KR100542478B1 - 석류 유래 피토에스트로겐을 함유하는 건강기능식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 석류 유래의 피토에스트로겐을 함유하는 건강기능식품에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 다량의 피토에스트로겐을 함유하는 석류 추출물을 포함하는 건강기능식품에 관한 것으로서,

본 발명에 따르면, 카테킨 1.0~2.0ppm, 다이드제인 20~30ppm, 제니스테인 0.1~0.5ppm, 쿠에르세틴 8.0~14.0ppm, 17β-에스트라디올 0.05~0.3ppm 및 2,3-디-MeO-에스트라디올 0.01~ 0.10ppm을 포함하는 석류 추출물을 0.1~99중량% 포함하는 건강기능식품이 제공되며,

본 발명에 따른 건강기능식품은 우수한 에스트로겐성을 나타내면서도 부작용이 없는 안전한 피토에스트로겐을 다량 함유하고 있으므로, 갱년기 또는 폐경기 여성에 있어서의 에스트로겐 결핍으로 인하여 유발될 수 있는 제반 증상을 효과적으로 예방 및 치료할 수가 있을 것으로 기대되고, 특히 안면홍조, 골다공증, 아테롬성 심장질환에 탁월한 효과를 나타내면서도, 부작용으로서의 체지방 증가 현상이 매우 낮으므로, 건강기능식품으로서 유용할 것으로 기대된다.

피토에스트로겐, 석류

Description

석류 유래 피토에스트로겐을 함유하는 건강기능식품{FUNCTIONAL HEALTH FOODSTUFFS CONTAINING PHYTOESTROGENS DERIVED FROM POMEGRANATE}

본 발명은 석류 유래의 피토에스트로겐을 함유하는 건강기능식품에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 다량의 피토에스트로겐을 함유하는 석류 추출물을 포함하는 건강기능식품에 관한 것이다.

일반적으로 내분비계는 생체의 항상성 유지, 생식, 발생, 행동 등에 관여하는 각종 호르몬을 생산·분비하는 기관계로서 선(腺), 호르몬, 표적세포(target cell)로 구성되며, 여기서 생산되는 호르몬은 혈액을 통해 체내를 순환하며 표적이 되는 각 세포 및 조직에 정보 및 명령을 전달하여 성장 및 발육, 암수분화 등에 관여한다.

이러한 내분비계 호르몬의 하나인 에스트로겐(estrogen)은 체내에서 콜레스테롤로부터 합성되며, 분비원(分泌源)은 주로 난소의 난포(卵胞) 및 황체(黃體)이고 임신시의 태아 태반계, 부신(副腎)·정소(精巢) 등에서도 분비된다. 난소에서의 에스트로겐 분비는 뇌하수체전엽(腦下垂體前葉)에서 분비되는 성선자극(性腺刺戟) 호르몬 (gonadotropin)이 생식기관에 신호를 전달하면 월경주기를 조절하고 임신을 가능케 하는 호르몬인 난포자극호르몬(follicle stimulating hormone;FSH)과 황체형성호르몬 (Lutenizing hormone;LH)이 분비되고, 이는 다시 난소에 작용하여 에스트로겐 (estrogen)과 프로게스테론(progesterone)을 분비하게 한다. 에스트로겐은 월경주기 전반부에 자궁내막을 자극해 수정란이 착상할 수 있도록 자궁내막이 두꺼워지도록 하고 혈액공급량을 증가시키며, 후반부에는 프로게스테론이 분비되어 자궁내막이 착상을 이루는데 보다 좋은 상태가 되도록 한다. 즉, 에스트로겐은 자궁내막의 증식, 자궁근의 발육, 제2차 성징(性徵)의 발현, 월경주기 성립의 매개, 임신시의 모체변화 야기, 유선관(乳腺管)의 증식분비 촉진 등에 관여하는 대표적인 여성호르몬이나, 신체의 다른 여러 부위에도 광범위한 영향을 미친다.

상기한 에스트로겐은 에스트라디올(estradiol), 에스트론(estrone), 에스트리올(estriol) 등을 총칭하며, 이 중에서 에스트라디올이 가장 강력한 것으로 알려져 있다. 에스트로겐은 수용체를 매개로 하여 기능을 하며 주로 간장에서 대사(代謝)를 받아, 포합성(抱合性) 에스트로겐이 되어 소변으로 배설된다.

폐경 전의 여성에 있어 난소는 에스트로겐의 주요 공급원이다. 주요 분비 생성물은 난포막 세포에 의해 공급되는 안드로겐 전구체로부터 과립막 세포에 의해 합성되는 에스트라디올이다. 분비된 에스트라디올은 에스트론으로 가역적으로 산화되고 에스트로겐은 에스트리올로 전환될 수 있다. 17-히드록시스테로이드 탈수소화효소에 의해 촉매화되는 간에서 에스트론과 에스트라디올 사이의 상호전환이 주로 일어난다. 남성 및 폐경 후 여성에 있어서 에스트로겐의 주요 공급원은 지방조직이 다. 이러한 조직에서 에스트론은 부신피질에 의해 분비되는 데하이드로에피안드로스테론으로부터 합성되며, 따라서 지방 조직에 의한 에스트로겐의 분비는 안드로겐 전구체를 이용함으로써 부분적으로 조절될 수 있는 것으로 알려져 있다(Mendelson, C.R. 및 Simpson, E.R., 52:169-176, (1987)).

폐경전의 여성에 있어서, 난소에 의해 생성되는 17β-에스트라디올은 주요 순환성 에스트로겐이다. 혈청 에스트라디올의 농도는 사춘기 소녀에서는 낮고, 초경인 소녀에게서는 높게 나타난다. 여성에 있어서 에스트라디올의 농도는 난포기의 약 100pg/㎖(367pmol/ℓ)로부터 배란기의 약 600 pg/㎖(2200pmol/ℓ)까지이다. 임신 기간 동안에는 거의 20,000pg/㎖(70,000pmol/ℓ)까지 상승하게 된다. 폐경기 후, 혈청 에스트라디올의 농도는 비슷한 나이의 남성에서 나타나는 농도(5~20pg/㎖)와 비슷한 수준으로 떨어지는 것으로 보고되어 있다(Yen, S.S.C. 및 Jaffe,R.B., 3rd ed. Philadelphia: W.B. Saunders, (1991)).

여성이 폐경기에 접어들면, 난소가 노화됨에 따라 하수체성 고나도트로핀 (gonadotropin)(여포-자극 호르몬(FSH) 및 황체형성 호르몬(LH))에 대한 반응이 감소하고, 이로 인해 초기 난포기가 더욱 단축되어 월경 주기가 더욱 단축되며, 배란기가 더욱 단축되고, 프로게스테론 생성이 감소되며, 사이클이 더욱 불규칙하게 된다. 결국, 여포가 반응하지 못하게 되어 에스트로겐을 생성하지 못하게 된다. 에스트로겐의 분비 감소는 여성의 비뇨생식계통 뿐만 아니라 신체전반에 걸쳐 큰 영향을 미치게 되며, 배란이 중단되어 월경이 사라지는 것을 폐경이라 하고, 폐경 또는 그 이전에 호르몬의 감소로 인한 폐경기 증상이 나타나게 된다.

또한, 40세 이전에 발생하는 미숙 폐경은 원인 미확인의 난소 부전으로 통칭되며, 이는 다량의 장기간에 걸친 흡연이나, 고해발 고도에서의 거주, 영양 불량 등과 관련이 있는 것으로 믿어지고 있다, 한편, 인위적 폐경은 난소적출술, 화학요법, 골반에 대한 방사선 조사, 또는 난소에 대한 혈액 공급을 저하시키는 임의의 과정으로부터 초래될 수 있다.

폐경기 이후 여성에서는 에스트로겐의 급속한 감소로 인하여, 심리학적 및 감성적 징후, 예컨대 피로, 흥분, 불면, 집중력 저하, 우울증, 기억 상실, 두통, 근심 및 신경과민이나 소심증 등이 발생할 우려가 현저히 높아지게 되며, 재발성 안면 홍조에 의한 수면 방해에 따른 피로와 흥분, 간헐성 현기증, 감각이상, 심계항진 및 빈맥, 메스꺼움, 변비, 설사, 관절통, 근육통, 수족 냉증 및 체중 증가 현상의 발생 우려 또한 현저히 높아지게 된다. 또한, 골다공증이 쉽게 유발될 뿐 아니라, 심장병, 고혈압, 뇌졸중 등의 심혈관계 질환으로 인한 사망률도 증가한다(Kalin MF ＆ Zumoff B. Steroids 55:330-352, 1990). 또한, 피부 및 비뇨생식계통의 변화를 초래하며, 자가면역성 질환, 백내장 및 대장암 등의 발병 가능성이 높아지게 된다.

여성이 폐경기에 접어들어 에스트로겐이 현저히 감소하게 되면, 예컨대, 질 점막 및 외음부 피부는 더욱 얇아지고, 통상의 박테리아 군상이 변하고, 소음순, 클리토리스, 자궁 및 난소의 크기가 감소하는 등 저부 생식관내에 현저한 변화를 초래하게 된다. 따라서, 질 점막의 염증(위축성 질염), 빈뇨 및 급뇨, 질 건조증 및 성교불쾌증을 유발시킬 수 있다. 또한, 골반 근육의 색조 소실, 실금증, 방광염 및 질염으로 발전되는 경향이 나타난다.

안면홍조 및 발한은 폐경기 여성 중 약 75% 정도가 경험하게 되는 것으로 알려져 있다. 홍조 현상은 통상적으로 폐경 중 또는 폐경 후에 발생하며, 에스트로겐 결핍과 직접 관련되어 있다. 그 대부분은 1년 이상 안면 홍조가 지속되며, 25 내지 50%는 5년 이상 안면 홍조가 지속된다. 안면홍조는 안면과 목, 가슴 상부에 집중되는 갑작스러운 열감으로 시작되며 피부가 적색으로 변하고, 이러한 열감은 30초 내지 5분간 지속되며, 흔히 다량의 발한을 수반하고, 때로는 심계 항진도 수반되며, 통상적으로는 발한과 오한이 수반된다(Casper, RF, Yen, SSC. Neuroendocrinology of menopausal flushes: An hypothesis of flushmechanism. Clin Endocrinol 1985; 22:293).

이러한 안면홍조 현상은 매일 1, 2회 정도, 또는 많을 경우에는 주야로 시간당 1회 정도의 범위일 수 있으며, 통상적으로는 하루에 수 차례씩 일어난다. 안면홍조 현상은 수면 각성을 일으켜서 수면을 방해하며, 수많은 여성들이 다량의 발한을 경험하게 되므로 사회 생활에 있어 상당히 당혹스러운 문제를 초래할 수 있다. 안면홍조 현상은 에스트로겐 금단에 의해 시상하부의 열 조절 기능장애에 기인하는 것으로 믿어지고 있다. 안면홍조 현상이 황체화 호르몬의 펄스와 동시에 발생하는 점으로부터 온도 변화가 매개되는 것으로 보고되어 있다(Casper, RF, Yen, SSC, Wilkes, MM. Menopausal flushes: ANeuroendocrine link with pulsatile luteinizing hormone secretion. Science 1979; 205:823 및 Tataryn, IV. Meldrum,DR, Lu, KH, et al. LH, FSH and skin temperature during the menopausal hot flash. J Clin Endocrinol Metab 1979;49:152). 안면홍조 현상의 개시 메카니즘은 내인성 오피오이드 펩타이드 금단 현상으로서, 에스트로겐은 중추 오피오이드 펩타이드 활성을 증가시키는 한편, 폐경은 내인성 중추 오피오이드 활성의 감소 또는 상실과 관련되어 있는 것으로 밝혀져 있다(Reid, RL, Quigley, ME, Yen, SS. The disappearance of opiodidergic regulation of gonadotropin secretionin postmenopausal women. J Clin Endocrinol Metab 1983; 57:1107).

현재, 상기한 안면홍조 현상을 방지하거나 치료하는 데 있어서 가장 효과적인 공지된 방법은 에스트로겐을 투여하여 결핍된 에스트로겐을 보충해 주는 것으로 알려져 있다.

또한, 폐경기의 여성에서 발생 빈도가 높은 심장혈관의 아테롬성 동맥경화증 (atherosclerosis)에 대한 감수성은 혈중의 에스트로겐 농도를 높이는 것에 의해 효과적으로 저감시킬 수가 있는 것으로 보고되어 있다(Stout D.W., 1982). 한편, 아테롬성 동맥경화증을 갖고 있는 토끼에 대한 실험 결과, 에스트로겐은 혈액중의 지질 함량을 낮추고 항아테롬성(antiatherosclerotic) 효과를 나타내는 것으로 확인되어 있다(Ivanova L.V., 1996; Numano., 1971). 또한, 에스트로겐을 콜레스테린 (cholesterin) 합성 저해제로 사용한 예도 보고되어 있다(Ekzoesterol, etinilestradiol, premarin; P.A. Nussbaumer, Hunkler F., 1967).

합병증을 갖는 아테롬성 동맥경화증은 혈중 에스트로겐 농도의 감소와 난소 기능의 감소 또는 상실로 인해 폐경기의 여성에게서 발생 빈도가 높으며, 서구에서는 에스트로겐을 이용한 장기간에 걸친 호르몬요법이 광범위하게 이용되고 있고, 많은 임상 연구결과들도 에스트로겐의 긍정적인 효과를 보고하고 있다(MyasnikovL.A., 1961; Kraznai I., 1963; Patrono V., 1972). 또한, 심장의 아테롬성 동맥경화증이 합병증으로 된 심근경색 질환을 가진 50~70세 남성의 치료에서도 상기와 같은 양호한 결과가 얻어졌음이 보고된 바 있다(Statut R.U., 1985).

또한, 에스트로겐은 자가면역 질환, 예컨대, 류마토이드 관절염 등에 대해 완화 효과를 갖는 것으로 알려져 있다(Chander ＆ Spector; 50:139). 류마토이드 관절염과 같은 자가면역 질환은 세포매개성 면역 및 체액매개성 면역에 있어서의 이상 조절로 야기되며, 종종 자가 항원에 대한 비정상적이거나 또는 강화된 T 세포, B 세포 및 대식세포성 작동세포 기능과 관련되고, 자가 항원에 대한 이들 세포성 성분들의 활성은 자가 내성과 관련된 피드백 기작의 파괴와 관련되어 있는 것으로 여겨진다. 예컨대, 하시모토(Hashimoto) 갑상선염과 같은 자가면역 질환은 가임 연령인 여성에서 우세하며, 여성 대 남성의 발병 비율은 약 50:1 이다(Ahmed 등, 121:531(1985)).

에스트로겐은 T 세포 기능에 대해서는 억제 역할을 하지만 B 세포에 대해서는 면역 자극 효과를 갖는 것으로 입증되었다. 따라서, 에스트로겐은 T 세포 기능의 저해를 통해, 류마토이드 관절염, 다경화증, 길랭-바레(Guillan-Barre)증후군, 하시모토 갑상선염을 포함하는 활성화된 T 세포와 관련된 질환의 예방 및 치료에 유용할 것으로 기대되고 있다(Holmadahl, J. 2:651 (1989)).

T 세포에 대한 에스트로겐의 억제 효과와 더불어, 에스트로겐은 자가 면역성 질환에 대한 예방 역할도 하는 것으로 믿어지고 있다. 마루이(Marui, j. 92:1866 (1993))는 산화방지제가 VCAM-1의 내피 발현을 억제한다고 보고하고 있다. 즉, VCAM-1은 맥관계 외부, 혈관 주위 및 표적 기관 내로의 트래픽킹(trafficking)과 관련된 T 세포 및 대식세포의 인테그린(integrin)인 VLA4에 대한 리간드로서, 에스트로겐은 산화방지제이기 때문에 세포의 VLA-4 의존성 트래픽킹을 저해시키고 결과적으로 자가면역-매개성 질환과 관련된 면역의 연쇄증폭반응(cascade)을 방해하는 것으로 알려져 있다.

또한, 에스트로겐은 대장암의 억제제인 것으로 보고되고 있다. 이와 관련한 코호트의 연구 결과는 에스트로겐 보충요법이 담즙산 합성에 의해 여성에서의 결장직장암의 위험을 감소시키는 것으로 보고하고 있다. 최근들어 서구에서의 여성결장직장암의 사망율 감소는 폐경 후 에스트로겐 보충요법이 광범위하게 사용된 결과인 것으로 믿어지고 있다(Mayer, Chapter 92, in , 14th ed., 1998).

상기한 사항 외에도, 에스트로겐은 생체 외 및 생체 내에서 내피 세포의 성장을 가속화하는 것으로 보고되어 있다(Morales, D.E., 91:755-63(1995); Krasinski, K., 95:1768-72(1997)). 에스트로겐은 혈관 상해 후 신속한 재내피세포증식 (reendothelialization)을 유도하며 이는 혈관내피성장인자의 국소적 발현 증가에 기인하는 것일 수 있다. 또한, 에스트로겐은 에스트로겐 수용체-의존 방식으로 배양된 인간내피세포의 고사를 저해한다(Spyridopoulos,I., J., 95:1505-14(1997)). 에스트로겐에 의한 내피 일체성 초기복원 현상은 산화질소의 이용가능성을 증가시킴으로써 상해에 대한 반응 감쇄를 초래하며, 평활근 세포의 증식을 직 접 저해하는 것으로 보고되어 있다(Cornwell, T.L., J., 267:C1405-C1413(1994)).

또한, 에스트로겐은 역학적 증명에 의해 백내장에 대해 예방 효과가 있다고 제안되어 있다. 여성은 남성보다 백내장으로 발전될 위험이 더 높기는 하지만, 이런 위험도의 증가는 폐경후 에스트로겐이 감퇴되었을 때 발생하기 쉬운 것으로 알려져 있다(Livingston, P.M., J., 26:1-6, (1994); Klein, B.E., J., 116:219-225, (1998)). 544명의 여성을 피실험 대상으로 한 연구에서, 이른 시기의 폐경은 백내장으로의 발전 위험성을 약 2.9배 증가시키는 것으로 보고되어 있다(Shibata, T., J., 26:25-33, (1994)). 또한, 소규모 역학적 연구 결과에 따르면 폐경 후의 에스트로겐 보충요법이 백내장의 발병을 감소시키는 것으로 보고하고 있다(Klein., J., 112:85-91, (1994); Cumming, R.G. 및 Mitchell, P., J., 145:242-249, (1997); Benitez del Castillo, J.M., J., 104:970-973, (1997)). 연령과 관련된 백내장의 생체 내 랫(rat) 모델은 에스트로겐의 예방 효과가 게놈에 의한 것이라고 제안하고 있다(Bigsby, R.M., J,. 96:9328-9332, (1999)).

전술한 바와 같이, 에스트로겐은 여성의 비뇨생식계통 뿐만 아니라, 뼈조직, 심장, 혈관, 중추신경계, 피부 조직 등 다양한 조직의 기능을 보호하는 작용이 탁월하기 때문에, 현재 폐경기 증상에 대한 가장 효과적인 예방 및 치료 방법으로서는 호르몬 대체요법(hormone replacement therapy; HRT)이 널리 사용되어 오고 있으며(Lobo RA ＆ Speroff L. FertilSteril 61: 592-595, 1994), 이는 폐경기 증상의 원인이 에스트로겐의 분비 감소에서 기인함에 착안하여 합성 에스트로겐, 또는 합성 에스트로겐과 합성 프로게스테론의 혼합물을 인위적으로 투여하는 방법이다. 임상적으로는 무월경이나 월경이상의 치료, 월경의 인위적 이동, 갱년기장애, 전립선암이나 유방암에 대한 호르몬 요법, 골다공증 등에 대해 적용되고 있다. 또한, 경구피임약은 황체호르몬과 에스트로겐으로 이루어진다. 또한, 배란 유발제인 클롬펜이나 유방암 치료에 쓰이는 타목시펜은 비스테로이드성 항(抗)에스트로겐이다. 이러한 합성 에스트로겐 호르몬 제제의 투여는 정제 형태로 경구 투여하거나 피부에 접착시키는 패취형 또는 국소적 적용을 위한 크림제 등의 형태로 적용되고 있다.

그러나, 합성 에스트로겐의 장기간에 걸친 투여는 유방암과 자궁암을 유발할 수 있다는 심각한 문제점을 갖고 있는 것으로 많은 연구 결과는 보고하고 있다(예컨대, Hunt K etal, Br J Obstet Gynaecol 94:620-635, 1987; Ravnikar VA. Women's Health Issues 2:75-82, 1992). 최근 들어서는 장기간에 걸친 합성 에스트로겐 대체 요법이 유방암을 유발할 가능성이 높다는 믿을 만한 주장이 다수 제기되면서 학자들 간에는 물론, 사회 전반에 걸쳐 논란이 가열되고 있다. 아직 확실히 증명된 것은 아니지만, 합성 에스트로겐 대체 요법을 받는 여성에 있어서의 유방암 발생 위험은 시간 경과에 따른 에스트로겐 노출 용량과 관련이 있는 것으로 믿어지고 있다.

따라서, 상기한 호르몬 대체 요법에 사용되는 합성 에스트로겐의 보다 안전한 대체물로서 식물성 에스트로겐인 피토에스트로겐(phytoestrogen)을 찾고자 하는 연구가 최근 활발히 진행되고 있는 추세에 있다.

상기한 피토에스트로겐은 동물의 체내에서 에스트로겐성 효과를 발휘하는 식 물 중에 존재하는 비스테로이드성 화합물을 지칭하며, 항암 작용과 심장병에 효과가 있는 것으로 알려져 있는 곡물, 과일, 채소들의 대부분은 피토에스트로겐을 미량 포함하고 있으며, 특히 콩을 포함한 콩 가공식품(두유, 두부, 된장 등)과 각종 곡류나 과일류, 알팔파, 클로버 등에 상대적으로 많이 포함되어 있다. 이소플라본의 경우에는 주로 콩과 식물에, 리그난의 경우에는 주로 곡류에 많이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

상기한 식물성 에스트로겐의 활성효과는 체내에서 생성되는 내인성 에스트로겐에 비해 1/100∼1/1000에 불과하지만, 그 함유량은 훨씬 크므로 결과적으로 충분한 에스트로겐 효과를 얻을 수 있다. 식물성 에스트로겐의 대표적인 활성으로는 골소실을 방지하고 골밀도를 증가시키는 효과와 폐경 여성에게 투여 시 FSH와 LH의 감소 및 폐경기 증상의 완화에 효과가 있다고 알려져 있으며, 이소플라본 중 하나인 제니스테인(genistein)은 세포의 단백질 타이로신 인산화효소(proteintyrosine kinase)를 억제하여 암세포의 성장을 억제하는 항암효과가 있음이 보고된 바 있다.

따라서, 폐경기 여성에서의 골다공증의 예방과 치료에 사용될 수 있음은 물론, LDL(low density lipid)을 낮추고 HDL(high density lipid)을 높이며, 자궁내막과 유방에서는 항암효과를 보이는 에스트로겐 작용제 또는 길항제로 역할을 함과 아울러, 피부 개선, 백내장 및 대장암 예방, 자가면역성 질환의 예방 등에 효과적이면서도 안전하게 사용할 수 있는, 폐경기 증상의 예방 및 치료를 위한 건강기능식품 또는 치료제로서 이용할 수 있는 효과적인 식물성 에스트로겐에 대한 요청이 급격히 증대되고 있다.

이러한 요청에 부응하여, 현재 식품 및 의약품 산업계에서는 천연자원 중에서 에스트로겐의 생리활성을 가지면서도, 유방암이나 자궁암 등을 유발하지 않음은 물론, 내분비계 장애 물질로서 작용하지 않는 안전한 천연호르몬 대체 식물을 찾고자 광범위한 노력을 지속하고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 갱년기 또는 폐경기 여성에 있어서의 갱년기 또는 폐경기 증상을 효과적으로 예방 개선할 수 있는 건강기능식품을 제공하기 위한 것이다.

삭제

이하, 본 발명에 관하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 갱년기 또는 폐경기 여성에 대한 천연 에스트로겐 공급원으로서의 석류 추출물을 포함하는 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명의 건강기능식품의 제조에는 주원료로써 석류가 이용되며, 석류는 이란을 중심으로 한 아시아 서남부 및 인도 북서부의 자생 식물로서, 현재는 아열대 및 열대 각지에 널리 퍼져 있는 식물이다. 예로부터 석류, 특히 흑석류는 강장제로 알려져 왔으며 특히 고혈압과 동맥경화 예방에 좋은 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, 수용성 당질이 38~47%로 다량 포함되어 있으며, 다양한 비타민과 미네랄을 포함한다.

본 발명에 있어 석류의 종류에는 특별한 제한은 없지만, 흑석류가 바람직하며, 구체적인 예로써는 이란산 흑석류를 들 수 있다.

본 발명자들에 의해 규명된 바에 의하면, 석류 농축물은 석류의 산지 및 수확 시기 등에 따라 약간의 차이는 있지만, 특히 흑석류 농축물은 피토에스트로겐을 상당량 포함하고 있으며, 구체적으로는 카테킨 1.0~2.0ppm, 다이드제인 20~30ppm, 제니스테인 0.1~0.5ppm, 쿠에르세틴 8.0~14.0ppm, 17β-에스트라디올 0.05~0.3ppm 및 2,3-디-MeO-에스트라디올 0.01~0.10ppm을 포함한다.

본 발명에 있어서의 석류 농축액은 수분 함량 35~42중량%, 지질 함량 0.3~0.6중량%, 단백질 함량 0.7~1.2중량%, 회분 1.2~1.6중량%, 탄수화물 38~47중량%를 포함한다. 본 발명에 있어서의 석류 농축액은 과육으로의 농축액, 과육과 씨앗의 농축액 및, 과피를 포함하는 원료로부터의 농축액을 포함하는 의미로 사용된다.

아미노산으로서는 트레오닌, 발린, 메티오닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 트립토판, 리신의 필수 아미노산 8종을 비롯하여 아스팔트산, 세린, 글루탐산, 프롤린, 글리신, 알라닌, 시스테인, 티로신, 히스티딘, 알지닌을 포함한다.

또한, 수용성 비타민으로서는 티아민(비타민 B₁), 리보플라빈(비타민 B₂), 아스콜빈산(비타민 C), 니아신, 비타민 B₆를 포함하며, 지방산으로서는 미리스틴산, 팔미트산, 스테아린산, 올레인산, 리놀레인산 등을 포함하고, 약산 성분으로서는 글리콜산 및 초산을 약간 포함한다.

본 발명에 따른 피토에스트로겐 함유 건강기능식품은 조성물 전 중량 기준으로 상기한 석류 농축 과즙을 0.1~99중량% 포함하며, 바람직하게는 3~70중량%, 더욱 바람직하게는 5~50중량% 포함한다. 가장 바람직하게는, 정제 또는 과립 형태인 경우에는 35~45중량%이며, 액제 형태인 경우에는 5~15중량%이다.

또한, 선택적으로, 본 발명에 따른 피토에스트로겐 함유 건강기능식품은 칡, 대두, 또는 칡과 대두 유래의 피토에스트로겐인 이소플라본을 조성물 전 중량 기준으로 각각 0.1~5.0중량% 포함할 수도 있다.

본 발명에 따른 피토에스트로겐 함유 건강기능식품은 엄격히 제한적인 것은 아니나, 피부 개선 및 뼈와 연골 조직의 활성화에 도움이 되는 키토올리고당 또는 연골 유래의 글루코오스아민을 0.1~8.0중량% 함유시킬 수도 있다.

또한, 필요에 따라 비타민 E, 비타민 C, 니코틴산아미드, 리보플라빈 등과 같은 비타민류를 0.01~4중량% 포함할 수도 있다.

본 발명에 따른 피토에스트로겐 함유 건강기능식품이 정제나 과립제, 또는 캡슐제 등의 고형 제제 형태인 경우에는, 콜라겐 및/또는 뮤코다당을 포함시킬 수도 있으며, 이 경우 함유량은 전 조성물 중량 기준으로 각각 2.5~5.0중량% 및 5.0~10.0중량%의 범위이다.

본 발명에 따른 피토에스트로겐 함유 건강기능식품은 습식 조립법 또는 건식 조립법에 의해 롤러 컴팩터(Roller compactor)를 이용하는 컴팩팅법 또는 강타법 등에 의해 과립 또는 통상적인 정제 형태로 제형화된다.

통상적으로, 정제의 제조에 있어서 주성분 이외의 첨가물은 모두 첨가제 또는 부형제라 통칭되며, 보다 자세하게 분류하면, 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제 등으로 나눌 수 있다.

부형제는 정제에 관한 경험, 비용, 주성분과의 적합성 등을 고려하여 선택되며, 보통 정제에 일정한 부피를 주고 타정성을 좋게 할 목적으로 사용된다. 적합한 부형제의 예로서는, 유당, 라올린(Raolin), 만니톨, 전분, 분말 백당, 인산칼슘, 미결정 셀룰로오스, 콜로이드성 실리카 등을 들 수 있으나, 본 발명에 있어서 특히 바람직한 부형제로서는 유당을 들 수 있으며, 그 함량은 전 조성물 중량 기준으로 10~25중량%의 범위이다.

결합제는 과립 상호간의 부착성을 향상시키는 외에, 압축된 다음 정제의 형태를 유지하는 작용을 한다. 결합제의 양은 가하는 사람의 경험, 다른 성분의 성질 등에 따라 결정되며, 그 양이 너무 적으면 결합능이 부족하게 되고 너무 많으면 지나치게 굳어지게 되므로 정제의 붕해 및 용출 속도가 늦어지게 된다. 바람직한 결합제의 종류 및 첨가량에 대하여 언급하면, 옥수수 전분 현탁액, 포도당 용액, 말토오스, 천연 검(gum), 셀룰로오스 유도체(메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 미결정셀룰로오스), 젤라틴, 포비돈, 콜라겐, 뮤코다당 등을 들 수 있으며, 본 발명에 있어서 바람직한 결합제로서는 피부 개선 효과 및 연골 강화 효능이 있는 콜라겐 또는 뮤코다당이며, 그 비율은 전술한 바와 같다.

활택제는 호퍼로부터 타정기의 다이(die)로의 유동 개선, 펀치나 다이에의 부착 방지, 타정기에서 정제를 인출할 때의 저항 감소, 정제에의 광택 부여 등과 같은 효과를 가져온다. 바람직한 활택제의 예로서는, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 스테아린산, 칼슘 스테아레이트, 발연 실리콘 이산화물 등을 들 수 있다. 특히 바람직한 활택제로는 썬 액티브철 및 알긴산 나트륨을 들 수 있고, 활택제의 양이 너무 많아지면 정제의 붕해와 용출을 지연시키므로, 본 발명에 있어서는 적어도 1종의 상기한 활택제를 총 정제함량에 대하여 0.1~0.5중량%의 비율로 사용하는 것이 좋다.

붕해제는 수분과 접촉시 팽창하여 위장관 내에서 정제를 붕괴시키는 효과를 가져오며, 바람직한 붕해제의 예로서는 앞서 결합제 및 부형제로서 언급한 것들을 들 수 있다.

부형제, 결합제 및 붕해제는 일반적으로 성분 간의 상호 관계 등을 고려하여 적절히 조합되며, 결합제로서의 목적으로 첨가한 것이 다른 부형제와의 상호 작용에 의하여 오히려 붕해제로서의 작용을 하는 경우도 있고, 그 반대의 경우도 있으므로 이들 간의 엄격한 구별은 절대적인 것이 아니며, 오히려 상대적이다.

상기한 정제나 과립, 캡슐제의 고형 제제 형태인 경우에는 석류 농축 과즙의 중량 기준으로 500mg, 750mg, 1000mg 제형으로 제조할 수 있으며, 750mg 제형의 경우에는 1일 6~12개의 정제를 경구 섭취한다.

한편, 본 발명에 따른 피토에스트로겐 함유 건강기능식품이 액제 형태인 경우에는, 안정화된 교질 용액을 형성시키기 위하여 폴리덱스트로오스를 전 조성물 중량 기준으로 3~10중량% 첨가하는 것이 바람직하다.

글루코오스아민과 전술한 비타민류를 전술한 바와 같은 양으로 포함시킬 수 있음은 물론이다.

그 외 나머지 잔부는 대부분 정제수이다.

상기한 액제 형태인 경우에는 50㎖ 또는 100㎖ 용량으로 진공 포장한 팩을 1일 1~2포 경구 섭취할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 피토에스트로겐 함유 건강기능식품의 제조 과정에 대하여 설명하기로 한다.

먼저, 액액 분리에 의한 용매 추출법에 의한 제조 단계는 다음과 같다.

(A) 분쇄한 석류에 물, 메탄올, 에탄올, n-헥산, 에틸아세테이트, 또는 이들의 임의의 혼합물을 가하는 용매 혼합 단계

(B) 60~비등점 사이의 온도 조건 하에 0.5~2시간 동안 환류시키는 환류 단계

(C) 상층 분리 단계

(D) 용매 제거 단계

추출 용매에 특별한 제한은 없으며, 바람직한 것은 메탄올 및 에탄올이며, 필요하다면 n-헥산 및/또는 에틸아세테이트 등을 첨가할 수도 있다.

상기한 환류 단계와 상층 분리 단계는 2~3회 반복하는 것이 바람직하다.

상기한 용매 제거 단계를 경유한 농축액은 약 30% 농축액으로서, 총 피토에스트로겐 함량은 약 1300~1700pg/㎖이다.

다음으로, 염산 처리에 의한 용매 추출법에 의한 제조 단계는 다음과 같다.

(A) 건조시켜 미분쇄한 석류에 물, 메탄올, 에탄올, n-헥산, 에틸아세테이 트, 또는 이들의 임의의 혼합물을 가하는 용매 혼합 단계

(B) 0.5~2시간 동안 환류시키는 환류 단계

(C) 상층 분리 단계

(D) HCl 첨가 단계

(E) 교반 단계

(F) 글래스 필터 여과 단계

(G) HCl 첨가 후 1~3시간 동안 60~100℃의 열수조에 정치하는 정치 단계

(H) 냉각 단계

(I) 아세토니트릴 첨가 단계

(J) 용매 제거 단계

상기한 환류 단계와 상층 분리 단계는 2~3회 반복하는 것이 바람직하다. HCl 은 0.1~1.0M 농도를 사용하고 균질하게 되도록 철저히 교반한 후 글래스 필터를 사용하여 과피, 과육 및/또는 씨앗의 미세 분쇄 입자를 제거하고 열수조에 정치하는 것에 의해서, 황산 또는 글루큐론산과의 포합 형태로 존재하는 에스트로겐을 비포합 형태의 에스트로겐으로 가수분해하게 된다. 이어서, 아세토니트릴을 첨가하여 세포내 성분들을 추출하고, 용매를 감압 증류법 등을 이용하여 제거한다.

상기한 용매 제거 단계를 경유한 농축액은 약 40% 농축액으로서, 총 피토에스트로겐 함량은 약 1420~1830pg/㎖이다.

상기한 아세토니트릴 첨가 단계에 이어서, (K) 37℃에서의 효소가수분해 단계, (L) 에틸아세테이트 첨가 추출 단계(바람직하게는 2~3회 반복 수행)를 수행한 후, 최종적으로 (M) 용매 제거 단계를 수행할 수도 있다.

에스트로겐은 많은 경우 황산 또는 글루큐론산과의 포합 형태로 존재하므로 비포합 형태의 에스트로겐으로 만들기 위하여 상기한 HCl에 의한 가수분해 외에 효소가수분해 단계를 독립적으로 또는 병행하여 수행할 수 있으며, 여기서의 효소가수분해단계는 0.2M의 초산과 초산 나트륨으로 pH 5.2로 맞춘 초산완충용액을 첨가한 후, Helix pomatia 유래의 글루큐로니다제/아릴설파타제(독일, Boehringer Mannheim사 제)를 첨가하여 수행된다.

이 경우의 농축액은 약 50% 농축액으로서, 총 피토에스트로겐 함량은 약 1540~1980pg/㎖이다.

이어서, 고상 추출법에 의한 제조 과정에 대하여 설명하면 하기의 단계로 구성된다.

(A) 건조시켜 미분쇄한 석류에 물, 메탄올, 에탄올, n-헥산, 에틸아세테이트, 또는 이들의 임의의 혼합물을 가하는 용매 혼합 단계

(B) 0.5~2시간 동안 환류시키는 환류 단계

(C) 상층 분리 단계

(D) Sedolit AD-2 이온교환수지 통과 단계

(E) 농축 단계

(F) 전술한 바와 같은 37℃에서의 효소가수분해 단계

(G) 에틸아세테이트 첨가 추출 단계

(H) 용매 제거 단계

상기한 (B) 및 (C)의 단계와, (G)의 단계는 2~3회 반복하는 것이 바람직할 수 있다. (D) 단계에서의 컬럼 통과액은 별도로 모아 보관하고, 아세톤:메탄올(1:9 농도 구배) 용액을 이용한 용출액은 (D)~(G) 단계를 수행한 후, (D) 단계에서의 컬럼 통과액과 합하여 (H)의 용매 제거 단계를 수행한다.

이 경우의 농축액은 약 50% 농축액으로서, 총 피토에스트로겐 함량은 약 1560~1960pg/㎖이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 하나, 이는 본 발명을 예증하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1: 흑석류 농축물의 제조

수확 후 3개월 된 이란산 흑석류의 과육 1㎏을 분쇄한 다음, 에틸알코올 8ℓ를 붓고 1시간 동안 70℃의 온도에서 환류하였다. 환류 후 상층을 분리하였다. 나머지를 다시 동일한 조건 하에 환류하였으며 환류 후 상층을 분리한 다음, 모아진 상층을 합하였다. 상기한 상층을 65℃의 온도에서 회전 감압 증발기를 이용하여 용매를 제거하였다.

결과로서 점조성 잔사를 214g 수득하였다.

실시예 2 : 흑석류 농축물의 제조

수확 후 3개월 된 이란산 흑석류(과육+씨앗) 1㎏을 분쇄한 다음, 메틸알코올 9ℓ를 붓고 1시간 동안 60℃의 온도에서 환류하였다. 환류 후 상층을 분리하였다. 나머지를 다시 동일한 조건 하에 환류하였으며 환류 후 상층을 분리한 다음, 모아진 상층을 합하였다. 모아진 상층에 0.5M HCl을 100㎖을 첨가한 다음, 30분간 교반한 후, 글래스 필터를 통하여 여과하였다.

여액에 다시 0.5M HCl을 100㎖을 첨가한 다음, 2시간 동안 65℃의 열수조에 정치한 후, 실온으로 냉각하였다. 이어서, 아세토니트릴 100㎖을 첨가한 다음, 70℃의 온도에서 회전 감압 증발기를 이용하여 용매를 제거하였다.

결과로서 점조성 잔사를 267g 수득하였다.

실시예 3 : 흑석류 농축물의 제조

실시예 2에서 얻은 잔사 100g에 0.2M 초산완충용액(pH 5.2)을 200㎖을 첨가한 후, Helix pomatia의 글루큐로니다제/아릴설파타제(독일, Boehringer Mannheim사 제)(글루큐로니다제 5.5U/㎖(38℃); 아릴설파타제 2.6U/㎖(38℃))를 50μL의 양으로 첨가하여 37℃에서 에스트로겐 포합체를 가수분해하였다. 이어서, 에틸아세테이트 100㎖를 첨가하고 2회 반복 추출하였다. 그 후, 80℃의 온도에서 회전 감압 증발기를 이용하여 용매를 제거하였다.

결과로서 점조성 잔사 87g을 수득하였다.

실시예 4 : 흑석류 농축물의 제조

수확 후 3개월 된 이란산 흑석류(과육+씨앗+과피) 1㎏을 분쇄한 다음, 메틸알코올 4ℓ과 N-헥산 2ℓ 및 물 4ℓ의 혼합 용매를 붓고 1시간 동안 85℃의 온도에서 환류하였다. 환류 후 상층을 분리하였다. 나머지를 다시 동일한 조건 하에 환류하였으며 환류 후 상층을 분리한 다음, 모아진 상층을 합하였다.

모은 상층을 입자 크기 0.1~0.2mm의 이온교환수지 Serdolit AD-2 수지 컬럼(아세톤/메탄올/증류수를 이용하여 차례로 환류 정제한 다음 증류수에 보관)에 장전하고 Bradlow. H.L. Steroids, 1977, 30, 581에 기재된 방법에 따라 컬럼을 통과시키고 통과액은 별도로 모아두었다. 다시 컬럼을 아세톤:메탄올 1:9의 농도 구배를 가는 용액으로 용출시킨 다음, 용출액을 65℃의 온도에서 회전 감압 증발기를 이용하여 농축하였다.

농축 용액에 0.2M 초산완충용액(pH 5.2)을 300㎖을 첨가한 후, 글루큐로니다제/아릴설파타제를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 에스트로겐 포합체를 가수분해하였다. 이어서, 에틸아세테이트 200㎖를 첨가하고 2회 반복 추출하였다.

그 후, 상기한 추출액과 컬럼 통과액을 합하고 85℃의 온도에서 회전 감압 증발기를 이용하여 용매를 제거하였다.

결과로서 점조성 잔사 135g을 수득하였다.

실시예 5 : 정제의 제조

실시예 4에서 얻은 농축물을 이용하여 하기와 같은 배합비(중량%)로 제형화한 정제를 제조하였다:

흑석류 농축물 40.0

글루코오스아민 5.0

콜라겐 3.5

뮤코다당 7.5

비타민 E(분체) 2.5

리보플라빈 0.5

알긴산나트륨 0.3

썬 액티브철 0.2

유당 20.0

이소플라본(칡) 2.5

카르복시메틸셀룰로오스 15.0

포도당 3.3

------------------------------------

100.0

실시예 6 : 액제의 제조

실시예 1에서 얻은 농축물을 이용하여 하기와 같은 배합비(중량%)로 제형화한 50㎖ 용량의 액제를 제조하였다:

흑석류 농축물 10.0

글루코오스아민 0.7

폴리덱스트로오스 6.3

비타민 C 0.1

솔비톨 1.0

니코틴산아미드 0.01

정제수 잔부

----------------------------------

100.0

실시예 7 : 일반성분분석

실시예 1에서 얻은 흑석류 농축물과 실시예 5의 정제에 대한 일반성분분석을 수행하였다.

시료의 수분함량은 105℃ 상압 가열 건조법, 조지방 함량은 속시렛추출법(Auto Soxtec System HT 1043, Tecator, Sweden), 조단백질 함량은 킬달법(Kjeltec 1030 Auto Analyzer, Tecator, Sweden)으로 측정된 질소량에 질소계수 6.25를 곱하여 산출하였으며, 조섬유의 함량은 H₂SO₄-NaOH 분해법으로(Dosi-Fiver 6 units, J.P. Selecta, Spain), 조회분은 직접회화법으로 측정하였다. 당질의 함량은 100%에서 단백질, 지방, 섬유질 및 회분의 양을 뺀 값으로 나타내었다.

그 결과를 하기의 표 1에 나타낸다.

조성	실시예 1	실시예 5
수분	39.3	2.6
지질	0.4	1.5
단백질	0.9	3.8
회분	1.4	7.6
탄수화물	42.0	84.5
합	100.0	100.0

실시예 8 : 아미노산 분석

실시예 3에서 얻은 흑석류 농축물과 실시예 5의 정제에 대하여 아미노산 분석을 수행하였다.

시료 1g을 6N HCl 20㎖과 함께 분해용 시험관에서 105℃에서 24시간 산가수분해시켜 얻은 분해액을 0.2㎛의 필터에서 여과한 후 닌하이드린법을 이용한 아미노산 자동분석기에서 분석하였다. 분석 기기는 6300 아미노산 분석기(Beckmann Inc., Fullerton, CA, USA)를 사용하였고, 검출은 460nm와 530nm에서 하였다. 사용한 컬럼은 소디움 컬럼(4.6mmx15cm)이었다.

그 결과를 하기의 표 2에 나타낸다(단위는 ppm).

아미노산	실시예 3	실시예 5
아스팔트산	896.2	1523.7
트레오닌	88.7	311.8
세린	459.5	545.4
글루탐산	1310.2	1735.7
프롤린	174.0	2384.9
글리신	106.5	505.3
알라닌	270.3	1095.1
시스테인	7.6	152.3
발린	97.5	518.8
메티오닌	92.7	불검출
이소류신	52.7	368.1
류신	64.8	442.2
티로신	59.4	111.2
페닐알라닌	57.5	138.8
히스티딘	158.3	295.4
트립토판	74.5	440.6
리신	82.1	510.5
알기닌	187.7	1237.9

실시예 9 : 무기질 및 약산 분석

실시예 4에서 얻은 흑석류 농축물과 실시예 5의 정제에 대하여 무기질 분석을 수행하였다.

무기질 전처리는 건식법으로 하였으며 inductively coupled plasma-atomic emission spectrophotometer(Spectro flame Modula E, Fitchburg, MA, USA)용을 사용하였다. 기기 작동 조건은 다음과 같다.

-----------------------------------------------------

전력 수용상에 대한 1.2Kw

분무기 압력 메인하드 타입 C에 대한 3.5bar

에어로솔 유속 0.3ℓ/min

시쓰(sheath) 기체류 0.3ℓ/min

냉각 기체류 12ℓ/mim

파장(nm) Fe 275.574

Cu 324.754

K 766.491

Zn 213.856

Mn 257.610

P 178.290

Na 588.995

Ca 373.690

--------------------------------------------------

결과를 하기의 표 3에 나타낸다(단위는 ppm).

조성	실시예 4	실시예 5
K	2550.8	2908.0
Ca	80.0	143.9
Na	10.1	14.7
P	150.0	167.8
Fe	6640.0	7311.0
Cl	3464.0	898.0
Mn	0.59	5.3
Cr	0.02	0.06
Zn	1.85	2.09
Cu	0.9	0.9
Pb	1.0	0.9
Cd	불검출	불검출
NO2	14972.0	2285
HPO4	33980.0	8243
SO4	4060.0	955
글리콜산	40680.0	406.7
개미산	불검출	1.6
초산	6800.0	33.3

실시예 10 : 비타민 분석

실시예 4에서 얻은 흑석류 농축물과 실시예 5의 정제에 대하여 비타민 분석을 수행하였다.

비타민 A와 E는 클로로포름/물의 혼합 용매로 추출하여 HPLC로 분석하였다. 컬럼은 μ-Bondapak C18(4.6mmx15cm), 용매는 100% 메탄올로 용매의 이동속도는 분당 1㎖씩 흘려 주었으며, 검출은 비타민 A는 325nm에서 C는 295nm에서 하였다. 비타민 C는 5% 메타포스포인산 용액으로 신속히 추출하여 HPLC법으로 μ-Bondapak C18(4.6mm 내경x15cm), 용매는 100% H2O로 용매의 이동속도는 분당 1㎖씩 흘려주었으며 검출은 270nm에서 하였다. 다른 수용성 비타민들은 메탄올과 물의 1:1 혼합용매로 추출후 HPLC법으로 μ-Bondapak C18(4.6mmx15cm)의 컬럼에서, 100% H2O에서 60% 메탄올의 용매로 20분간에 걸쳐 농도 구배를 걸어 주었으며, 분당 1㎖씩 흘려 주었고 검출은 270nm에서 하였다.

결과를 하기의 표 4에 나타낸다(단위는 mg/100g).

조성		실시예 4	실시예 5
수용성 비타민	티아민(비타민 B1)	0.12	0.37
	리보플라빈(비타민 B2)	0.02	0.06
	아스콜빈산(비타민 C)	20.00	25.41
	니아신	0.80	0.99
	비타민 B6	0.02	0.06
지용성 비타민	토코페롤(비타민 E)	불검출	불검출

실시예 11 : 지방산 분석

실시예 2에서 얻은 흑석류 농축물과 실시예 5의 정제에 대하여 지방산 분석을 수행하였다.

지방산 조성의 분석은 Bligh와 Byer법에 준하여 지질을 추출하고, n-헥산층을 메틸에스터화시킨 후 무수 Na2SO4로 탈수한 후 여과하여 GC로 분석하였다. 분석시 GC는 Hewlett Packard 6890A(Palo Alto, CA, USA)를 사용하였으며, 컬럼은 HP사 FFAP으로 주입 포트는 260℃, 검출 포트는 270℃, 오븐은 초기 온도 180℃부터 분당 2℃씩 220℃까지 높혔다. 사용한 가스는 헬륨, 시료 주입량은 0.5㎕, 스플리트 레이시오는 50:1, 검출은 플레임 이오나이제이션 검출기로 하였다.

결과를 하기의 표 5에 나타낸다(단위는 피크 면적%).

조성	실시예 2	실시예 5
미리스틴산	13.1	2.5
팔미트산(16:0)	8.3	30.1
스테아린산(18:0)	69.40	51.6
올레인산(18:1)	6.8	3.9
리놀레인산(18:2)	불검출	3.3
리놀레인산(18:3)	불검출	불검출
기타	2.4	8.6

실시예 12와 비교예 1 및 2: 피토에스트로겐 분석

실시예 4에서 얻은 흑석류 농축물과 비교예 1 및 2로서 대두 및 칡뿌리 농축물에 대하여 피토에스트로겐 분석을 수행하였다.

사용된 피토에스트로겐 표준품은 플라본, 헥사에스트롤, DES, 에쿠올, 크리신, 엔터로락톤, α-지랄라놀, 지랄라논, 17-β-에스트라디올, 바이오카닌-A, 카테킨, β-지랄에놀, α-지랄에놀, 다이드제인, 제니스테인, 카엠프페롤, 에피제님, 쿼르세틴의 20종이고, 에스트로겐류는 에스트론, 17-β-에스트라디올, 2-하이드록시에스트론, 2-하이드록시에스트라디올, 6-α-디하이드로에스트론, 6-α-하이드로시에스트라디올, 4-메톡시에스트라디올, 에스트리올, 16-에피에스트리올, 16,17-에피스트리올, 16-α-2-하이드록시에스트론, 17-에피에스트리올, 6-케토에스트리올, 2-메톡시에스트리올, 6-하이드록시에스트리올 및 16-케토에스트라디올의 16종이었으며, 내부 표준 물질은 d4-17β-에스트라디올로써 모두 Sigma사 미국 특급 시약을 사용하였다.

표준 용액은 0.01g을 정확히 칭량한 다음, 메탄올로 1000ppm이 되게 만든 후 10배 희석한 것을 냉장 보관하여 사용하였다.

유도체화 시약은 MSTFA(N-메틸-N-트리메틸실릴트리츨루오로아세트아미드)와 트리메틸클로로실란(TMCS)을 구입하여 STRA와 TMCS를 100:1(v/v)의 비율로 섞은 혼합 용액을 사용하였다.

Serdolit AD-2 수지(100-200 미크론)은 Serve사(독일)로부터 구입하였다.

시료의 전처리와 분석 방법은 Chung 등의 방법을 참고하였다. 즉, 메탄올로 추출한 25mg의 시료에 내부 표준 d4-17β-에스트라디올 10㎍/㎖을 넣고 55℃에서 3시간 가수분해시킨 후 MSTFA/TMSC의 100:1 혼합물 50㎕을 가하고 60℃에서 30분간 반응시켜 TMS 에스터 유도체를 만든 후 이를 GC/MS에 2㎕ 주입하였다. 유도체화시켜 GC/MS에 주입하였다. 사용한 분석 기기는 Hwelette-Packard 5890 PIUS 가스 크로마토그라피에 디렉트 인터페이스로 연결된 5970 매스 셀렉티브 디텍터(MSD)를 사용하였다. 분리관은 울트라-2(길이 25mm, 내경 0.20mm, 필름 두께 0.33㎛를 사용하였으며, 분리관의 온도는 180℃에서 260℃까지 20℃/min으로 올리고 300℃까지 상승시켜 10분간 유지시켰다. 주입기의 온도는 300℃, 검출기의 온도는 300℃ 이동상 기체 헬륨의 유속은 0.85㎖/min 그리고 주입 방법은 스플리트 모드(비율 1:12)로 설정하였다. 이온화에 사용한 전자 에너지는 70eV였고 전처리된 시료들을 분석하기 위해 질량 스펙트럼상의 특성 이온만을 선택하여 검출하는 셀렉티드 이오 모니터링(SIM)방법을 이용하였다.

결과를 하기의 표 6에 나타낸다(단위는 ppm).

조성	실시예 4(흑석류)	비교예 1(대두)	비교예 2(칡뿌리)
에쿠올	불검출	불검출	0.63
바이오카닌-A	불검출	0.66	0.65
캬테킨	1.48	불검출	불검출
다이드제인	23.72	745.46	51.15
제니스테인	0.29	3.48	0.31
아피제닌	불검출	35.33	불검출
쿠에르세틴	9.75	불검출	불검출
17β-에스트라디올	0.15	불검출	불검출
2,3-디-MeO-에스트라디올	0.04	불검출	불검출

실시예 13 :

안면홍조 현상을 겪고 있는 55~65세의 여성 30인을 15인씩 무작위로 2그룹으로 나누고 하나의 그룹에는 실시예 5에서 제조한 정제(흑석류 추출물 750mg/개)를 1일 9개씩 1개월간 복용하게 하고 다른 그룹에는 플레시보로써 흑석류 추출물 대신에 포도당으로 대체한 동일 형상의 정제를 1일 9개씩 3개월 복용케하고 안면홍조 현상의 완화 정도에 대하여 설문 조사하였으며, 그 결과를 하기의 표 7에 나타낸다.

	3일	1주일	2주일	3주일	1개월
실시예 5 투여군	6(1)	12(5)	14(8)	15(10)	15(14)
플래시보 투여군	1(0)	2(0)	1(0)	3(0)	2(0)

상기 표에서 숫자는 완화되었다고 응답한 사람의 수이며 ( )의 숫자는 홍조 현상이 없어졌다고 응답한 사람의 숫자이다.

상기한 결과로부터 본 발명에 따른 정제는 폐경으로 인한 안면홍조 현상의 치료 및 예방에 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 14 :

본 발명에 따른 흑석류 추출물 함유 건강기능식품의 뼈 형성 촉진 여부를 평가하기 위하여 뼈 형성에 관계된 골아세포(osteoblast) 세포주(cell line)인 ROS 17/2.8을 사용하였다.

ROS 17/2.8 세포를 페놀레드가 첨가되지 않은 10% 송치혈청(fetal bovine serum)과 1% 항생제-항균제 혼합물(100 IU페니실린, 100 mg 스트렙토마이신, 250 ng 암포테리신)을 첨가한 둘베코 변형 이글배지(Dulbecco's Modified EagleMedium)에 접종하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 세포증식은 엠티티(MTT; 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolin bromide)의 대사환원 원리를 통한 엠티티 에세이(MTT assay) 방법과 방사성 표지된 티미딘(³H-Thymidine) 방사능 활성을 통한 티미딘 편입 에세이(incorporation assay)로 측정하였다.

상기한 실시예 3에서의 추출물을 평가하였으며, 대두에서 분리한 제니스테인을 비교대조군으로, 시료 무첨가군을 대조군(control)으로 설정하여 증식정도를 비교하였다.

먼저, ROS 17/2.8 세포를 96-웰(well)에 8% 에스트로겐 결핍-FBS 배지로 세포수 2x10³ 으로 접종하고 송치혈청의 효과를 배제하기 위해 24시간 동안 0.8% 에스 트로겐 결핍-송치 혈청으로 배지 조성을 바꾸어 주었으며, 2.5% 에스트로겐 결핍-송치혈청 조건 하에서 흑석류 추출물로부터의 피토에스트로겐 혼합물(실시예 12) 및 제니스테인(10^-9 및 10^-12 몰농도)로 48시간 동안 자극하였다. 각 웰(well)에 75㎕ 엠티티(1.6 ㎎/mL) 용액을 첨가하여 37℃에서 3시간동안 반응시킨 후, 디메틸슬폭사이드(dimethylsulfoxide) 75㎕를 첨가하여 세포에 형성된 포르마잔 결정체(formazan crystal)을 용해시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 540nm에서 측정하였다. 이어서, 동일 세포를 24-웰에 세포수가 1x10⁴으로 접종하고, 전술한 바와 동일하게 자극을 주었다. 자극 종결 4시간 전에 방사능 표지된 티미딘 용액을 한 웰당 1μc씩 첨가하여 37℃에서 배양하였다. 배양한 세포는 3% 트리클로로아세테이트 용액으로 침전물을 형성시킨 후, 2% 디소디움카보네이트 용액을 200㎕씩 첨가하여 용해시켰다. 베타 카운터에서 방사능 활성도를 측정하였다. 뼈 형성 촉진능은 대조군에 대한 상대치로 나타냈다.

결과를 하기의 표 8에 나타낸다.

	농도(M)
	대조군	10-12	1-9
실시예 3에서의 피토에스트로겐 혼합물	100	117	126
대두 제니스테인	100	113	111

상기의 표 8로부터 확인되는 바와 같이, 실시예 3에서의 피토에스트로겐 혼합물은 낮은 농도인 10^-12M에서 이미 117%의 세포 증식 효과를 나타내었으며, 생리적 농도인 10^-9M에서는 약 126%까지 증가하여 용량 의존적으로 골아세포의 증식을 촉진하였다. 대두의 제니스테인도 골아세포 증식을 최고 113% 증가시켰지만 실시예 3의 피토에스트로겐 혼합물 보다는 훨씬 낮은 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 15 :

본 발명에 따른 흑석류 추출물 함유 건강기능식품의 뼈 형성 촉진 여부를 평가하기 위하여 마우스 태아의 미분화 골아세포주인 KS483 세포를 36-웰 플레이트에 세포수 2.4×10⁴으로 접종한 후, 세포가 완전히 증식하여 밀집 상태에 달하였을 때 8% 송치 혈청 조건 하에 실시예 14와 동일한 조건으로 세포를 자극하였다. 제니스테인은 비교군으로, 시료 무첨가군은 대조군으로 설정하였다.

세포분화유도물질인 아스콜빈산(43㎍/mL), 베타-글리세로포스페이트 3mM 및 덱사메타존 5nM을 2일마다 첨가하여 3주 동안 배양하면서, 일정 시점마다 세포염색하여 분화 촉진정도를 비교하였다.

분화 유도 3주 째에는 질산은으로 본코사 염색을 하여 형성된 노듈 수를 비교하였다. 분화촉진작용은 대조군에 대한 상대치로 나타냈다.

	농도(M)
	대조군	10-12	1-9
실시예 3에서의 피토에스트로겐 혼합물	1.0	2.12±0.00	3.38±0.01
대두 제니스테인	1.0	ND	0.92±0.01

상기한 표 9의 결과로부터, 실시예 3에서의 피토에스트로겐 혼합물은 낮은 농도인 10^-12M에서 이미 2배의 세포분화촉진 효과를 나타내었으며, 생리적 농도인 10^-9M에서는 3.4배까지 증가시키는 용량-의존적인 분화촉진효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 한편, 대두의 제니스테인은 생리적 농도에서 0.9배 정도의 분화를 나타냈다.

따라서, 본 발명의 흑석류 추출물 함유 건강기능식품은 매우 우수한 골아세포 분화효과를 갖는 것으로 판단되었다.

실시예 16 :

본 발명에 따른 흑석류 추출물 함유 건강기능식품의 골다공증 억제 효과를 평가하기 위하여, 스프라구돌리(Sprague-Dawley) 12주령의 암마우스(평균 체중 240g)를 펜토바비탈(pentobarbital) 마취 하에 양쪽 난소를 적출하고, 대조군 마우스는 가수술(sham)을 하였다. 난소를 제거하고 난 다음, 1주일 후에 마우스를 다음과 같은 3개의 그룹으로 나누었다.

실시예 6의 식이(5㎖/kg/1일)를 먹인 그룹, 에스트로겐을 주당 2회 피하 주사(50㎍/100㎕ 대두유)한 그룹, 대조 식이를 먹인 대조군으로 나누었다. 난소 제거한 4주 후에 쥐를 희생하여 뒷다리 경골(tibia)을 분리하였다.

경골은 분리 즉시, 포르말린 고정액에 넣어 보관하였다가 탈회하여 근위 골 간단(proximal metaphysis) 부위를 5㎛로 횡절하였다. 골다공증의 정도는 소주골밀도(trabecular bone density), 피질골 두께(cortical bone thickness), 골수강에서 지방적이 차지하는 비율(adipocyte density)로 판정하였다. 각각의 결과를 가수술군에 대한 상대치로 나타냈으며, 그룹간의 차이는 일변량분산분석을 통해 검정하였다.

		소주골밀도	피질골두께	지방세포밀도
가수술대조군		100±1.1	100.0±8.6	100.0±5.7
난소제거군	무처리군	13.1±0.3	105.3±14.1	283.1±3.8
	실시예 3의 식이	62.1±3.6	112.5±11.2	116.8±17.4
	에스트로겐 처리	82.7±4.2	107.1±11.3	135.7±18.2

상기한 표 10으로부터 확인되는 바와 같이, 난소제거 4주 후 무처리군의 경골의 소주골밀도는 가수술한 대조군의 13%까지 감소하여 심한 골다공증을 나타냈으며, 난소 제거 후 에스트로겐을 투여한 쥐의 골밀도는 대조군의 약 83%로서 골다공의 진행이 효과적으로 억제되었음을 확인할 수 있었다. 한편, 난소 제거 후 실시예 3의 식이를 먹인 마우스의 골밀도는 대조군의 62%였다. 이는 에스트로겐 보다는 낮지만 난소제거로 생기는 골다공증의 골밀도 보다 5배 이상 높은 값으로서, 본 발명에 따른 건강기능식품 섭취시 골다공증의 진행이 유의하게 억제될 수 있다는 가능성을 강하게 시사하는 것으로 해석되었다.

난소 제거 후 소주골이 흡수되어 골다공증이 진행됨에 따라 무처리군의 경우에는 골수 내 지방세포 밀도는 2.8배 증가하는 반면, 난소제거 후 인위적으로 에스트로겐을 피하 투여한 경우에는 골수 내 지방축적은 약 36% 정도 증가하였다. 반면에, 난소 제거 후 실시예 3의 식이를 먹인 마우스의 골수 내 지방축적 증가는 대조군의 16.8%에 그쳤다. 따라서, 이러한 결과는 본 발명에 따른 건강기능식품 섭취시 합성 에스트로겐 투여시의 부작용인 지방 증가 현상이 훨씬 적다는 것을 나타낸다.

실시예 17

아테롬성 동맥경화증에 대한 영향 조사를 위하여, 하룻 동안 단식시켜 고지혈증을 유발시킨 웅성 마우스를 선택하여 실험하였다. 3일간 비타민 D2와 콜레스테롤을 각각 80,000 ed/100 g과 20 mg/100g씩 투여하여 비타민-콜레스테롤 고지혈증을 일으킨 것과 트리톤 WP-1339 225 mg/kg을 복강 투여하여 내인성 고지혈증을 유발한 것을 사용하였다. 그 다음, 트리톤을 투여한 20시간 후 및 비타민과 콜레스테롤 혼합물을 투여한 20시간 후 지질의 양을 측정하였다. 실시예 4의 추출물은 고지혈증 유발 전 3일간 및 희생시키기 3시간 전에 3mg/kg의 양으로 4회 투여하였다.

내인성 고지혈증의 경우, 초기 콜레스테롤 농도는 0.83±0.07mmol/ℓ, 트리글리세라이드 양은 0.28±0.003mmol/ℓ였으나, 고지혈증의 유발에 의해 혈장의 콜레스테롤과 트리글리세라이드 농도는 각각 3.26±0.05mmol/ℓ과 0.51±0.04mmol/ℓ로 증가하였으나, 실시예 4의 추출물을 투여한 경우 0.65±0.02mmol/ℓ과 0.26±0.021mmol/ℓ로 각각 크게 감소하였다. 또한, 트리톤을 투여한 경우 혈중 트리글리세라이드 양은 8.2 ±0.41mmol/ℓ로 29배 증가하였으며, 콜레스테롤양은 5.45±0.13mmol/ℓ로서 6.7배 증가하였다. 한편, 실시예 4의 추출물을 투여한 경 우, 콜레스테롤 양은 2.76±0.24 mmol/ℓ로 감소하였으나, 혈중 트리글리세라이드 양에는 변화가 없었다.

한편, 비타민-콜레스테롤 고지혈증의 경우, 콜레스테롤과 트리글리세라이드의 혈중 농도는 초기농도에 비해 3.2배 증가하였으나, 실시예 4의 추출물을 투여한 경우에는 콜레스테롤의 양은 정상화되었으며, 트리글리세라이드 양은 증가하였다.

위의 결과로부터 본 발명에 따른 건강기능식품은 콜레스테롤 및 트리글리세라이드의 농도를 효과적으로 저감시킨다는 사실이 확인되었다.

실시예 18

추출물이 중추신경계에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시예 4의 추출물 3∼10mg/kg을 우레탄으로 인한 혼수상태의 고양이와 모르핀-우레탄 혼수상태의 개에 정맥투여하여 급성독성 실험을 수행한 결과, 약 3분간 약한 동맥혈압의 상승(3∼7%)이 있고 아드레날린의 동맥자극 효과가 약간 상승하는 경향이 있었으나, 히스타민과 아세틸콜린을 투여하면 이러한 동맥압에는 변화가 인지되지 않았다.

이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 이란산 흑석류 추출물 및 이를 포함하는 건강기능식품은 급성독성을 전혀 일으키지 않음과 아울러, 중주신경계의 기능 등에도 하등의 영향을 미치지 않는다는 사실을 확인하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 석류 추출물과 이를 유효성분으로서 포함하는 건강기능식품은 우수한 에스트로겐성을 나타내면서도 부작용이 거의 없는 안전한 피토에스트로겐을 다량 함유하고 있으므로, 갱년기 또는 폐경기 여성에 있어서의 에스트로겐 결핍으로 인하여 유발될 수 있는 제반 증상을 효과적으로 예방 개선할 수가 있을 것으로 기대된다. 특히, 본 발명에 따른 건강기능식품은 안면홍조, 골다공증, 아테롬성 심장질환에 탁월한 효과를 나타내면서도, 부작용으로서의 체지방 증가 현상이 매우 낮으므로, 건강기능식품으로서 유용할 것으로 기대되는 신규 유용한 발명이다.

Claims (18)

1. 삭제
2. 카테킨 1.0~2.0ppm, 다이드제인 20~30ppm, 제니스테인 0.1~0.5ppm, 쿠에르세틴 8.0~14.0ppm, 17β-에스트라디올 0.05~0.3ppm 및 2,3-디-MeO-에스트라디올 0.01~ 0.10ppm을 포함하며 수분 함량 35~42중량%, 지질 함량 0.3~0.6중량%, 단백질 함량 0.7~1.2중량%, 회분 1.2~1.6중량%, 탄수화물 38~47중량%인 석류 추출물을 조성물 전 중량 기준으로 0.1~99중량% 포함하는 갱년기 또는 폐경기 여성의 골다공증 또는 안면 홍조 예방 개선용 건강기능식품.
3. 삭제
4. 제2항에 있어서, 상기한 석류 추출물을 전 조성물 중량 기준으로 35~45중량% 포함하는 정제 또는 과립 형태의 갱년기 또는 폐경기 여성의 골다공증 또는 안면 홍조 예방 개선용 건강기능식품.
5. 제2항에 있어서, 상기한 석류 추출물을 전 조성물 중량 기준으로 5~15중량% 포함하는 액상 제제 형태의 갱년기 또는 폐경기 여성의 골다공증 또는 안면 홍조 예방 개선용 건강기능식품.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기한 건강기능식품이 칡, 대두, 또는 칡과 대두 유래의 피토에스트로겐인 이소플라본을 조성물 전 중량 기준으로 각각 0.1~5.0중량% 더욱 포함하는 갱년기 또는 폐경기 여성의 골다공증 또는 안면 홍조 예방 개선용 건강기능식품.
7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 글루코오스아민을 전 조성물 중량 기준으로 0.1~8.0중량% 더욱 포함하는 갱년기 또는 폐경기 여성의 골다공증 또는 안면 홍조 예방 개선용 건강기능식품.
8. 제7항에 있어서, 비타민 E, 비타민 C, 니코틴산아미드, 리보플라빈, 아스콜빈산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 비타민류를 전 조성물 중량 기준으로 0.01~4중량% 더욱 포함하는 갱년기 또는 폐경기 여성의 골다공증 또는 안면 홍조 예방 개선용 건강기능식품.
9. 제4항에 있어서, 콜라겐과 뮤코다당을 전 조성물 중량 기준으로 각각 2.5~5.0중량% 및 5.0~10.0중량% 더욱 포함하는 갱년기 또는 폐경기 여성의 골다공증 또는 안면 홍조 예방 개선용 건강기능식품.
10. 제4항에 있어서, 유당을 전 조성물 중량 기준으로 10~25중량% 더욱 포함하는 갱년기 또는 폐경기 여성의 골다공증 또는 안면 홍조 예방 개선용 건강기능식품.
11. 제5항에 있어서, 폴리덱스트로오스를 전 조성물 중량 기준으로 3~10중량% 더욱 포함하며 잔부가 정제수인 갱년기 또는 폐경기 여성의 골다공증 또는 안면 홍조 예방 개선용 건강기능식품.
12. 삭제
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