JP3570989B2

JP3570989B2 - 大豆抽出物、その調製方法および医薬組成物

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Publication number: JP3570989B2
Application number: JP2000504870A
Authority: JP
Inventors: ボムバルデーリ、エツィオ; ガベッタ、ブロノ
Original assignee: インデナエッセピア
Priority date: 1997-07-30
Filing date: 1998-07-30
Publication date: 2004-09-29
Anticipated expiration: 2018-07-30
Also published as: PT1001797E; SK283491B6; EP1001797B1; PL191191B1; KR20010022432A; CA2298142C; CZ2000223A3; RU2183964C2; HK1025507A1; US7108871B2; US6607757B2; HUP0003058A3; DE69830495D1; HUP0003058A2; NO20000399L; EP1001797B9; JP2001511455A; US20020058062A1; AU9071198A; US6280777B1

Description

【０００１】
説明
本発明は、完熟大豆の抽出により、または油を含まない大豆粉末（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ（Ｌ．）ＭＥＲＲＩＬ、Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅファミリー）から得られる新規な抽出物、その製造およびこれらの抽出物を含有する製剤に関する。イソフラボンおよびサポニンの含有量が決まった比率であることが、この新規な抽出物の特徴である。
【０００２】
大豆は、タンパク質および無機塩と同様に、それらの地理的起源およびその植物が栽培され、また収穫された条件に依存して異なる量で、糖類およびアミノ酸成分に加えて、サポニンおよびイソフラボン成分を含有することが知られている。
【０００３】
このサポニン含有物は、それらのトリテルペン成分の化学構造に応じて３種類、すなわち大豆サポニンＡ、ＢおよびＥ群に分類されてきた（ＯｋｕｂｏＫ．他、ＡＣＳＳｙｍｐ．、Ｓｅｒ．５４６、３３０ページ、１９９４年）。
【０００４】
【化１】

【０００５】
イソフラボン成分は、糖鎖に結合するアシル基、例えばマロニル基を含むことがあるイソフラボングルコシド（ダイジン、ゲニスチンおよびグリシチン（ｇｌｙｃｉｔｉｎ））から成る。
【０００６】
【化２】

【０００７】
近年に至って刊行された、大豆をベースとする食物を多量に消費する主として東洋の国民に関連する生物医学文献および疫学的情報によれば、これらの食物を多量に用いると女性における閉経前および閉経後症状を軽減する（Ａ．Ｃａｓｓｉｄｙ、ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮｕｔｒｉｔｉｏｎＳｏｃｉｅｔｙ、５５巻、３３９〜４１７ページ、１９９６年）。これらの事実は、未だ明確な科学的根拠を欠くものの、通常は様々な大豆ベースの食物中に存在するイソフラボン・アグリコンのゲニステイン、ダイゼインおよびグリシテインに因るものとされている。
【０００８】
イソフラボンは通常、植物卵胞ホルモンと見なされており、多くのｉｎｖｉｔｒｏの研究は、これらの物質が、エストラジオールの活性に比べて５００から１０００分の１と評価される活性により、哺乳動物の卵胞ホルモンと競合する機構に作用することを明らかにしている（Ｄ．Ａ．ＳｈｕｔｔおよびＲ．Ｉ．Ｃｏｘ、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、５２巻、２９９〜３１０ページ、１９７２年）。
【０００９】
近年に至って刊行された、大豆をベースとする食物を多量に消費する主として東洋の諸国民に関連する更なる生物医学文献および疫学的情報によれば、これらの食物を用いると、女性における乳癌および男性における前立腺癌を大幅に減少させる（Ａ．Ｎｏｍｕｒａ、Ｂ．Ｅ．、ＨｅｎｄｅｒｓｏｎＪ．Ｌｅｅ、ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ、３１巻、２０２０〜２０２５ページ、１９７８年；Ｔ．Ｈｉｒａｙａｍａ、Ｄｉｅｔ、ＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄＣａｎｃｅｒ、４１〜５３ページ、１９８６年、Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉ、Ｍ．Ｎａｇａｏ、Ｔ．Ｓｕｇｉｍｕｒａ、Ｓ．Ｔａｋａｙａｍａ、Ｌ．Ｔｏｍａｔｉｓ、Ｌ．Ｗ．ＷａｔｔｅｎｂｅｒｇおよびＧ．Ｎ．Ｗｏｇａｎ編、Ｔｏｋｙｏ：ＪａｐａｎｅｓｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＳｏｃｉｅｔｙＰｒｅｓｓ；Ｒ．Ｋ．Ｓｅｖｅｒｓｏｎ、Ａ．Ｍ．Ｙ．Ｎｏｍｕｒａ、Ｊ．Ｓ．Ｇｒｏｖｅ、Ｇ．Ｎ．Ｓｔｅｍｍｅｒｍａｎ、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、４９巻、１８５７〜１８６０ページ、１９８９年）。また、これらの事実は、未だ明確な科学的根拠を欠くものの、通常は様々な大豆ベースの食物中に存在するイソフラボン・アグリコンのゲニステイン、ダイゼインおよびグリシテインに因るものとされている。
【００１０】
これらのイソフラボンは、腫瘍細胞の増殖において役割を果たしていると思われる酵素であるプロテインキナーゼ、具体的にはチロシンキナーゼと相互作用する能力に関して、ｉｎｖｉｔｒｏモデルにおいて検討されてきた。
【００１１】
最近になって、閉経前および閉経後症状の予防的治療のため、また、癌の予防的治療のために大豆抽出物をベースとする医薬を調製する多くの試みがなされてきた。いくつかの特許および特許出願が、大豆または大豆もやし中に存在するイソフラボングルコシドの化学的または酵素的加水分解によって得られる新規な大豆抽出物の組成物について記載している（ＫｉｋｋｏｍａｎＣｏｒｐ．、Ｊ−０８２９１１９１；ＫｉｋｋｏｍａｎＣｏｒｐ．、Ｊ−０７１７３１４８；ＫｅｌｌｙＧＥＷＯ−９３２３０６９；ＫｉｋｋｏｍａｎＣｏｒｐ．、Ｊ−０５１１７０７５６６）。これらの公報は全て、高濃度のイソフラボンの調製、ならびに閉経前および閉経後障害の抑制、および抗腫瘍活性に関する活性のみに関するものである。
【００１２】
前述の抽出物とは対照的に、イソフラボングルコシドおよびＢ群大豆サポニンを決まった比率で含有する抽出物は、閉経前および閉経後症状の予防または治療および癌の予防または治療のいずれに関しても、イソフラボン単独に比べて顕著により活性であることが見いだされた。
【００１３】
本発明の抽出物に関連する他の態様は、アルコール中毒およびアルコール依存または飲酒癖に関するものである。これらは、「アルコール中毒症」という用語でまとめられ、現代社会全体に深刻な問題を形成する現象である（ＧｅｓｓａＧ．Ｌ．、「Ｂｉｓｏｇｎｏｃｏｍｐｕｌｓｉｖｏｄｉｂｅｒｅｅｐｒｉｎｃｉｐｉｏｄｅｌｐｉａｃｅｒｅ」（飲酒する衝動および快楽原理）、Ｍｅｄｉｃｉｎａｄｅｌｌｅｔｏｓｓｉｃｏｄｉｐｅｎｄｅｎｚｅ（薬物依存症の医学）、ＩＩ、５ページ、１９９４年）。例えば、イタリアでは、人口の９％以上（約５００万人）が大酒飲みであり、１００万人以上はアルコール依存症である（Ｃａｌａｍｏ−ＳｐｅｃｈｈｉａＦ．Ｐ．、「Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉａｄｅｌｌ’ａｌｃｏｌｉｓｍｏｉｎＩｔａｌｉａ」（イタリアにおけるアルコール中毒症の疫学）、ＡｔｔｉｄｅｌＶＩＩＣｏｎｇｒｅｓｓｏＮａｚｉｏｎａｌｅｄｅｌｌａＳ．Ｉ．Ａ．（Ｓ．Ｉ．Ａ．第７回国内会議報告）、Ｍｅｄｉｓｅｒｖｅ、Ｒｏｍｅ、２９５〜３０１ページ、１９９１年）。米国などの国々をも計算に入れると、これらの数は増加し、１３００万人以上がアルコール依存症である。アルコール中毒および真性アルコール依存症は、極めて高額な公的支出につながり（１９９１年以来、米国では１年につき約２０００億ドルが費やされている）、患者に対しても、大きな社会的および心理学的損害の原因である。
【００１４】
心理学的種類の試み（集団療法など）に加えて、アルコール中毒症を治療するための既存の試みは、アルコール代謝に作用して、肝臓のアルデヒドデヒドロゲナーゼを阻害し、その結果、アルコール摂取の過程で生ずる好ましからざる現象すべてと共に、嘔吐を催させるアセトアルデヒドの濃度を上昇させる、ジスルフィラムやカルシウムカルバミドなどの医薬を用いるものである。
【００１５】
先行技術によれば、その誘導物がアルコール中毒症を治療するために用いられる唯一の植物は、Ｐｕｅｒａｒｉａｌｏｂａｔａ（Ｒａｄｉｘｐｕｅｒａｒｉｅ）およびＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａであり、これらは伝統的な漢方薬では極めて広範に用いられており、国際出願ＷＯ９３／００８９６号およびＷＯ９６／３５４４１号の内容を形成する。抽出物の使用に加え、これらの特許出願は、ＷＯ９３／００８９６号においてはダイゼインおよびその半合成誘導体などの純粋な物質、またＷＯ９６／３５４４１号においてはタンシノン（ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ）およびミルチロン（ｍｉｌｔｉｒｏｎｅ）などのジテルペノイドの用途を請求の範囲に記載している。前述の副作用の発現を伴うアルコール脱水素酵素に対する効果は、イソフラボン誘導体に関しては明らかにされてきたものの、同じ機構は、ジテルペノイド化合物に関しては排除されてきた。さらには、国際出願ＷＯ９６／３６３３２号は、アルコール消費の軽減におけるフォルスコリンの効果を開示した。
【００１６】
驚くべきことに、イソフラボングルコシドおよびＢ群大豆サポニンを決まった比率で含有する抽出物は、意図的なアルコール消費を減少させるうえで、有効に使用できることを見いだされた。これらの抽出物は、イソフラボン単独に比べてはるかに効果的であり、血漿アルコール濃度が変化しないままであることから、アルコール脱水素酵素を阻害する機構とは異なる機構で作用する。
【００１７】
前述の先行技術の他に、国際出願ＷＯ９６／１０３４１号は、実質的に大豆種子の純粋な胚軸を含有する食品および健康食品を開示している。抽出手順および、本発明におけるイソフラボンとサポニンとの比率については、何ら言及していない。
【００１８】
米国特許第４，４２８，８７６号は、マメ科の植物からサポニンおよびフラボノイドを単離する方法を開示している。そこに開示されている０．４％水酸化ナトリウム水溶液による大豆の抽出は、本発明とは異なる最終抽出物をもたらす。ここでも、本発明におけるようなイソフラボンとサポニンとの比率については、何ら言及していない。
【００１９】
ＪＰ５９０８８０６４は、サポニンのみの単離および用途を対象としている。同じものが、ドイツ特許第３４００２５８号に出願されている。同様に、ＪＰ６１０３６２２５は、サポニンの単離および精製を対象とし、ＪＰ６２００５９１７は、イソフラボンを全く含まない純粋なサポニンの調製を対象としている。ＪＰ４０３６２４２は、抗炎症化合物として、純粋なサポニンまたは高いサポニン／イソフラボン比率を有する抽出物の調製に関係している。
【００２０】
欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−４２６９９８号は、大豆からのイソフラボン、特に、ゲニスチンおよびダイジンマロン酸エステルの調製を開示している。サポニンの抽出およびイソフラボンとサポニンとの比率については言及していない。
【００２１】
ＪＰ６３２４５６４８は、食物を食用に適さないようにしている苦みの成分と考えられているサポニンおよびイソフラボンをまったく含まない大豆食品素材の調製を対象としている。
【００２２】
ＭａｒｋＭｅｓｓｉｎａ他、ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、８３巻、８号、５４１〜５４６ページ、１９９１年４月１７日は、科学文献においてすでに報告されている癌の危険の軽減における大豆製品の役割を対象としている。しかしながら、この資料および他の文献はいずれも、本発明の比率でサポニンおよびイソフラボンを含有する抽出物について言及してなく、その特殊な抽出物によって得られる薬理学的効果についても触れていない。
【００２３】
したがって、本発明は、イソフラボングルコシドの１重量部当たり、０．６から１．５重量部、好ましくは１重量部のＢ群大豆サポニンを含有し、抽出物のイソフラボングルコシドの含有量は少なくとも１３重量％である抽出物に関する。
【００２４】
ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によって示されるように、イソフラボン成分の活性に対して有益な効果を有するＢ群大豆サポニンは、以下の構造を有する。
【００２５】
【化３】

【００２６】
本発明は、さらに、以下の工程を含むことを特徴とする、上に定義した抽出物を製造する方法に関する。
【００２７】
ａ）脂肪族アルコールまたはこれらのアルコールと水との混合物による、完熟大豆または油を含まない大豆粉末の抽出、
ｂ）工程ａ）による抽出物の濃縮、
ｃ）脂肪族炭化水素で処理することによる、油状および親油性物質からの工程ｂ）の濃縮抽出物の精製、
ｄ）水と混合しない脂肪族アルコールによる活性成分の抽出、
ｅ）工程ｄ）による抽出物の濃縮および乾燥。
【００２８】
特には、本発明の抽出物は、Ｂ群大豆サポニンおよびイソフラボングルコシドを３：２から２：３の相互比率で含有する完熟大豆または油を含まない大豆粉末を、脂肪族アルコール単独、あるいは、水との混合物、好ましくは、９５％純度アルコール等のエタノール／水の混合物で、抽出することによって製造することができる。抽出物の濃縮および脂肪族炭化水素（例えば、ｎ−ヘキサンまたはｎ−ヘプタン）で処理することによる油状および親油性物質の精製の後、ｎ−ブタノール、イソブタノールおよびイソアミルアルコールなどの水と混合しない脂肪族アルコールで活性成分を抽出する。小量まで濃縮した後、有機相を減圧下で乾燥する。本発明は、さらに、前記方法の改良形態にも関し、そのでは、工程ｂ）またはｃ）の後に、濃縮したアルコール抽出物に以下の工程ｄ’）を施し、続いて工程ｅ）に供する。
【００２９】
ｄ’）活性成分のポリスチレンベースの吸着樹脂への吸着；樹脂の水洗；エタノールによる活性成分の溶離。
【００３０】
この修正形態によれば、本発明の代表的な抽出物は、植物材料の濃縮したアルコール抽出物中に存在する活性成分（イソフラボンおよびサポニン）の、デュオライトまたは任意のＸＡＤ、特にＸＡＤ１１８０などのポリスチレンベースの吸着樹脂への微酸性ｐＨによる吸着；および樹脂カラムを注意深く水で洗い流して塩および他の不活性成分を除去した後のエタノールによるイソフラボンおよびＢ群大豆サポニン混合物の溶離によって製造することができる。
【００３１】
これらの条件の下で得られる抽出物は、用いる植物材料の品質に応じ、１３から１７重量％のイソフラボン、ならびにイソフラボングルコシドの１重量部当たり０．６から１．５重量部のＢ群大豆サポニンを含有する。この抽出物は、抽出物に固有な活性にとって不可欠であることが判明している大量のポリフェノール物質をも含有している。
【００３２】
上述した方法ならびにその改良の実施形態は、以下の工程を含む。
【００３３】
ｆ）工程ｅ）の抽出物を、水と混合するアルコールおよび水の混合物に懸濁し、水と混合しない非プロトン性溶媒で希釈する、
ｇ）工程ｆ）の混合物を加熱して、完全に溶解させ、室温に放置する、
ｈ）ろ過により、沈殿するＢ群大豆サポニンを採取する、
ｉ）水相から有機相を分離し、有機相を濃縮して乾燥し、イソフラボン成分を製造する、そして
ｊ）工程ｈ）のサポニンおよび工程ｉ）のイソフラボンを混合し、抽出物を生成させる。
【００３４】
したがって、本発明の抽出物は、極めて高含有量のイソフラボングルコシドおよび前述の比率のＢ群大豆サポニンとを特徴とする抽出物であっても、上述の方法またはその改良形態に従って得られる抽出物から好適に製造できる。この目的では、以下の手順に従うことができる。前記抽出物を、１０から５０体積％の水を含む、エタノールまたはメタノールなどの水と混合するアルコール中に懸濁し、塩化メチレンまたは酢酸エチルなどの水と混合しない非プロトン性溶媒で希釈する。得られる不均一混合物を加熱して、抽出物を完全に溶かし、室温に放置すると、Ｂ群大豆サポニンを沈殿させることができる。９０％以上の純度を有するサポニンを、ろ過によって採取する。８０％以上の純度を有するイソフラボン成分は、有機相を分離して、これを蒸発させ、次いで乾燥することにより水性母液から得られる。次いで、イソフラボンおよびサポニンを混合して、可能な限り高含有量のイソフラボングルコシド、ならびにイソフラボングルコシドの１重量部当たり０．６から１．５重量部のＢ群大豆サポニンを有する抽出物を得ることができる。
【００３５】
本発明による方法の個々のプロセス工程を遂行するために好ましい条件は、以下の通りである。この場合、体積による部の計量単位は、ｌ（リットル）、重量による部の計量単位はｋｇ（キログラム）である。
【００３６】
工程ａ：植物材料は、生物資源１重量部当たり１２から１７倍容量の溶媒で抽出することが好ましい。抽出温度は、好便には５５℃以上である。各抽出は、好適には、４時間未満の間に行う。エタノールの他に適当な溶媒は、中でも、メタノール、プロパノールおよびイソプロパノールである。これらの溶媒は、１０％までの水を含むことができる。
【００３７】
工程ｂ：抽出物は、好ましくは５０℃以下の温度において減圧下で濃縮する。抽出物は、好ましくは、６５から７５％のアルコール含有量となるまで濃縮する。
【００３８】
工程ｃ：精製は、好適には、植物材料の１重量部当たり０．３から０．６倍容量の脂肪族炭化水素を用いて行う。適切な手法は、油状および親油性の物質を抽出する手法である。
【００３９】
工程ｄ：活性化合物は、好ましくは、一抽出当たり、植物材料１重量部を基に算出して、０．２から０．４倍容量の水と混合しないアルコール性溶媒で抽出する。抽出は、３回行うのが好ましい。
【００４０】
工程ｅ：工程ｄの抽出物を、好ましくは５０℃以下の温度において減圧下で濃縮する。
【００４１】
工程ｆ：工程ｅ）の抽出物を、２：８から３：７ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲のアルコール／水比率を用い、５から１０倍容量（抽出物１部あたり）の水溶性アルコールに懸濁することが好都合である。非プロトン性の水と混合しない溶媒は、工程ｅの抽出物１重量部に対して、２から５倍容量で用いることが好都合である。
【００４２】
工程ｇ：完全な溶解を達成するため、混合物を加熱し還流を維持することが好都合である。次いで、混合物を室温に１５から２４時間維持することが好ましい。
【００４３】
工程ｉ：有機相は、３０℃以下の温度において減圧下で蒸発させることにより濃縮することが好都合である。
【００４４】
工程ｊ：工程ｈのサポニンおよび工程ｇのイソフラボングルコシドを用い、サポニンおよびイソフラボングルコシドを１：１の比率で含有するアルコール溶液を調製することが好ましく、次いでこの溶液を５０℃以下の温度において減圧下で濃縮乾固することが好都合である。
【００４５】
イソフラボンおよびＢ群大豆サポニンの量は、Ｓｕｐｅｌｃｏ−ＳｉｌＬＣ−ＡＢＺカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）、５μｍ、および、Ａ）Ｈ_２Ｏ（ＣＦ_３ＣＯＯＨ０．０１％）、Ｂ）アセトニトリル（ＣＦ_３ＣＯＯＨ０．０１％）およびＣ）メチルアルコール（ＣＦ_３ＣＯＯＨ０．０１％）からなるグラジエントを用いる３成分溶離媒質を用いて、ＨＰＬＣ分析によって決定する。個々の成分は、サーモスプレーインターフェースを介してＨＰＬＣと組み合わせた質量分析法により同定および識別ができる。
【００４６】
本発明による抽出物は、それらの特有の作用によって、従来から知られている抽出物とは区別される。
【００４７】
更年期障害に関しては、のぼせ、不眠症およびうつ病が、更年期に女性が病む最も頻度の高い更年期症状である。それらは、卵巣活性の減少または閉止、したがって卵胞ホルモン産生の減少および黄体化ホルモン（ＬＨ）および卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）産生の増加とを随伴している。
【００４８】
最近の研究（ＤｕｋｅｒＥ．Ｍ．他、Ｐｌａｎｔａ．ｍｅｄ．、５７巻、４２０ページ、１９９１年）は、ＬＨの一時的増加と卵巣切除後の雌性ラットの皮膚における温度変化との間の関連性を報告している。ＬＨ濃度とのぼせとの間の関係は、雌性ラットの場合ばかりでなく、女性でも認められており、ＬＨ分泌量は、活性な内分泌化合物の精神神経的／内分泌効果の検討にとって、適当なパラメータとみなすことができることを示唆している。
【００４９】
表１は、卵巣切除した雌性ラットを２つの別々の分画（イソフラボンおよびＢ群大豆サポニン）および本発明による抽出物で処置した場合に得られる結果を示している。
【００５０】
【表１】

【００５１】
雌性ラットは、知られている方法によって卵巣切除を施した。術後の１５日間、動物を、１日１回の経口投与により試験物質で１５日間処置した。最終処置の３時間後に、動物を殺した。その後、直ちに血液を遠心分離し、得られた血清をＮｉｓｗｅｎｄｅｒ他（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１２８巻、８０７ページ、１９８６年）に記載される方法に従い、ラジオイムノアッセイによるＬＨの測定まで、−２５℃で保存した。
【００５２】
見られるように、本発明の抽出物を投与すると、統計学的に有意なＬＨの減少がもたらされ、それは、個々の成分の総和として得られる減少より著しかった（相乗効果）。
【００５３】
健康な動物の反復処置で用いた抽出物は、雄性動物の器官または器官系に巨視的または微視的な変化をもたらさず、一方、雌性動物においては、子宮および骨格重量を変化させ、それらの卵胞ホルモン活性を確証している。
【００５４】
本発明の抽出物を、自然に生じたか外科的原因であるかに関係なく、更年期の女性に投与したところ、処置から僅か数日の内に、血漿ＬＨ濃度を修正し、のぼせまたはうつ病などの更年期障害を軽減し、また、長期にわたる処置の間、骨の鉱質除去を減少させた。
【００５５】
本発明の抽出物はまた、顕著な抗増殖活性を有している。表２は、卵巣腫瘍細胞系（ＯＶＣＡ４３３）に対する抗増殖活性を示す。
【００５６】
【表２】

【００５７】
細胞は、子ウシ血清ならびに培地を無菌に保つためにペニシリン２００単位／ｍｌ添加した最小量の基本培地で、単層培養に培養した。試験の再現性のために、細胞を毎週トリプシン処理し、８×１０^４細胞／ｍｌの濃度でプレートに塗布し、５％ＣＯ_２および湿気を含む空気雰囲気中、３７℃でインキュベートした。化合物の活性を評価するため、細胞を、最小量の基質中、１×１０^５／ｍｌの濃度でウエル（Ｆａｌｃｏｎ３０４６、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＮＹ）中に加えた。２４時間後、基質を新たな基質で置換し、無水エタノールに溶かした化合物を加えた。対照は、試験される活性化合物を含まない希釈剤で同様に処理した。７２時間の試験期間の間、２４時間間隔で前述の処置を繰り返した。細胞増殖の阻害は、対照の増殖を「処置」試験と比較して、細胞の直接計数によって評価した。示されるように、本発明の抽出物は、それらの成分の抗増殖活性の総和に比べて高い抗増殖活性を有していた（相乗作用）。本発明の混合物は、文献に報告されている通常の条件に従って胸腺欠損ヌードマウスに移植された腫瘍のサイズを測定することによって検証されるように、ｉｎｖｉｖｏにおける細胞増殖を阻害した。１０から５００ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で動物を処置することにより、検討された腫瘍の顕著な変性を引き起こし、高い割合の個体で腫瘍の消失にまで至った。
【００５８】
アルコール消費に対する抑制効果に関しては、「Ｓａｒｄｉｎｉａｎアルコール嗜好性」（Ｓｐ）種のアルコール消費ラット（ＦａｄｄａＦ．、ＭｏｓｃａＥ．、ＣｏｌｏｍｂｏＧ．、ＧｅｓｓａＧ．Ｌ．、Ａｌｃｏｈｏｌｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇｒａｔｓ；Ｇｅｎｅｔｉｃｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｏａｌｃｏｈｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｄｏｐａｍｉｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｅｈａｖ．、４７巻、７２７ページ、１９９０年）を用いて測定した。これらの動物は、アルコールと水を自由に選択させると体重１ｋｇあたり１日６から７ｇのアルコールを消費し（水とアルコールの比率は２：１以上）、近年これらの動物を用いて、様々な物質の自発的アルコール消費に対する効果を測定することに成功している。例えば、ＢａｌａｋｌｅｅｖｓｋｙＡ．、ＣｏｌｏｍｂｏＧ．、ＦａｄｄａＦ．、ＧｅｓｓａＧ．Ｌ．、Ｒｏ１９−４６０３、ａｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｖｅｒｓｅａｇｏｎｉｓｔ、ａｔｔｅｎｕａｔｅｓｖｏｌｕｎｔａｒｙｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｉｎｒａｔｓｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙｂｒｅｄｆｏｒｈｉｇｈｅｔｈａｎｏｌｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＡｌｃｏｈｏｌＡｌｃｏｈｏｌ、２５巻、４４９〜４５２ページ、１９９０年；ＦａｄｄａＦ．、ＧａｒａｕＢ．、ＣｏｌｏｍｂｏＧ．、ＧｅｓｓａＧ．Ｌ．、Ｉｓｒａｄｉｐｉｎｅａｎｄｏｔｈｅｒｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓａｔｔｅｎｕａｔｅｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎｉｎｅｔｈａｎｏｌ−ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇｒａｔｓ、Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ：ＣｌｉｎｉｃａｌａｎｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、１６巻（３号）、４４９〜４５２ページ、１９９２年を参照されたい。
【００５９】
動物は、通常の飼育条件に置き、水（常備）と１日あたり４時間与えられる（すなわち、昼／夜サイクルの暗所の始めの４時間）アルコール（１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ溶液）を自由に選択できるようにした。消費された水およびアルコールの量は、毎日同時刻に記録した。餌は自由に与えた。アルコールおよび水を安定的に消費するようになった後、抽出物を、１０００ｍｇ／ｋｇの投与量で水に懸濁させ、１日１回、２ｍｌ／ｋｇの体積を７日間連続して経口投与した。対照については、同一体積の希釈剤を用いた。処置の終了後、アルコール消費量を、処置前の値に戻るまで記録した。
【００６０】
表３は、アルコール消費に対する大豆抽出物１０００ｍｇ／ｋｇの反復経口投与の効果を示している。
【００６１】
【表３】

【００６２】
表３は、大豆抽出物がアルコール消費を顕著に減少させるとの結論を下させる。アルコール消費の減少は、７日の処置期間の間は一定に保たれ、処置終了後に減少する。さらに、アルコール消費の減少は、個々の成分の効果の総和によって得られる減少より大きかった（相乗効果）。
【００６３】
したがって、本発明はまた、活性成分として先に定義した抽出物を含有する医薬組成物にも関する。特に、本発明は、閉経前および閉経後症状を予防または治療するためのこの抽出物を含有する医薬組成物、女性の乳癌および男性の前立腺癌を予防および治療するためのこの抽出物を含有する医薬組成物、ならびにアルコール中毒症の予防または治療をするためのこの抽出物を含有する医薬組成物に関する。
【００６４】
本発明の生産物または抽出物は、それらの溶解度に適合してすぐに使用できる溶液、流体または液体を調製するための、錠剤、軟ゼラチンまたは硬ゼラチンカプセル剤、顆粒粉末剤に、適当な方法で製剤化することができる。本発明による抽出物の投与量は、単回または反復投与の場合には、１日あたり３０ｍｇから５００ｍｇの範囲であり、１日当たり２回投与で２００ｍｇが好ましい。経口剤が投与に好都合な剤形である。
【００６５】
以下の実施例は、本発明の一例を示するものである。
【００６６】
実施例１−イソフラボン含有量１５重量％およびイソフラボングルコシド／Ｂ群大豆サポニン比率１：１．５を有する大豆抽出物の、溶媒を用いる精製による製造
イソフラボングルコシド０．２％およびＢ群大豆サポニン０．３％を含有する油を含まない大豆粉末１０ｋｇを、９５％のエチルアルコール３０ｌにより五度還流する。アルコール抽出物を混ぜ、減圧下で５ｌまで濃縮する。濃縮物を水１．５ｌで希釈し、ｎ−ヘキサン５ｌで四度抽出する。ヘキサン相を捨て、濃縮されたアルコール相をｎ−ブタノール２．５ｌを用いて四度抽出する。有機相を濃縮し、減圧下で乾燥する。イソフラボン含有量１５重量％およびＢ群大豆サポニン含有量２２．５重量％を有する抽出物１３３ｇが得られる。
【００６７】
本実施例の方法によって得られる抽出物のＨＰＬＣ図を、図１に示す。
実施例２−イソフラボン含有量１５重量％およびイソフラボングルコシド／Ｂ群大豆サポニン比率１：１．５を有する大豆抽出物の、ポリスチレン樹脂を用いる精製による製造
実施例１において製造した水性濃縮物は、アルコール相の濃縮物から樹脂状残渣を溶解するため、ｎ−ブタノールによる抽出を行わず、代わって、ポリエトキシ化ひまし油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））で処理する。次いで、精製水（５ｌ）に懸濁し、ＸＡＤ１１８０樹脂のカラムにかける。そして、塩類、糖類および表面活性剤を完全に除去するため、カラムを水で洗い流し、その後、９５％エチルアルコール約１０ｌで溶離する。このエタノール溶離液を濃縮し、乾燥すると、実施例１で得られた抽出物と同一の組成を有する抽出物１３０ｇが得られる。
【００６８】
実施例３−イソフラボン含有量４３重量％およびイソフラボングルコシド／Ｂ群大豆サポニン比率１：１を有する大豆抽出物の製造
実施例１または２において得られた抽出物２００ｇを、エチルアルコール２０％の水溶液１ｌに懸濁し、酢酸エチル０．５ｌで希釈する。懸濁液は、完全に溶解するまで、激しく撹拌しつつ、還流加熱を施し、その後、一晩の間放置する。析出したサポニン（３８ｇ、純度９３％）は、ろ過によって単離し、酢酸エチルおよび水を含有する水性母液は互いを分別する。有機相は減圧下で濃縮し、乾燥する。イソフラボンおよびサポニンを１：１の重量比率で含有する調製物を得る目的で、純度８１％のイソフラボン残渣３７ｇをエチルアルコール１ｌに溶かし、結晶性サポニン３２ｇを混合する。アルコール性溶液を減圧下で濃縮乾固すると、イソフラボングルコシド４３重量％およびＢ型大豆サポニン４３重量％の含有量を有する抽出物６９ｇとなる。
【００６９】
実施例４−大豆抽出物を含有する硬ゼラチンカプセル剤の製造
【００７０】
【表４】

実施例５−大豆抽出物を含有する錠剤の製造
【００７１】
【表５】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の抽出方法によって得られる大豆抽出物のＨＰＬＣ図を示す。

Claims

イソフラボングルコシド１重量部当たり０．６から１．５重量部のＢ群大豆サポニン含有量で、抽出物中のイソフラボングルコシド含有量が少なくとも１３重量％である大豆抽出物を製造するための方法であって、
ａ）Ｂ群大豆サポニンおよびイソフラボングルコシドを３：２から２：３の相対比率で含有する完熟大豆または油を含まない大豆粉末を、脂肪族アルコールまたはこれらのアルコールと水との混合物によって抽出する工程と、
ｂ）工程ａ）の抽出物を濃縮する工程と、
ｃ）脂肪族炭化水素で処理することにより、油状および親油性物質から工程ｂ）の濃縮抽出物を精製する工程と、
ｄ）水と混合しない脂肪族アルコールによって活性成分を抽出する工程と、
ｅ）工程ｄ）の抽出物を濃縮し、乾燥する工程とを含むことを特徴とする方法。
請求項１に記載の方法であって、
工程ｂ）または工程ｃ）の後に、濃縮したアルコール抽出物を、
ｄ’）活性成分をポリスチレンベースの吸着樹脂へ吸着させ、
樹脂を水で洗い流し、エタノールで活性成分を溶離する工程に供し、工程ｅ）に続ける
ことを特徴とする方法。
請求項１または２に記載の方法であって、
前記工程ｅ）の後に、
ｆ）工程ｅ）の抽出物を、水と混合するアルコールおよび水の混合物に懸濁し、水と混合しない非プロトン性溶媒でそれを希釈するステップと、
ｇ）工程ｆ）の混合物を加熱し、完全に溶解させ、室温にそれを放置する工程と、
ｈ）ろ過により、沈殿するＢ群大豆サポニンを採取する工程と、
ｉ）水相から有機相を分離し、有機相を濃縮し、それを乾燥し、イソフラボン成分を製造する工程と、
ｊ）抽出物を調製するため、工程ｈ）のサポニンおよび工程ｉ）のイソフラボンを混合する工程とを、さらに含む
ことを特徴とする方法。
前記大豆抽出物中、イソフラボングルコシド１重量部当たり１重量部のＢ群大豆サポニン含有量であることを特徴とする、請求項１〜３に記載の方法。
活性成分として、大豆抽出物を含有する、閉経前および閉経後症状を予防または治療するための医薬組成物であって、
前記大豆抽出物は、イソフラボングルコシド１重量部当たり０．６から１．５重量部のＢ群大豆サポニン含有量で、抽出物中のイソフラボングルコシド含有量が少なくとも１３重量％である大豆抽出物であることを特徴とする医薬組成物。
活性成分として、大豆抽出物を含有する、男性における前立腺癌を予防または治療するための医薬組成物であって、
前記大豆抽出物は、イソフラボングルコシド１重量部当たり０．６から１．５重量部のＢ群大豆サポニン含有量で、抽出物中のイソフラボングルコシド含有量が少なくとも１３重量％である大豆抽出物であることを特徴とする医薬組成物。
前記大豆抽出物中、イソフラボングルコシド１重量部当たり１重量部のＢ群大豆サポニン含有量であることを特徴とする請求項５または６に記載の医薬組成物。
前記大豆抽出物は、請求項１〜４に記載される方法で製造される大豆抽出物であることを特徴とする請求項５または６に記載の医薬組成物。
活性成分として、大豆抽出物を含有する医薬組成物の調製方法であって、
該医薬組成物は、閉経前および閉経後症状を予防または治療するための医薬組成物、あるいは、男性における前立腺癌を予防または治療するための医薬組成物であり、
前記大豆抽出物は、イソフラボングルコシド１重量部当たり０．６から１．５重量部のＢ群大豆サポニン含有量で、抽出物中のイソフラボングルコシド含有量が少なくとも１３重量％である大豆抽出物であり、
完熟大豆または油を含まない大豆粉末を原料とし、前記大豆抽出物を調製する工程と、
前記大豆抽出物の有効量と薬理的に許容される担体とからなる前記医薬組成物を調剤する工程とを有し、
前記大豆抽出物を調製する工程は、前記請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法を用いて行うことを特徴とする方法。