DE19732866A1

DE19732866A1 - Neue Soja-Extrakte, ihre Herstellung und auf ihnen basierende Formulierungen

Info

Publication number: DE19732866A1
Application number: DE1997132866
Authority: DE
Inventors: Ezio Bombardelli; Bruno Gabetta
Original assignee: Indena SpA
Current assignee: Indena SpA
Priority date: 1997-07-30
Filing date: 1997-07-30
Publication date: 1999-02-18
Anticipated expiration: 2017-07-31
Also published as: DE19732866C2

Description

Die Erfindung betrifft neue Extrakte, erhalten durch Extraktion von reifen, vollständigen Sojabohnen oder aus ölfreiem Sojamehl (Glycine max. (L.) MERRIL, Familie der Leguminosen), ihre Her stellung und diese Extrakte enthaltende Formulierungen. Die neuen Extrakte sind durch ihren Gehalt an Isoflavonen und Sapo ninen in definierten Mengenverhältnissen gekennzeichnet.

Es ist bekannt, daß Soja Saponin- und Isoflavonkomponenten zu sätzlich zu Saccharid- und Aminosäurekomponenten sowie Proteine und Mineralsalze in Mengen enthält, die von deren geographischem Ursprung und den Bedingungen, unter denen die Pflanze angebaut und geerntet wurde, abhängen.

Die Saponingehalte wurden in drei Klassen in Abhängigkeit von der chemischen Struktur ihrer Triterpenkomponenten unterteilt: Soja-Saponine der Gruppen A, B und E (Okubo K. et al., ACS Symp., Ser. 546, 330, 1994).

Isoflavonkomponenten bestehen aus Glukosidisoflavonen (Daidzin, Genistin und Glycitin), die an die Saccharinkette geknüpfte Acylreste - z. B. Malonsäurereste - enthalten können.

Entsprechend in den letzten Jahren veröffentlichter biomedizini scher Literatur und epidemiologischer Informationen, hauptsäch lich in Bezug auf die Bevölkerung im Osten, die sich in großem Umfang mit Nahrungsmitteln auf Sojabasis ernährt, reduziert die Verwendung dieser Nahrungsmittel in großem Ausmaß die pre-meno pausalen und post-menopausalen Symptome bei der Frau (A. Cassi dy, Proceeding of the Nutrition Society, 1996, 55, 339-417). Diese Daten, die noch einer klaren wissenschaftlichen Grundlage entbehren, werden gewöhnlich den Isoflavonaglykonen Genistein, Daidzein und Glycitein zugeschrieben, die in den verschiedenen Nahrungsmitteln auf Sojabohnenbasis enthalten sind.

Isoflavone werden gewöhnlich als pflanzliche Östrogene angesehen und zahlreiche in-vitro Untersuchungen zeigten, daß diese Sub stanzen in einem konkurrierenden Mechanismus mit den Östrogenen der Säuger mit einer Aktivität wirken, die als um einen Faktor von 500 bis 1000 geringer bewertet wird als diejenige von Östra diol (D.A. Shutt and R.I. Cox, Journal of Endocrinology, 1972, 52, 299-310).

Zahlreiche Versuche wurden in jüngster Zeit unternommen, um Arzneimittel auf Basis von Soja-Extrakten für die präventive Behandlung von pre-menopausalen und post-menopausalen Symptomen herzustellen. Einige Patente bzw. Patentanmeldungen berichten über Präparate von neuen Soja-Extrakten, erhalten durch chemi sche oder enzymatische Hydrolyse der in Sojabohnen oder -keimen enthaltenen Isoflavonglycoside (Kikkoman Corp. J-08291191; Kik koman Corp. J-07173148; Kelly GE WO-9323069; Kikkoman Corp. J-0511707566). All diese Druckschriften richten sich ausschließ lich auf die Herstellung von Isoflavonen hoher Konzentration und diesen Substanzen werden Aktivitäten hinsichtlich der Regulie rung pre-menopausaler und post-menopausaler Störungen zuge schrieben.

Es wurde nun gefunden, daß in Gegensatz zu dem zuvor Beschriebe nen Extrakte, welche Glukosidisoflavone und Soja-Saponine der Gruppe B in definierten Verhältnissen enthalten, erheblich wirk samer sind als Isoflavone allein.

Demzufolge betrifft die Erfindung einen Extrakt, der 0,6 bis 1,5 Gewichtsteile, bevorzugt 1 Gewichtsteil, an Soja-Saponinen der Gruppe B je 1 Gewichtsteil an Glukosidisoflavonen enthält.

Wie durch HPLC-MS-Analysen gezeigt, besitzen Soja-Saponine der Gruppe P, die auf die Aktivität der Isoflavon-Komponenten einen positiven Einfluß ausüben, die folgenden Strukturen:

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend definierten Extraktes, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

a) die Extraktion reifer, vollständiger Sojabohnen oder von ölfreiem Sojamehl mit aliphatischen Alkoholen oder einer Mischung dieser Alkohole mit Wasser;
b) das Konzentrieren des Extrakts von Stufe a)
c) die Reinigung des konzentrierten Extrakts von Stufe b) von öligen und lipophilen Substanzen durch Behandlung mit aliphatischen Kohlenwasserstoffen;
d) die Extraktion der aktiven Komponenten mit mit Wasser nicht mischbaren aliphatischen Alkoholen;
e) das Konzentrieren des Extrakts von Stufe d) und dessen Trocknung.

Insbesondere können die erfindungsgemäßen Extrakte hergestellt werden durch Extrahieren von reifen, vollständigen Sojabohnen oder von ölfreiem Sojamehl, enthaltend Soja-Saponine der Gruppe B und Glucosidisoflavone in dem reziproken Verhältnis von 3 : 2 bis 2 : 3 mit aliphatischen Alkoholen allein oder in Mischung mit Wasser - bevorzugt mit einer Mischung von Ethanol/Wasser, wie 95%igen Ethanol. Nach Konzentrieren des Extrakts und Reinigung von öligen und lipophilen Substanzen durch Behandlung mit ali phatischen Kohlenwasserstoffen (z. B. n-Hexan oder n-Heptan) werden die aktiven Komponenten mit mit Wasser nicht mischbaren aliphatischen Alkoholen wie n-Butanol, Isobutanol und Isoamyl alkohol, extrahiert. Nach Konzentrieren auf ein vermindertes Volumen wird die organische Phase unter Vakuum getrocknet. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Abänderung des vorstehenden Verfahrens, bei der nach Stufe b) oder c) der konzentrierte Alkohol-Extrakt der folgenden Stufe d') unterzogen wird, an die sich die Stufe e) anschließt

d') die Adsorption der aktiven Komponenten an einem Adsorp tionsharz auf Polystyrolbasis; das Spülen des Harzes mit Wasser; und die Elution der aktiven Bestandteile mit Etha nol.

Entsprechend dieser Abänderung kann ein typischer Extrakt der Erfindung hergestellt werden durch Adsorption der aktiven Kom ponenten (Isoflavone und Saponine), die in dem konzentrierten Alkoholextrakt des pflanzlichen Materials enthalten sind, an einem Adsorptionsharz auf Polystyrolbasis wie Duolite oder jeg liches XAD, insbesondere XAD1180 aufgrund von dessen leicht sau rem pH; und Elution der Mischung der Isoflavone und der Soja- Saponine der Gruppe B wiederum mit Ethanol nach sorgfältigem Spülen der Harz-Säule mit Wasser zur Entfernung von Salzen und anderen nicht aktiven Komponenten.

Der unter diesen Bedingungen erhaltene Extrakt enthält 13 bis 17 Gew.-% Isoflavone und 0,6 bis 1,5 Gewichtsteile Soja-Saponine der Gruppe B, entsprechend der Qualität des eingesetzten pflanz lichen Materials je 1 Gewichtsteil Glucosid-Isoflavone. Dieser Extrakt enthält auch eine große Menge an polyphenolischen Sub stanzen, die sich als wesentlich für die dem Extrakt innewohnen de Aktivität erwiesen, obgleich sie nicht bei der Rezeptor-Akti vität eine Rolle zu spielen scheinen.

Eine Ausführungsform des vorstehenden Verfahrens und dessen Abänderung umfaßt die folgenden Stufen:

f) das Suspendieren des Extrakts von Stufe e) in einer Mi schung von einem mit Wasser mischbaren Alkohol und Wasser und das Verdünnen mit einem mit Wasser nicht mischbaren aprotischen Lösungsmittel;
g) das Erhitzen der Mischung von Stufe f) zur Vervollstän digung der Auflösung und das Belassen bei Raumtemperatur;
h) das Sammeln der ausgefallenen Soja-Saponine der Gruppe B durch Filtration;
i) die Abtrennung der organischen Phase von der Wasserpha se; und das Konzentrieren der organischen Phase und Trock nen zur Erzielung der Isoflavon-Komponenten; und
j) das Mischen der Saponine von Stufe h) und der Isoflavone von Stufe i), um den Extrakt zu bilden.

Dementsprechend können die erfindungsgemäßen Extrakte bevorzugt auch solche, die durch einen sehr hohen Gehalt an Glucosidiso flavonen und Soja-Saponinen der Gruppe B in dem vorstehend be schriebenen Verhältnis gekennzeichnet sind, auch hergestellt werden aus den entsprechend dem vorstehend beschriebenen Ver fahren bzw. dessen Abänderung erhaltenen Extrakt. Hierzu kann wie folgt vorgegangen werden: Der besagte Extrakt wird in einem mit Wasser mischbaren Alkohol, wie Ethanol oder Methanol, mit einem Wassergehalt von 10 bis 50 Volumen% suspendiert und mit einem mit Wasser nicht mischbaren aprotischen Lösungsmittel, wie Methylenchlorid oder Ethylacetat, verdünnt. Die erhaltene hete rogene Mischung wird zur Vervollständigung der Auflösung des Extrakts erhitzt und bei Raumtemperatur belassen, damit die Soja-Saponine der Gruppe B ausfallen können. Die eine Reinheit von über 90% aufweisenden Saponine werden durch Filtrieren ge sammelt. Die Isoflavon-Komponenten, die eine Reinheit von mehr als 80% besitzen, werden aus der wäßrigen Mutterlauge durch Abtrennen der organischen Phase und Eindampfen und Trocknung der letztgenannten erhalten. Die Isoflavone und Saponine können dann gemischt werden, um einen Extrakt mit einem höchstmöglichen Gehalt an Glucosidisoflavonen und mit einem Gehalt an Soja-Sapo ninen der Gruppe B von 0,6 bis 1,5 Gewichtsteilen je 1 Gewichts teil Glucosidisoflavone zu erhalten.

Bevorzugte Bedingungen für die Durchführung der einzelnen Ver fahrensstufen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die folgen den. Hierbei sind die Maßeinheiten für Volumenteile l (Liter) und diejenigen für Gewichtsteile kg (Kilogramm).

Stufe a: Die Extraktion des pflanzlichen Materials wird bevor zugt mit 12 bis 17 Volumina Lösungsmittel je 1 Teil (Gewicht) Biomasse durchgeführt. Die Extraktionstemperatur ist zwecksmäßig höher als 55°C. Jede Extraktion wird zweckmäßigerweise innerhalb von weniger als 4 Stunden durchgeführt. Geeignete Lösungsmittel außer Ethanol sind unter anderem Methanol, Propanol und Isopro panol. Diese Lösungsmittel können bis zu 10% Wasser enthalten.

Stufe b: Die Konzentrierung des Extrakts erfolgt zweckmäßig bei einer Temperatur unterhalb 50°C unter Vakuum. Der Extrakt wird zweckmäßig bis zu einem Alkoholgehalt von 65 bis 75% eingeengt.

Stufe c: Die Reinigung wird zweckmäßig mit 0,3 bis 0,6 Volumina an aliphatischen Kohlenwasserstoffen je 1 Teil (Gewicht) pflanz liches Material durchgeführt. Eine geeignete Vorgehensweise ist diejenige der Extraktion der öligen und lipophilen Substanzen.

Stufe d: Die Extraktion der Wirkstoffe erfolgt zweckmäßig mit 0,2 bis 0,4 Volumina an alkoholischem mit Wasser nicht misch barem Lösungsmittel je Extraktion, berechnet auf 1 Teil (Ge wicht) an pflanzlichem Material; vorzugsweise werden drei Ex traktionen durchgeführt.

Stufe e: Die Konzentrierung des Extrakts von Stufe d erfolgt zweckmäßig bei einer Temperatur unterhalb 50°C unter Vakuum.

Stufe f: Der Extrakt von Stufe e) wird zweckmäßig in 5 bis 10 Volumina (je 1 Teil Extrakt) an wasserlöslichem Alkohol mit einem Alkohol-Wasserverhältnis im Bereich von 2 : 8 bis 3 : 7 Vol/Vol suspendiert. Das aprotische, mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel wird zweckmäßig in einer Menge von 2 bis 5 Volumi na, bezogen auf 1 Teil (Gewicht) des Extrakts von Stufe e ver wendet.

Stufe g: Die Mischung wird, um eine vollständige Auflösung zu erreichen, zweckmäßig erhitzt und unter Rückfluß gehalten. An schließend hält man die Mischung bevorzugt 15 bis 24 h bei Raum temperatur.

Stufe i: Das Eindampfen der organischen Phase erfolgt zweckmäßig bei einer Temperatur von geringer als 30°C unter Vakuum.

Stufe j: Vorzugsweise bereitet man aus den Saponinen von Stufe h und den Glucosidisoflavonen von Stufe g eine alkoholische Lö sung, die die Saponine und Glucosidisoflavone in einem Verhält nis von 1 : 1 enthält, welche dann zweckmäßig bei einer Temperatur unterhalb 50°C unter Vakuum zur Trockne eingeengt wird.

Die Mengen der Isoflavone und der Soja-Saponine der Gruppe B werden durch HPLC-Analyse mit Hilfe einer Supelco-Sil LC-ABZ Säule (250 mm × 4,6 mm), 5 µm, und eines ternären Elutionsmit tels mit einem Gradienten, bestehend aus A) H₂O (CF₃COOH 0,01%), B) Acetonitril (CF₃COOH 0,01%) und C) Methylalkohol (CF₃COOH 0,01%), ermittelt. Die einzelnen Komponenten können durch Massenspektrometrie kombiniert mit HPLC über eine Thermo spray-Grenzfläche identifiziert und charakterisiert werden.

Die erfindungsgemäßen Extrakte zeichnen sich gegenüber bisher bekannten Extrakten hinsichtlich ihrer speziellen Wirkung insbe sondere im Hinblick auf Menopause-Störungen aus.

Hitzewallungen, Schlaflosigkeit und Depression sind die häufig sten klimakterischen Symptome, an denen Frauen während der Meno pause leiden. Sie sind begleitet von einem Nachlassen bzw. Aus klingen der ovarialen Aktivität und demzufolge von einer ver minderten Östrogenproduktion sowie einer erhöhten Produktion an luteinisierendem Hormon (LH) und follikelstimulierendem Hormon (FSH).

In einer neuerlichen Studie (Duker E.M. et al., Planta med. 57, 420, 1991) wurde über eine Assoziation zwischen einem gelegent lichen Anstieg an LH und Temperaturänderungen in der Haut von weiblichen Ratten im Anschluß an eine Ovariotomie berichtet. Diese Beziehung zwischen LH-Spiegel und Hitzewallungen, die nicht nur bei weiblichen Ratten, sondern auch bei Frauen beob achtet wurde, legt nahe, daß die Dosis an sekretiertem LH als geeigneter Parameter für die Untersuchung von psychoneurotisch/en dokrinen Effekten aktiver endokriner Verbindungen angesehen werden kann.

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden bei der Behandlung von ovarektomisierten weiblichen Ratten mit zwei getrennten Fraktionen (Isoflavone und Soja-Saponine der Gruppe B) und den erfindungsgemäßen Extrakten.

Tabelle 1

Konzentration des luteinisierenden Hormons (LH) im Plasma von ovarektomisierten weiblichen Ratten nach oraler Behandlung mit Soja-Extrakten

Die weiblichen Ratten wurden nach bekannten Verfahren einer Ovariotomie unterzogen. 15 Tage nach der Operation wurden die Tiere mit den Testsubstanzen durch einmalige orale Verabreichung pro Tag während 15 Tagen behandelt. Die Tiere wurden 3 Stunden nach der letzten Behandlung getötet. Das Blut wurde unmittelbar darauf zentrifugiert und das erhaltene Serum bei -25°C bis zur Bestimmung des LH durch Radioimmunoassay entsprechend der von Niswender et al. beschriebenen Methode (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 128, 807, 1986) aufbewahrt.

Ersichtlicherweise führte die Verabreichung der erfindungsgemä ßen Extrakte zu einer statistisch signifikanten LH-Abnahme, die stärker war als diejenige, die für die Summe der einzelnen Kom ponenten erhalten wurde (synergistischer Effekt).

Die bei wiederholten Behandlungen an gesunden Tieren verwendeten Extrakte führen bei den Organen oder Systemen männlicher Tiere zu keinen makroskopischen oder mikroskopischen Veränderungen, während sie bei den weiblichen Tieren das Gewicht von Uterus und Skelett modifizieren, was ihre östrogene Aktivität belegt.

Wurden die erfindungsgemäßen Extrakte an Frauen in der Meno pause - sei es, daß sie natürlich oder chirurgisch bedingt war - ver abreicht, modifizierten sie die LH-Plasmaspiegel und reduzierten Menopausestörungen wie Hitzewallungen oder Depression etc. in nerhalb weniger Behandlungstage sowie die Knochenentmineralisie rung bei der Behandlung über längere Zeiträume.

Die Erfindung betrifft daher auch eine pharmazeutische Zusammen setzung, die als aktive Komponente den vorstehend definierten Extrakt enthält. Insbesondere betrifft die Erfindung eine diesen Extrakt enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung für die Prävention oder die Behandlung von pre-menopausalen und post-menopausalen Symptomen.

Die erfindungsgemäßen Produkte bzw. Extrakte können in geeigne ter Weise in Tabletten, Weich- oder Hartgelatinekapseln, granu laren Pulvern zur Herstellung von verwendungsbereiten Lösungen oder Fluids bzw. Flüssigkeiten, die mit ihrer Löslichkeit kom patibel sind, formuliert werden. Die Dosen des erfindungsgemäßen Extrakts liegen im Bereich von 30 mg bis 500 mg bei ein- oder mehrmaliger Verabreichung pro Tag, bevorzugt bei 200 mg bei zweimaliger Verabreichung pro Tag. Die zweckmäßige Verabrei chungsform ist die orale.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von Soja-Extrakt mit einem Isoflavon gehalt von 15 Gew.-% und einem Verhältnis Glucosidisoflavone/So ja-Saponine der Gruppe B von 1 : 1,5 durch Reinigung mit Lö sungsmitteln

10 kg von Öl befreites Sojamehl, enthaltend 0,2% Glucosidiso flavone und 0,3% Soja-Saponine der Gruppe B, werden fünfmal mit 30 l 95%igem Ethylalkohol am Rückfluß gekocht. Die Alkoholex trakte werden gemischt und im Vakuum bis auf 5 l eingeengt. Man verdünnt mit 1,5 l Wasser und extrahiert viermal mit 5 l n-He xan. Die Hexanphase wird verworfen und die konzentrierte Alko holphase viermal mit 2,5 l n-Butanol extrahiert. Die organische Phase wird konzentriert und unter Vakuum getrocknet. Man erhält 133 g Extrakt mit einem Isoflavongehalt von 15 Gew.-% und einem Gehalt an Soja-Saponinen der Gruppe B von 22,5 Gew.-%.

Ein HPLC-Diagramm eines nach dem Verfahren dieses Beispiels erhaltenen Extrakts wird in Fig. 1 gezeigt.

Beispiel 2 Herstellung eines Soja-Extrakts mit einem Isofla vongehalt von 15 Gew.-% und einem Verhältnis Glucosidisoflavo ne/Soja-Saponine der Gruppe B von 1 : 1,5 durch Reinigung an Poly styrolharz

Das in Beispiel 1 hergestellte wäßrige Konzentrat wird nicht mit n-Butanol extrahiert, sondern mit polyethoxyliertem Rhizi nusöl (Cremophor®) behandelt, um die harzartigen Rückstände aus der Einengung der Alkoholphase aufzulösen. Man bringt es dann in einer Säule auf XAD1180 Harz, suspendiert in gereinigtem Wasser (5 l) auf. Die Säule wird bis zur vollständigen Entfernung von Salzen, Zuckern und oberflächenaktiven Mitteln mit Wasser ge spült und dann mit etwa 10 l 95%igem Ethylalkohol eluiert. Nach Konzentrieren und Trocknen des Ethanol-Eluats erhält man 130 g Extrakt mit der gleichen Zusammensetzung wie derjenigen des in Beispiel 1 erhaltenen Extrakts.

Beispiel 3 Herstellung eines Soja-Extrakts mit einem Isofla von-Gehalt von 43 Gew.-% und einem Verhältnis Glucosidisofla vone/Soja-Saponine der Gruppe B von 1 : 1

Man suspendiert 200 g des in Beispiel 1 oder 2 erhaltenen Ex trakts in 1 l wäßrigem 20%igen Ethylalkohol und verdünnt mit 0,5 l Ethylacetat. Die Suspension wird einem Gegenstrom-Erhitzen unter starkem Rühren bis zur vollständigen Auflösung unterzogen und dann während einer Nacht belassen. Die ausgefallenen Saponi ne (38 g, Reinheit 93%) werden durch Filtrieren gewonnen und die Ethylacetat und Wasser enthaltende wäßrige Mutterlauge wird abgetrennt. Die organische Phase wird unter Vakuum eingeengt und getrocknet. Der Isoflavon-Rückstand - 37 g mit einer Reinheit von 81% - wird in 1 l Ethylalkohol gelöst und mit 32 g kristal lisierten Saponinen versetzt, um zu einem Produkt zu gelangen, das Isoflavone und Saponine in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 1 enthält. Die Alkohollösung wird unter Vakuum zur Trockne einge engt und ergibt 69 g Extrakt mit einem Gehalt an 43 Gew.-% Gluco sidisoflavonen und 43 Gew.-% Soja-Saponinen der Gruppe B.

Beispiel 4 Herstellung von Soja-Extrakt enthaltenden Hartgelatinekapseln

Soja-Extrakt hergestellt entsprechend Beispiel 1	200,0 mg
Lactose	67,5 mg
Mikrokristalline Cellulose	22,5 mg
Kolloidales Siliciumdioxid	3,0 mg
Croscarmellose-natrium (vernetztes Polymeres von Carboxymethylcellulose-natrium)	21,0 mg
Talk	8,0 mg
Magnesiumstearat	3,0 mg

Beispiel 5 Herstellung von Soja-Extrakt enthaltenden Tabletten

Soja-Extrakt hergestellt gemäß Beispiel 3	400,0 mg
Soja-Polysaccharide	155,5 mg
Mikrokristalline Cellulose	57,0 mg
Hydroxypropylmethylcellulose	12,0 mg
Hydriertes pflanzliches Öl	19,5 mg
Kolloidales Siliciumdioxid	3,0 mg
Magnesiumstearat	3,0 mg

Claims

1. Soja-Extrakt, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 0,6 bis 1,5 Gewichtsteilen Soja-Saponinen der Gruppe B je 1 Gewichtsteil Glucosidisoflavone.

2. Soja-Extrakt gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 1 Gewichtsteil Soja-Saponine der Gruppe B je 1 Ge wichtsteil Glucosidisoflavone.

3. Verfahren zur Herstellung eines Extrakts gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

a) die Extraktion von reifen, vollständigen Sojabohnen oder von ölfreiem Sojamehl mit aliphatischen Alkoholen oder einer Mischung dieser Alkohole mit Wasser;
b) das Konzentrieren des Extrakts von Stufe a)
c) das Reinigen des konzentrierten Extrakts von Stufe b) von öligen und lipophilen Substanzen durch Behandlung mit aliphatischen Kohlenwasserstoffen;
d) das Extrahieren der aktiven Komponenten mit mit Wasser nicht mischbaren aliphatischen Alkoholen;
e) das Konzentrieren des Extrakts von Stufe d) und dessen Trocknung.

4. Abänderung des Verfahrens gemäß Anspruch 3, worin nach Stufe b) oder Stufe c) der konzentrierte Alkoholextrakt der folgenden Stufe d') unterzogen wird, an die sich Stufe e) anschließt

5. Verfahren gemäß Anspruch 3 oder 4, umfassend die folgenden zusätzlichen Stufen:

f) das Suspendieren des Extrakts von Stufe e) in einer Mischung von einem mit Wasser mischbaren Alkohol und von Wasser und das Verdünnen mit einem mit Wasser nicht mischbaren aprotischen Lösungsmittel;
g) das Erhitzen der Mischung von Stufe f) zur vollständigen Auflösung und das Belassen bei Raumtemperatur;
h) das Sammeln der ausgefallenen Soja-Saponine der Gruppe B durch Filtrieren;
i) das Abtrennen der organischen Phase von der Wasserphase; und das Konzentrieren der organischen Phase und Trocknen, um die Isoflavon-Komponenten zu erzielen; und
j) das Mischen der Saponine von Stufe h) und der Isoflavone von Stufe i) zur Bildung des Extrakts.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als wirksame Kom ponente einen Extrakt gemäß Anspruch 1 oder 2.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 für die Prävention oder Behandlung von pre-menopausalen und post-meno pausalen Symptomen.