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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Saponine
sind Glykoside, die in Pflanzen weit verbreitet sind. Jedes Saponin
besteht aus einer oder mehreren Zuckereinheiten, die an ein „Sapogenin"-Aglykon gebunden
sind. Die Zuckereinheiten können
Glucose, Galactose oder eine Pentose oder Methylpentose sein, während das
Sapogenin ein Triterpen oder ein Steroid sein kann.
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Saponine
haben Detergenseigenschaften, wobei sie Öl-in-Wasser-Emulsionen bilden
und reichliche Mengen Schaum oder Seifenlauge erzeugen, wenn sie
in Wasser gelöst
werden. Der Name „Saponin" ist abgeleitet vom
Lateinischen „Sapo" für „Seife". Saponin-haltige
Pflanzen sind seit Jahrhunderten als Seifen eingesetzt worden, insbesondere
Seifenkraut (Saponaria officinalis), Seifenwurzel (Chlorogalum pomeridianum),
Panamarinde (Quillaja saponaria) und Seifenbeere (Sapindus mukurossi).
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Saponine
werden als Schaumbildner in Softdrinks, gefrorenen, mit Kohlensäure versetzten
Getränken,
Cocktailmischungen und Feuerlöschern
eingesetzt. Ihre Detergenseigenschaften haben zu ihrer Verwendung
in Shampoos, Gesichtsreinigern und verschiedenen kosmetischen Zusammensetzungen geführt. Antimikrobielle
und Antipilzeigenschaften sowie Nutzen als Nutraceuticals oder Pharmaka
sind Saponinen zugeschrieben worden.
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Die
herkömmlichen
Verfahren zum Extrahieren und Isolieren von Saponinen aus trockenen Pflanzenmaterialien
bestehen aus dem Extrahieren mit verschiedenen Alkoholen (Methanol, Ethanol, Propanol)
oder Wasser-Alkohol-Mischungen. Ein Entfettungsschritt unter Verwendung
nicht-polarer organischer Lösemittel
(d. h. Petrolether oder Hexan) können
entweder vor dem Extraktionsschritt oder am Extrakt selbst durchgeführt werden.
Rohe Saponine werden dann durch Einbringen einer großen Menge Aceton
oder Ether ausgefällt.
K. Hostettmann und A. Marston, Saponins, Cambridge University Press (1995),
S. 143–145.
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Die
zeitaufwändigen
Verfahren, die verwendet werden, um Proteine zu reinigen, wie etwa
Dialyse, Ionenaustauschchromatographie und Ausschlußchromatographie,
werden oft eingesetzt, um eine weitere Reinigung von Saponinen zu
bewirken. P. A. Ireland, S. Z. Dziedzic und M. W. Kearsley, „Saponin Content
of Soya and Some Commercial Soya Products by Means of High-performance
Liquid Chromatography of the Sapogenins", J. Sci. Food Agric. 1986, 37, 694–698.
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Sojabohnensamen
(Glycine max, Leguminosen) enthalten etwa 0,5 Gew.-% Saponine. P.
A. Ireland, S. Z. Dziedzic und M. W. Kearsley, „Saponin Content of Soya and
Some Commercial Soya Products by Means of High-performance Liquid
Chromatography of the Sapogenins",
J. Sci. Food Agric. 1986, 37, 694–698. Soja-Saponine sind seit
dem frühen
20. Jahrhundert Forschungsgegenstand gewesen. Diese Verbindungen
bestehen aus einem Triterpenoid-Skelett
mit verschiedenen Zucker- und Acetyleinheiten. Der gegenwärtige Konsens
ist, daß die Soja-Sapogenole
A, B und E echte Aglykone sind, während die Soja-Sapogenole C,
D und E Artefakte der Hydrolyse sind, die während des Verfahrens ihrer Isolierung
auftreten. Die entsprechenden Glykoside sind die sogenannten „Gruppe-A-Saponine", „Gruppe-B-Saponine" bzw. „Gruppe-E-Saponine".
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Soja-Saponine
haben antimutagene Eigenschaften gezeigt, die sie zu vielversprechenden
Mitteln für
Krebsprophylaxe machen. M. J. Plewa et al., „The Use of Single Cell Electrophoresis
and Flow Cytometry to Identify Antimutagens from Commercial Soybean
Products", Mutation
Research, 402 (1998), 211–218
und Li Baixiang, "The
study on the Antimutation Mechanism of Soyasaponin", Proceedings of the
Third International Soybean Processing and Utilization Conference,
(2000), 264–265. Überdies
haben Gruppe B-Soja-Saponine
in vitro ausgeprägte
unterdrückende
Wirkungen auf die Replikation des menschlichen Immundefektvirus
(HIV) gezeigt. H. Nakashima et al., N. Aids, 3, 10 (1989), 665–668. Die chemische
Struktur von Sojabohnen-Saponin ist sehr ähnlich zu derjenigen der Verbindung
Glycyrrhizin, ein bekanntes Antivirusmittel, so sind Soja-Saponine vielversprechend
als Bausteine für
die Synthese antiviraler pharmazeutischer Verbindungen.
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Trotz
der Kultivierung und Verarbeitung sehr großer Mengen Sojabohnen sind
gegenwärtig
Soja-Saponine keine signifikante Handelsware aufgrund der Schwierigkeit,
sie zu isolieren und zu reinigen.
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Sojaproteinkonzentrate
und Sojaproteinisolate sind wichtige Handelswaren, die in breitem
Umfang durch Extrahieren von mit Hexan entfettetem Sojabohnenmehl
mit einem Lösemittel,
das aus einer Mischung aus Ethanol und Wasser besteht (typischerweise
75 Gew.-% Ethanol), bei erhöhten
Temperaturen hergestellt werden. Der Zweck dieser Extraktion ist,
Lecithin, Zucker und komplexe Kohlehydrate von den Proteinen abzutrennen.
Das Ethanol wird durch fraktionierte Destillation rückgewonnen, was
eine wäßrige Lösung von
Zuckern (überwiegend Saccharose,
Raffinose und Stachyose) und andere Kohlehydrate zurückläßt, die
auch Isoflavone und Saponine enthält. Dieses Material ist im
Handel als „Soja-Solubles" oder Soja-Melasse
bekannt.
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Durch
Ansäuern
von Sojamelasse, typischerweise auf einen pH von 2,5 bis 4,5, bei
erhöhten Temperaturen
werden Isoflavon- und Saponin-reiche Feststoffe ausgefällt. Diese
Feststoffe können
durch Zentrifugation oder Filtration entfernt werden, dann getrocknet,
um als ein kommerzielles Ausgangsmaterial für die Gewinnung von Soja-Isoflavonen
durch Extraktion mit geeigneten organischen Lösemitteln (d. h. Methanol,
Ethanol, Aceton, etc.) zu dienen. US-Patent 5,919,921.
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US-Patente
4,428,876 und 4,594,412 und Internationales Patent WO 99/34810 offenbaren
Verfahren zur Gewinnung von Soja-Saponinen aus aus Sojabohnen gewonnenen
Materialien, die chromatographische Techniken umfassen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Der
Gegenstand der vorliegenden Erfindung verwendet Aceton/Wasser-Mischungen
bei verschiedenen Konzentrationen und Temperaturen als ein kosteneffektives
Verfahren zur Gewinnung von Soja-Saponinen hoher Reinheit aus aus
Sojabohnen gewonnenen Materialien, während auch ein wirtschaftliches
Mittel zur Gewinnung von Soja-Isoflavonen als einem Nebenprodukt
bereitgestellt wird.
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Obgleich
Saponine charakteristischerweise in Aceton unlöslich sind, können Mischungen
aus Aceton und Wasser Saponine bei erhöhten Temperaturen lösen. Das
Aceton-zu-Wasser-Verhältnis für diesen
Zweck kann von ungefähr
2,5 bis 5,0 Teile Aceton pro einem Teil Wasser reichen und liegt
optimal bei ungefähr
4 : 1, gewichtsbezogen. Bei merkbar höheren Konzentrationen an Aceton
wird die Effizienz der Extraktion von Saponinen unnötigerweise verringert;
bei merkbar höheren
Konzentrationen an Wasser kann die gewonnene Menge an Saponinen verringert
werden und unerwünschte
Verunreinigungen (hauptsächlich
Oligosaccharide) werden in Lösung
gehen, was die Reinheit der Saponine, die gewonnen werden, senkt.
Demgemäß könnten, obgleich
höhere
Konzentrationen an Aceton oder Wasser verwendet werden können, diese
nicht so effizient sein.
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Um
die Saponine zu extrahieren, wird das Ausgangsmaterial in der optimalen
Aceton/Wasser-Mischung
bei Aceton-Rückflußtemperatur
(56°C bei
atmosphärischem
Druck oder höhere
Temperaturen bei erhöhten
Drücken)
digeriert, um die Saponine in Lösung
zu bringen. Für
diesen Zweck ist es wünschenswert,
einen pH von wenigstens 5,0 und vorzugsweise 6,5 oder höher zu verwenden.
Die ungelösten
Feststoffe werden durch Zentrifugation, Filtration oder Absetzen
und Dekantieren entfernt, während
eine Temperatur von mehr als 50°C
gehalten wird. Das Zentrat oder Filtrat, das die gelösten Saponine
enthält,
wird dann auf eine Temperatur von weniger als 10°C (vorzugsweise –5 bis 5°C) abgekühlt, woraufhin
die gelösten
Soja-Saponine ausfallen und durch Zentrifugation, Filtration oder
Absetzen und Dekantieren entfernt werden können. Die Soja-Isoflavone,
die sich im Stand der Technik als schwierig von Soja-Saponinen abzutrennen
erwiesen haben, bleiben in Lösung
und werden in dem Zentrat, dem Filtrat oder der dekantierten überstehenden
Flüssigkeit
entfernt, aus dem/der sie ihrerseits durch Entfernen des Acetons
durch fraktionierte Destillation und Abkühlen der resultierenden wäßrigen Kopffraktion,
um die Isoflavone unlöslich
zu machen, was ihre Gewinnung durch Filtration, Zentrifugation oder
Absetzen und Dekantieren ermöglicht,
gewonnen werden.
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Das
Verhältnis
von Ausgangsmaterial zur Aceton/Wasser-Mischung kann variieren.
Die Effizienz der Extraktion der Isoflavone unter Verwendung eines
Verhältnisses
von Ausgangsmaterial zu Aceton/Wasser-Mischung von ungefähr, massebezogen, 1
zu 10 ist typischerweise sehr hoch, wobei es oft 90% übersteigt.
Die Effizienz der Saponin-Extraktion mit diesen Parametern ist jedoch
beträchtlich
niedriger (typischerweise 20 bis 40%), obgleich die Reinheit der
Saponine sehr hoch ist. Unter diesen Bedingungen kann effiziente
Saponin-Gewinnung
zwei oder mehr aufeinanderfolgende Extraktionen mit dem optimalen
Aceton/Wasser-Lösemittel
oder Rückgriff
auf Gegenstromextraktionsverfahren, die den Fachleuten bekannt sein
werden, erfordern.
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Die
durch Filtration, Zentrifugation oder Absetzen und Dekantieren des
abgekühlten
nassen Aceton-Extraktes gewonnenen Saponine haben typischerweise
eine Reinheit, die 70% übersteigt.
Sie können
leicht weiter gereinigt werden, indem sie in einem geeigneten Lösemittel
gelöst,
filtriert und auskristallisieren gelassen werden. Wie haben hervorragende
Ergebnisse unter Verwendung eines Lösemittels erhalten, das aus
70% Ethanol/30% Wasser bestand, in einem Gewichtsverhältnis von
zehn bis fünfzehn
Teilen Lösemittel
zu einem Teil Saponine, obgleich die Fachleute realisieren werden,
daß Mischungen
in anderen Alkoholen und Wasser sich als wirksam erweisen könnten. Die
Mischung wird auf 70°C
oder höher
erhitzt, um die Lösung
der Saponine zu bewirken, bei dieser Temperatur filtriert, um unlösliche Verunreinigungen
zu entfernen, und langsam auf 25°C
oder weniger abkühlen
gelassen, woraufhin die Saponine mit einer Reinheit, die 95% übersteigt, auskristallisieren
und gewonnen werden. Das Erhalten von Soja-Saponine in dieser Reinheit
ohne Rückgriff
auf chromatographische Techniken ist bisher nicht berichtet worden.
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Beispiel 1
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1.000
Gramm eines kommerziellen Soja-Isoflavon-Konzentrats, gewonnen aus
Sojamelasse („Prevastein" von der Central
Soya Company, Fort Wayne, Indiana, das ein Pulver mit der folgenden
Zusammensetzung ist: 5,0% Isoflavone, 10,16% Saponine, 35% Gesamtkohlehydrate,
7% Lecithin, 2% Fette, 33% Proteine, 5% Asche, 5% Feuchtigkeit) wurden
zu einer kräftig
gerührten
Mischung aus 9.450 Gramm Aceton und 2.350 Gramm Wasser zugegeben.
Die Mischung wurde für
90 Minuten auf Aceton-Rückfluß (56°C) erhitzt,
dann auf einem Büchner-Trichter
durch Whatman-Filterpapier #4 filtriert, während eine Temperatur von mehr
als 50°C gehalten
wurde.
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Das
Filtrat, eine nicht-trübe,
bernsteinfarbene Flüssigkeit,
wurde auf 5°C
abgekühlt,
woraufhin ein schmutzig-weißer
Niederschlag aus der Lösung ausfiel.
Diese Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration auf einem Buechner-Trichter
durch Whatman-Filterpapier #4 entfernt, während eine Temperatur von weniger
als 10°C
gehalten wurde.
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Der
Filterkuchen wurde mit einem mäßigen Volumen
an reinem Aceton gewaschen und im Vakuum bei 50°C getrocknet, um 24,0 Gramm
elfenbeinfarbige Feststoffe mit einer Reinheit (d. h. Gesamtsaponingehalt)
nach HPLC, die 86% übersteigt,
zu ergeben, was einer Ausbeute von 20,3% entspricht. Die Analyse
zeigte auch, daß die
in diesem Material enthaltende Menge an Isoflavonen 0,2 Gew.-% nicht überstieg.
HPLC-Analyse des abgekühlten
Filtrats aus diesem Schritt zeigte eine Konzentration von nur 0,06
Gew.-% gelöste
Saponine.
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Im
Anschluß an
die Isolation der Saponine wurde das im Filtrat enthaltene Aceton
durch fraktionierte Destillation bei atmosphärischem Druck abgestrippt und
zur Wiederverwendung zurückgewonnen. Das
gestrippte Filtrat wurde dann mit 500 Gramm Hexan unter kräftigem Rühren bei
60°C für 30 Minuten extrahiert,
um Lecithin und Fette zu entfernen. Das Rühren wurde unterbrochen, damit
sich die Mischung in Schichten trennen konnte; die obere (organische)
Schicht wurde entfernt und die untere (wäßrige) Schicht wurde auf < 10°C abgekühlt, woraufhin Soja-Isoflavone
ausfielen und durch Vakuumfiltration auf einem Buechner-Trichter
durch Whatman-Papier #4 entfernt wurden. Der Filterkuchen wurde
bei 50°C im
Vakuum getrocknet, um 53,5 Gramm Soja-Isoflavone mit einer Reinheit
(d. h. Gesamtisoflavongehalt) von 72% nach HPLC zu ergeben, was
einer Ausbeute von 77% der im Ausgangsmaterial enthaltenen Isoflavone
entspricht.
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Die „verbrauchten
Feststoffe" (d.
h. das Ausgangsmaterial, das anfänglich
extrahiert und aus der heißen
Aceton/Wasser-Mischung durch Filtration entfernt wurde) wurde zu
einer kräftig
gerührten
Mischung aus 9.450 Gramm Aceton und 2.350 Gramm Wasser zugegeben.
Die Mischung wurde für
90 Minuten auf Aceton-Rückfluß (56°C) erhitzt,
dann auf einem Buechner-Trichter durch Whatman-Filterpapier #4 filtriert,
während
eine Temperatur von mehr als 50°C
gehalten wurde.
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Das
Filtrat, eine nicht-trübe,
bernsteinfarbene Flüssigkeit,
wurde auf 5°C
abgekühlt,
woraufhin ein schmutzig-weißer
Niederschlag aus der Lösung ausfiel.
Diese Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration auf einem Buechner-Trichter
durch Whatman-Filterpapier #4 gewonnen, während eine Temperatur von weniger
als 10°C
gehalten wurde.
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Der
Filterkuchen wurde mit einem mäßigen Volumen
an reinem Aceton gewaschen und im Vakuum bei 50°C getrocknet, um 22,8 Gramm
elfenbeinfarbene Feststoffe mit einer Reinheit (d. h. Gesamtsaponingehalt)
nach HPLC von 88% zu ergeben, was einer Ausbeute von zusätzlich 29,4%
der Saponine entspricht, die nach der ersten Extraktion zurückgeblieben
waren, oder einer Gesamtsausbeute von 46% der anfänglich im
Ausgangsmaterial vorhandenen Saponine nach zwei aufeinanderfolgenden
Extraktionen. HPLC-Analyse zeigte auch, daß die in diesem Material enthaltene
Menge an Isoflavonen 0,08 Gew.-% nicht überstieg. Noch einmal zeigte HPLC-Analyse
des abgekühlten
Filtrats aus diesem Schritt eine Konzentration von nur 0,06 Gew.-%
gelöste
Saponine.
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Beispiel 2
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1.000
Gramm eines kommerziellen Soja-Isoflavon-Konzentrats, gewonnen aus
Sojamelasse („Solgen
10" von Solbar Plant
Extracts, Ashdod, Israel, ein Pulver mit der folgenden Zusammensetzung: 9,0%
Isoflavone, 8,1% Saponine, 6% lösliche
Nahrungsfaser, 6% nicht-komplexe
Zucker, 6% Oligosaccharide, 7% Lecithin, 1% Fett, 18% Proteine,
4% Asche, 8% Feuchtigkeit) wurde zu einer kräftig gerührten Mischung aus 9.450 Gramm
Aceton und 2.350 Gramm Wasser zugegeben. Der pH dieser Aufschlämmung betrug
3,1, zu sauer, um Saponine in Lösung
zu bringen, so wurden 94 Gramm einer 50 Gew.-%-igen wäßrigen Lösung von
Natriumhydroxid langsam zugegeben, um den pH auf 6,5 anzuheben. Die
Mischung wurde für
90 Minuten auf Aceton-Rückfluß (56°C) erhitzt,
dann auf einem Buechner-Trichter durch Whatman-Filterpapier #4 vakuumfiltriert,
während
eine Temperatur von 50°C
oder höher
gehalten wurde.
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Das
Filtrat, eine nicht-trübe,
bernsteinfarbene Flüssigkeit,
wurde auf 5°C
abgekühlt,
woraufhin ein schmutzig-weißer
Niederschlag aus der Lösung ausfiel.
Diese Feststoffe wurden durch Vakuumfiltration auf einem Buechner-Trichter
durch Whatman-Filterpapier #4 entfernt, während eine Temperatur von weniger
als 10°C
gehalten wurde. Der Filterkuchen wurde mit einem mäßigen Volumen
an abgekühltem Aceton
gewaschen und im Vakuum bei 50°C
getrocknet, um 44 Gramm (4,4% der Masse des Ausgangsmaterials, entsprechend
einer Ausbeute von% von enthaltenen Saponinen) hellgelbbraun gefärbte Feststoffe
mit einer Reinheit (d. h. Gesamtsaponingehalt) von 71% nach HPLC
zu ergeben, was einer Ausbeute von 38,5% entspricht. Der Isoflavon-Gehalt
dieses Materials überstieg
nicht 0,4 Gew.-%.
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Analyse
dieses abgekühlten
Filtrats mit HPLC zeigte einen Gehalt an gelöstem Saponin von 0,14%, was
14,9 Gramm Gehalt entspricht.
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Im
Anschluß an
die Isolation der Saponine wurde das im Filtrat enthaltene Aceton
durch fraktionierte Destillation bei atmosphärischem Druck abgestrippt und
zur Wiederverwendung zurückgewonnen. Das
gestrippte Filtrat wurde mit 500 Gramm Hexan unter kräftigem Rühren bei
60°C für 30 Minuten
extrahiert, um Lecithin und Fette zu entfernen. Das Rühren wurde
unterbrochen, damit die Mischung sich in Schichten trennen konnte;
die obere (organische) Schicht wurde entfernt und 1.000 ml Wasser wurden
zur unteren (wäßrigen)
Schicht zugegeben, um ihre Viskosität zu verringern. Diese Lösung wurde dann
auf < 10°C abgekühlt, woraufhin
Soja-Isoflavone ausfielen. Nachdem man die Lösung über Nacht stehengelassen hatte,
wurde die überstehende
Flüssigkeit
dekantiert und der Niederschlag wurde bei 50°C im Vakuum getrocknet, um 134
Gramm Soja-Isoflavone mit einer Reinheit (d. h. Gesamtisoflavongehalt)
nach HPLC von 44% zu ergeben, was einer Ausbeute von 66% der im
Ausgangsmaterial enthaltenen Isoflavone entspricht.
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Obgleich
die Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen
derselben beschrieben worden ist, sind zahlreiche Modifikationen möglich, ohne
vom Schutzumfang der Erfindung, wie er durch die folgenden Ansprüche definiert
ist, abzuweichen.