CZ298532B6

CZ298532B6 - Sójový extrakt, zpusob jeho prípravy a farmaceutický prostredek, který jej obsahuje

Info

Publication number: CZ298532B6
Application number: CZ20000223A
Authority: CZ
Inventors: Bombardelli@Ezio; Gabetta@Bruno
Original assignee: Indena S. P. A.
Priority date: 1997-07-30
Filing date: 1998-07-30
Publication date: 2007-10-31
Also published as: CA2298142A1; US6607757B2; RU2183964C2; ATE297213T1; HK1025507A1; ES2243005T3; DE69830495T2; NO323231B1; HU229444B1; PL337520A1; PL191191B1; EP1001797A1; DE69830495D1; EP1001797B9; KR100388511B1; US20020058062A1; WO1999006057A1; EP1001797B1; CA2298142C; SK1042000A3

Abstract

Sójové extrakty obsahující 0,6 až 1,5 hmotn. dílusójových saponinu skupiny B na 1 hmotn. díl glukosidisoflavonu, pricemž obsah glukosidisoflavonu v extraktu je alespon 13 % hmotn.; zpusob jejich prípravy; a farmaceutický prostredek, který obsahuje tyto extrakty a je vhodný pro lécení chorob souvisejících s klimakteriem, lécbu rakoviny a alkoholismu.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových extraktů získaných extrakcí zralých celých sójových bobů nebo sójové mouky zbavené oleje (glycin max (L.) MERRIL, třída Leguminosae), způsobu jejich přípravy a prostředků, které obsahují tyto extrakty. Nové extrakty se vyznačují tím, že obsahují v určitém poměru izoflavony a saponiny.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že sója obsahuje saponiny a izoflavony a dále sacharidy a aminokyseliny, a také proteiny a minerální soli v množství, které závisí na oblasti původu a podmínkách, za jakých byla rostlina pěstována a sklizena.

Saponinové látky byly rozděleny do tří tříd podle chemické struktury jejich triterpenové části: sójové saponiny skupiny A, B a E (Okubo K. a další, ACS Symp., Ser. 546, 330. 1994).

	Ri	r₂	r₃
skupina	A	sacharidový řetězec	sacharidový řetězec	OH
skupina	B	sacharidový řetězec	OH	H
skupina	E	sacharidový řetězec	-0	H

Izoflavonové sloučeniny se dělí na glukosidizoflavony (daidzin, genistin a glycitin), které mohou obsahovat acylové, například malonylové, zbytky připojené k řetězci sacharidu.

	Ri	r₂
Daidzin	H	H	D-glukóza
Glycitin	och₃	H	D-glukóza
Genistin	H	OH	D-glukóza
Naizdein	H	H	H
Glycitein	OCHj	H	H
Genistein	H	OH	H

Podle biomedicinálních publikací a epidemiologických prací publikovaných v nedávné době (hlavně u východních národů, které ve velkém konzumují potraviny na bázi sóji) požívání těchto potravin účinně omezuje premenopauzální a postmenopauzální symptomy (A. Cassidy, Proceedings, of the Nutrition Society, 1996, 55, 339—417). Tato fakta, která dosud postrádají jasný vědecký základ, jsou obvykle přisuzována izoflavonu a glykongenisteinu, daidzeinu a glyciteinu, které jsou přítomné v různých sójových potravinách.

Izoflavony se obvykle považují za rostlinné estrogeny a řada in vitro studií prokázala, že tyto látky působí na mechanismy ovlivňující savčí estrogeny s aktivitou řádově (500 až 1000) nižší, než estradiol (D.A. Shutt aR.I. Cox, Journal of Endocrinology, 1972, 52, 299-310).

Podle dalších biomedicinálních publikací a epidemiologických prací publikovaných v nedávné době (hlavně u východních národů, které ve velkém konzumují potraviny na bázi sóji) požívání těchto potravin účinně omezuje výskyt rakoviny prsu a žen a rakoviny prostaty u mužů (A. Nomura, B.e., Henderson J. Lee, Američan Journal of Clinical Nutrition, 1978, 31, 20202025; T. Eirayamn v Diet, Nutrition and Cancer, 1986 str. 41-53, Y. Hayashi, M. Nagao, T. Sugimura, S. Takayana, L. Tomatis, L.W. Wattenberg a G.N. Wogn, Tokyo: Japanese Scientifíc Society Press; R.K. Severson. A.M.Y. Nomura, IS. Grove, G.N. Stemmrman, Cancer Research, 1989, 49, 1857-1860). I tato fakta, která dosud postrádají jasný vědecký základ, jsou obvykle přisuzována izoflavonu a glykongenisteinu, daidzeinu a glyciteinu, které jsou přítomné v různých sójových potravinách.

Tyto izoflavony byly studovány v in vitro modelech s ohledem na jejich schopnost interagovat s proteinkinázami, zejména tyrosinkinázou, což jsou enzymy, které pravděpodobně hrají roli při proliferaci nádorových buněk.

V současné době bylo popsáno mnoho způsobů přípravy léčiv na bázi sójových extraktů pro preventivní léčení premenopauzálních s postmenopauzálních symptomů a také rakoviny. Některé patenty nebo patentové přihlášky popisují prostředky s novými sójovými extrakty získanými chemickou nebo enzymatickou hydrolýzou glukosidizoflavonů přítomných v sójových bodech nebo jejich výhoncích (Kikkoman Corp. J—08291191; Kikkoman Corp. J—07173148; Kelly GE WO-93 023 069; Kikkoman Corp. J—0511707566). Všechny tyto publikace jsou ale považovány pouze za přípravu izoflavonů s vysokou koncentrací a aktivitou (s ohledem na ovlivňování premenopauzálních a postmenopauzálních poruch a protirakovinnou aktivitu).

Nyní bylo objeveno, že na rozdíl od dřívějších popisů jsou samotné izoflavony (s ohledem na prevenci i léčení premenopauzálních a postmenopauzálních symptomů a prevenci i léčení rakoviny) značně aktivnější než extrakty, které obsahují v určitém poměru glukosidizoflavony a sójové saponiny skupiny B.

Dalším aspektem spojeným s extrakty v souladu s předkládaným vynálezem je zneužívání alkoholu a alkoholová závislost. Toto jsou fenomény, které lze shrnout pod pojmem „alkoholismus“ a

-2CZ 298532 B6 tvoří závažný problém současné moderní společnosti (Gessa G.L., „Bizogno compulsive di bere e principio del piacerell [Nutkání k pití a princip radosti] v Medicína delle tossicodipendenze [Léčení drogové závislosti] II, 5 (1994)). Například v Itálii je víc než 9 % populace (asi 5 milionů osob) tzv. těžší konzumenti a více než 1 milion osob jsou alkoholově závislí (Calamo-Spechhia F.P., „Epidmiologia delFalcolismo v Itália“ [Epidemiologie alkoholismu v Itálii] v Atti del VII Congresso Nazionale della S.I.A. [Sborník 7. národního kongresu S.I.A.] Mediserva, Řím, 295301 (1991)). Tato čísla se zvyšují, když vezmeme v úvahu USA, kde je více než 13 milionů osob závislých na alkoholu. Zneužívání alkoholu a současná alkoholová závislost vedou k velmi vysokým státním výdajům (od roku 1991 bylo v USA takto použito asi 200 miliard dolarů ročně) a jsou příčinou velkých sociálních a psychologických problémů postižených.

Stávající přístupy k léčení alkoholismu kromě psychologických (skupinová terapie apod.) sestávající z podávání léků jako je disulfirem a kalciumkarbamid, které ovlivňují metabolismus alkoholu resp. inhibují jatemí aldehyddhydrogenázu, a tak zvyšují hladinu dávícího acetaldehydu a způsobují výskyt všech nepříjemných jevů spojených s požíváním alkoholu.

Podle dosavadního stavu techniky byla jedinou rostlinou používanou při léčení alkoholismu Pueraria lobata (Radix puerarie) a Salvia miltiorrhiza, která se hojně užívá v tradičně čínské medicíně a tvoří podstatu patentové přihlášky WO 93/00 896 a WO 96/35 441. Kromě použití extraktů tyto patentové přihlášky nárokují použití čistých látek jako je daidzein a jeho semisyntetické deriváty ve WO 93/ 00 896 nebo diterpenoidy jako jsou tanshinon a miltiron ve WO 96/35 441. Účinek na alkoholdehydrogenázu svýše uvedenými postranními efekty byl uveden i u derivátů izoflavonu, zatímco byl stejný mechanismus u diterpenoidických sloučenin vyloučen. Dále uvádí patentová přihláška WO 96/36 332 účinek forskolinu na snížení spotřeby alkoholu.

Nyní bylo překvapivě objeveno, že lze s úspěchem pro snížení patologické spotřeby alkoholu použít extrakty obsahující v určitém poměru glukosidizoflavony a sójové saponiny skupiny B. Tyto extrakty jsou značně účinnější než samotné izoflavony a působí jiným mechanismem, než je inhibice alkoholdehydrogenázy, protože plazmový koncentrace alkoholu zůstává nezměněna.

Kromě výše uvedeného dosavadního stavu techniky uvádí WO 96/10 341 dietetické nebo zdravotnické prostředky obsahující v podstatě čisté hypokotyly sójových semen. Není zde ale uvedena žádná zmínka o postupu extrakce ani o poměru izoflavonů a saponinů v souladu s předkládaným vynálezem.

Patent US 4 428 876 uvádí způsob izolace saponinů a flavonoidů z luštěnin. Uvedená extrakce sójových bobů 0,4% vodným hydroxidem sodným ale poskytuje jiný konečný extrakt než ten v souladu s předkládaným vynálezem. A opět zde není žádný odkaz na poměr izolavonů a saponinů v souladu s předkládaným vynálezem.

Patent JP 59088064 vede pouze k izolaci a použití samotných saponinů. Téhož se týká DE 3 400 258. Podobně JP 61036225 vede k izolaci a čištění saponinů a JP 62005917 k přípravě čistých saponinů zcela prostých izoflavonů. Práce JP 4036242 se týká přípravy čistého saponinů nebo extraktu obsahujícího vysoký poměr saponin/izoflavon jako protizánětlivé činidlo.

Patent EP-A-424 998 uvádí přípravu izoflavonů ze sójových bobů a zejména genistin a daidzinmalonátu. Není zde žádná zmínka o extrakci saponinů a o poměru izoflavonů a saponinů.

Práce JP 63245648 vede k přípravě sójové potraviny zbavené saponinů a izoflavonů, které jsou shledány způsobujícími pachuť a nepoživatelnost potraviny.

Mark Messina a další, Joumal of the National Cancer Institute, Vol. 83, No. 8, 17.4. 1991, strany 541-546, uvádí roli sójových produktů při potlačování rizika rakoviny, která již byla uvedena ve vědecké literatuře. Ani tento ani jiný produkt ale neuvádí extrakt obsahující saponiny a

-3 CZ 298532 B6 izoflavony v poměru jako předkládaný vynález natož farmakologický účinek dostupný takto specifickým extraktem.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se proto týká extraktu, který obsahuje 0,6 až 1,5 hmotnostního dílu, s výhodou 1 hmotnostní díl sójového saponinů skupiny B na 1 hmotnostní díl glukosidizoflavonů, kdy je obsah glukosidizoflavonů v extraktu alespoň 13 % hmotnostních.

Jak ukázala HPLC-MS analýza, mají sójové saponiny skupiny B, které způsobují výhodný efekt na aktivitu izoflavonové složky, následující strukturu:

	*1	r₂
sójový saponin V	CH₂OH	glukóza
sójový saponin II izomer	ch₃	arabinóza
sójový saponin I	ch₂oh	ramnóza
sójový saponin II	H	ramnóza
sójový saponin III	ch₂oh	H
sójový saponin IV	H	H

Vynález se dále týká způsobu přípravy výše uvedených extraktů, který se vyznačuje tím, že 15 zahrnuje následující kroky:

a) extrakce zralých celých sójových bobů nebo sójové mouky zbavené oleje alifatickými alkoholy nebo směsí těchto alkoholů s vodou;

b) zahuštění extraktu z kroku a);

-4CZ 298532 B6

c) čištění zahuštěného extraktu z kroku b) od olejovitých a lipofilních látek působením alifatických uhlovodíků;

d) extrakce aktivních složek pomocí s vodou nemísitelných alifatických alkoholů;

e) zahuštění extraktu z kroku d) a jeho vysušení.

Konkrétně lze extrakty v souladu s předkládaným vynálezem připravit extrakcí zralých celých sójových bobů nebo sójové mouky zbavené oleje, které obsahují sójové saponiny skupiny B a glukosidizoflavony ve vzájemném poměru 3:2 až 2:3 pomocí alifatických alkoholů samotných nebo ve směsi s vodou, výhodně pomocí směsi ethanol/voda jako je 95% čistý ethanol. Po zahuštění extraktu a čištění od olejovitých a lipofilních látek působením alifatických uhlovodíků (např. n-hexanu nebo n-heptanu) se aktivní složky extrahují pomocí s vodou nemísitelných alifatických alkoholů jak je n-butanol, izobutanol a izoamylalkohol. Po zahuštění na menší objem se organická fáze vysuší za sníženého tlaku. Vynález se dále týká modifikací výše uvedeného postupu, kdy se po krocích b) nebo c) zahuštěný alkoholový extrakt podrobí následujícímu kroku ď), který je následován krokem e):

ď) adsorpce aktivních složek na polystyrénovou adsorpční pryskyřici; promytí pryskyřice vodou; vymytí aktivních složek ethanolem.

V souladu s touto modifikací lze typický extrakt podle předkládaného vynálezu připravit adsorpcí aktivních složek (izoflavonů a saponinů), které jsou přítomné v zahuštěném alkoholovém extraktu rostlinného materiálu, na polystyrénové adsorpční pryskyřici jako je duolit nebo jakýkoliv XAD, zejména XAD1180 kvůli svému mírně kyselému pH; a zpětným vymytím směsi izoflavonů a sójových saponinů skupiny B ethanolem po pečlivém promytí sloupce pryskyřice vodou za odstranění solí a dalších neaktivních složek.

Extrakt získaný za těchto podmínek obsahuje 13 až 17% hmotnostních izoflavonů a 0,6 až 1,5 hmotnostního dílu sójových saponinů skupiny B (v závislosti na kvalitě použitého rostlinného materiálu) na 1 hmotnostní díl glukosidizoflavonů. Tento extrakt obsahuje i velké množství polyfenolických látek, které se ukázaly být nezbytné pro vlastní aktivitu extraktu.

Provedení výše uvedeného postupu a jeho modifikací zahrnuje následující kroky:

f) suspendování extraktu z kroku e) ve směsi s vodou mísitelného alkoholu a vody a jeho zředění s vodou nemísitelným aprotickým rozpouštědlem;

g) zahřívání směsi z kroku f) pro dokončení rozpouštění a ponechání při teplotě místnosti;

h) oddělení vysrážených sójových saponinů skupiny B filtrací;

i) oddělení organické a vodné fáze a zahuštění organické fáze a její vysušení za získání izoflavonové složky; a

j) smíchání saponinů z kroku h) a izoflavon z kroku i) za účelem vytvoření extraktu.

A tak lze získat i extrakty v souladu s předkládaným vynálezem, které se vyznačují velmi velkým obsahem glukosidizoflavonů a sójových saponinů skupiny B ve výše popsaném poměru, a to z extraktu získaného výše popsaným postupem nebo jeho modifikací. Za tím účelem lze postup provést následovně: uvedený extrakt se suspenduje v alkoholu mísitelném s vodou jako je ethanol nebo methanol s obsahem vody 10 až 50 % objemových a zředí se s vodou nemísitelným aprotickým rozpouštědlem jako je ethylenchlorid nebo ethylacetát. Získaná heterogenní směs se zahřeje pro dokončení rozpouštění extraktu a ponechá se při teplotě místnosti, takže se mohou vysrážet sójové saponiny skupiny B. Saponiny, které mají čistotu vyšší než 90 %, se oddělí filtrací. Izoflavonové složky, které mají čistotu více než 80 % se získají z vodných matečných louhů oddělením organické fáze a jejím zahuštěním a vysušením. Izoflavony a saponiny lze pak smísit za účelem získání extraktu s nej vyšším možným obsahem glukosidizoflavonů a s obsahem sójových saponinů skupiny B od 0,6 do 1,5 hmotnostního dílu na 1 hmotnostní díl glukosidizoflavonů.

-5CZ 298532 B6

Dále jsou uvedeny výhodné podmínky pro provedení jednotlivých kroků postupu v souladu s předkládaným vynálezem. V tomto případě jsou jednotky pro měření objemových dílů „litry“ a hmotnostních dílů „kilogramy“.

Krok a: rostlinný materiál se s výhodou extrahuje 12 až 17 objemy rozpouštědla na 1 hmotnostní díl biomasy. Extrakční teplota je s výhodou nad 55 °C. Každá extrakce se s výhodou provádí v periodě kratší než 4 hodiny. Vhodná rozpouštědla kromě ethanolu jsou mj. methanol, propanol a izopropanol, tato rozpouštědla mohou obsahovat do 10 % vody.

Krok b: extrakt se s výhodou zahustí při teplotě do 50 °C za sníženého tlaku. Extrakt se s výhodou zahustí na obsah alkoholu 65 až 75 %.

Krok c: čištění se s výhodou provádí za použití 0,3 až 0,6 objemů alifatického uhlovodíku na 1 hmotnostní díl rostlinného materiálu. Vhodný postup je extrakce olejovitých a lipofilních látek.

Krok d: aktivní složky se s výhodou extrahují 0,2 až 0,4 objemy alkoholického s vodou nemísitelného rozpouštědla na každou extrakci počítáno na 1 hmotnostní díl rostlinného materiálu; s výhodou se provedou 3 extrakce.

Krok e: extrakt z kroku d se s výhodou zahustí při teplotě do 50 °C za sníženého tlaku.

Krok f: extrakt z kroku e) se s výhodou suspenduje v 5 až 10 objemech (na 1 díl extraktu) ve s vodou mísitelném alkoholu za použití poměru alkohol/voda v rozsahu od 2:8 do 3:7 objem/objem. Aprotické s vodou nemísitelné rozpouštědlo se s výhodou použije v množství 2 až 5 objemů na 1 hmotnostní díl extraktu z kroku e.

Krok g: k dosažení úplného rozpuštění se směs s výhodou zahřívá k varu. Směs se pak s výhodou ponechává stát při teplotě místnosti 15 až 24 hodin.

Krok i: organická fáze se s výhodou zahustí odpařením při teplotě do 30 °C za sníženého tlaku.

Krokj: saponiny z kroku h a glukosidizoflavony z kroku g se s výhodou použijí k přípravě alkoholického roztoku, který obsahuje saponiny a glukosidizoflavony v poměru 1:1. Roztok se pak s výhodou zahustí do sucha při teplotě do 50 °C za sníženého tlaku.

Množství izoflavonů a sójových saponinů skupiny B se stanoví HPLC analýzou za použití Supelco-Sil LC-ABZ kolony (250 mm x 4,6 mm), 5 pm, a temámího elučního média s gradientem, které obsahuje A) H₂O (CF₃COOH 0,01 %), B) acetonitril (CF3COOH 0,01 %) a C) methylalkohol (CF3COOH 0,01%). Jednotlivé složky lze identifikovat a charakterizovat hmotnostní spektroskopii v kombinaci s HPLC a termosprej interface.

Extrakty v souladu s předkládaným vynálezem se liší od dříve známých extraktů kvůli svému zvláštnímu působení. Z poruch v menopauze jsou nejčastější klimakterické poruchy, kterými ženy trpí v menopauze, návaly horkosti, nespavost a deprese. Jsou spojeny se snížením nebo zastavením činnosti vaječníků a spojenou sníženou tvorbou estrogenu a zvýšenou tvorbou luteinizačního hormonu (LH) a folikulus stimulujícího hormonu (FSH).

Současné studie (Duker E.M. a další; Planta Med. 57, 420, 1991), uvádějí spojitost mezi příležitostným zvýšením LZ a teplotními změnami kůže samic krys po vynětí vaječníků. Tato spojitost mezi hladinou LH a návaly horkosti, která byla pozorována nejen v případě krys, ale i žen, napovídá, že množství vylučovaného LH může být vhodným parametrem pro studování psychoneurotického a endokrinního účinku aktivních endokrinních sloučenin.

-6CZ 298532 B6

Tabulka 1 uvádí výsledky získané u krys po vyjmutí vaječníků při podávání dvou oddělených frakcí (izoflavony a sójové saponiny skupiny B) a extraktu v souladu s předkládaným vynálezem.

Tabulka 1: Koncentrace luteinizačního hormonu (LH) v plazmě u krys po vyjmutí vaječníků po perorálním podávání sójového extraktu

Podávaný produkt	Dávka (mg/kg/den)	LH (ng/ml)
Nosič	10 ml/kg	6,2±0,01
Sójové saponiny skupiny B	1000	5,8±0,02
Sójové isoflavony	1000	3,4±0,001
Sójový extrakt připravený podle příkladu 1	1000	2,l±0,001
Sójový extrakt připravený podle příkladu 3	1000	1,3±0,001

Samice krys byly podrobeny ovariotomii známým způsobem. Po 15 dnech po operaci byly zvířatům podávána testovaná látka: jednorázově, perorálně, 15 dnů. Zvířata byla usmrcena 3 dny po poslední dávce. Krev byla odstředěna hned nato a získané sérum bylo až do stanovení LH radioimunologickým testem podle Niswender a další (Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 128, 807, 1986) skladováno při -25 °C.

Jak je vidět, podávání extraktu v souladu s předkládaným vynálezem vedlo ke statisticky významnému snížení hladiny LH, které bylo větší než součet jednotlivých složek (synergický efekt).

Extrakty použité u opakovaného léčení zdravých zvířat nevedly k žádným makroskopickým ani mikroskopickým změnám orgánů ani systémů u samců krys, když u samic došlo ke změně hmotnosti dělohy a kostry, což potvrzuje estrogenní aktivitu.

Když byly extrakty v souladu s předkládaným vynálezem podávány ženám v menopauze (bez ohledu jestli k ní došlo přirozeně nebo chirurgicky), došlo ke změně hladiny v LH v plazmě a omezení menopauzálních poruch, jako jsou návaly horkosti nebo deprese apod. v několika dnech podávání a při dlouhodobější léčbě došlo i ke snížení demineralizace kostí.

Extrakty v souladu s předkládaným vynálezem mají i značnou antiproliferační aktivitu. Tabulka 2 uvádí antiproliferační in vitro aktivitu u kmene nádorových buněk vaječníků (OVCA 433).

Tabulka 2: Antiproliferační aktivita sójových extraktů proti nádorových buňkám vaječníků (OVCA 433) in vitro

Sloučenina	IC₅₀ μΜ
Sójové saponiny skupiny B	6,2
Sójové isoflavony	4,5
Sójový extrakt připravený podle příkladu 1	1,6
Sójový extrakt připravený podle příkladu 3	1,1

-7 CZ 298532 B6

Buňky byly kultivovány v monovrstvě na minimu esenciálního média obsahujícího přidané telecí sérum a 200 jednotek/ml penicilinu pro udržení sterility média. Za účelem reprodukovatelnosti testů byly buňky každý týden trypsinizovány a naneseny na desku s hustotou 8 x 10⁴ buněk/ml a inkubovány při 37 °C na vzduchu s obsahem 5 % CO₂ a vlhkosti. Za účelem testování aktivity sloučenin byly buňky naneseny do jamek (Falcon 3046, Becton Dickinson NY) při koncentraci 1 x 10⁵/ml v minimálním množství substrátu. Po 24 hodinách byl substrátu vyměněn za čerstvý a byly přidány sloučeniny rozpuštěné v absolutním ethanolu. Kontrolní pokus byl proveden s excipientem za absence aktivní sloučeniny. Výše uvedený postup byl opakován ve 24hodinových intervalech po dobu 72 hodin. Inhibice proliferace buněk byla stanovena přímým počítáním buněk za porovnání testovaného a kontrolního vzorku. Ukázalo se, že extrakty v souladu s předkládaným vynálezem mají antiproliferační aktivitu, která je větší než součet antiproliferačních aktivit jejich složek (synergická aktivita). Sloučenina v souladu s předkládaným vynálezem inhibovaly buněčnou proliferaci in vivo, což bylo ověřené měřením velikosti nádorů transplantovaných nahým atypickým myším podle běžných postupů popsaných v literatuře. Podávání dávek v rozsahu 10 až 500 mg/kg vedlo ke značné degeneraci studovaných nádorů až po jejich zmizení u vysokého procenta jedinců.

Inhibiční efekt na spotřebu alkoholu byl stanoven pomocí alkoholických krys druhu „Sardinská alkoholička“ (Sp) (Fadda F„ Mosca E., Colombo G., Gesse G.L., Alcohol preferring rats; Genetic sensitivity to alcohol-induced stimulation of dopamin metabolism, vFysiol. Behav. 47, 727 (1990)). Tato zvířata, která měla volný výběh mezi vodou a alkoholem, požívala denně 6 až 7 kg alkoholu na 1 kg tělesné hmotnosti (při poměru voda:alkohol více než 2:1), byla v posledních letech použita ke stanovení účinku různých látek na dobrovolnou spotřebu alkoholu, viz např. Balakleevsky A., Colombo G., Padda F„ Gessa G.L., RO 19-4603, a benzodiazepine receptor inverse agonist, attenuates voluntary ethanol comsumption in rats selectively bred for high ethanol prefřence, Alcohol 25, 449-452 (1990); Fadda F„ Garau B., Collombo G., Gessa G.L., Isradipine and other calcium channel antagonists attenuate ethanol consumption in ethanolpreferring rats, Alcoholism: Clinical and Experimental Research 16 (3), 449-452 (1992).

Zvířata chovaná za normálních podmínek měla volný výběr mezi vodou (která byl vždy k dispozici) a alkoholem (10% roztok objem/objem), který byl nabízen ve 4 hodinových periodách každý den (tj. první 4 hodiny temna během cyklu den/noc). Každý den ve stejnou dobu byla zaznamenána spotřeba vody a alkoholu. Potrava byla k dispozici dle libosti. Když byla dosažena stabilní spotřeba alkoholu a vody, začalo perorální podávání extraktu v dávce 1000 mg/kg suspendovaného ve vodě (2 ml/kg, jednou za den, 7 po sobě jdoucí dnů). Jako kontrolní pokud byl použit stejný objem excipientu. Na konci podávání byla zaznamenávána spotřeba alkoholu, dokud nedosáhla hodnot před podáváním.

Tabulka 3 ukazuje účinek opakovaného perorálního podávání 1000 mg/kg sójového extraktu na spotřebu alkoholu.

Tabulka 3 vede k závěru, že sójový extrakt významně snižuje spotřebu alkoholu. Snížená spotřeba alkoholu zůstává během 7 dnů podávání konstantní a zpátky narůstá až po ukončení léčení. Dále je vidět, že snížení spotřeby alkoholu je významnější než jen součet účinků jednotlivých složek (synergický efekt).

-8CZ 298532 B6

Tabulka 3 - Účinek opakovaného perorálního podávání sójových extraktů na spotřebu alkoholu u Sp krys (Sardinské alkoholicky)

Spotřeba alkoholu (g/kg)	den 5	CN O +1 k£> CN	rd O +1 CN CN	CN O +1 os rd	rd O +1 ω rd	rd O +1 ΐο rd
tí Φ	CN O +1 O\ CN	(Π O +1 > CN	m o +1 os CN	2,0* + 0,1	rd O +1 rd CN
Cú tí Φ Ό	m o +1 00 CN	(N o +1 Oi CN	2,8 ±0,1	o +1 OS CN	ΓΊ O +1 O m
CN tí Φ Ό	2,9 + 0,2	CO o +1 co CN	CN O +1 os (N	rd O H os CN	m o +1 os CN
H tí Φ	rd O +1 Φ CN	2,8 + 0,1	CN O +1 KO CN	3,0 + 0,2	CN O +1 co CN
m tn X * > ~χ «Β tn Q S		σι X X. rH € CN	O o o rd	O o o rd	O o o rd	O O o rd
SLOUČENINA		>0 rl U 0 X	Saponiny skupiny B	Sójové isoflavony	Extrakt z příkladu X	<*> t nJ H X M >U ft N 4J M a U

01; Dunnetův t-test pro násobné porovnání s kontrolním vzorkem

	<Ν	ΓΝ	η	n
10	Ο	Ο	ο	o	o
β	+1	+1	+1	d-l	+1
0)	KD	ο	kD		CN
	·»	·»		·.	*.
	ΓΝ	m	CN	CN	CN
	CN	rd	ΓΝ	CN	CN
os	Ο	Ο	Ο	O	O
β	+1	+1	+1	d-l	+1
Φ
Ό	00	σ\		O	os
	·»	··	·«	•
	ΓΝ	ΓΝ	CN	CN	rd
	rd	CN	rd	rd	rd
00	Ο	Ο	Ο	O	O
β	+1	+1	+1	+1	H
φ
Ό	os	Γ'	cn	Ίη	CN
	ΓΝ	ΓΝ	r—1	rd	rd
		CN	rd	CN	CN
	ο	Ο	O	O	O
β	+1	+1	+1	+1	d-l
0
•σ	0S		o		CN
	CN	ΓΝ	CN	rd	rd
	rd	rd	CN	rd	rd
	Ο	Ο	O	O	O
β	+1	+1	+1	d-l	d-l
0)
Ό	Ο	<Ν			* r*
	<*)	ΓΝ	rd	rd	rd
	tn
	X

	rH	Ο	O	O	O
	ε	Ο	O	O	o
		Ο	o	O	o
	CN	Η	rd	rd	rd
				rd	cn
		»		β	3
				Ό	Ú
		S	β	e	rt
		β	0	rH	rd
		Η	>	X	X
		0.		M	M
		β	rd	>M	>h
Ή		χ	<H	P,	A
Ζ		9]	0
			ω	N	N
>		S	•rl
Ο		β			4J
υ		•Η		X	X
	>υ	π	>	Φ	«
α		0	0	k	k
84	ω	Λ	*n	jj	4J
ο	ρ	<0	'0	X	X
α	'Ά	W	tn	M	M

-9CZ 298532 B6

Vynález se proto týká i farmaceutických prostředků, které obsahují jako aktivní složku výše uvedený extrakt. Konkrétně se vynález týká: farmaceutického prostředku obsahujícího tento extrakt pro prevenci nebo léčení premenopauzálních nebo postmenopauzálních symptomů; farmaceutického prostředku obsahujícího tento extrakt pro prevenci nebo léčení rakoviny prsu žen a prostaty mužů; a farmaceutického prostředku obsahujícího tento extrakt pro prevenci nebo léčení alkoholismu.

Prostředky nebo extrakty v souladu s předkládaným vynálezem lze vhodným způsobem upravit do formy tablet, měkkých nebo tvrdých želatinových kapslí, granulovaného prášku pro přípravu instantních roztoků nebo tekutin nebo kapalin, které odpovídají jejich rozpustnosti. Dávky extraktu v souladu s předkládaným vynálezem jsou v rozsahu 30 mg až 500 mg za den v případě jednorázového nebo opakovaného podávání, s výhodou 200 mg při podávání dvakrát denně. Výhodná forma podávání je perorální.

Příklady provedení vynálezu

Vynález ilustrují následující příklady.

Příklad 1 - Příprava sójového extraktu s obsahem izoflavonu 15 % hmotnostních a poměrem glukosidizoflavonu ku sójovým saponinům B skupiny 1:1,5 čištěním rozpouštědly.

kg sójové mouky zbavené oleje obsahující 0,2 % glukosidizoflavonů a 0,3 % sójových saponinů skupiny B se pětkrát zahřívá k varu vždy ve 30 litrech 95% ethylalkoholu. Alkoholové extrakty se spojí a zahustí za sníženého tlaku na objem 5 litrů. Koncentrát se zředí 1,5 litrem vody a čtyřikrát se extrahuje 5 1 n-hexanu. Hexanová fáze se odloží a zahuštěná alkoholová fáze se čtyřikrát extrahuje 2,5 1 n-butanolu. Organická fáze se zahustí a vysuší za sníženého tlaku. Získá se 133 g extraktu obsahujícího 15 % hmotnostních izoflavonu a 22,5 % hmotnostních sójových saponinů skupiny B.

Chromatogram z HPLC extraktu získaného postupem podle tohoto příkladu je uveden na obrázku 1.

Příklad 2 - Příprava sójového extraktu s obsahem izoflavonu 15 % hmotnostních a poměrem glukosidizoflavonu ku sójovým saponinům B skupiny 1:1,5 čištěním na polystyrénové pryskyřici

Vodný koncentrát připravený podle příkladu 1 se neextrahuje n-butanolem, ale podrobí se působení polyethoxylovaného ricinového oleje (Cremofor^(R)), a to za účelem rozpouštění pryskyřičných zbytků po zahuštění alkoholové fáze. Směs se potom aktivuje suspendovaná v čištěné vodě (5 1) na kolonu pryskyřice XAD1180. Kolona se promyje vodou za úplného odstranění soli, sacharidů a povrchově aktivních látek, a pak se vymývá 10 litry 95% ethylalkoholu. Po zahuštění a vysušení ethanolové fáze se získá 130 g extraktu se stejným složením jako v příkladu 1.

Příklad 3 - Příprava sójového extraktu s obsahem izoflavonu 43 % hmotnostních a poměrem glukosidizoflavonu ku sójovým saponinům B skupiny 1:1

Extrakt (200 g) získaný v příkladu 1 nebo 2 se suspenduje v 1 1 20% vodného ethylalkoholu a zředí se 0,5 I ethylacetátu. Suspenze se za intenzivního míchání zahřívá k varu až do úplného rozpuštění, a pak se nechá stát přes noc. Tím dojde k vysrážení saponinů (38 g, 93% čistota), které se oddělí filtrací, a oddělení vodných matečných louhů, které obsahují ethylacetát a vodu. Organická fáze se zahustí za sníženého tlaku a vysuš se. Izoflavonový zbytek (37 g) o čistotě

-10CZ 298532 B6 % se rozpustí v 1 1 ethylalkoholu a přidá se 32 g krystalických saponinů za účelem získání produktu, který obsahuje izoflavony a saponiny v hmotnostním poměru 1:1. Alkoholový roztok se zahustí do sucha za sníženého tlaku a poskytne 69 g extraktu s obsahem glukosidizoflavonů % hmotnostních a obsahujícího 43 % hmotnostních sójových saponinů skupiny B.

Příklad 4 - Příprava tvrdých želatinových tobolek obsahujících sójový extrakt

Sójový extrakt připravený podle příkladu 1	200,0 mg
Laktóza	67,5 mg
Mikrokrystalická celulóza	22,5 g
Koloidní oxid křemičitý	3,0 mg
Sodná sůl kroskarmelózy (zesítěný polymer	21,0 mg
sodné soli karboxymethylcelulózy)
Mastek	8,0 mg
Stearan hořečnatý	3,0 mg

Příklad 5 - Příprava tablet obsahujících sójový extrakt

Sójový extrakt připravený podle příkladu 3	400,0 mg
Sójové polysacharidy	155,5 mg
Mikrokrystalická celulóza	57,0 mg
Hydroxypropylmethylcelulóza	12,0 mg
Ztužený rostlinný tuk	19,5 mg
Koloidní oxid křemičitý	3,0 mg
Stearan hořečnatý	3,0 mg

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sójový extrakt, vyznačující se tím, že obsahuje 0,6 až 1,5 hmotnostního dílu sójových saponinů skupiny B na 1 hmotnostní díl glukosidizoflavonů a že obsah glukosidizoflavonů v extraktu je alespoň 13 % hmotnostních.
2. Sójový extrakt podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje 1 hmotnostní díl sójových saponinů skupiny B na 1 hmotnostní díl glukosidizoflavonů.
3. Způsob přípravy extraktu podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

a) extrakce zralých celých sójových bobů nebo sójové mouky zbavené oleje, obsahujících sójové saponiny skupiny B a glukosidizoflavony ve vzájemném poměru 3:2 až 2:3, alifatickými alkoholy nebo směsí těchto alkoholů a vody;

b) zahuštění extraktu z kroku a);

c) čištění zahuštěného extraktu z kroku b) od olejovitých a alifatických látek působením alifatických uhlovodíků;

d) extrakce aktivních složek pomocí s vodou nemísitelných alifatických alkoholů;

e) zahuštění extraktu z kroku d) a jeho vysušení.

-11 CZ 298532 B6
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že po kroku b) nebo kroku c) se zahuštěný alkoholový extrakt podrobí následujícímu kroku ď), který je následován krokem e):

ď) adsorpce aktivních složek na polystyrénovou adsorpční pryskyřici; promytí pryskyřice vodou; vymytí aktivních složek ethanolem.
5. Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že zahrnuje následující další kroky:

f) suspendování extraktu z kroku e) ve směsi alkoholu mísitelného s vodou a vody a jeho zředění aprotickým rozpouštědlem nemísitelným s vodou;

g) zahřívání směsi z kroku f) pro dokončení rozpouštění a ponechání směsi při teplotě místnosti;

h) oddělení vysrážených sójových saponinů skupiny B filtrací;

i) oddělení organické a vodné fáze; a zahuštění organické fáze a její sušení za získání izoflavonových složek; a

j) smísení saponinů z kroku h) a izoflavonů z kroku i) za účelem vytvoření extraktu.
6. Farmaceutický prostředek, v y z n a č u j í c í se tím, že jako aktivní složku obsahuje extrakt podle nároku 1 nebo 2.
7. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 pro prevenci nebo léčení premenopauzálních a postmenopauzálních symptomů.
8. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 pro prevenci nebo léčení rakoviny.
9. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 nebo 8 pro prevenci nebo léčení rakoviny prsu žen.
10. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 nebo 8 pro prevenci nebo léčení rakoviny prostaty mužů.
11. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 pro prevenci nebo léčení alkoholismu.