KR100505746B1 - 석류씨 유래 피토에스트로겐 함유 건강기능식품의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 석류씨 유래 피토에스트로겐 함유 건강기능식품의 공업적 제조방법에 관한 것으로서,

본 발명의 제조방법은 (A) 석류씨를 160~250℃의 온도에서 5~40분간 볶음 처리하는 전처리 단계, (B) 분체화(粉體化)시키는 분쇄단계, 선택적으로 (C) 40~55℃의 온도에서 10~120분간 초음파를 조사하는 초음파조사단계, (D) 분체를 추출기에 도입하고 용매를 가하여 혼합하는 추출용매 혼합단계, (E) 50~90℃에서 3~20시간 추출하는 추출단계, (F) HCl을 0.1~0.5M 농도가 되도록 가한 후, 약 75~85℃의 열수조에 1~3 시간 동안 정치 또는 교반하는 HCl 가수분해단계 및, (G) 추출액을 35~65℃의 온도 범위에서 1~6시간 정도 정치 또는 교반하여 32~40Brix로 농축하는 농축 단계로 구성되며,

본 발명의 제조방법은 피토에스트로겐을 함유하는 석류씨 추출물을 경제성 있는 높은 효율로 대규모로 수득할 수가 있고, 이에 의해 공업적 규모로 생산되는 석류씨 추출물 또는 이를 포함하는 건강기능식품은 우수한 에스트로겐성을 나타내면서도 부작용이 거의 없으므로 건강기능식품으로서 뿐만 아니라, 피토에스트로겐 분리물을 생물의약으로서도 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

석류씨 유래 피토에스트로겐 함유 건강기능식품의 제조방법{PREPARING METHODS FOR HEALTH ASSISTANT FUNCTIONAL FOODSTUFFS CONTAINING PHYTOESTROGENS DERIVED FROM POMEGRANATE SEEDS}

본 발명은 석류씨 유래 피토에스트로겐 함유 건강기능식품의 공업적 제조방법에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 다량의 피토에스트로겐을 함유하는 석류씨 추출물을 주요 성분으로 하는 갱년기 여성을 위한 건강기능식품의 공업적 제조방법 에 관한 것이다.

내분비계 여성 호르몬의 하나인 에스트로겐(estrogen)은 체내에서 콜레스테롤로부터 합성되며, 분비원(分泌源)은 주로 난소의 난포(卵胞) 및 황체(黃體)이고 임신시의 태아 태반계, 부신(副腎)·정소(精巢) 등에서도 분비된다.

에스트로겐은 에스트라디올(estradiol), 에스트론(estrone), 에스트리올 (estriol) 등을 총칭하며, 자궁내막의 증식, 자궁근의 발육, 제2차 성징(性徵)의 발현, 월경주기 성립의 매개, 임신시의 모체변화 야기, 유선관(乳腺管)의 증식분비 촉진 등에 관여하는 대표적인 여성호르몬이나, 뼈를 포함한 신체의 다른 여러 부위에도 광범위한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

폐경 전의 여성에 있어 난소는 에스트로겐의 주요 공급원이며, 남성 및 폐경 후 여성에 있어서 에스트로겐의 주요 공급원은 지방조직이다. 이러한 조직에서 에스트론은 부신피질에 의해 분비되는 데하이드로에피안드로스테론으로부터 합성된다.

여성이 폐경기에 접어들면, 난소가 노화됨에 따라 하수체성 고나도트로핀 (gonadotropin)(여포-자극 호르몬(FSH) 및 황체형성 호르몬(LH))에 대한 반응이 감소하고, 이로 인해 초기 난포기가 더욱 단축되어 월경 주기가 더욱 단축되며, 배란기가 더욱 단축되고, 프로게스테론 생성이 감소되며, 사이클이 더욱 불규칙하게 된다. 결국, 여포가 반응하지 못하게 되어 에스트로겐을 생성하지 못하게 된다. 에스트로겐의 분비 감소는 여성의 비뇨생식계통 뿐만 아니라 신체전반에 걸쳐 큰 영향을 미치게 되며, 배란이 중단되어 월경이 사라지는 것을 폐경이라 하고, 폐경 또는 그 이전에 호르몬의 감소로 인한 갱년기 또는 폐경기 증상이 나타나게 된다.

갱년기의 여성과 폐경기의 여성은 에스트로겐의 급속한 감소로 인하여, 심리학적 및 감성적 징후, 예컨대 피로, 흥분, 불면, 집중력 저하, 우울증, 기억 상실, 두통, 근심 및 신경과민이나 소심증 등이 발생할 우려가 현저히 높아지게 되며, 재발성 안면 홍조에 의한 수면 방해에 따른 피로와 흥분, 간헐성 현기증, 감각이상, 심계항진 및 빈맥, 메스꺼움, 변비, 설사, 관절통, 근육통, 수족 냉증 및 체중 증가 현상의 발생 우려 또한 현저히 높아지게 된다. 또한, 골다공증이 쉽게 유발될 뿐 아니라, 심장병, 고혈압, 뇌졸중 등의 심혈관계 질환으로 인한 사망률도 증가한다(Kalin MF ＆ Zumoff B. Steroids 55:330-352, 1990). 또한, 피부 및 비뇨생식계통의 변화를 초래하며, 자가면역성 질환, 백내장 및 대장암 등의 발병 가능성이 높아지게 된다.

안면홍조 및 발한은 폐경기 여성 중 약 75% 정도가 경험하게 되는 것으로 알려져 있다. 홍조 현상은 통상적으로 폐경 중 또는 폐경 후에 발생하며, 에스트로겐 결핍과 직접 관련되어 있다. 그 대부분은 1년 이상 안면 홍조가 지속되며, 25 내지 50%는 5년 이상 안면 홍조가 지속된다. 안면홍조는 안면과 목, 가슴 상부에 집중되는 갑작스러운 열감으로 시작되며 피부가 적색으로 변하고, 이러한 열감은 30초 내지 5분간 지속되며, 흔히 다량의 발한을 수반하고, 때로는 심계 항진도 수반되며, 통상적으로는 발한과 오한이 수반된다(Casper, RF, Yen, SSC. Neuroendocrinology of menopausal flushes: An hypothesis of flushmechanism. Clin Endocrinol 1985; 22:293).

이러한 안면홍조 현상은 매일 1, 2회 정도, 또는 많을 경우에는 주야로 시간당 1회 정도의 범위일 수 있으며, 통상적으로는 하루에 수 차례씩 일어난다. 안면홍조 현상은 수면 각성을 일으켜서 수면을 방해하며, 수많은 여성들이 다량의 발한을 경험하게 되므로 사회 생활에 있어 상당히 당혹스러운 문제를 초래할 수 있다.

현재, 상기한 안면홍조 현상을 방지하거나 치료하는 데 있어서 가장 효과적인 공지된 방법은 에스트로겐을 투여하여 결핍된 에스트로겐을 보충해 주는 것으로 알려져 있다.

또한, 폐경기의 여성에서 발생 빈도가 높은 심장혈관의 아테롬성 동맥경화증 (atherosclerosis)에 대한 감수성은 혈중의 에스트로겐 농도를 높이는 것에 의해 효과적으로 저감시킬 수가 있는 것으로 보고되어 있다(Stout D.W., 1982).

합병증을 갖는 아테롬성 동맥경화증은 혈중 에스트로겐 농도의 감소와 난소 기능의 감소 또는 상실로 인해 폐경기의 여성에게서 발생 빈도가 높으며, 서구에서는 에스트로겐을 이용한 장기간에 걸친 호르몬요법이 광범위하게 이용되고 있고, 많은 임상 연구결과들도 에스트로겐의 긍정적인 효과를 보고하고 있다 (MyasnikovL.A., 1961; Kraznai I., 1963; Patrono V., 1972). 또한, 심장의 아테롬성 동맥경화증이 합병증으로 된 심근경색 질환을 가진 50~70세 남성의 치료에서도 상기와 같은 양호한 결과가 얻어졌음이 보고된 바 있다(Statut R.U., 1985).

또한, 에스트로겐은 자가면역 질환, 예컨대, 류마토이드 관절염 등에 대해 완화 효과를 갖는 것으로 알려져 있으며(Chander ＆ Spector; 50:139), T 세포 기능에 대해서는 억제 역할을 하지만 B 세포에 대해서는 면역 자극 효과를 가지므로 T 세포 기능의 저해를 통해 류마토이드 관절염, 다경화증, 길랭-바레(Guillan-Barre) 증후군, 하시모토 갑상선염을 포함하는 활성화된 T 세포와 관련된 질환의 예방 및 치료에 유용할 것으로 기대되고 있고(Holmadahl, J. 2:651 (1989)), 자가면역-매개성 질환과 관련된 면역의 연쇄증폭반응(cascade)의 저해에 의해 이러한 질환의 예방 역할도 하는 것으로 믿어지고 있다.

또한, 에스트로겐은 에스트로겐 보충요법이 담즙산 합성에 의해 여성에서의 결장직장암의 위험을 감소시키는 것으로 보고되어 있으며, 최근들어 서구에서의 여성결장직장암의 사망율 감소는 폐경 후 에스트로겐 보충요법이 광범위하게 사용된 결과인 것으로 믿어지고 있다(Mayer, Chapter 92, in , 14th ed., 1998).

상기한 사항 외에도, 에스트로겐은 생체 외 및 생체 내에서 내피 세포의 성장을 가속화하는 것으로 보고되어 있다(Morales, D.E., 91:755-63(1995); Krasinski, K., 95:1768-72(1997)). 즉, 에스트로겐은 혈관 상해 후 신속한 재내피세포증식(reendothelialization)을 유도한다.

전술한 바와 같이, 에스트로겐은 여성의 비뇨생식계통 뿐만 아니라, 뼈조직, 심장, 혈관, 중추신경계, 피부 조직 등 다양한 조직의 기능을 보호하는 작용이 탁월하기 때문에, 현재 폐경기 증상에 대한 가장 효과적인 예방 및 치료 방법으로서는 호르몬 대체요법(hormone replacement therapy; HRT)이 널리 사용되어 오고 있으며(Lobo RA ＆ Speroff L. FertilSteril 61: 592-595, 1994), 이는 폐경기 증상의 원인이 에스트로겐의 분비 감소에서 기인함에 착안하여 합성 에스트로겐, 또는 합성 에스트로겐과 합성 프로게스테론의 혼합물을 인위적으로 투여하는 방법이다.

임상적으로는 무월경이나 월경이상의 치료, 월경의 인위적 이동, 갱년기장애, 전립선암이나 유방암에 대한 호르몬 요법, 골다공증 등에 대해 적용되고 있다. 또한, 경구피임약은 황체호르몬과 에스트로겐으로 이루어진다. 또한, 배란 유발제인 클롬펜이나 유방암 치료에 쓰이는 타목시펜은 비스테로이드성 항(抗)에스트로겐이다. 이러한 합성 에스트로겐 호르몬 제제의 투여는 정제 형태로 경구 투여하거나 피부에 접착시키는 패취형 또는 국소적 적용을 위한 크림제 등의 형태로 적용되고 있다.

그러나, 합성 에스트로겐의 장기간에 걸친 투여는 유방암과 자궁암을 유발할 수 있다는 심각한 문제점을 갖고 있는 것으로 많은 연구 결과는 보고하고 있다(예컨대, Hunt K etal, Br J Obstet Gynaecol 94:620-635, 1987; Ravnikar VA. Women's Health Issues 2:75-82, 1992). 최근 들어서는 장기간에 걸친 합성 에스트로겐 대체 요법이 유방암을 유발할 가능성이 높다는 믿을 만한 주장이 다수 제기되면서 학자들 간에는 물론, 사회 전반에 걸쳐 논란이 가열되고 있다. 아직 확실히 증명된 것은 아니지만, 합성 에스트로겐 대체 요법을 받는 여성에 있어서의 유방암 발생 위험은 시간 경과에 따른 에스트로겐 노출 용량과 관련이 있는 것으로 믿어지고 있다.

따라서, 상기한 호르몬 대체 요법에 사용되는 합성 에스트로겐의 보다 안전한 대체물로서 식물성 에스트로겐인 피토에스트로겐(phytoestrogen)을 찾고자 하는 연구가 최근 활발히 진행되고 있는 추세에 있다.

상기한 피토에스트로겐은 동물의 체내에서 에스트로겐성 효과를 발휘하는 식물 중에 존재하는 비스테로이드성 화합물을 지칭하며, 항암 작용과 심장병에 효과가 있는 것으로 알려져 있는 곡물, 과일, 채소들의 대부분은 피토에스트로겐을 미량 포함하고 있으며, 특히 콩을 포함한 콩 가공식품(두유, 두부, 된장 등)과 각종 곡류나 과일류, 알팔파, 클로버 등에 상대적으로 많이 포함되어 있다. 이소플라본의 경우에는 주로 콩과 식물에, 리그난의 경우에는 주로 곡류에 많이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

상기한 식물성 에스트로겐의 활성효과는 체내에서 생성되는 내인성 에스트로겐에 비해 1/100~1/1000에 불과하지만, 그 함유량은 훨씬 크므로 결과적으로 충분한 에스트로겐 효과를 얻을 수 있다. 식물성 에스트로겐의 대표적인 활성으로는 골소실을 방지하고 골밀도를 증가시키는 효과와 폐경 여성에게 투여 시 FSH와 LH의 감소 및 폐경기 증상의 완화에 효과가 있다고 알려져 있으며, 이소플라본 중 하나인 제니스테인(genistein)은 세포의 단백질 타이로신 인산화효소(proteintyrosine kinase)를 억제하여 암세포의 성장을 억제하는 항암효과가 있음이 보고된 바 있다.

따라서, 폐경기 여성에서의 골다공증의 예방과 치료에 사용될 수 있음은 물론, LDL(low density lipid)을 낮추고 HDL(high density lipid)을 높이며, 자궁내막과 유방에서는 항암효과를 보이는 에스트로겐 작용제 또는 길항제로 역할을 함과 아울러, 피부 개선, 대장암 예방, 자가면역성 질환의 예방 등에 효과적이면서도 안전하게 사용할 수 있는, 폐경기 증상의 예방 및 치료를 위한 건강기능식품 또는 치료제로서 이용할 수 있는 효과적인 식물성 에스트로겐에 대한 요청이 급격히 증대되고 있다.

이러한 요청에 부응하여, 현재 식품 및 의약품 산업계에서는 천연자원 중에서 에스트로겐의 생리활성을 가지면서도, 유방암이나 자궁암 등을 유발하지 않음은 물론, 내분비계 장애 물질로서 작용하지 않는 안전한 천연호르몬 대체 식물을 찾고자 광범위한 노력을 지속하고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 갱년기 또는 폐경기 여성에 있어서의 갱년기 또는 폐경기 증상을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 건강기능식품의 공업적 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

삭제

이하, 본 발명에 관하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 갱년기 또는 폐경기 여성에 대한 천연 에스트로겐 공급원으로서의 석류씨 추출물을 주성분으로서 포함하는 건강기능식품의 공업적 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 제조방법에 있어서는 주원료로써 석류씨를 이용한다. 본 발명에 있어서 석류씨의 종류에는 특별한 제한은 없지만, 바람직하게는 흑석류씨이며, 구체적으로는 이란산 흑석류씨를 들 수 있다. 구체적으로는 색도계 측정시 명도(L)값이 57~60의 범위, 색상(a)값이 10~13의 범위, 채도(b)값이 20~23의 범위이다.

상기한 흑석류씨의 일반 성분은 수분 6.0~7.0%, 조지방 7.9~8.5%, 조단백질 11~15%, 조회분 1.4~2.0%, 탄수화물 81~88%의 범위이다.

본 발명의 제조방법에 따라 추출되는 석류씨 농축물은 피토에스트로겐을 상당량 포함하고 있으며, 구체적으로는 카테킨 1.3~2.5ppm, 다이드제인 22~35ppm, 제니스테인 0.25~0.42ppm, 쿠에르세틴 9.0~16.7ppm, 17β-에스트라디올 0.1~0.3ppm 및 2,3-디-MeO-에스트라디올 0.01~0.10ppm을 포함한다.

본 발명의 제조방법에 따른 석류씨 농축물은 트레오닌, 발린, 메티오닌, 이소류신, 류신, 페닐알라닌, 리신의 필수 아미노산을 비롯하여 아스팔트산, 세린, 프롤린, 글리신, 알라닌, 티로신, 알지닌을 포함한다. 다량 함유되어 있는 아미노산은 글리신, 류신, 아스팔트산, 알지닌이고, 글루타민산, 시스테인, 히스티딘, 트립토판은 검출되지 않았다.

또한, 수용성 비타민으로서는 티아민(비타민 B₁), 리보플라빈(비타민 B₂), 아스콜빈산(비타민 C), 니아신, 비타민 B₆를 포함한다.

지방산은 올레인산(18:1)이 6.3~7.1%, 리놀레인산(18:2)이 13.1~14.5%, 리놀레닌산(18:3)이 58~62%로서 불포화 지방산이 약84.6%, 팔미틴산(16:0)이 8.0~8.8% 및 스테아린산(18:0)이 8.0~8.2%로서 포화 지방산이 약16.4% 정도이다.

유리당은 포도당이 6.0~7.2mg/100g, 서당이 7.2~8.2mg/100g의 범위로서 다른 당은 검출되지 않는다.

유기산은 시트르산이 4.2~4.7g/L, 말레인산이 0.4~0.6g/L, 타르탈산이 0.2~0.5g/L, 숙신산이 0.3~0.5g/L, 옥살산이 0.03~0.07g/L의 범위이다.

페놀화합물의 총량은 5.8~6.5mg/g의 범위이고, 이 중에서 플라보노이드류의 함량은 3.00~3.40mg/g의 범위이다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조되는 피토에스트로겐 함유 건강기능식품은 조성물 전 중량 기준으로 상기한 석류씨 농축 추출물을 0.1~99중량% 포함하며, 바람직하게는 3~70중량%, 더욱 바람직하게는 5~50중량% 포함한다. 가장 바람직하게는, 정제 또는 과립 형태인 경우에는 35~45중량%이며, 액제 형태인 경우에는 5~15중량%이다.

또한, 선택적으로, 본 발명의 피토에스트로겐 함유 건강기능식품의 제조방법에 따르면 칡 및/또는 대두 유래의 피토에스트로겐인 이소플라본을 조성물 전 중량 기준으로 각각 0.1~5.0중량% 포함시킬 수도 있다.

본 발명의 제조방법에 따르면, 피부 개선 및 뼈와 연골 조직의 활성화에 도움이 되는 키토올리고당 또는 연골 유래의 글루코오스아민을 0.1~8.0중량% 함유시킬 수도 있다.

또한, 필요에 따라 비타민 E, 비타민 C, 니코틴산아미드, 리보플라빈 등과 같은 비타민류를 0.01~4중량% 포함시킬 수도 있다.

피토에스트로겐 함유 건강기능식품을 정제나 과립제, 또는 캡슐제 등의 고형 제제 형태로 제조하는 경우에는, 콜라겐 및/또는 뮤코다당을 포함시킬 수도 있으며, 이 경우 함유량은 전 조성물 중량 기준으로 각각 2.5~5.0중량% 및 5.0~10.0중량%의 범위이다.

본 발명의 제조방법에 따른 피토에스트로겐 함유 건강기능식품은 습식 조립법 또는 건식 조립법에 의해 롤러 컴팩터(Roller compactor)를 이용하는 컴팩팅법 또는 강타법 등에 의해 과립 또는 통상적인 정제 형태로 제형화된다.

통상적으로, 정제의 제조에 있어서 주성분 이외의 첨가물은 모두 첨가제 또는 부형제라 통칭되며, 보다 자세하게 분류하면, 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제 등으로 나눌 수 있다.

부형제는 정제에 관한 경험, 비용, 주성분과의 적합성 등을 고려하여 선택되며, 보통 정제에 일정한 부피를 주고 타정성을 좋게 할 목적으로 사용된다. 적합한 부형제의 예로서는, 유당, 라올린(Raolin), 만니톨, 전분, 분말 백당, 인산칼슘, 미결정 셀룰로오스, 콜로이드성 실리카 등을 들 수 있으나, 본 발명에 있어서 특히 바람직한 부형제로서는 유당을 들 수 있으며, 그 함량은 전 조성물 중량 기준으로 10~25중량%의 범위이다.

결합제는 과립 상호간의 부착성을 향상시키는 외에, 압축된 다음 정제의 형태를 유지하는 작용을 한다. 결합제의 양은 가하는 사람의 경험, 다른 성분의 성질 등에 따라 결정되며, 그 양이 너무 적으면 결합능이 부족하게 되고 너무 많으면 지나치게 굳어지게 되므로 정제의 붕해 및 용출 속도가 늦어지게 된다. 바람직한 결합제의 종류 및 첨가량에 대하여 언급하면, 옥수수 전분 현탁액, 포도당 용액, 말토오스, 천연 검(gum), 셀룰로오스 유도체(메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 미결정셀룰로오스), 젤라틴, 포비돈, 콜라겐, 뮤코다당 등을 들 수 있으며, 본 발명에 있어서 바람직한 결합제로서는 피부 개선 효과 및 연골 강화 효능이 있는 콜라겐 또는 뮤코다당이며, 그 비율은 전술한 바와 같다.

활택제는 호퍼로부터 타정기의 다이(die)로의 유동 개선, 펀치나 다이에의 부착 방지, 타정기에서 정제를 인출할 때의 저항 감소, 정제에의 광택 부여 등과 같은 효과를 가져온다. 바람직한 활택제의 예로서는, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 스테아린산, 칼슘 스테아레이트, 발연 실리콘 이산화물 등을 들 수 있다. 특히 바람직한 활택제로는 썬 액티브철 및 알긴산 나트륨을 들 수 있고, 활택제의 양이 너무 많아지면 정제의 붕해와 용출을 지연시키므로, 본 발명에 있어서는 적어도 1종의 상기한 활택제를 총 정제함량에 대하여 0.1~0.5중량%의 비율로 사용하는 것이 좋다.

붕해제는 수분과 접촉시 팽창하여 위장관 내에서 정제를 붕괴시키는 효과를 가져오며, 바람직한 붕해제의 예로서는 앞서 결합제 및 부형제로서 언급한 것들을 들 수 있다.

부형제, 결합제 및 붕해제는 일반적으로 성분 간의 상호 관계 등을 고려하여 적절히 조합되며, 결합제로서의 목적으로 첨가한 것이 다른 부형제와의 상호 작용에 의하여 오히려 붕해제로서의 작용을 하는 경우도 있고, 그 반대의 경우도 있으므로 이들 간의 엄격한 구별은 절대적인 것이 아니며, 오히려 상대적이다.

상기한 정제나 과립, 캡슐제의 고형 제제 형태인 경우에는 석류 농축 과즙의 중량 기준으로 500mg, 750mg, 1000mg 제형으로 제조할 수 있으며, 750mg 제형의 경우에는 1일 6~12개의 정제를 경구 섭취한다.

한편, 본 발명의 제조방법에 따른 피토에스트로겐 함유 건강기능식품이 액제 형태인 경우에는, 안정화된 교질 용액을 형성시키기 위하여 폴리덱스트로오스를 전 조성물 중량 기준으로 3~10중량% 첨가하는 것이 바람직하다.

글루코오스아민과 전술한 비타민류를 전술한 바와 같은 양으로 포함시킬 수 있음은 물론이다.

그 외 나머지 잔부는 대부분 정제수이다.

상기한 액제 형태인 경우에는 50㎖ 또는 100㎖ 용량으로 진공 포장 팩을 1일 1~2포 경구 섭취할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 석류씨 유래 피토에스트로겐 함유 건강기능식품의 제조방법에 관하여 도 1의 블록 흐름도를 참조하여 구체적으로 설명하기로 한다.

삭제

입고된 석류씨, 바람직하게는 흑석류씨에 대한 외관 검사를 수행하여 불량한 것을 제외시키는 선별, 정선 공정을 수행한다. 이 때, 색도계로 측정하여 명도(L)값이 57~60의 범위, 색상(a)값이 10~13의 범위, 채도(b)값이 20~23의 범위 내인 것만을 선택하여 사용한다.

본 발명에 따르면, 정선된 석류씨로부터의 추출 효율을 높이기 위하여 석류씨를 열처리한다(전처리 단계로서의 열처리 단계).

이러한 열처리 단계는 160~250℃의 온도에서 5~40분간, 바람직하게는 180~200℃의 온도에서 15~25분간 볶음 처리를 수행하거나, 또는 마이크로파 오븐(전자레인지)을 이용하여 2450MHz(파장 12cm)의 마이크로파를 1~15분간, 바람직하게는 8~12분간 조사한다.

이어서, 석류씨를 분쇄기로 분쇄한다(분쇄단계). 상기한 전자레인지를 이용한 마이크로파 조사는 석류씨 분체에 대하여 수행할 수도 있으며, 분쇄 전 및 후에 각각 수행할 수도 있다.

분쇄의 정도는 필요에 따라 선택될 수 있는 사항에 불과하나, 본 발명에 있어서는 일반적으로 20~100메시, 바람직하게는 25~60메시, 더욱 바람직하게는 40~50메시 정도이다.

분쇄기에서 분쇄된 석류씨 분체(粉體)를 추출기에 도입하고, 물, 메탄올, 에탄올, n-헥산, 에틸아세테이트, 또는 이들의 임의의 혼합물을 가한다(추출용매 혼합단계).

상기한 용매 중에서 바람직한 것은 잔류하여 인체에 섭취될 가능성을 고려할 때, 물, 에탄올, 또는 이들의 혼합용매이며, 추출 효율도 함께 고려할 때 더욱 바람직하게는 70~90%의 에탄올이며, 가장 바람직하게는 80% 에탄올이다.

선택적으로는, 추출에 앞선 전처리 단계로서 추출용매 혼합단계 후에, 추출 효율을 높이기 위하여 초음파 발생기를 이용하여 진동에 의한 세포벽 파쇄조작을 더욱 수행할 수도 있으며, 이 조작은 40~55℃의 온도에서 10~120분간, 바람직하게는 30~90분간 초음파를 조사하는 것으로 수행된다(초음파조사단계). 상기한 초음파 발생기는 후술하는 추출기에 장착시켜 사용하는 것이 공정 효율성을 높임에 있어 보다 바람직하다.

상기한 추출용매 혼합단계 또는 초음파 처리단계에 이어서, 본격적인 추출 처리가 수행된다(추출단계). 추출 온도는 50~90℃의 범위이며, 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하는 경우에는 55~65℃, 순수한 물을 사용하는 경우에는 75~95℃의 범위이며, 추출 시간은 3~20시간의 범위이다.

상기한 추출기는 외부에 워터자켓이 설치되고 온도 컨트롤러가 장착되며, 선택적으로는 초음파 발생기를 설치할 수도 있다.

각각의 추출기에서의 추출 조작은 3~5회 정도 추출 단계를 반복하는 것이 수율 증대 및 경제성 측면에서 바람직하다. 상기한 추출기는 적어도 1개 이상, 바람직하게는 추출 효율성을 높이기 위하여 복수개의 추출기를 연결하여 사용하는 것이다.

본 발명의 제조방법에 있어서 바람직한 일례는 적어도 2개 이상의 추출기를 병렬로 설치하고, 석류씨 분체를 제1 추출기에 장입한 후, 약 3~10 배수, 바람직하게는 약 3~7 배수, 더욱 바람직하게는 약 5배수의 80% 에탄올을 가하고 55~65℃의 온도에서 4~6시간 추출하고(제1 추출단계) 추출액을 저장 탱크 또는 가수분해조로 이송시킨 다음, 다시 약 1~5 배수, 바람직하게는 약 3배수의 80% 에탄올을 가하고 55~65℃의 온도에서 4~6시간 추출하고(제2 추출단계) 추출액을 저장 탱크 또는 가수분해조로 이송시킨 후, 다시 약 1~5 배수, 바람직하게는 약 3배수의 정제수를 가하고 75~85℃의 온도에서 3~5시간 추출하고(제3 추출단계) 추출액을 저장 탱크 또는 가수분해조로 이송시킨다. 제2, 제3...의 추출기도 각각 동시에, 또는 일정한 시간 간격을 두고 독립적으로 상기한 추출 조작을 수행할 수 있다.

이와 같은 병렬 처리에 의해 추출 조작이 완료된 각각의 추출기의 내부 청소 및 새로운 원료의 도입 등에 따른 래그(lag) 타임으로 연속 조작이 중단됨이 없이 수행하는 것이 가능하게 되므로 공정 효율성 제고 측면에서 보다 바람직할 수 있다.

상기한 추출기로부터 저장 탱크 또는 가수분해조로의 추출액 이송시에는 그 경로에 포어 사이즈 5~25㎛의 필터, 바람직하게는 약 10㎛의 필터를 설치하여 추출액 중의 섬유질 들과 같은 상대적으로 큰 고형물을 여과 제거할 수 있다(선택적 단계로서의 여과 단계).

이어서, 황산 또는 글루큐론산과의 포합 형태로 존재하는 에스트로겐을 비포합 형태의 생체 이용성이 높은 에스트로겐으로 가수분해하기 위하여 HCl을 가하여 추출액의 HCl 농도를 0.1~0.5M 농도가 되게 한 후, 약 75~85℃의 열수조에 1~3 시간 동안 정치 또는 교반하는 단계를 더욱 수행한다(HCl 가수분해 단계).

상기한 저장 탱크 또는 가수분해조로부터 농축기로의 추출액 이송시에는 그 경로에 포어 사이즈 5~25㎛의 필터, 바람직하게는 약 10㎛의 필터를 설치하여 여과 처리를 수행할 수 있다(선택적 단계로서의 여과 단계).

상기한 여과 단계에 후속하여, 농축기를 이용하여 농축을 수행한다(농축 단계).

상기한 농축 처리는 전술한 제1, 제2, 제3 ... 추출 단계에서 추출된 추출액을 한데 모아 35~65℃의 온도 범위에서 1~6시간 정도 정치 또는 교반하는 것에 의해 수행될 수도 있다.

그러나, 농축 효율성을 높이기 위하여 물과 에탄올의 혼합용매를 사용한 경우에는 35~45℃의 온도에서 1~3시간 정도, 바람직하게는 약 40℃의 온도에서 약 2시간 정도, 물 만을 사용한 경우에는 50~70℃의 온도에서 1~3시간 정도, 바람직하게는 55~60℃의 온도에서 약 2시간 정도 농축 처리를 수행하는 바와 같이, 각각의 추출 단계에서 추출된 추출액을 즉시 개별적으로 농축시킨 다음 후속하는 혼합단계에서 균질하게 혼합시킬 수도 있다.

상기한 농축 단계에서의 농축은 32~40Brix 정도, 바람직하게는 34~38Brix 정도로 농축을 수행한다.

사용된 에틸알코올은 추출기 및 농축기로부터 회수하여 정제 및 농축 후 재사용하였으며, 에틸알코올의 회수율은 약 88~91% 정도이다.

이와같이 농축된 석류씨 추출물은 점도 컨트롤러가 부착된 혼합기를 이용하여 칡이나 대두의 이소플라본, 키토올리고당, 글루코오스아민, 또는 폴리덱스트로오스와, 필요에 따른 비타민 E, 비타민 C, 니코틴산아미드, 리보플라빈 등과 같은 비타민류 등과 혼합된 다음(혼합단계), 정제나 액제 등의 형태로 제조된다.

한편, 상기한 농축단계와 혼합단계 중간에, 선택적인 단계로서 황산 또는 글루큐론산과의 포합 형태로 존재하는 에스트로겐을 비포합 형태의 생체 이용성이 높은 에스트로겐으로 가수분해하기 위하여 인큐베이터로서의 효소가수분해조를 이용하여 효소처리를 수행할 수도 있으며(효소처리단계), 효소 처리 후에는 다시 농축시키게 된다(농축 단계).

상기한 효소처리단계는 전술한 HCl에 의한 가수분해와 독립적으로 또는 병행하여 수행할 수 있으며, 여기서의 효소가수분해단계는 0.2M의 초산과 초산 나트륨으로 pH 5.2로 맞춘 초산완충용액을 첨가한 후, Helix pomatia 유래의 글루큐로니다제/아릴설파타제(독일, Boehringer Mannheim사 제)를 첨가하여 약38℃의 온도에서 1.5~2.5시간 정도 가수분해시키는 것으로 수행된다.

효소가수분해 처리된 추출액의 농축은 35~65℃의 온도 범위에서 약 10~60분간 처리하는 것으로 종료될 수 있다(부수농축단계).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 하나, 이는 본 발명을 예증하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1: 석류씨 농축물의 제조

명도(L)값이 58.23, 색상(a)값이 11.18 및 채도(b)값이 21.30의 색도를 갖는 이란산 흑석류씨를 분쇄기를 이용하여 평균 입도 45메시로 분쇄하였다.

흑석류씨 분체 300kg을 2500ℓ용량의 워터자켓이 설치된 추출기에 장입하였다.

이어서, 80% 에틸알코올 1500ℓ를 혼합하여 60℃의 온도에서 5시간 동안 1차 추출한 다음, 1차 추출액을 10㎛의 포어 사이즈를 갖는 여과기를 경유하여 저장탱크로 이송시키고 5시간 정치시킨 후, 다시 10㎛의 포어 사이즈를 갖는 여과기를 경유하여 농축기로 이송시키고 40℃의 온도에서 약 2시간 동안 36Brix로 농축하였다.

상기한 1차 추출 후, 다시 80% 에틸알코올 900ℓ를 혼합하여 60℃의 온도에서 5시간 동안 2차 추출한 다음, 2차 추출액을 10㎛의 포어 사이즈를 갖는 여과기를 경유하여 저장탱크로 이송시키고 5시간 정치시킨 후, 다시 10㎛의 포어 사이즈를 갖는 여과기를 경유하여 농축기로 이송시키고 40℃의 온도에서 약 2시간 동안 36Brix로 농축하였다.

상기한 2차 추출 후, 다시 정제수 900ℓ를 혼합하여 80℃의 온도에서 4시간 동안 3차 추출한 다음, 3차 추출액을 10㎛의 포어 사이즈를 갖는 여과기를 경유하여 저장탱크로 이송시키고 5시간 정치시킨 후, 다시 10㎛의 포어 사이즈를 갖는 여과기를 경유하여 농축기로 이송시키고 55~60℃의 온도에서 약 3시간 동안 36Brix로 농축하였다.

사용된 에틸알코올은 회수 후 다시 정제하여 재사용하였다. 추출기 및 농축기로부터 80% 에틸알코올 약 1620ℓ, 50% 에틸알코올 약 540ℓ, 24% 에틸알코올 약 180ℓ, 8% 에틸알코올 약 180ℓ를 회수하였으며, 에틸알코올의 회수율은 약 89.6%였다.

혼합기에서 상기한 1차, 2차 및 3차 추출 농축물을 균질하게 혼합하였으며, 농축 추출 혼합물의 총량은 약 57kg이었다(수율 약 19%).

실시예 2: 석류씨 농축물의 제조

실시예 1에서 1차 추출에 앞서, 용매를 50℃로 승온시켜 유지하면서 추출기에 부착된 초음파 발생기(Ultrasonic Cleaner: BRANSON 8210, BRANSON ULTRASONICS, USA)로 60분간 초음파를 조사하는 전처리 단계로서의 초음파 조사단계를 수행한 것을 제외하고는, 실시예 1과 본질적으로 동일한 절차를 반복하였다.

농축 추출 혼합물의 총량은 약 64.2kg이었다(수율 약 21.4%).

실시예 3: 석류씨 농축물의 제조

실시예 1에서의 분쇄 단계에 앞서, 석류씨를 190℃에서 20분간 볶음 처리를 수행한 것을 제외하고는, 실시예 1과 본질적으로 동일한 절차를 반복하였다.

농축 추출 혼합물의 총량은 약 59.1kg이었다(수율 약 19.7%).

실시예 4: 석류씨 농축물의 제조

실시예 1에서의 분쇄 단계에 이어서, 석류씨 분체에 10분간 마이크로파를 조사(RE-2755, SAMSUNG, KOREA)한 것을 제외하고는, 실시예 1과 본질적으로 동일한 절차를 반복하였다.

농축 추출 혼합물의 총량은 약 62.4kg이었다(수율 약 20.8%).

실시예 5: 석류씨 농축물의 제조

실시예 1에서의 흑석류씨를 분쇄기를 이용하여 평균 입도 45메시로 분쇄한 다음, 흑석류씨 분체 300kg을 2500ℓ용량의 워터자켓이 설치된 추출기에 장입하였다.

이어서, 80% 에틸알코올 1500ℓ를 혼합하여 60℃의 온도에서 5시간 동안 1차 추출한 다음, 1차 추출액을 10㎛의 포어 사이즈를 갖는 여과기를 경유하여 저장탱크로 이송시키고, 다시 80% 에틸알코올 900ℓ를 혼합하여 60℃의 온도에서 5시간 동안 2차 추출한 다음, 2차 추출액을 10㎛의 포어 사이즈를 갖는 여과기를 경유하여 저장탱크로 이송시킨 후, 다시 정제수 900ℓ를 혼합하여 80℃의 온도에서 4시간 동안 3차 추출한 다음, 3차 추출액을 10㎛의 포어 사이즈를 갖는 여과기를 경유하여 저장탱크로 이송시켰다.

저장탱크 중의 1차, 2차 및 3차 추출액을 10㎛의 포어 사이즈를 갖는 여과기를 경유하여 농축기(가수분해조)로 이송시키고, 황산 또는 글루큐론산과의 포합 형태로 존재하는 에스트로겐을 비포합 형태의 생체 이용성이 높은 에스트로겐으로 가수분해하기 위하여 추출액의 HCl 농도가 0.2M 농도가 되도록 HCl을 가한 후, 약 80 ℃의 온도에서 2시간 동안 온화하게 교반하는 HCl 가수분해단계를 수행하였다.

HCl 가수분해단계 종료 후, 3시간 동안 정치한 다음, 55℃의 온도에서 3시간 동안에 걸쳐 36Brix로 농축하였다.

농축 추출 혼합물의 총량은 약 57.1kg이었다(수율 약 19%).

실시예 6: 석류씨 농축물의 제조

실시예 1에서 얻은 농축물에 0.2M의 초산과 초산 나트륨으로 pH 5.2로 맞춘 초산완충용액을 첨가한 후, Helix pomatia 유래의 글루큐로니다제/아릴설파타제(독일, Boehringer Mannheim사 제)를 시료 ℓ당 15000유니트로 제조하여 시료량의 2배량으로 첨가하고 약38℃의 온도에서 2시간 가수분해시켰다.

효소가수분해 처리된 추출액을 45℃의 온도 범위에서 약 15분간 다시 농축하는 부수농축단계를 수행하였다.

농축 추출 혼합물의 총량은 약 57kg이었다(수율 약 19%).

실시예 7~9 : 정제의 제조

실시예 2, 5 및 6에서 얻은 농축물을 이용하여 하기와 같은 배합비(중량%)로 제형화한 정제를 제조하였다:

조성성분	실시예 7	실시예 8	실시예 9
흑석류 농축물	40.0	38.0	42.0
글루코오스아민	5.0	6.0	4.5
콜라겐	3.5	4.0	3.0
뮤코다당	7.5	8.0	7.0
키토산올리고당	-	-	0.5
비타민 E(분체)	2.5	3.0	2.0
리보플라빈	0.5	0.3	0.8
알긴산나트륨	0.3	0.5	0.1
썬 액티브철	0.2	0.2	0.2
유당	20.0	18.0	19.0
이소플라본	2.5	3.5	4.0
카르복시메틸셀룰로오스	15.0	14.0	13.0
포도당	3.3	5.0	3.4
합계	100.0	100.0	100.0

실시예 10 : 액제의 제조

실시예 2에서 얻은 농축물을 이용하여 하기의 표 2에 나타낸 바와 같은 배합비(중량%)로 제형화한 50㎖ 용량의 액제팩을 제조하였다:

조성성분	실시예 10
흑석류 농축물	10.0
글루코오스아민	1.2
폴리덱스트로오스	6.2
비타민 C	0.5
솔비톨	3.0
니코틴산아미드	0.01
정제수	잔부
합계	100.0

실험예 1 내지 3과 비교예 1 및 2: 피토에스트로겐 분석

실시예 2, 5 및 6에서 얻은 흑석류 농축물과 비교예 1 및 2로서 대두 및 칡뿌리 농축물에 대하여 피토에스트로겐 분석을 수행하였다.

사용된 피토에스트로겐 표준품은 플라본, 헥사에스트롤, DES, 에쿠올, 크리신, 엔터로락톤, α-지랄라놀, 지랄라논, 17-β-에스트라디올, 바이오카닌-A, 카테킨, α-지랄에놀, β-지랄에놀, 다이드제인, 제니스테인, 카엠프페롤, 에피제님, 쿼르세틴의 20종이고, 에스트로겐류는 에스트론, 17-β-에스트라디올, 2-하이드록시에스트론, 2-하이드록시에스트라디올, 6-α-디하이드로에스트론, 6-α-하이드록시에스트라디올, 4-메톡시에스트라디올, 에스트리올, 16-에피에스트리올, 16,17-에피스트리올, 16-α-2-하이드록시에스트론, 17-에피에스트리올, 6-케토에스트리올, 2-메톡시에스트리올, 6-하이드록시에스트리올 및 16-케토에스트라디올의 16종이었으며, 내부 표준 물질은 d4-17β-에스트라디올로써 모두 Sigma사 미국 특급 시약을 사용하였다.

표준 용액은 0.01g을 정확히 칭량한 다음, 메탄올로 1000ppm이 되게 만든 후 10배 희석한 것을 냉장 보관하여 사용하였다.

유도체화 시약은 MSTFA(N-메틸-N-트리메틸실릴트리츨루오로아세트아미드)와 트리메틸클로로실란(TMCS)을 구입하여 STRA와 TMCS를 100:1(v/v)의 비율로 섞은 혼합 용액을 사용하였다.

Serdolit AD-2 수지(100-200 미크론)은 Serve사(독일)로부터 구입하였다.

시료의 전처리와 분석 방법은 Chung 등의 방법을 참고하였다. 즉, 메탄올로 추출한 25mg의 시료에 내부 표준 d4-17β-에스트라디올 10㎍/㎖을 넣고 55℃에서 3시간 가수분해시킨 후 MSTFA/TMSC의 100:1 혼합물 50㎕을 가하고 60℃에서 30분간 반응시켜 TMS 에스터 유도체를 만든 후 이를 GC/MS에 2㎕ 주입하였다. 유도체화시켜 GC/MS에 주입하였다. 사용한 분석 기기는 Hwelette-Packard 5890 PIUS 가스 크로마토그라피에 디렉트 인터페이스로 연결된 5970 매스 셀렉티브 디텍터(MSD)를 사용하였다. 분리관은 울트라-2(길이 25mm, 내경 0.20mm, 필름 두께 0.33㎛를 사용하였으며, 분리관의 온도는 180℃에서 260℃까지 20℃/min으로 올리고 300℃까지 상승시켜 10분간 유지시켰다. 주입기의 온도는 300℃, 검출기의 온도는 300℃ 이동상 기체 헬륨의 유속은 0.85㎖/min 그리고 주입 방법은 스플리트 모드(비율 1:12)로 설정하였다. 이온화에 사용한 전자 에너지는 70eV였고 전처리된 시료들을 분석하기 위해 질량 스펙트럼상의 특성 이온만을 선택하여 검출하는 셀렉티드 이오 모니터링(SIM)방법을 이용하였다.

결과를 하기의 표 3에 나타낸다(단위는 ppm).

조성	실험예 1- 실시예 2 의 농축물	실험예 2 - 실시예 5의 농축물	실험예 3- 실시예 6 의 농축물	비교예 1(대두)	비교예 2(칡뿌리)
에쿠올	불검출	불검출	불검출	불검출	0.63
바이오카닌-A	불검출	불검출	불검출	0.66	0.65
캬테킨	1.48	1.79	2.38	불검출	불검출
다이드제인	23.72	26.5	32.38	745.46	51.15
제니스테인	0.29	0.31	0.35	3.48	0.31
아피제닌	불검출	불검출	불검출	35.33	불검출
쿠에르세틴	9.75	10.6	14.1	불검출	불검출
17β-에스트라디올	0.15	0.17	0.23	불검출	불검출
2,3-디-MeO-에스트라디올	0.04	0.05	0.08	불검출	불검출

실험예 4 : 폴리페놀 및 플라보이드의 정량 분석

실시예 1에서 얻은 흑석류 농축물에 대하여 다음과 같은 방법으로 폴리페놀류 및 플라보이드류의 정량분석을 수행하였으며 실험예 4로 하였다.

시료의 총페놀 함량은 페놀성물질이 포스포몰리브덴산(phosphomolybdic acid)과 반응하여 청색을 나타내는 것을 이용한 폴린-덴스(Folin-Dens)법으로 측정하였다. 이 방법은 시료 추출 용액 50㎖를 취하여 40℃에서 진공 건조 후 80% 에탄올용액 5㎖로 정용하였다.

이 시료액 3㎖과 Folin-Dens시약 3㎖을 혼합하여 3분간 실온에서 방치한 후 Na₂CO₃용액 3㎖을 가하여 혼합한 후 실온에서 1시간 정치시킨 후 760nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준검량곡선은 타닌산(tannic acid)을 이용하여 작성하였다. 총 플라보노이드 함량은 전처리조건에 따른 시료 추출용액 10㎖을 취하여 40℃에서 진공건조 후 50% 메탄올용액 5㎖로 정용한 시료용액 1㎖과 디에틸렌글리콜 (diethylene glycol) 10㎖을 혼합하고 여기에 1 N-NaOH용액 1㎖을 가하여 잘 혼합한 후 37℃에서 1시간 반응시킨 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준검량곡선은 나린진(naringin)을 이용하여 작성하였다.

실험예 4에서 총 폴리페놀량은 6.1mg/g이고 이 중 플라보노이드류의 양은 3.15mg/g이었다.

실험예 5: 항산화 효과 측정

DPPH에 의한 수소공여능의 측정에 의한 석류씨 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위하여, 100㎖ 에탄올에 DPPH 16㎖을 용해시킨 후 증류수 100㎖을 혼합하고, 와트만 필터 여과지(Whatman Filter paper) No.2로 여과하는 것에 의하여 DPPH(α,α'-diphenyl-β-picrylhydrazyl)용액을 만들었다.

이 용액 5㎖에 일정 농도(0.05%, 0.1%)의 tlfydyddor 1㎖을 혼합한 후 5분 간격으로 528nm에서 흡광도의 감소를 측정하였다.

실시예 2의 추출물의 수소공여능을 조사한 결과, 반응전의 흡광도가 약 2분이 경과한 뒤에는 매우 낮은 0.2를 나타냈으며, 이러한 결과는 석류씨에 함유되어있는 페놀성 화합물 및 플라보노이드류가 매우 강한 항산화활성을 나타내는 물질인 것으로 판명되었다.

실시예 11: 용매 종류에 따른 석류씨 농축 효율

명도(L)값이 58.23, 색상(a)값이 11.18 및 채도(b)값이 21.30의 색도를 갖는 이란산 흑석류씨를 분쇄기를 이용하여 평균 입도 45메시로 분쇄한 후, 60℃에서 3시간 동안 단 1회만 추출한 다음 10㎛의 포어 사이즈를 갖는 필터로 여과한 후에 있어서의 여액 중 고형분 함량을 조사하였으며, 그 결과를 하기의 표 4에 나타낸다.

용매	고형분 함량(중량%)
메탄올	7.3
클로로포름	9.1
에틸 아세테이트	11.9
헥산	7.5
아세토니트릴	10.9
99.9% 에탄올	8.3
90% 에탄올	8.9
80% 에탄올	10.2
70% 에탄올	9.0

실시예 12 내지 20: 전처리에 따른 효과

전처리에 따른 석류씨에서의 피토에스트로겐 농축 효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

석류씨를 볶음온도 170℃, 190℃, 210℃에서 각각 볶음시간 10분, 20분, 30분간 처리한 다음 45메시로 분쇄하고, 각각 30mg을 취하고 80% 에탄올을 10㎖ 첨가하고 회전 진탕기(Rotary Shaker: SK-300, JEIOTECH, KOREA)로 125rpm로 20분간 진탕하였다. 이어서, 환류냉각기가 부착된 가열 멘틀(heating mentle)에서 80℃, 2시간 추출 후 와트만(Whatman) 여과지 No.5로 여과한 다음, 헥산으로 지질을 제거하고 피펫으로 5㎖씩 취하여 표지하였다(각각 실시예 12, 13 및14).

45메시로 분쇄한 석류씨 분체를 3부분으로 나누고 마이크로파 오븐(RE-2755, SAMSUNG, KOREA)에서 2450MHz(파장 12cm)의 마이크로파를 각각 2분, 4분 및 10분간 조사한 다음, 시험관에 30mg씩 각각 취하였다. 이어서 전술한 바와 동일한 절차를 반복한 다음 표지하였다(각각 실시예 15, 16 및 17).

45메시로 분쇄한 석류씨 분체 90mg에 80% 에탄올을 30㎖을 첨가하고, 45℃에서 각각 30분, 1시간, 1시간 30분, 2시간 동안 초음파 조사 처리를 수행하였다 (BRANSON 8210, BRANSON ULTRASONICS, USA). 각각의 시간 동안 초음파 처리한 시료는 전술한 바와 동일한 절차를 수행한 다음, 피펫으로 5㎖씩 취하여 표지하였다(각각 실시예 18, 19 및 20).

대조로서 상기한 전처리의 어느 것도 수행하지 않은 45메시로 분쇄된 석류씨 분체 30mg을 취하여 전술한 바와 동일한 절차 및 조건으로 처리한 다음 피펫으로 5㎖씩 취하여 표지하였다.

상기한 실시예 12 내지 20의 시료와 대조 시료에 대한 고형분 함량을 수율로서 측정함과 아울러, 실험예 4에 기재한 것과 실질적으로 동일한 절차 및 방법을 이용하여 총 폴리페놀량 및 총 플라보노이드량을 정량하였으며, 그 결과를 하기의 표 5에 나타낸다.

전처리		수율(고형분)(%)	총 폴리페놀(mg/g)	총 플라보노이드(mg/g)
볶음처리	170℃/10분	10.4	5.64	2.86
	190℃/20분	11.3	6.12	3.02
	210℃/30분	10.8	5.87	2.93
마이크로파 조사	2분	11.1	6.05	3.04
	4분	11.5	6.54	3.56
	10분	11.8	7.02	4.08
초음파 조사	30분	11.1	7.06	4.02
	60분	12.0	7.58	4.89
	120분	14.6	8.51	5.97
	180분	15.0	9.07	6.89
대조	무처리	10.2	5.58	2.78

실험예 6

안면홍조 현상을 겪고 있는 45~52세의 여성 75인을 15인씩 무작위로 2그룹으로 나누고 하나의 그룹에는 실시예 7,8,9에서 제조한 정제(흑석류 추출물 750mg/개)를 1일 9개씩 1개월간 복용하게 하고 다른 그룹에는 플레시보로써 흑석류 추출물 대신에 포도당으로 대체한 동일 형상의 정제를 1일 9개씩 1개월 복용케하고 안면홍조 현상의 완화 정도에 대하여 설문 조사하였으며, 그 결과를 하기의 표 6에 나타낸다.

	3일	1주일	2주일	3주일	1개월
실시예 7 투여군	6(1)	12(5)	14(8)	15(10)	15(11)
실시예 8 투여군	8(2)	12(7)	14(10)	15(12)	15(13)
실시예 9 투여군	12(3)	14(7)	15(11)	15(14)	15(14)
플래시보 투여군	1(0)	2(0)	1(0)	3(0)	2(0)

상기 표에서 숫자는 완화되었다고 응답한 사람의 수이며 ( )의 숫자는 홍조 현상이 없어졌다고 응답한 사람의 숫자이다.

상기한 결과로부터 본 발명의 제조방법에 따른 정제는 폐경으로 인한 안면홍조 현상의 치료 및 예방에 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 7

본 발명의 제조방법에 따른 석류씨 유래 피토에스트로겐 함유 건강기능식품의 뼈 형성 촉진 여부를 평가하기 위하여 뼈 형성에 관계된 골아세포(osteoblast) 세포주(cell line)인 ROS 17/2.8을 사용하였다.

ROS 17/2.8 세포를 페놀레드가 첨가되지 않은 10% 송치혈청(fetal bovine serum)과 1% 항생제-항균제 혼합물(100 IU페니실린, 100 mg 스트렙토마이신, 250 ng 암포테리신)을 첨가한 둘베코 변형 이글배지(Dulbecco's Modified EagleMedium)에 접종하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 세포증식은 엠티티(MTT; 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolin bromide)의 대사환원 원리를 통한 엠티티 에세이(MTT assay) 방법과 방사성 표지된 티미딘(³H-Thymidine) 방사능 활성을 통한 티미딘 편입 에세이(incorporation assay)로 측정하였다.

상기한 실시예 6에서의 추출물을 평가하였으며, 대두에서 분리한 제니스테인을 비교대조군으로, 시료 무첨가군을 대조군(control)으로 설정하여 증식정도를 비교하였다.

먼저, ROS 17/2.8 세포를 96-웰(well)에 8% 에스트로겐 결핍-FBS 배지로 세포수 2x10³ 으로 접종하고 송치혈청의 효과를 배제하기 위해 24시간 동안 0.8% 에스트로겐 결핍-송치 혈청으로 배지 조성을 바꾸어 주었으며, 2.5% 에스트로겐 결핍-송치혈청 조건 하에서 흑석류 추출물로부터의 피토에스트로겐 혼합물(실시예 6) 및 제니스테인(10^-9 및 10^-12 몰농도)로 48시간 동안 자극하였다. 각 웰(well)에 75㎕ 엠티티(1.6 ㎎/mL) 용액을 첨가하여 37℃에서 3시간동안 반응시킨 후, 디메틸슬폭사이드(dimethylsulfoxide) 75㎕를 첨가하여 세포에 형성된 포르마잔 결정체 (formazan crystal)를 용해시켰다. 흡광도는 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 540nm에서 측정하였다. 이어서, 동일 세포를 24-웰에 세포수가 1x10⁴으로 접종하고, 전술한 바와 동일하게 자극을 주었다. 자극 종결 4시간 전에 방사능 표지된 티미딘 용액을 한 웰당 1μc씩 첨가하여 37℃에서 배양하였다. 배양한 세포는 3% 트리클로로아세테이트 용액으로 침전물을 형성시킨 후, 2% 디소디움카보네이트 용액을 200㎕씩 첨가하여 용해시켰다. 베타 카운터에서 방사능 활성도를 측정하였다. 뼈 형성 촉진능은 대조군에 대한 상대치로 나타냈다.

결과를 하기의 표 7에 나타낸다.

	농도(M)
	대조군	10-12	1-9
실시예 6에서의 농축물	100	117	126
대두 제니스테인	100	113	111

상기의 표 7로부터 확인되는 바와 같이, 실시예 6에서의 피토에스트로겐 혼합물은 낮은 농도인 10^-12M에서 이미 117%의 세포 증식 효과를 나타내었으며, 생리적 농도인 10^-9M에서는 약 126%까지 증가하여 용량 의존적으로 골아세포의 증식을 촉진하였다. 대두의 제니스테인도 골아세포 증식을 최고 113% 증가시켰지만 실시예 3의 피토에스트로겐 혼합물 보다는 훨씬 낮은 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

실험예 8

본 발명의 제조방법에 따른 흑석류 추출물 함유 건강기능식품의 뼈 형성 촉진 여부를 평가하기 위하여 마우스 태아의 미분화 골아세포주인 KS483 세포를 36-웰 플레이트에 세포수 2.4×10⁴으로 접종한 후, 세포가 완전히 증식하여 밀집 상태에 달하였을 때 8% 송치 혈청 조건 하에 실험예 7과 동일한 조건으로 세포를 자극하였다. 제니스테인은 비교군으로, 시료 무첨가군은 대조군으로 설정하였다.

세포분화유도물질인 아스콜빈산(43㎍/mL), 베타-글리세로포스페이트 3mM 및 덱사메타존 5nM을 2일마다 첨가하여 3주 동안 배양하면서, 일정 시점마다 세포염색하여 분화 촉진정도를 비교하였다.

분화 유도 3주 째에는 질산은으로 본코사 염색을 하여 형성된 노듈 수를 비교하였다. 분화촉진작용은 대조군에 대한 상대치로 나타냈다.

	농도(M)
	대조군	10-12	1-9
실시예 6의 농축물	1.0	2.12±0.00	3.38±0.01
대두 제니스테인	1.0	ND	0.92±0.01

상기한 표 8의 결과로부터, 실시예 6에서의 피토에스트로겐 혼합물은 낮은 농도인 10^-12M에서 이미 2배의 세포분화촉진 효과를 나타내었으며, 생리적 농도인 10^-9M에서는 3.4배까지 증가시키는 용량-의존적인 분화촉진효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 한편, 대두의 제니스테인은 생리적 농도에서 0.9배 정도의 분화를 나타냈다.

따라서, 본 발명의 제조방법에 따른 흑석류 추출물 함유 건강기능식품은 매우 우수한 골아세포 분화효과를 갖는 것으로 판단되었다.

실험예 9

본 발명의 제조방법에 따른 흑석류 추출물 함유 건강기능식품의 골다공증 억제 효과를 평가하기 위하여, 스프라구돌리(Sprague-Dawley) 12주령의 암마우스(평균 체중 240g)를 펜토바비탈(pentobarbital) 마취 하에 양쪽 난소를 적출하고, 대조군 마우스는 가수술(sham)을 하였다. 난소를 제거하고 난 다음, 1주일 후에 마우스를 다음과 같은 3개의 그룹으로 나누었다.

실시예 9의 식이(5㎖/kg/1일)를 먹인 그룹, 에스트로겐을 주당 2회 피하 주사(50㎍/100㎕ 대두유)한 그룹, 대조 식이를 먹인 대조군으로 나누었다. 난소 제거한 4주 후에 쥐를 희생하여 뒷다리 경골(tibia)을 분리하였다.

경골은 분리 즉시, 포르말린 고정액에 넣어 보관하였다가 탈회하여 근위 골간단(proximal metaphysis) 부위를 5㎛로 횡절하였다. 골다공증의 정도는 소주골밀도(trabecular bone density), 피질골 두께(cortical bone thickness), 골수강에서 지방적이 차지하는 비율(adipocyte density)로 판정하였다. 각각의 결과를 가수술군에 대한 상대치로 나타냈으며, 그룹간의 차이는 일변량분산분석을 통해 검정하였다.

		소주골밀도	피질골두께	지방세포밀도
가수술대조군		100±1.1	100.0±8.6	100.0±5.7
난소제거군	무처리군	13.1±0.3	105.3±14.1	283.1±3.8
	실시예 9의 식이	62.1±3.6	112.5±11.2	116.8±17.4
	에스트로겐 처리	82.7±4.2	107.1±11.3	135.7±18.2

상기한 표 9로부터 확인되는 바와 같이, 난소제거 4주 후 무처리군의 경골의 소주골밀도는 가수술한 대조군의 13%까지 감소하여 심한 골다공증을 나타냈으며, 난소 제거 후 에스트로겐을 투여한 쥐의 골밀도는 대조군의 약 83%로서 골다공의 진행이 효과적으로 억제되었음을 확인할 수 있었다. 한편, 난소 제거 후 실시예 9의 식이를 먹인 마우스의 골밀도는 대조군의 62%였다. 이는 에스트로겐 보다는 낮지만 난소제거로 생기는 골다공증의 골밀도 보다 5배 이상 높은 값으로서, 본 발명의 제조방법에 따른 건강기능식품 섭취시 골다공증의 진행이 유의하게 억제될 수 있다는 가능성을 강하게 시사하는 것으로 해석되었다.

난소 제거 후 소주골이 흡수되어 골다공증이 진행됨에 따라 무처리군의 경우에는 골수 내 지방세포 밀도는 2.8배 증가하는 반면, 난소제거 후 인위적으로 에스트로겐을 피하 투여한 경우에는 골수 내 지방축적은 약 36% 정도 증가하였다. 반면에, 난소 제거 후 실시예 3의 식이를 먹인 마우스의 골수 내 지방축적 증가는 대조군의 16.8%에 그쳤다. 따라서, 이러한 결과는 본 발명의 제조방법에 따른 건강기능식품 섭취시 합성 에스트로겐 투여시의 부작용인 지방 증가 현상이 훨씬 적다는 것을 나타낸다.

실험예 10

추출물이 중추신경계에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시예 6의 추출물 3~10mg/kg을 우레탄으로 인한 혼수상태의 고양이와 모르핀-우레탄 혼수상태의 개에 정맥투여하여 급성독성 실험을 수행한 결과, 약 3분간 약한 동맥혈압의 상승(3~7%)이 있고 아드레날린의 동맥자극 효과가 약간 상승하는 경향이 있었으나, 히스타민과 아세틸콜린을 투여하면 이러한 동맥압에는 변화가 인지되지 않았다.

이러한 결과로부터, 본 발명의 제조방법에 따른 흑석류 추출물 및 이를 포함하는 건강기능식품은 급성독성을 전혀 일으키지 않음과 아울러, 중추신경계의 기능 등에도 하등의 영향을 미치지 않는다는 사실을 확인하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 석류씨로부터의 피토에스트로겐 함유 건강기능식품의 공업적 제조방법에 따르면, 피토에스트로겐을 함유하는 석류씨 추출물을 경제성있는 높은 효율로 대규모로 생산할 수가 있으며, 생산되는 석류씨 추출물 또는 이를 포함하는 건강기능식품은 우수한 에스트로겐성을 나타내면서도 부작용이 거의 없는 안전한 피토에스트로겐을 다량 함유하고 있으므로, 갱년기 또는 폐경기 여성에 있어서의 에스트로겐 결핍으로 인하여 유발될 수 있는 제반 증상을 효과적으로 예방 및 치료할 수가 있을 것으로 기대됨과 아울러, 부작용으로서의 체지방 증가 현상이 매우 낮으므로 건강기능식품으로서 뿐만 아니라, 피토에스트로겐 분리물을 생물의약으로서도 사용할 수 있을 것으로 기대되는 신규 유용한 발명이다.

도 1은 본 발명의 제조방법을 나타내는 블록 흐름도이다.

Claims (16)

1. 하기의 단계로 구성되는 피토에스트로겐 함유 건강기능식품의 공업적 제조방법:

   (A) 색도계로 측정하여 명도(L)값이 57~60의 범위, 색상(a)값이 10~13의 범위, 채도(b)값이 20~23의 범위의 석류씨를 선별하여 160~250℃의 온도에서 5~40분간 볶음 처리하는 전처리 단계;

   (B) 석류씨를 20~100메시의 크기로 분쇄하여 분체화(粉體化)시키는 분쇄단계;

   (C) 분쇄된 석류씨 분체를 추출기에 도입하고 물, 에탄올, 또는 이들의 혼합용매를 가하여 혼합하는 추출용매 혼합단계;

   (D) 50~90℃에서 3~20시간 추출하여 추출액을 생성시키는 추출단계;

   (E) HCl을 0.1~0.5M 농도가 되도록 가한 후, 약 75~85℃의 열수조에 1~3 시간 동안 정치 또는 교반하는 HCl 가수분해단계; 및

   (F) 추출액을 35~65℃의 온도 범위에서 1~6시간 정도 정치 또는 교반하여 32~40Brix로 농축하는 농축 단계.
2. 하기의 단계로 구성되는 피토에스트로겐 함유 건강기능식품의 공업적 제조방법:

   (A) 색도계로 측정하여 명도(L)값이 57~60의 범위, 색상(a)값이 10~13의 범위, 채도(b)값이 20~23의 범위의 석류씨를 20~100메시의 크기로 분쇄하여 분체화(粉體化)시키는 분쇄단계;

   (B) 분쇄된 석류씨 분체를 추출기에 도입하고 물, 에탄올, 또는 이들의 혼합용매를 가하여 혼합하는 추출용매 혼합단계;

   (C) 40~55℃의 온도에서 10~120분간 초음파를 조사하는 초음파조사단계;

   (D) 50~90℃에서 3~20시간 추출하여 추출액을 생성시키는 추출단계;

   (E) HCl을 0.1~0.5M 농도가 되도록 가한 후, 약 75~85℃의 열수조에 1~3 시간 동안 정치 또는 교반하는 HCl 가수분해단계; 및

   (F) 추출액을 35~65℃의 온도 범위에서 1~6시간 정도 정치 또는 교반하여 32~40Brix로 농축하는 농축 단계.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기한 혼합용매가 70~90% 에탄올이며, 상기한 추출단계 및 농축단계로부터 회수되어 정제된 후 재사용되는 제조방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기한 추출단계가 3내지 5회 반복 수행되는 제조방법.
5. 제1항에 있어서, 상기한 전처리 단계가 180~200℃의 온도에서 15~25분간 볶음 처리하는 것으로 이루어지는 제조방법.
6. 제1항에 있어서, 상기한 전처리 단계가 2450MHz(파장 12cm)의 마이크로파를 1~15분간 조사하는 것으로 이루어지는 제조방법.
7. 제1항에 있어서, 상기한 분쇄 단계에 후속하여 2450MHz(파장 12cm)의 마이크로파를 1~15분간 조사하는 전처리 단계를 수행하는 제조방법.
8. (삭제)
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기한 농축단계에 후속하여 초산완충용액을 첨가한 후 글루큐로니다제/아릴설파타제를 첨가하여 1.5~2.5시간 가수분해하는 효소가수분해단계를 더욱 수행하는 제조방법.
10. 제9항에 있어서, 효소가수분해단계에 후속하여 가수분해액을 35~65℃의 온도 범위에서 약 10~60분간 처리하는 부수농축단계를 더욱 수행하는 제조방법.
11. 제4항에 있어서, 상기한 3~5회의 추출단계 중 최종 단계에서 사용되는 용매가 정제수인 제조방법.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기한 농축단계에 후속하여 농축된 석류씨 추출물 0.1~99중량%와 이소플라본, 글루코오스아민, 콜라겐, 뮤코다당, 폴리덱스트로오스, 비타민, 키토산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 화합물을 혼합하는 혼합단계를 더욱 수행하는 제조방법.
13. (삭제)
14. (삭제)
15. (삭제)
16. (삭제)