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Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 und anderen LLD- und APF-aktiven
Substanzen Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Herstellung von
Konzentraten, welche Vitamin B12 in Kombination mit anderen LLD- (Lactobacillus
Lactis Dorner) und APF- (Animal Protein Factor) aktiven Substanzen enthalten, und
insbesondere auf Verfahren zur Herstellung von Konzentraten in Form von hochgereinigten
kristallinen Komplexen.
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Bisher wurden Konzentrate von Vitamin B12, die auf verschiedene Weise
z. B. aus Leberextrakten oder durch Fermentation von Kulturflüssigkeiten mit Hilfe
geeigneter Mikroorganismen wie Streptomyces griseus erzeugt worden sind, vorzugsweise
derart gewonnen, daß eine wäßrige Lösung, welche Vitamin B" und andere LLD- und
APF-aktive Substanzen enthielt, z. B. eine Kulturflüssigkeit der vorstehend beschriebenen
Art, mit einem Adsorptionsmittel wie Aktivkohle behandelt und die adsorbierten Substanzen
mit geeigneten Lösungsmitteln, z. B. Mischungen von Wasser mit Methanol, Äthanol
oder Pyridin, ausgezogen werden. Aus diesen Auszügen wurde Vitamin B12 in hochkonzentrierter
und im wesentlichen reiner Form gewonnen.
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Es hat sich jedoch herausgestellt, daß ein großer Teil der Aktivität
der Ausgangslösung während der Adsorption, Extraktion und Aufaibeitung der Auszüge
verlorengeht.
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Es wurde nun gefunden, daß man die Ausbeute an Vitamin B12 und anderen
LLD- und APF-aktiven Substanzen in überraschend einfacher -Weise um mehrere zoo
°/o steigern und außerdem Produkte in
wesentlich höherem Reinheitsgrad
als nach den vorbekannten Verfahren erhalten kann, wenn das neben Vitamin B12 und
LLD- sowie APF-aktive Substanzen enthaltende Adsorbat an Aktivkohle mit einem zweiphasigen
Lösungsmittelsystem, bestehend aus Wasser und einem organischen polaren, mit Wasser
unvollständig mischbaren Lösungsmittel, eluiert wird. (Polare Flüssigkeiten sind
solche, die in flüssigem Zustand Ionen bilden können.) Die dabei zusammen mit dem
Vitamin B12 aus dem Aktivkohleadsorbat eluierten LLD- und APF-aktiven Stubstanzen
sind anscheinend mit dem Vitanün B12 eng verwandt und bilden mit Vitamin B12 kristalline
Komplexe, wenn das gewonnene Konzentrat einen genügenden Reinheitsgrad erreicht
hat.
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Aus dem erhaltenen Eluat können die aktiven Substanzen dann auf verschiedene
Weise gewonnen werden. Sie können z. B. in eine Lösung übergeführt werden, die für
eine chromatographische Behandlung geeignet ist und an einer Tonerdekolonne einer
chromatographischen Reinigung unterworfen werden. Die abfließende Lösung kann aber
auch zunächst einer weiteren Reinigung oder vollständigen Reinigung unterworfen
werden, um neue kristalline Komplexe von Vitamin B12 und verwandten LLD- und APF-aktiven
Substanzen zu bilden.
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Als Extraktionsmittel für das Kohleadsorbat können Mischungen von
Wasser mit einer großen Anzahl von organischen, polaren Lösungsmitteln verwendet
werden, welche nicht vollständig mit Wasser mischbar sind. Das anzuwendende organische
LösungsmitteP sollte nur so weit mit Wasser mischbar sein, daß bei Mischungen im
Verhältnis von r Teil Wasser und z Teil des organischen Lösungsmittels ein Zweiphasensystem
gebildet wird. Es können jedoch auch Variationen in den angewendeten Mengen von
Wasser und orga-. nischen Lösungsmitteln verwendet werden. Wesentlich ist, daß die
zur Extraktion verwendete Mischung ein Zweiphasensystem bildet.
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Als organische Lösungsmittel kommen unter anderem in Betracht: aliphatische
Alkohole, welche mehr als 3 Kohlenstoffatome enthalten, insbesondere normaler, sekundärer
Butylalkohol und Isobutylalkohol, wogegen tertiärer Butylalkohol, der unbeschränkt
mit Wasser mischbar ist, nicht geeignet ist. In Betracht kommen weiterhin: Amylalkohole,
Hexylalkohole und Octylalkohole, Ketone, wie Methyläthylketon und Methyhsobutylketon,
ferner Aralkylalkohole, wie Benzylalkohol, Ester, wie Amylacetat, Arylalkohol, wie
Kresol usw. Als besonders gut geeignet haben sich Butylalkohole, Amylallrohole und
Benzylalkohol erwiesen.
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Bei der Zweiphasenextraktion mit Wasser und einem organischen Lösungsmittel
ist es erforderlich, daß eine genügende: Menge von organischem Lösungsmittel anwesend
ist, um die vorhandene adsorptive Kapazität der Aktivkohle für das organische Lösungsmittel
zu sättigen. Auf z g Kohle sind hierzu z. B. etwa o.,2 ccm Butanol erforderlich.
Vorteilhaft wird ein großer Überschuß von organischem Lösungsmittel verwendet. Dies
gestattet eine Verminderung der zu verwendenden wäßrigen Phase (dies beruht auf
der Tatsache, daß eine bestimmte Mindestmenge von Flüssigkeit für die Behandlung
eines bestimmten Volumens Aktivkohle angewendet werden muß). Die Anwendung großer
Mengen des organischen Lösungsmittels erlaubt die Verwendung entsprechend geringerer
Mengen von Wasser.
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Das Volumen der, wäßrigen Phase muß genügend größer sein als das Volumen
der vorhandenen Aktivkohle, damit der Verlust der wäßrigen Phase bei der Filtration
durch den Kohlekuchen sich nicht zu einem störenden Verlust an wertvollen Substanzen
auswirkt. Das Wasservolumen soll also ausreichen, um das aktive Material praktisch
vollständig und auch das organische Lösungsmittel aus der Kohle abzuführen. Die
Wassermenge wird zweckmäßig durch Versuche ermittelt. Die in den Beispielen angegebenen
Mengen sind solche, die sich unter den dort angegebenen Arbeitsbedingungen als geeignet
erwiesen haben.
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Die Durchführung des Verfahrens gemäß Erfindung kann so vorgenommen
werden, daß man eine Lösung, die Vitamin B12 und andere LLD- und APF-aktive Substanzen
enthält, z. B. eine bei der Fermentierung von S. griseus erhaltenen Mischung, in
üblicher Weise mit Aktivkohle behandelt, wobei das Vitamin B12 und LLD- und APF-aktive
Substanzen an Aktivkohle adsorbiert werden. Anschließend wird die Aktivkohle mit
dem ausgewählten organischen Lösungsmittel gut vermischt bzw. aufgeschlämmt. Im
allgemeinen können auf = kg trockne Aktivkohle etwa 6,7 bis 8,31 organisches Lösungsmittel
angewandt werden. Hat man die Aktivkohle eine Zeitlang gut durchgemischt, fügt man
Wasser in einer Menge hinzu, die etwa dem Volumen der zuvor angewandten organischen
Lösungsmittelmenge entsprechen kann, und setzt den Mischungsvorgang weiter fort.
Dann filtriert man die Aktivkohle ab und wäscht anschließend so lange mit Wasser,
das an Lösungsmittel gesättigt ist, bis die abfließende Flüssigkeit nicht nur rot
oder braun gefärbt ist, sondern eine gelbe Farbe zeigt. Das Filtrat und die Waschwässer
werden miteinander vereinigt und' die Schicht an organischen polaren Lösungsmitteln
von der wäßrigen, das Vitamin B12 und die anderen aktiven Substanzen enthaltenden
Phase getrennt. Das zurückgewonnene Lösungsmittel kann immer wieder in den Extraktionsprozeß
zurückgeführt werden.
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Die wäßrige Schicht enthält nicht nur ungewöhnlich große Mengen von
Vitamin B12, sondern auch große Mengen von anderen; Vitamin-B"-ähnlichen Substanzen,
welche LLD- und APF-Aktivität besitzen. Es sei hervorgehoben, daß die ungewöhnlich
hohe Konzentration an aktiven Substanzen in der wäßrigen Lösung auf das Zweiphasenextraktionsverfahren
gemäß Erfindung zurückzuführen ist. Dies wird durch die Tatsache belegt, daß weder
Wasser allein noch ein organisches, polares Lösungsmittel allein für eine erfolgreiche
Extraktion der von der Aktivkohle adsorbierten aktiven Substanzen brauchbar ist.
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Bei getrennter Anwendung dieser Flüssigkeiten enthält der Auszug praktisch
keine oder nur ganz geringe Mengen von aktiven Substanzen. Bei dem Zweiphasensystem
bewirkt anscheinend das poläre Lösungsmittel die Trennung der aktiven Substanzen
von der Aktivkohle, während die wäßrige Schicht,
welche im wesentlichen
frei ist von Lösungsmitteln, die Fähigkeit hat, die von der Aktivkohle entfernten
aktiven Substanzen bereitwillig aufzunehmen.
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Die wäßrige Phase, welche das Vitamin B12 und andere aktive Substanzen
enthält, kann zwecks Gewinnung dieser Substanzen nach bekannten Verfahren behandelt
werden, wie z. B. Sättigen mit Ammoniumsulfat, Konzentrieren oder Niederschlagen
mit Aceton oder Äther.
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Vorzugsweise wird die wäßrige Phase mit einem organischen Lösungsmittel
extrahiert, in dem das Vitamin B12 und die anderen aktiven Substanzen leicht löslich
sind. Bei Durchführung dieses Verfahrens kann man ein anorganisches Salz, wie z.
B. Ammonium-, Aluminium-, Natriumsulfat, Natriumchlorid, Kalziumchlorid, Magnesiumsulfat,
in zur Sättigung ausreichenden Mengen zusetzen und hierdurch die aktiven Substanzen
in das organische Lösungsmittel zwingen.
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Zur Durchführung des Extraktionsverfahrens werden polare Lösungsmittel
der oben beschriebenen Art verwendet; die besten Resultate werden mit Benzylalkohol
erreicht. Die Extraktion der aktiven Substanzen aus der wäßrigen Phase mit Hilfe
organischer Lösungsmittel dient zur Reinigung, zur Verminderung des Volumens des
Konzentrats von aktiven Substanzen oder zur Vergrößerung der relativen Konzentration
der aktiven Substanzen in dem Lösungsmittel. Zwecks weiterer Konzentration der aktiven
Substanzen kann man die dieselben enthaltende Lösung mit Wasser extrahieren und
diese Extraktion noch vorteilhaft durch Zufügung eines zweiten Lösungsmittels, wie
z. B. Chloroform, das mit dem die aktiven Substanzen enthaltenden organischen Lösungsmittel
mischbar ist, aber nur geringes Lösungsvermögen für die aktiven Substanzen besitzt,
vervollständigen. Durch Zufügung dieses zweiten o@ganischen Lösungsmittels werden
die aktiven Substanzen vollständiger in die wäßrige Phase gezwungen, die so erhaltene,
gereinigte, wäßrige Phase kann wieder mit einem organischen Lösungsmittel wie- Benzylalkohol
in der oben beschriebenen Weise ausgezogen werden, um einen konzentrierten Auszug
des Vitamins B12 und anderer aktiven Substanzen zu erhalten.
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Die so erhaltenen Konzentrate von aktiven Substanzen in organischen
Lösungsmitteln, wie z. B. Benzylalkohol, werden vorzugsweise getrocknet, um Spuren
von etwa vorhandenem Wasser zu entfernen, und dann in einer chromatographischen
Kolonne von Tonerde weiterbehandelt. Die Kolonne wird dann durch Waschen mit Methanol
entwickelt und die gesamte abfließende, rotgefärbte Flüssigkeit, welche das aktive
Material in der Hauptsache enthält, gesammelt. Gewünschtenfalls kann die Kolonne
vor der Entwicklung mit Methanol mit einer Mischung von Methanol-Aceton (etwa r
: 2) behandelt werden, bis der Abfluß farblos ist. Hierdurch kann man beträchtliche
Mengen von Verunreinigungen entfernen, ohne die LLD- und APF-aktiven Substanzen
zu beseitigen.
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Es empfiehlt sich, bei der chromatographischen Reinigung Benzylalkohol
als Lösungsmittel zu verwenden, von dem das aktive Material durch Adsorption an
Tonerde entfernt wird. Benzylalkohol gibt das aktive Material in der Nähe der Spitze
der Kolonne ab und besitzt keine Neigung, das aktive Material in den Unterteil der
Kolonne durch Waschwirkung zu führen. Dies ist besonders dann 'von Wichtigkeit,
wenn Substanzen, die verhältnismäßig große Mengen von Verunreinigungen enthalten,
der chromatographischenBehandlung unterworfen werden. Wenn die Konzentrate einen
höheren Reinheitsgrad besitzen, können auch andere Lösungsmittel zur erfolgreichen
Durchführung des chromatographischen Reinigungsverfahrens verwendet werden.
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Die aus der chromatographischen Kolonne abfließende, mit aktiven Substanzen
angereicherte Lösung wird vorteilhaft im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert,
dann mit einem Mittel behandelt, das, wie z. B. Äther, befähigt ist, die aktiven
Substanzen niederzuschlagen, alsdann wird das Reaktionsgemisch einer für die Gewinnung
von reinem Vitamin B12 geeigneten Weiterbehandlung unterworfen werden. Es sind bereits
verschiedene Verfahren für die Isolierung von reinem Vitamin B12 bekannt, die Verwendung
finden können; ein sehr befriedigendes bekanntes Verfahren besteht darin, das Vitamin
B12 mit Benzylalkohol zu extrahieren und es durch Wasser-Benzylalkohol-Extraktion
im Gegenstromverfahren zu reinigen.
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Der nach der chromatographischen Behandlung erhaltene Niederschlag
kann noch einer Behandlung unterworfen werden, die einen neuen kristallinen Komplex
von Vitamin B12 und Vitamin-B1,-ähnlichen Substanzen liefert. Man kann z. B. derart
vorgehen, daß der Niederschlag mit einem geeigneten Lösungsmittel wie Methanol ausgezogen
wird und die so erhaltene Lösung einer chromatographischen Behandlung in einer Kolonne
unterworfen wird, die ein Adsorptionsmittel, wie z. B. Tonerde, enthält. Methanol
wird vorzugsweise zur Entwicklung der Kolonne und zum Ausziehen des aktiven Materials
verwendet. Die abfließende rotgefärbte Flüssigkeit, welche die aktiven Substanzen
in der Hauptsache enthält, wird gesammelt. Durch Zugabe von Äther wird das aktive
Material niedergeschlagen und der Niederschlag in Wasser gelöst. Durch Konzentration
der wäßrigen Lösung oder durch Zugabe von etwa 7 Raumteilen Aceton kann man die
Kristallisation des neuen Komplexes bewirken. Dieser neue Komplex ist gekennzeichnet
durch ultraviolette Absorptions-Maxima bei etwa 3550 und 5350 Ä bei Gegenwart
von etwa 30'/, Material mit einem Verteilungskoeffizienten von 1,2 für das System
Wasser-Benzylalkohol, bei Gegenwart von etwa 30 °/o Material mit einem Verteilungskoeffizienten
von 7 für das System Wasser-Kohlenstofftetrachloridkresol (q.: r), bei Gegenwart
von etwa 25 °/o Material mit einem Verteilungskoeffizienten von o,2 für das System
Wasser-Kohlenstofftetrachloridkresol (5:2) _ und bei Anwesenheit von etwa 35 °/o
Material mit einem Verteilungskoeffizienten von o,r für das System Wasser-Kohlenstofftetrachloridkresol
(6:i).
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Beispiele z. Kulturflüssigkeit, die durch Fermentierung mittels eines
Stammes von S. griseus erhalten wurde,
wurde einer Vorreinigung
durch Behandlung mit Diatomeenerde unterworfen, an welche eine Filtration angeschlossen
wurde. Das Filtrat wurde durch Vermischen mit etwa 4,8 g Aktivkohle auf den Liter
Flüssigkeit in ein Schlammfilter geführt. Die Aktivkohle wurde alsdann entfernt
und . durch Lufttrocknung -in ein Produkt von etwa 67% Feststoffen übergeführt.
Die Aktivkohle wurde alsdann gemahlen und in eine Anzahl von Portionen unterteilt.
Jede Portion wurde
30 Minuten lang mit dem gleichen Volumen von verschiedenen
Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen verrührt. Die Aktivkohle wurde alsdann
entfernt, mit Wasser gewaschen, die wäßrige Schicht abgetrennt und auf LLD-Aktivität
geprüft. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
| Trennung LLD- |
| der wäßrigen Aktivität*) |
| Schicht, U/Gm der |
| siehe Aktivkohle |
| Fußnoten |
| Kohlenstofftetrachlorid- |
| Wasser (i: _) ......... 1 40000 |
| Benzol-Wasser (i: i) ... 1 40000 |
| Petroläther (3o bis 6o°)- |
| Wasser (i: i) ****'*''* 1 40000 |
| Methanol-Wasser (1:1).. 2 40000 |
| Methanol........:...... 2 40000 |
| Äthanol-Wasser (i: i) ... 2 6o ooo |
| Äthanol ................ 2 40000 |
| n-Butanol-Wasser (i: i). . 1 400000 |
| s-Butanol-Wasser (i : i) . . i 470000 |
| i-Amylalkohol (2-Methyl- |
| butanol-4)-Wasser |
| (i: i) ................ 1 330000 |
| Benzylalkohol-Wasser |
| (i: i) ................ 3 440000 |
| 2-Butanol Wasser (i: i) .-. i 280000 |
| Methyläthylketon-Wasser |
| (i: i) ................ 4 500000 |
| Methyhsobutylketon= |
| Wasser (i: i) ......... 1 250000 |
| Kresol (Mischung von |
| Isomeren)-Wasser (i: 1) 5 150000 |
| Amylacetat (Mischung von |
| Isomeren)-Wasser (i: i) 1 200000 |
| i-Hexanol-Wasser (i: i) 1 440000 |
| 'k) r. Lösungsmittel abgetrennt nach Stehen und Wasser- |
| schichtenproben für den Versuch; |
| 2. Lösungsmittel durch Verdampfung entfernt unter Zu- |
| rücklassung wäßriger Lösungen für den Versuch; |
| 3. Zufügung von Chloroform und Wasserschicht für den |
| Versuch gesammelt; |
| q. Lösungsmittel durch Extraktion mit Äther entfernt |
| und Wasserschicht für den Versuch gesammelt. |
| 5. Zufügung von Kohlenstofftetrachlorid und Wasser- |
| schickt für den Versuch gesammelt. |
2. Kulturflüssigkeit, welche durch Fermentierung mittels eines Stammes von S. griseus
erhalten wurde, wurde zunächst einer Vorreinigung mit Diatomeenerde mit anschließender
Filtration unterworfen. Drei Portionen der Flüssigkeit wurden genommen und jede,
Portion mit 5 g Aktivkohle je Liter 15 Minuten lang zu einem Schlamm verrührt. Jede
Mischung wurde dann filtriert, die Kuchen mit Wasser gewaschen und 15 Minuten lang
Luft durch die Filterkuchen gezogen. Dann wurde jeder Kuchen mit einer Mischung
von Wasser und n-Butanol- oder s-Butanol oder Benzylalkohol (1, 2:1) 15 Minuten
lang aufgeschlämmt, dann wurde die Aktivkohle von jeder Probe durch Zentrifugieren
entfernt und die Kuchen mit Wasser gewaschen. Allquote Teile der vereinigten Filtrate
und Waschflüssigkeiten wurden auch auf LLD-Aktivität geprüft.
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Die wäßrigen Schichten wurden abgetrennt, mit Ammoniumsulfat gesättigt
und mehrmals mit Benzylalkohol ausgezogen. Jede Benzylalkohollösung wurde mit aktiver
Tonerde chromatographisch behandelt und die Kolonne mit Methanol entwickelt. Die
rotgefärbten Abflüsse wurden zwecks Erzeugung von Niederschlägen mit Äther behandelt.
Die Niederschläge wurden in Wasser gelöst, mit Benzylalkohol gesättigt und die optischen
Dichten bei 5500 A. (wo die charakteristischen Absorptionsmaxima von Vitamin
B12 auftreten) gemessen und mit den Werten von reinem Vitamin B12 verglichen. Die
Ablesungen entsprechen der Farbe des Vitamins B12 + der Farbe der vorhandenen Vitamin-B1,-ähnlichen
Substanzen.
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Die wäßrigen Lösungen wurden einer 8-Stufen-Gegenstromverteilung zwischen
Wasser und Benzylalkohol unterworfen und die optischen Dichten der Inhalte der fünften
Röhre bei 5500 Ä gemessen, um die Menge des anwesenden Vitamins B12 zu bestimmen.
Die Ergebnisse sind aus der nachfolgenden Zusammenstellung ersichtlich:
| LLD- Totalfarbe, Vorhandenes |
| Aktivität berechnet Vitamin B12 |
| des Extrakts als mg von |
| Lösungsmittel oha der Vitamin Bl@ in mg |
| Aktivität pro 37851 pro 3t85 1 |
| Kultur- |
| -der Kultur- Kultur- |
| flüssigkeit flüssigkeit flüssigkeit |
| n-Butanol- |
| Wasser ..... 98% 268 68 |
| s-Butanol- |
| Wasser .... 95)/o 202 88 |
| Benzyl- |
| alkohol- |
| Wasser .... ioo% 205 78 |
3. Etwa 8328 1 Kulturflüssigkeit, welche mit Hilfe eines Stammes von S. griseus
vergoren worden sind und 4630 Einheiten LLD-Aktivität je ccm besaßen, wurden einer
Vorreinigung mit Diatomeenerde und anschließender Filtration unterworfen, das Filtrat
wurde mit 40 kg Aktivkohle vermischt, die Aktivkohle wurde dann durch Filtration
entfernt. Die Aktivkohle wurde mit 170,3 1 n-Butanol versetzt und die Mischung 15
Minuten verrührt. Alsdann wurden 132,5 1 Wasser und 11,34 kg Filterhilfsmittel zugefügt
und die Mischung weiter 45 Minuten gerührt. Die festen Bestandteile wurden dann
durch Zentrifugieren abgetrennt und-mehrmals auf der Zentrifuge mit insgesamt etwa
151,q:1 Wasser, das mit Butanol gesättigt war, ausgewaschen. Das Filtrat und die
Waschflüssigkeit wurden vereinigt und die Schichten getrennt,
die
wäßrige Schicht wurde filtriert, um Kohlefeinteile zu entfernen.
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Den 321,8 1 der filtrierten wäßrigen Schicht wurden 49,2 1
Benzylalkohol und 192,74 kg Anunoniumsulfat zugefügt, die Mischung wurde 15 Minuten
verrührt und dann = Stunde stehengelassen. Die wäßrige Schicht wurde nunmehr abgetrennt
und mit 32,2 1 Benzylalkohol ausgezogen. Die benzylalkoholischen Auszüge wurden
miteinander vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, das Volumen
der getrockneten Auszüge betrug etwa io6 1.
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Die benzylalkoholische Lösung wurde dann mit 2o kg aktiver Tonerde
chromatographisch behandelt; nachdem die gesamte Lösung in die Kolonne eingeführt
war, wurde die Kolonne mit einer Mischung von Methanol und Aceton 1:2 ausgewaschen,
bis der Abfluß farblos war. Die Kolonne wurde dann mit Methanol entwickelt, die
abgehende, rotgefärbte, mit aktiven Substanzen angereicherte Flüssigkeit (etwa 521)
gesammelt und im Vakuum unter 35° bis auf etwa 21 konzentriert und durch Zugabe
von i Raumteil Aceton und 4 Raumteilen Äther ein Niederschlag erzeugt. Der Niederschlag
wurde abfiltriert und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Der so erhaltene
rötlichbraune, amorphe Niederschlag enthielt etwa "/,"/,Vitamin B12.
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Der getrocknete Niederschlag wurde portionsweise mit Methanol extrahiert,
bis ein weißer Rückstand verblieb. Die Hälfte der erhaltenen Methanollösung wurde
mit aktiver Tonerde chromatographisch behandelt und die Kolonne mit Methanol entwickelt.
Der rotgefärbte Abfluß wurde gesammelt und mit 4 Raumteilen Äther zwecks Fällung
behandelt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet.
Der getrocknete Niederschlag wurde in wenig Wasser gelöst und Aceton bis zur beginnenden
Trübung zugefügt. Die Lösung wurde alsdann stehengelassen zwecks Kristallisation,
die gebildeten Kristalle durch Zentrifugieren abgetrennt und im Vakuum bei Raumtemperatur
getrocknet. Es wurden 139 mg rotgefärbter Kristalle erhalten, @, Max 3550
Ä, = 130 und 5350 Ä, = 48.
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Mit Hilfe einer 8-Stufen-Gegenstromverteilung wurde festgestellt,
daß etwa 30 % des Materials einen Verteilungskoeffizienten von i,2 für das
System Wasser-Benzylalkohol hatten. Bei Verwendung einer 3-Stufen-Gegenstromverteilung
wurde gefunden, daß etwa 33 % des Materials einen Verteilungskoeffizienten
von 7 für das System Wasser-Kohlenstofftetrachloridkresol (4:1) hatten. Etwa 25
°/o des Materials hatten einen Verteilungskoeffizienten von o,2 in dem System Wasser-Kohlenstofftetrachloridkresol
(5:2), und etwa 37 °/o des Materials hatten einen Verteilungskoeffizienten von o,i
bei dem System Wasser-Kohlenstofftetrachloridkresol (6:1).
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Die vorstehend angegebenen Daten zeigen offenbar, daß der neue Komplex
aus etwa i Teil Vitamin B12 und 2 Teilen Vitamin-B" ähnlichen Substanzen besteht.