßt diese Lösung mit einer Geschwindigkeit von etwa
5 bis 10 ccm/min durch die 10 1 Harz nach unten fließen. Nun liegt die Säule zum
Teil in Acetat-und zum Teil in Cyanidform vor (etwa 63 °/o-Acetat und 37°/o Cyanid).
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Den kombinierten wäßrigen Extrakten des Präzipitats, welches man
aus der Flüssigkeit erhält, die von der ersten Harzsäule abströmt, setzt man etwa
60 g Kaliumcyanid zu und rührt die Lösung etwa I5 Minuten. Diese Lösung wird dann
auf die Säule des Acetat- Cyanid-Harzes geleitet, und zwar mit einer Geschwindigkeit
von etwa 5 bis Ioccm/min, worauf man mit etwa der gleichen Geschwindigkeit mit etwa
2 1 destilliertem Wasser nachwäscht. Dann wird die Säule mit destilliertem Wasser-
mit einer Geschwindigkeit von etwa 100 ccm/min gewaschen, bis die abströmende Flüssigkeit
im wesentlichen farblos ist und ihr Gesamtgehalt an Feststoffen weniger als etwa
0,05 mg/ccm beträgt. Bald nachdem der erste Teil der vorerwähnten uyam.dbehandelten
Extrakte in der abströmenden Flüs.sigkeit erscheint, folgt eine rötlichorange oder
orangepurpurn gefärbte Fraktion, welche eine kleine Menge von Vitamin-B 22-aktiven
Substanzen enthält. Diese Fraktion wird gesondert aufgefangen und zur Aufarbeitung
einer früheren Stufe des Verfahrens zugeführt.
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(Wenn das gleiche Verfahren ausgeführt wird, man jedoch zwischen
dem Zusatz der cyanid behandelten Extrakte zur Säule und dem Auswaschen derselben
mit Wasser 2 bis 3 Stunden stehenläßt, ist der obenerwähnte anfängliche Durchbruch
kleiner Mengen von Vitamin-B12-aktiven Substanzen im wesentlichen beseitigt. Die
Verweilzeit von 2 bis 3 Stunden scheint eine noch stärker quantitative Adsorption
der Vitamin-Bj2-laktiven Substanzen durch das Harz zu ermöglichen).
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Dann wird wäßrige Essigsäure, deren Konzentration etwa 5 56/o beträgt
und die vorzugsweise auf etwa 50 abgekühlt ist (während des Eluierens wird Wärme
entwickelt), durch das mit Wasser aus. gewaschene Harz mit einer Geschwindigkeit
von etwa 75 cm/min von oben nach unten geleitet, um das Vitamin B12 zu eluieren.
Die abströmende Flüssigkeit wird verworfen, bis die erste rötlichpurpurne Färbung
auftritt. Die abströmende Fldssigkeit wird nun als angereicherter Schnitt aufgefangen,
bis sich ihre Farbe in ein helles Orange oder Gelb ändert. Von da an wird die Flüssigkeit
wiederum gesondert aufgefangen, bis sie im wesentlichen farblos geworden ist. Die
letztgenannte, gesondert laufgefangene Fraktion, deren Volumen etwa 8 1 beträgt,
enthält nur einen kleinen Bruchteil des vorhandenen Vitamins Bl2. Sie wird zur Aufarbeitung
einer früheren Verfahrensstufe zugeführt.
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Aus der angereichterten Fraktion, die etwa 8 1 ausmacht, wird Vitamin
Ble dadurch entfernt, daß man sie etwa dreimal mit Kresol-Kohlenstofftetrachlorid
(I : I) extrahiert, wobei man zuerst mit etwa 0,1 Raumteil Lösungsmittel und darauf
jedesmal mit 0,05 Raumteilen Lösungsmittel auswäscht, bis die verbrauchte wäßrige
Schicht im wesentlichen farblos ist. Den vereinigten Extrakten werden unter Rühren
etwa 2 Raumteile Äceton und 2 Raumteile Äthyläther zugesetzt. Es bildet sich ein
Präzipitat, welches durch Filtration auf einem Filter entfernt wird, das zuvor mit
einem Filterungshilfsmittel überzogen ist. Dann wäscht man mit Aceton und trocknet
im Vakuum bei Raumtemperatur.
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C. Gewinnung von reinem Vitamin B12 Der getrocknete Feststoff wird
mit Wasser extrahiert, bis man einen farblosen Extrakt erhält.
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Die Extrakte werden filtriert und auf eine Konzentration von etwa
5 bis 10 mg Vitamin B12 je ccm, die durch Messung der Lichtabsorption bei 5500 A
bestimmt wird, verdünnt. Die Kristallisation des Vitamins B12 wird durch Zusatz
von etwa 7 bis 10 Raumteilen Aceton bewirkt, die man langsam unter leichtem Rühren
zusetzt. Man erhält eine optimale Ausbeute an kristallinem Vitamin Bt2, indem man
das Gemisch etwa I6 bis 24 Stunden stehenläßt. Darauf werden die Kristalle durch
Filtration abgetrennt, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Die so erhaltenen Kristalle
stellen Vitamin B12 von einer Reinheit von etwa 85 bis 90% dar. Das Produkt wird
durch einfache Umkristallisation aus Wasser weiter gereinigt, wodurch man eine Reinheit
von über 95 ovo erhält.
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Die Wiederholung des vorgeschriebenen Verfahrens unter Verwendung
verschiedener Ausgangskonzentrate hat zuweilen als anfängliches Produkt ein Vitamin
B12 von einer-Reinheit von etwas unter 85% ergeben. Derartige Produkte geringerer
Reinheit werden zweckmäßig dadurch gereinigt, das man eine wäßrige Lösung des Produktes
durch ein Harzbett leitet, wie es unter A beschrieben ist.
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Nach einer derartigen ergänzenden Harzbehandlung bewirkt der Zusatz
von Aceton zu der abströmenden angereicherten Fraktion häufig die
direkte
Ausfällung von Vitamin B12 von einer Reinheit von 994/o und mehr.
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Beispiel 2 A. Entfernung der Verunreinigungen durch Harzanstauscher
Man stellt eine Harzsäule nach folgender Vorschrift her: Es werden 230 ccm des gleichen
Harzes wie nach Beispiel I in eine Glassäule eingebracht, deren innerer Durchmesser
2,54 cm und deren Höhe 6I cm beträgt. Man leitet etwa 700 ccm einer wäßrigen 3%igen
Natriumhydroxydlösung mit einer Geschwindigkeit von etwa 5 ccm/min abwärts strömend
durch das Harz, daran snschließend eine wäßrige Natriumchloridlösung mit der gleichen
Geschwindigkeit, bis die abströmende Flüssigkeit wird nun als angereicherter Schnitt
der gleichen Geschwindigkeit mit destilliertem Wasser gewaschen, bis das Waschwasser
keine Chlorionen mehr enthält. Man beläßt in der Säule ausreichend Wasser, damit
das Harz bedeckt bleibt.
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Nun liegt das Harz in Form des Chlorides vor.
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41 g eines Vitamin-B12-Konzentrates, welches maximal etwa 31/1% Vitamin-B12-aktiver
Substanzen enthält, wird in etwa 115 ccm Wasser gelöst. Die nicht gelösten Feststoffe
werden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit von
etwa 4 ccm/min abwärts strömend durch das Harz geleitet, worauf man Wasser mit der
gleichen Geschwindigkeit folgen läßt. Das Waschwasser wird so lange verworfen, bis
eine Färbung auftritt. Dann wird es als angereicherter Schnitt so lange gesondert
aufgefangen, als es noch gefärbt ist. Auf diese Weise erhält man etwa 475 ccm einer
angereicherten Flüssigkeit.
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B. Entfernung von Vitamin B12 durch Harzaustauscher Das Harz, das
zur Entfernung der Verunreinigung dient, wird in der gleichen Weise regeneriert,
wie es im vorhergehenden Abschnitt beschrieben ist. Es werden etwa 3 g Natriumcyanid
in 30 ccm Wasser gelöst. Diese Lösung wird mit einer Geschwindigkeit von etwa 4
cem/min abwärts strömend durch das. Harz geleitet. Dann liegt das Harz teilweise
als Chlorid, teilweise als Cyanid vor.
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Der von der ersten Harzbehandlung abströmenden angereicherten Flüssigkeit
werden etwa 3 g Natriumcyanid zugesetzt. Die Lösung wird etwa 10 Minuten gerührt.
Diese Lösung wird nun mit einer Geschwindigkeit von etwa 4 ccm/min oben auf die
Harzsäule geleitet. Dieser Lösung folgen etwa 450 ccm destilliertes Wasser mit gleicher
Geschwindigkeit Dann wird die Säule mit einer Geschwindigkeit von etwa I2 bis 15
ccm/min mit destilliertem Wasser ausgewaschen, bis das Waschwasser im wesentlichen
farblos und der gesamte Feststoffgehalt des Waschwassers unter etwa 0,05 mg/ccm
liegt.
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Nun läßt man eine 5%ige wäßrige Lösung von Essigsäure mit einer Geschwindigkeit
von etwa 1 ccm/min abwärts durch das Harz fließen. Das Waschwasser wird so lange
verworfen, bis in ihm eine rotpurpurne Färbung auftritt. Dann wird es in Anteilen
von je 50 ccm als angereicherter Schnitt gesammelt, bis es im wesentlichen farblos
geworden ist. Es werden etwa fünf solche Anteile aufgefangen. Die ersten beiden
Fraktionen enthalten die Masse des Vitamins B12. Sie werden mit 10 Raumteilen Aceton
verdünnt und stehengelassen, worauf die Kristallisation einsetzt. die erhaltenen
Kristalle (etwa -1,383 g vor der Trocknung) stellen Vitamin B12 von einer Reinheit
von etwa 90% (auf wasserfreier Basis) dar. Die verbleibende Fraktion geringerer
Reinheit wird erneut aufgearbeitet.
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Die Aufteilung der Vitamin-B12-aktiven Substanzen auf die verschiedenen
Verfahrensstufen sind in der nachfolgenden Tabelle aufgezeigt. Die in der Spalte
»Gramm aus Gesamtfärbung« angegebenen Zahlenwerte sind ein Maß für die Konzentration
von Vitamin-B12-aktiven Substanzen.
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Die Werte sind aus Messung der optischen Dichte der Lösung bei 5500
Ä berehcnet, wobei der Bezugswert für reines Vitamin B12 El96 = 64 ist.
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Bestandteil Gramm aus Gesamtfärbung Säule I Beschickungsgut.................1,350
Vitaminreicher Durchbruch *) (Beschickungsgut für Säul II).....................1,310
Restschnitt..................0,023 Wäsche mti 55%iger Essigsäure..................0.062
Säule II Beschickungsgut I, . . . . . . 1,310 Durchbruch..................0,126
Elaut 1.....................0,630 (0,750g Kristalle) Eluat 2 ; o, .. .. .. . . ..
. . 0,425 (0,633 g Kristalle) Eluat 3.......................0,136 Elaut 4.......................0,029
Elaut 5.......................0,0083 * Vitaminreicher Durchbruch bezeichnet den
Sättigungspunkt des Harzes. Bei der adsorptiven Bindung aktiver Stoffe an Harze
ist die Grenze der Adsorptionsfähigkeit des Harzes gewöhnlich dann erreicht, wenn
keine weiteren aktiven Substanzen von dem Harz adsorbiert werden, die aktiven Substanzen
mithin die Harzsäule ungebunden passieren. Dieser Punkt wird als »Durchbruch« bezeichnet.
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In der vorstehenden Tabelle ist zu beachten, daß die Werte für »Gramm
aus Gesamtfärbung« auf Messung der optischen Dichte beruhen, die infolge ihrer Natur
stets Näherungswerte sind. Die Tatsache, daß die Gesamtfärbung in den Eluatfraktionen
(Säule II) die Gesamtfärbung des Beschickungsgutes übersteigt, beruht auf der Anwesenheit
von Vitamin-Bl2-analogen Stoffen, wie Vitamin Bt2a, im Beschickungsgut. Die Messungen
der optischen Dichte erfolgen bei 5500 Å, wo Vitamin B12 maximal absorbiert. Bei
dieser Wellenlänge ist indessen die Absorption durch die Vitamin-B, 2-analogen Stoffe
nicht so groß, und
infolgedessen ergeben Berechnungen, die den
für Vitamin B12 charakteristischen Wert von El96 = 64 zugrunde legen, einen etwas
niedrigeren Näherungswert, als Vitamin-Bl2-aktive Substanzen, die tatsächlich im
Beschickungsgut enthalten sind.
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Nach dieser Erläuterung sieht man, daß die Werte für Säule II eine
erhebliche Umwandlung von Vitamin-Bl2-analogen Stoffen, wieVitamin Bl2 a, in Vitamin
B12 in der Hauptadsorptionsstufe(Säule II) anzeigen.
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Beispiel 3 Eine wäßrige Lösung von Vitamin B12, die etwa 10 mg Vitamin
B12 und Vitamin-Bl2-ähnliche Verbindungen sowie 90 mg nicht identifizierte Verunreinigungen
je ccm enthält, wird mit 60 mg Kaliumcyanid je ccm behandelt. Dann werden Anteile
von je 5 ccm der erhaltenen Lösung, deren jeder 5I,5 mg Vitamin B12 (gemessen bei
5500 Å) enthält, durch Säulen eines stark basischen Anionenaustauschharzes mit quaternären
Ammoniumgruppen im Molekül geleitet, welche 25 ccm Harz enthalten und in Form des
Hydroxydes, des Acetates bzw. des Cyanid-Acetates vorliegen. Die Säulen werden mit
Wasser gewaschen und mit 50/oiger wäßriger Essigsäure eluiert. Das Verfahren entspricht
dem im Beispiel 2, B beschriebenen Verfahren. Es wurde gefunden, daß in jedem Beispiel
Vitamin B12 adsorbiert, die Eluierung leicht bewirkt und eine erhebliche Reinigung
erzielt wird.
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Vergleichswerte zeigen, daß sowohl die Adsorption je Einheit Harz
als auch die Reinigung entsprechend der Form variiert, in welcher das Harz vorliegt.
mg Vitamin B12 (Färbung)
| Im Eluat- |
| Form des Harzes Im Eluat Adsrption*) |
| durchbruch |
| Cyanid-Acetat 4I 56 8090°/O |
| Acetat 37 54 6o - 80010. |
| Hydroxyd 24 48 weniger |
| als 500/0 |
* Unter der Annahme einer IooO/Oigen Eluierung des adsorbierten Vitamins B1,.
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Beispiel 4 Man leitet durcheine Säule aus dein gleichen Harz wie
im Beispiel 3, welche 95 ccm Harz als Cyanid enthält, etwa 5 ccm einer wäßrigen
Lösung, die etwa 10 mg Vitamin-Bl2-aktive Substanzen und go mg nicht identifizierte
Verunreinigungen je ccm enthält. Die Säule wird mit Wasser ausgewaschen und mit
einer 5°/oigen wäßrigen Essigsäurelösung eluiert. Das Verfahren entspricht demjenigen
gemäß Beispiel 2, B. Es wurde gefunden, daß Vitamin B12 adsorbiert, die Eluierung
leicht bewirkt und eine erhebliche Reinigung erzielt wird. Bei der Eluierung enthält
das angereicherte Eluat 39 mg Vitamin B12 im Vergleich zu einer Gesamtmenge voh
51 mg in dem Eluat + dem Durchbruch, woraus zu ersehen ist, daß die Adsorption (unter
der Annahme einer Ioo°/oigen Eluierung) etwa 70 bis 80 % beträgt.
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Beispiel 5 Man leitet durch eine Säule von dem gleichen Harz wie
im Beispiel 3, welches in Form des Cyanid-Acetates vorliegt und mit Methanol gefüllt
ist, eine mit Kaliumcyanid behandelte methylalkoholische Lösung eines Vitamin-Bl2-Konzentrates.
Die Säule wird anschließend mit Methanol, Wasser und Methanol gewaschen und dann
mit einer methylalkoholischen 1 o0/oigen Essigsäurelösung eluiert. Dieses Verfahren
entspricht im übrigen demjenigen gemäß Beispiel 2, B. Es wurde gefunden, daß Vitamin
B12 adsorbiert, die Eluierung leicht bewirkt und eine Reinigung erzielt wird. Die
Adsofption beträgt in diesem Fall, bezogen auf das Verhältnis von Vitamin B12 im
Eluat (angereicherter Schnitt)O/Vitamin B12 im Eluat + Durchbruch, d. h. auf 23
: 37 mg, etwa 60 bis 806/o.
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Man leitet durch eine Säule von dem gleichen Harz wie im Beispiel
3, welches in Form des Cyanid-Acetates vorliegt und mit Wasser gefüllt ist, eine
mit Kaliumcyanid behandelte wäßrige Lösung eines Vitamin-Bl2-Konzentrates. Die Lösung
wird anschließend mit Wasser und Methanol gewaschen und dann mit 5%iger methylalkoholischer
Essigsäure eluiert. Das Verfahren entspricht im übrigen dem im Beispiel 2, B beschriebenen
Verfahren. Es wurde gefunden, daß Vitamin B12 adsorbiert, die Eluierung leicht bewirkt
und eine Reinigung erzielt wird. Die Adsorption beträgt in diesem Fall über 90%,
d. h.
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47,7 mg Vitamin B12 im Eluat (angereicherter Schnitt) je 49,7 mg Vitamin
B12 im Eluat + Durchbruch, was ein Anzeichen dafür ist, daß als Ausgangsgut eine
wäßrige Lösung besser als eine methylalkoholische ist.
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Beispiel 6 Eine mit Kaliumcyanid behandelte wäßrige Lösung eines
Vitamin-B12-Konzentrates wird in drei gleiche Teile geteilt. Die Teile werden auf
pE 4, 7 bzw. 9 eingestellt, und jeder dieser Teile wird gemäß Beispiel 2, B behandelt.
Es wurde gefunden, daß bei den verschiedenen pH-Werten im wesentlichen die gleiche
Adsorption, Eluierung und Reinigung erzielt wird.
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Beispiel 7 Das Verfahren gemäß Beispiel 2 wird mit der Maßgabe wiederholt,
daß man ein stark basisches Anionenaustauschharz mit quaternären Ammoniumgruppen
verwendet. Es wurde gefunden, daß die Verunreinigungen durch Behandlung mit.dem
Harz in Abwesenheit von Cyanid entfernt werden und daß in Anwesenheit von Cyanid
die Adsorption von Vitamin B12 erfolgt, daß die anschließende Eluierung leicht bewirkt
und eine Reinigung erzielt wird. Die Adsorption beträgt in diesem Fall
etwa
60 bis 8o 0/o, d. h. etwas weniger, als sie mit »Amberlite XE-75« oder »XE-98« erzielt
wird.
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Beispiel 8 Das Verfahren gemäß Beispiel 2 wird in drei getrennten
Versuchsreihen wiederholt, wobei an Stelle eines stark basischen Anionenaustauschharzes
mit quaternären Ammoniumgruppen nunmehr ein hearzartiges Kondensationsprodukt aus
Phenolformaldehyd und Alkylenpolyamin mit primären, sekundären und tertiären Aminen
und Phenolgruppen sowie ein stark basisches Polyaminharz als Anionenaustauschharze
nunmehr verwendet werden. Es wurde gefunden, daß die Verunreinigungen durch Behandlung
mit dem Harz in Abwesenheit von Cyani!d entfernt werden und in seiner Anwesenheit
Vitamin B12 adsorbiert wird, daß die anschließende Eluierung leicht bewirkt und
eine Reinigung erzielt wird. Die Adsorption war indessen bei Verwendung dieser Harze
verhältnismäßig niedrig, d. h., es wurden weniger als 500/0 der aktiven Substanzen
adsorbiert und als Eluat (angereicherter Schnitt) gewonnen.
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Beispiel g Das Verfahren gemäß Beispiel 2 wird mit der Maßgabe wiederholt,
daß ein Kondensationsprodukt vom Molamintypus verwendet wird. Es wurde gefunden,
daß die Verunreinigungen durch Behandlung mit dem Harz in Abwesenheit von Cyanid
entfernt werden und daß in seiner Anwesenheit die Adsorption von Vitamin B12 erfolgt,
daß die anschließende Eluierung leicht bewirkt und eine Reinigung erzielt wird.
Die Adsorption an diesem Harz war verhältnismäßig hoch; es werden etwa 70 bis goO/o
der aktiven Substanzen adsorbiert und als Eluat (angereicherter Schnitt) gewonnen.
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Beispiel 10 Das Verfahren gemäß Beispiel 2, B wird mit der Maßgabe
wiederholt, daß gleiche Teile des Harzadsorbates getrennt mit je einer wäßrigen
Lösung -von Schwefel-, Salz-, Phosphor-, Glutamin-, Zitronensäure, einbasischem
Kaliumphosphat bzw.
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Natriumhydroxyd eluiert werden. Mit den ersten drei Lösungen erzielt
man eine gute Eluierung (900/0. oder mehr), mit den nächsten drei Lösungen eine
annehmbare Eluierung (60 bis 90°/9) und mit Natriumhydroxydlösung eine recht schlechte
Eluierung (weniger als 500/0).
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Das oben beschriebene Verfahren wird wiederholt, und das Harzadsorbat
wird abwechselnd mit wäßriger Natriumchloridlösung, Wasser, Natriumchloridlösung,
Wasser, einbasischem Natriumphosphat, Wasser, Natriumsulfat und Wasser eluiert und
gewaschen, und zwar in jedem Fall so lange, bis die abströmende Flüssigkeit im wesentlichen
farblos geworden ist. In jeder Fraktion ist Vitamin B12 in verschiedenen Anteilen
enthalten, und das gesamte Vitamin B12 wird im wesentlichen eluiert.
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Beispiel II Es werden mehrere wäßrige Vitamin-B12-aktive Konzentrate
nach dem gleichen Verfahren gewonnen und gereinigt, indem man sie durch eine Säule
leitet, die 45 1 eines stark basischen Anionenaustauschharzes mit quaternären Ammoniumgruppen
in Acetatform enthält. Die Konzentrate haben ein Volumen von 151 bis 227 1. Die
Leitung der Lösungen durch die Säulen und das Auffangen der Fraktionen erfolgt im
allgemeinen gemäß den Beispielen I, A und 2, A. In jedem Fall zeigen Farbmessungen,
daß die gefärbten Verunreinigungen im wesentlichen entfernt werden. Die weiteren
Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.
| B12-aktive Substanzen, g* Gesamte Feststoffe, g* |
| Versuchs- (angereicherte (angereicherte |
| Nr. Beschickung Fraktion) Beschickung Fraktion) |
| der Säule abströmeade der Säule abströmende |
| Flüssigkeit - Flüssigkeit |
| I 87,3 76,7 8I40 5200 |
| 2 64,0 64, o 5IOO 4270 |
| 3 77,6 72,0 6730 5200 |
| 4 64,3 59,5 4470 3120 |
| 5 38,2 35,9 65oo 5550 |
| 6 48,4 48,8 8050 5950 |
* Die Harzeinlagen sind in allen Beispielen in Raumteilen angegeben, gemessen unter
Verwendung von radioaktivem VitamiriBl2 als Spurensubstanz.
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PATENTANSPR0CIIE : I. Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von
Vitamin B12 aus einem Verunreinigungen enthaltenden Vi tamin-B12-aktiven Konzentrat,
dadurch gekennzeichnet, daß man eine die Vitaminsubstanz und die Verunreinigungen
enthaltende Lösung in Gegenwart von Cyanionen mit einem mäßig bis stark basischen
und mäßig bis stark porösen Anionenaustauschharz behandelt, dessen Austauschkapazität
im wesentlichen auf quaternären Ammoniumgruppen beruht.