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Verfahren zur Extraktion von Vitamin B12 aus seinen wäßrigen Lösungen
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Extraktion, Reinigung und Konzentration
des bzw. der gegen perniciöse Anämie wirksamen Faktoren. im folgenden kurz Anti-Anämia-perniciosa-Faktoren
genannt, aus wäßrigen Lösungen derselben. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht
auf der Entdeckung, daß Anti-,Anämia-perniciosa-Faktoren aus wäßrigen Lösungen,
die einen hohen Salzgehalt aufweisen, .durch mit Wasser mischbare Alkohole und Ketone
selektiv extrahiert werden.
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Das Vorkommen eines Anti-Anämia-pernücios,a-Faktors bzw. mehrerer
solcher Faktoren in verschiedenen tierischen Organen, wie z. B. der Leber, ist eine
gesicherte Tatsache. Die sogenannten Leberkonzentrate, .die diese Faktoren enthalten,
werden in bedeutendem Ausmaß bei der Behandlung der perniciösen (Addisonschen) und
der m,akrocytischen Anämie von .der Art der Anämia perniciosa mit megalablastisc'hemKnochenmarkverwendet.
Der antiperniciös wirkende Leberextrakt wurde in hohem Grad konzentriert (Biochem.
Journal [Proceedings] 1946, Bd.4o"S. IV; Nature 1948, Bd. 161, S.638 und Science
1948, Bd. 107, S. 396). Da der gegen perniciöse Anämie wirksame Faktor so in Erscheinung
tritt, als bestehe er aus einem einzigen chemischen Indivi.dium, wird er im folgenden,
ungeachtet seiner Herkunft, als Vitamin Bit bezeichnet. Dieses chemische Individuum
kann auch andere wirksame, verwandte Substanzen enthalten. Unabhängig davon, ob
diese Fraktion, die zur Bekämpfung von perniciöser Anämie als wirksam erkannt wurde,
aus einer oder mehreren chemischen Einheiten besteht, werden mit der angewendeten
Bezeichnung Vitamin B12 jene Suhstanzen
oder -Fraktionen bezeichnet,
die bei der Behandlung von perniciöser Anämie oder Addisonscher perniciöser Anämie
klinisch wirksam sind.
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Außer in der Leber tritt das Vitamin. B12 im Verein mit dem Mycelien
von Streptomyces griseus und Streptomycels fradiae auf, wenn diese auf gewissen
'künstlichen Nährböden gezüchtet werden, und ist außerdem in anderen Materialien,
beispiels-Nveise in den Fäkalien -von Schweinen, Hühnern und Vieh und im Mageninhalt
von geschlachteten Tieren, in bedeutenden Mengen zu finden. Die in diesen Abfallmaterialien
vorkommenden Anti-Anämia-pernicios.a-Faktoren sind unter der Bezeichnung tierische
Proteinfaktoren bekannt. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind auf die Konzentration
von Vitamin B12 enthaltenden Fraktionen aus allen genannten Quellen anwendbar.
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Es sind bereits Verfahren beschrieben worden, mittels welcher Vitamin
t012 konzentriert werden kann. insbesondere bei Verwendung von Leber als Ausgangsmaterial.
Die Herstellung einer wäßrigen Lösung des Vitamins B12 stellt eine Operation dar,
die vielen der bekannten Verfahren zur Konzentrierung des Vitamins B12 gemeinsam
ist. Ob nun die wäßrige Lösung durch Extraktion von ganzer Tiber zwecks Erzielung
eines rohen Ausgangspräparates oder durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln
und Extraktion der organischen Lösungen mit Wasser oder durch Fällung in verschiedenen
Stadien eines andere Operationen umfassenden Reinigungsverfahrens erhalten wird,
ist unwichtig, .da man nur bezweckt, eine wäßrige Lösung .des Vitamins B12 zu erhalten.
Die wäßrige i_ösung, die Paste oder die trockenen Feststoffe, die durch teilweise
oder vollständige Abtrennung des Wassers erhalten werden, dienen als Ausgangsmaterial
für die herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Leber- oder Vitamin-B12Kon7entraten,
wie dies beispielsweise durch Laland und Klein, Acta Med. Scand, 1936, Bd. 88, S.
62o und in den USA.-Patenten 2 134 256, a 125 84.a., 2 324 8d.8 und 2 369 _1.65
beschrieben wurde. Obwohl diese und andere Verfahren brauchbare Leberkonzentrate
liefern, die das Vitamin B'12 in einem Reinheitsgrad von mehr als etwa o,2,ug (o,aGamma
oder o,ooo2 mg) Vitamin B12 pro Milligramm der Gesamtmenge an Feststoffen enthalten,
haben diese Produkte in -der Therapie der Anämie keine große Verbreitung gefunden.
Das Vitamin Bi., wurde zwar in noch viel höherer Reinheit erhalten, jedoch nur nach
Behandlung mittels langwieriger und komplizierter Reinigungsverfahren.
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Erwünscht sind nun einfachere Verfahren, mittels welcher der Gehalt
solcher Präparate an Vitamin B12 erhöht und die Kosten bedeutend vermindert werden
könnten. Es wäre außerdem zweckmäßig, ein Verfahreln zur Hand zu haben, mittels
ri'essen das in einer verdünnten wäßrigen Lösung enthaltene Vitamin B12 leicht extrahiert
und in Form einer konzentrierten Lösung von stark vermindertemVolumen erhalten werden
könnte. Einige der bekannten Verfahren liefern ein konzentrierteres Produkt. wenn
sie auf Rohmaterialien angewendet werden, sind jedoch von geringem Wert, wenn sie
zum Konzentrieren stärker gereinigter, Vitamin B12 enthaltender Materialien angewendet
werden. Es ist deshalb auch ein Verfahren erwünscht, welches auch dann wirksam ist,
wenn es zur Konzentration oder Reinigung stärker gereinigter Vitamin-B12-Präparate
angewendet wird. Zur Herstellung stärker gereinigter Vitamin-B12-Präparate, die
in hohem Maß kornzentriert worden waren, war es bisher nötig, die rohen Präparate
der weiteren Einwirkung gemischter Mikroorganismen zu unterwerfen, die dazu bestimmt
sind, die eine weitere Reinigung verhindernden Verunreinigungen zu entfernen, wie
dies beispielsweise in J. Biochem. Soc. (Proceedings) 1946, Bd. 4o, S. IV beschrieben
ist. Es wäre auch ein Verfahren erwünscht, mittels dessen ein leicht in kristallisiertes
Vitamin. B12 überführbares Vitamin-B12 Konzentrat unter Vermeidung solcher Behandlungen
mit Mikroorganismen erhalten werden könnte.
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Das erfindungsgemäße Verfahren genügt in zahlreichen Punkten den obengenannten
Anford erungen. Mit der vorliegenden Erfindung gelangt man zu einem einfachen Verfahren,
mittels dessen sehr rohe Präparate, die Vitamin B12 enthalten, beispielsweise diejenigen
mit einer Reinheit von weniger als i Gamma pro Milligramm Feststoff, konzentriert
und gereinigt werden können unter Bildung von Produkten, die eine genügende Wirksamkeit
aufweisen, um für den Handel brauchbar zu sein. Zur Erhöhung der Reinheit von Produkten
mit einem größeren Gehalt an Vitamin B12 ist das Verfahren nicht so geeignet wie
andere Verfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerdem zur Extraktion von
Vitamin B12 aus den ersten verdünnten wäßrigen Extrakten, die aus Leber, iNZyceliu.m
von Streptomyces griseus und Streptomyces fradiae und anderen Ausgangsmaterialien
erhalten werden, anwendbar. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders
bei Verwendung solcher verdünnter Extrakte.
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Das erfindungsgemäße Verfahren liefert eine Methode zur Reinigung
von Vitamin B12. Es liefert ferner eine Methode, mittels welcher Vitamin .B12 aus
einem großen Volumen Wasser in ein kleineres Volumen eines mit Wasser mischbaren
Lösungsmittels extrahiert werden kann. Die Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen
Verfahrens beruht auf dem günstigen Verteilungsverhältnis von Vitamin B12 und,den
normalerweise mit diesem zusammen auftretenden Verunreinigungen zwischen zwei flüssigen
Phasen gewisser Systeme aus Salz, Wasser und Lösungsmittel, .die aus einer waseerlöslichen
Lösungsmittelphase und einer wäßrigenSalzlösungsp4ase bestehen. Es wurde bisher
'keine Methode beschrieben, die eine einfache Extraktion von Vitamin B12 aus einer
wäßrigen Lösung mittels eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels ermöglicht hätte.
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Zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man eine wäßrige
Lösung von Vitamin B12 mit einem mit Wasser mischbaren
organischen
Lösungsmittel innig vermischen und hierauf eine große Menge eines wasserlöslichen
schwachsauren, schwachbasischen oder mäßig stark basischen Salzes zugeben, um ein
zweiphasiges System zu erzeugen, dessen obere Phase aus einer w.äßrigen Lösung ,des
mit Wasser mischbaren Lösungsmittels besteht und das gereinigte Vitamin B12 enthält.
Eine bevorzugte Ausführungsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin,
die wäßrige Lösung von Vitamin B12 mit dem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel zu
versetzen und anschließend der Lösung das Salz zuzusetzen, bis sich zwei Schichten
gebildet haben. Bei dieser bevorzugten Ausführungsform wird eine solche Menge dies
mit Wasser mischbaren Lösungsmittels verwendet, daß das Vitamin B12 und die das
letztere begleitendem Verunreinigungen in Lösung bleiben und nicht ausgefällt werden.
Diese Vorsichtsmaßnahme isrt deshalb erforderlich, weil gewisse Lösungsmittel, -wenn
sie in zu großen Mengen zugesetzt werden, eine Ausfällung dies Vitamins B12 aus
den wäßrigen Lösungen verursachen können. So wird beispielsweise Aceton zur Fällung
von Vitamin B12 aus dessen wäßrigen Lösungen verwendet. Es wird jedoch im allgemeinen
eine Menge verwendet, die etwa i9 Volumina Aceton auf i Volumen Wasser beträgt.
Wird anschließend das Salz zugesetzt, so bildet sich zwischen den in der Lösungsmittelphase
gelösten festen Bestandteilen und den in der wäßrigen Salzlösung in Lösung befindlichen
festen Bestandteilen rasch ein (Gleichgewicht, so daß ein zusätzliches Rühren nicht
erforderlich ist. Bei dieser Arbeitsweise ist es möglich, die genaue Salzmenge,
die verwendet werden mu@ß, zu bestimmen, da die Zugabe von Salz beim ersten Anzeichen
der Ausfällung einer festen Phase unterbrochen werden kann. Da durch Zugabe des
mit Wasser mischbaren Lösungsmittels zu Wasser eine Verminderung der Löslichkeit
des Salzes verursacht wird, ist es anderenfalls schwierig, das Salz derart zu dosieren,
daß die Trennung der Lösung in zwei Schichten erfolgt, ohne -daß überschüssige Mengen
des. Salzes im .Form eines festen Niederschlages .abgeschieden werden, wodurch die
Ausführung des Verfahrens unnötigerweise kompliziert würde.
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Die als obere Schicht erhaltene und das gereinigte Vitamin B12 enthaltende
Lösungsmittellösung wird von der wäßrigen Salzlösung abgetrennt. Die auf diese Weise
erhaltene Lösung von Vitamin B12 im mit Wasser mischbaren Lösungsmittel enthält
Co bis ioo°/o des anfänglich vorhandenen Vitamins 31. zusammen mit 45 bis 35'/o
oder weniger der anderen festen Verunreinigungen. Ein bedewbenderAnteil der dasVntamin
B12 hierin begleitenden Feststoffe besteht aus dem verwendeten anorganischen Salz
und nicht mehr aus den ursprünglichen organischen Verunreinigungen. Somit ist in
Wirklichkeit eine größere Menge der mit dem Vitamin B12 vereinigten, ursprünglichen,
organischen Verunreinigungen entfernt worden, als man aus .der Verminderung in der
Gesamtmenge der festen Verunreinigungen schließen könnte. Es ist dies bei gewissen
anschließenden Reinigungsoperationen deutlicher ersichtlich, bei welchen die anorganischen
Salze leichter vom Vitamin B12 als die anderen organischen Verunreinigungen entfernbar
sind, und zwar wegen des großen Unterschiedes in den C.öslichkeiten .dieser Substanzen.
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Als wasserlösliche Alkohole, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens verwendbar sind, seien Äthanol, Propanol, Isopropanol und tert.-Butanol
genannt. Müthanol ist ungeeignet, da es unter Bedingungen, unter denen das Vitamin
B12 nicht zerstört wird, von wäßrigen salzhaltigen Lösungen nicht abgetrennt werden
kann. Außer tert.-Butanol sind die Butanole in Wasser nicht genügend löslich, um
für das erfindungsgemäße Verfahren verwendbar zu sein. Es fehlt ihnen außerdem die
Fähigkeit, das Vitamin B12 aus einer wäßrigen Lösung zu extrahieren. Als Ketone,
die sich für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen, sind Aceton
und Methyläthy lketon zu nennen. Aceton und Isopropylallzohol werden wegen ihres
Reinigungsvermögens gegenüber Vitamin. B12 und der Leichtigkeit, mit welcher sie
sich von wäßrigen Salzlösungen abtrennen, als Lösungsmittel bevorzugt.
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Als Salze, die sich für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
eignen, sind Natriumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumchlorid, Kaliumsulfat, Calciumchlorid,
;Nlagnesiumchlorid, Zinkchlorid, Zinksulfat, Magnesiumcitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfa@t,
Ammoniumcarbonat, Ammoniumbromid, Natriumcarbonat usw. zu nennen. Die Salze müssen
eine hohe Löslichkeit in Wasser und eine viel kleinere Löslichkeit in den mit Wasser
mischbaren Alkoholen und Ketonen aufweisen. Die wäßri.ge Lösung des in Frage stehenden
Salzeis sollte neutral, schwach sauer oder schwach alkalisch reagieren, vorzugsweise
neutral oder schwach sauer, da das Vitamin B12 in den letzteren Lösungen beständiger
ist als in alkalischen Lösungen. Salze, die mit dem mit Wasser mischbaren Alkohol
oder Keton Komplexe bilden, sind weniger zweckmäßig als inerte Salze, da bei deren
Verwendung die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. erschwert wird. Die
Methode des Aussalzens von mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln aus wäßrigen Lösungen
ist allgemein in »Organic Laboratory Methods« von L a s s a r- C oh n (übersetzt
von Ralph B. Oesper, Baltimore, Williams and Wilkins, 1928, S.272 bis 27q.) beschrieben.
Diese allgemeinen Prinzipien sind auf die vorliegende Erfindung Übertragbar. Ammoniumswlfat
wird als sehr leicht lösliches neutrales Salz für die Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens bevorzugt. Im allgemeinen besitzen Salze mit polyvalenten Anionen, wie
Sulfate, Citrate, Phosphate und Carbonate, ein größeres Aussalzvermögen als Salze
mit monovalenten Anionen bzw. divalenten Kationen. Die ersteren Salze werden deshalb
bevorzugt. Salze von divalenten Kationen mit divalenten Anionen, beispielsweise
Magnesiumsulfat, unterscheiden sich in dieser Hinsicht nicht wesentlich von Salzen
mit
monovalenten Kationen, wie z.B.Amrnoniunisulfat. '\Titamin B12
enthaltende wäßrige Lösungen, die sich für die Behandlung nach dem erfindungsgemäßen
%"erfaliren eignen, können aus verschiedenen Quellen, beispielsweise aus Leber und
Kulturen von Mikroorganismen von .der Gattung der Streptomyces, nach bekannten Methoden
erhalten werden.
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Es wurde ferner gefunden, daß ein. Vitamin-13)1,-Präparat mit einem
Reinheitsgrad von etwa 3,5 Gamma pro '-,\lilligramrn Feststoff nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren derart gereinigt werden kann, daß ein Produkt mit einem Gehalt von etwa
5,3 Gamma Vitamin B12 pro Milligramm erhalten wird. Außer der Konzentration und
Gewinnung von Vitamin B1", aus einem großen Volumen Lösung erzielt man somit auch
ein Produkt von größerer Reinheit.
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Die Beispiele, in welchen die praktische Ausführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens erläutert ist, sollen die Erfindung nicht einschränken. Bezüglich .der
Art des verwendeten Salzes, der Salzkonzentration, der Lösungsmittelkonzentration
usw. bestehen Variationsmöglichkeiten. Beispiel 1 1,21,1 1 einer wäßrigen Lösung
von Vitamin 1312 mit einem Gehalt von o,3 Gamma Vitamin B12 pro Milligramm Feststoff
wurden zuerst mit d-0,3 1 Isopropylalkohol und dann mit 54,43 kg festem Ammoniumsulfat
versetzt. Die Lösung trennte sich scharf in zwei Schichten, die voneinander getrennt
wurden. Die untere, gelbe Schicht, die etwa 5 bis io% des Vitamins BU enthielt,
wurde verworfen.
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Die obere, wäßrige, isopropylalkoholische Schicht (`'olumen 30,31)
wurde zusammen mit einer zusätzlichen Menge Ammoniumsulfat gerührt. Es bildeten
sich zwei Schichten, die getrennt wurden. Die aus Salzlösung bestehende untere Schicht
wurde verworfen. Diese zweite Extraktion muß nicht durchgeführt werden, erleichtert
jedoch die Entfernung eines bedeutenden Teiles des Amnioniumsulfates. der sonst
in der oberen, wäßrigen Isopropylaikoholschicht zurückbleibt. Die auf diese Weise
erhaltene Isopropylalkoholschicht enthielt etwa 6o bis 8o0./0 des anfänglich vorhandenen
Vitamins B12 und 35 bis q.o Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht des ursprünglich
vorhandenen festen Materials.
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Diese Vitamin-Bi.Lösung kann durch Wiederholung :der oben beschriebenen
Operationen oder nach anderen bekannten Reinigungsverfahren weitergereinigt werden.
Die das Vitamin B12 enthaltenden Feststoffe können auch durch Ausfällung aus .der
Lösung isoliert werden, indem man etwa i9 oder mehr Volumteile Aceton zusetzt, vorzugsweise
nach Entfernung des Isopropylalkohol.s..
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Beispiel e In 80o cm3 einer wäßri@gen Lösung mit einem Gehalt von
3,5 Gamma Vitamin B12 pro Milligramm Feststoff (7a0 ooo Gamma Vitamin Bit
und 2o6 g Feststoffe) \vurden unter Ruhren zuerst Zoo cm-' Aceton und dann 4q:0
g festes Ammoniumsulfat eingetragen. Die beiden Schichten, die sich bildeten, wurden
voneinander getrennt. Die aus wäßriger Salzlösung .bestehende untere Schicht wurde
zweimal mit zusätzlichen Portionen von ioo cm3 Acetoli extrahiert. Die verbrauchte
Salzlösung, die i i 50o Gamma Vitamin Bit enthielt, wurde verworfen. Die oberen
Acetonschichten aus den zusätzlichen Extraktionen wurden mit der zuerst erhaltenen
Acetonschicht zu einem Gesamtvolunien von 700 cm3 vereinigt. Die Flüssigkeit
wurde nach Zugabe von 256 g festem Ammoniumsulfat mit ioo cm3 Wasser extrahiert.
Nach nveimaligem Extrahieren mit Portionen von 6o, cm3 Aceton enthielt die wäßrige
Salzlösung weniger als 7000 Gamma Vitamin B12 und wurde verworfen. Das aus
den vereinigten Acetonextrakten (685. cm3) gewonnene Vitamin-Bi.-Präparat wies einen
Gehalt von 5,3 Gamma Vitamin B12 pro Milligramm Feststoff auf. Das auf diese Weise
erhaltene Vitamin B-12 kann durch direkte Behandlung der Lösung oder durch Zugabe
von z4oocm3Aceton zurLösung und Abfiltrieren .das ausgefällten festen Produktes
unter Verwendung von ioo g Diatomeenerde als Filtrierhilfsmittel weitergereinigt
werden. Beispiel 3 5 cm3 Kaliumcarbonatlösung mit einem Gehalt von 2,i g Kaliumcarbonat
wurden in 5 cm3 einer Vitamin B12 und feste Begleitsubstanzen enthaltenden wäßrigen
Lösung, ;deren Gehalt an Vitamin B12 6o ooo Gamma mit einem Reinheitsgrad von 0,09
Gamma Vitamin Bi. pro Milligramm Festsubstanz betrug, eingetragen. Die erhaltene
Lösung wurde mit io cm3 Äthylalkohol innig vermischt. Beim Stehen schied sich das
Gemisch in zwei Schichten. Die obere, äthylalkohol.ische Schicht wurde abgetrennt,
mit 5 cm3 Äthylalkohol verdünnt und sofort mit a,85 cn" i n-Schwefels.äure neutralisiert.
Eine Analyse der Lösung ergab, daß eine quantitative Extraktion des Vitamins Bit
in die Alkoholphase stattgefunden hatte. Beispiel q. Einer wäßrigen Lösung von 85
ooo Gamma Vitamin B112 in 7 cm3 Wasser wurden zuerst 5 cms Methyläthylketon und
dann 5 cm3 gesättigte Ammoniumsulfatlösung zugesetzt. Es bildeten sich zwei Schichten.
Die obere Methyläthylketonschieht wurde abgetrennt. Die Analyse ergab, das diese
Schicht den größten Teil des Vitamins B12 im Zustand erhöhter Reinheit enthielt.