JP4579620B2 - エストロゲン様作用剤及びその製造方法、並びに骨粗しょう症予防剤及び骨粗しょう症治療剤 - Google Patents

Description

本発明は、優れたエストロゲン様作用を発揮することができるエストロゲン様作用剤及びその製造方法、並びに骨粗しょう症予防剤及び骨粗しょう症治療剤に関するものである。

従来、１０−ヒドロキシデカン酸や１０−ヒドロキシ−２−デセン酸等の炭素数が１０の直鎖脂肪酸はローヤルゼリー中に含有されており、生理活性機能としてアルドース還元酵素阻害作用、抗炎症作用、及びチロシナーゼ活性阻害作用が報告されている（例えば、特許文献１〜４参照。）。
特開平７−６９８７９号公報 特開平９−３１５９２８号公報 特開２００１−２６１５７１号公報 特開２００４−７５５４３号公報

この発明は、本発明者らの鋭意研究の結果、１０−ヒドロキシデカン酸や１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を含む特定の直鎖脂肪酸が優れたエストロゲン様作用を発揮することを見出したことによりなされたものである。その目的とするところは、優れたエストロゲン様作用を発揮することができるエストロゲン様作用剤並びに骨粗しょう症予防剤及び骨粗しょう症治療剤を提供することにある。別の目的とするところは、エストロゲン様作用剤を容易に製造することができるエストロゲン様作用剤の製造方法を提供することにある。

前記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明のエストロゲン様作用剤は、下記一般式（１）若しくは（２）で示される化合物からなるものである。
請求項２に記載の発明のエストロゲン様作用剤は、下記一般式（１）若しくは（２）で示される化合物の金属塩或いは有機アミン塩からなるものである。
請求項３に記載の発明のエストロゲン様作用剤の製造方法は、下記一般式（２）で示される化合物又は下記一般式（２）で示される化合物の金属塩或いは有機アミン塩からなるエストロゲン様作用剤の製造方法であって、ローヤルゼリーから有機溶媒によって抽出成分を抽出する抽出工程と、抽出成分を分離する分離工程とを備えるものである。
請求項４に記載の発明のエストロゲン様作用剤の製造方法は、下記一般式（２）で示される化合物又は下記一般式（２）で示される化合物の金属塩或いは有機アミン塩からなるエストロゲン様作用剤の製造方法であって、ローヤルゼリーから有機溶媒及び油脂の混合液によって抽出成分を抽出する抽出工程と、抽出成分を分離する分離工程とを備えるものである。

（式中、Ｘは水素又は水酸基を示す。）

請求項５に記載の発明の骨粗しょう症予防剤は、請求項１又は請求項２に記載のエストロゲン様作用剤を有効成分として含有するものである。
請求項６に記載の発明の骨粗しょう症治療剤は、請求項１又は請求項２に記載のエストロゲン様作用剤を有効成分として含有するものである。

本発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１及び請求項２に記載の発明のエストロゲン様作用剤によれば、優れたエストロゲン様作用を発揮することができる。

請求項３及び請求項４に記載の発明のエストロゲン様作用剤の製造方法によれば、エストロゲン様作用剤を容易に製造することができる。
請求項５に記載の発明の骨粗しょう症予防剤によれば、骨粗しょう症の発症を予防することができる。
請求項６に記載の発明の骨粗しょう症治療剤によれば、骨粗しょう症を治療することができる。

本実施形態の第１のエストロゲン様作用剤は、下記一般式（１）で示される化合物又はその塩からなる。

（式中、Ｘは水素又は水酸基を示す。）
このエストロゲン様作用剤は炭素数が１０の直鎖飽和脂肪酸であり、デカン酸を基本骨格としている。前記一般式（１）で示される化合物としては、Ｘが水素を示すｎ−デカン酸、又はＸが水酸基を示す１０−ヒドロキシデカン酸が挙げられる。

本実施形態の第２のエストロゲン様作用剤は、下記一般式（２）で示される化合物又はその塩からなる。

（式中、Ｘは水素又は水酸基を示す。）
このエストロゲン様作用剤は炭素数が１０の直鎖不飽和脂肪酸であり、２−デセン酸を基本骨格としている。前記一般式（２）で示される化合物としては、Ｘが水素を示すトランス−２−デセン酸、又はＸが水酸基を示す１０−ヒドロキシ−２−デセン酸が挙げられる。これら第１及び第２のエストロゲン様作用剤において、前記各一般式で示される化合物の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等の金属塩、モノメチルアミン、トリメチルアミン等の有機アミン塩が挙げられる。

これらエストロゲン様作用剤は、ローヤルゼリー等の動物素材や花粉等の植物素材から得られる。各エストロゲン様作用剤は、体内に吸収されたときには優れたエストロゲン様作用（エストロゲンの生理活性に類似した作用）を発揮する。

本実施形態の医薬品又は医薬部外品は、第１又は第２のエストロゲン様作用剤を有効成分として含有している。医薬品又は医薬部外品は、エストロゲン様作用剤の優れたエストロゲン様作用により、エストロゲン欠乏症の発症の予防の他、骨粗しょう症予防剤として骨粗しょう症の発症の予防に用いられる。

医薬品は、経口剤又は非経口剤として構成される。経口剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。医薬品は、錠剤として構成されるときには結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等が混合されるとともに表面にシェラックや砂糖がコーティングされ、カプセル剤として構成されるときには前記各成分の他に油脂等の液体担体等が混合され、シロップ剤又はドリンク剤として構成されるときには甘味剤、防腐剤、色素香味剤等が混合される。非経口剤の剤形としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に注射剤等が挙げられる。医薬品は、外用剤として構成されるときにはワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等の基材が混合される。また、医薬品は、注射剤として構成されるときには剤形として液剤や凍結乾燥剤が挙げられ、凍結乾燥剤のときには注射用蒸留水、生理食塩水、輸液等に無菌的に溶解して用いられる。一方、医薬部外品においては、エストロゲン様作用剤は錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、歯磨き粉等に含有される。

医薬品又は医薬部外品中のエストロゲン様作用剤の含有量は０．００１〜３０質量％が好ましく、０．０１〜１０質量％がより好ましく、０．０５〜１質量％がさらに好ましい。エストロゲン様作用剤の含有量が０．００１質量％未満では、医薬品又は医薬部外品に含有されるエストロゲン様作用剤の量が少ない。一方、３０質量％を超えると、医薬品又は医薬部外品が賦形剤等の剤形を維持するための成分を含有するときにその成分の含有量が低下し、医薬品又は医薬部外品は剤形を維持するのが困難になる。

本実施形態の飲食品は、第１又は第２のエストロゲン様作用剤を含有している。ここで、飲食品とはドリンク等の飲料品やクッキー等の食品を含み、健康食品等の食品製剤も含む。この飲食品は、エストロゲン様作用剤の優れたエストロゲン様作用により、エストロゲン欠乏症及び骨粗しょう症の発症の予防に用いられる。

飲食品中のエストロゲン様作用剤の含有量は０．００１〜１０質量％が好ましく、０．００１〜５質量％がより好ましく、０．０１〜０．１質量％がさらに好ましい。エストロゲン様作用剤の含有量が０．００１質量％未満では、飲食品に含有されるエストロゲン様作用剤の量が少ない。一方、１０質量％を超えると、飲食品がその他の成分として基材を含有するときに、基材の含有量が減少することによって飲食品はその形態を維持するのが困難になる。その他の成分としては、基材、賦形剤、添加剤、副素材、増量剤等が挙げられる。飲食品の形態は粉末状、錠剤状、ドリンク剤等の液状、カプセル状等が挙げられ、具体的には飴、せんべい、クッキー、各種飲料等の形態を採用することができる。

飲食品は、一日数回に分けて経口摂取される。一日の摂取量は０．００１〜１０ｇが好ましく、０．００１〜５ｇがより好ましく、０．０１〜０．１ｇがさらに好ましい。飲食品の摂取量が０．００１ｇ未満では、一日に摂取することができるエストロゲン様作用剤の量が少なくなる。一方、１０ｇを超えると、摂取量が多いために飲食品の取扱い性が悪化するおそれがある。

次に、エストロゲン様作用剤の製造方法について説明する。この製造方法は、抽出工程と分離工程とを備えている。抽出工程においては、浸漬処理と、固液分離処理と、必要に応じて濃縮及び乾燥とが行われる。浸漬処理では、有機溶媒に動物素材又は植物素材を浸漬した後に撹拌又は放置することにより、有機溶媒中にエストロゲン様作用剤を含有する抽出成分が抽出される。有機溶媒としては、エタノール、メタノール等の低級アルコール類、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよいし、二種以上が組み合わされて用いられてもよい。これらの中でも、エタノールが、得られたエストロゲン様作用剤を経口剤等の原料として容易に用いることができるために好ましい。さらに、浸漬処理においては、エストロゲン様作用剤を損なうことなく抽出するために、有機溶媒及び油脂の混合液を用いるのが好ましい。油脂としてはグリセリン、スクワレン、ラード、なたね油、シソ油、オリーブ油、大豆油、ゴマ油等が挙げられ、これらはエストロゲン様作用剤の安定性を高めることができる。

有機溶媒の量は、動物素材又は植物素材の１重量部に対して１〜１０重量部が好ましく、２〜８重量部がより好ましく、３〜６重量部がさらに好ましい。一方、抽出温度は１０〜３０℃が好ましい。抽出時間は１〜２４時間が好ましく、２〜１２時間がより好ましく、３〜６時間がさらに好ましい。

有機溶媒の量が１重量部未満、抽出温度が１０℃未満又は抽出時間が１時間未満では、抽出効率が低下してエストロゲン様作用剤の製造効率が低下するおそれがある。一方、有機溶媒の量が１０重量部を超えると抽出後の濃縮に時間を要し、抽出時間が２４時間を超えると抽出に時間を要する。よって、エストロゲン様作用剤の製造効率が低下するおそれがある。また、抽出温度が３０℃を超えると、抽出されたエストロゲン様作用剤が熱によって損なわれるおそれがある。さらに、有機溶媒の沸点が３０℃未満のときに有機溶媒が揮発するおそれがある。抽出に用いる容器は、密閉容器が有機溶媒の揮発を防止するために好ましく、防爆型容器が前記効果に加えて取扱いが容易なためにより好ましい。

動物素材及び植物素材はエストロゲン様作用剤を含有し、動物素材としてはローヤルゼリー等が挙げられ、植物素材としては花粉、オリーブ又はその種子、海藻、大豆、大麦若葉等が挙げられる。ローヤルゼリーは、蜜蜂のうち日齢３〜１２日の働き蜂が下咽頭腺及び大腮腺から分泌する分泌物を混合して作る乳白色のゼリー状物質である。ローヤルゼリーは中国、日本等のアジア諸国、台湾、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、南アメリカ諸国等の国又は地域のいずれの産地であってもよい。花粉の種類としてはトウモロコシ、ライ麦、チモシイ（大粟反）等が挙げられる。花粉は、単一種のみにより構成されてもよいし、複数種の混合により構成されてもよい。これらの中でも、ローヤルゼリーが、エストロゲン様作用剤の含有量が高いために好ましい。

動物素材又は植物素材の形態としては、採取された状態のままのもの、採取された後に乾燥されたもの、採取された後に乾燥及び粉砕されて粉末化されたもの等が挙げられる。ここで、例えば採取された状態のままのローヤルゼリー、即ち生ローヤルゼリーは通常６５〜６７質量％の水分を含有している。このため、例えば生ローヤルゼリーを１００容量％の有機溶媒に浸漬したときには、有機溶媒と生ローヤルゼリー中の水分とが混合することにより有機溶媒の濃度が低下し、抽出効率が低下するおそれがある。よって、動物素材又は植物素材は、乾燥されたものが抽出効率を向上させることができるために好ましく、粉末化されたものが前記効果に加えて取扱いが容易なために好ましい。動物素材又は植物素材の乾燥は真空凍結乾燥等が挙げられる。一方、動物素材又は植物素材の粉砕には粉砕器、裁断機等が好適である。

浸漬処理の後、動物素材又は植物素材と有機溶媒との混合液の固液分離処理により、有機溶媒と抽出成分とからなる抽出液を得る。固液分離処理には、常圧濾過、吸引濾過、遠心分離等が用いられる。常圧濾過及び吸引濾過に用いる濾材としては食品用の濾紙、珪藻土を重層した濾紙等が挙げられ、遠心分離には通常の遠心分離機等が用いられる。固液分離処理は、濾過と遠心分離とを組み合わせて行うのが、分離効率を向上させることができるために好ましい。さらに、濾過によって得られる残渣は、有機溶媒によって再抽出されるのが抽出効率を向上させることができるために好ましい。

固液分離処理の後、必要に応じて抽出液を濃縮及び乾燥することにより抽出成分を得る。このとき、抽出液を減圧下で加熱することにより濃縮及び乾燥してもよいし、真空凍結乾燥機を用いることにより抽出液を加熱することなく濃縮及び乾燥してもよい。減圧下で加熱するときには、加熱温度は２０〜６０℃が好ましく、２５〜５５℃がより好ましく、３０〜５０℃がさらに好ましい。加熱温度が２０℃未満では、濃縮等に時間を要しエストロゲン様作用剤の製造効率が低下するおそれがある。一方、６０℃を超えると、エストロゲン様作用剤が熱により損なわれるおそれがある。

分離工程においては、分離処理と、濃縮及び乾燥とが行われる。分離処理では、分離用担体をカラムに充填した後に抽出成分が溶解された分離用溶液をカラムに供することにより、分離用溶液中の抽出成分においてエストロゲン様作用剤と他の成分とを分離する。このとき、エストロゲン様作用剤は分離用溶液に溶解した状態で得られる。この分離処理により、抽出成分からエストロゲン様作用剤のみを取出すことができる。

分離用担体の材質としては、セルロース、アガロース等の多孔性の多糖類、酸化ケイ素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン等が挙げられる。分離用担体の種類としては、逆相担体、イオン交換担体、アフィニティ担体、分配性担体、分子篩用担体、吸着性担体等が挙げられる。逆相担体はその表面が疎水性化合物によりコーティングされ、ＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）等が挙げられる。イオン交換担体はその表面がイオン性の物質によりコーティングされ、具体例としてはＩＲＡ−４１０、ＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）等が挙げられる。ここで、エストロゲン様作用剤は疎水性を示す。このため、イオン交換担体は、抽出成分がエストロゲン様作用剤の他に親水性を示す成分を多く含有するときに用いることができる。アフィニティ担体はその表面が抗体等によりコーティングされ、抗原となる物質のみを分離する。分配性担体は分離する物質と分離用溶媒との間の分配係数の差異を利用して分離を行い、シリカゲル（メルク社製）等が挙げられる。分子篩用担体は分子の大きさの差異を利用して分子量数十〜数千の分子の分離を行い、セファデックス（登録商標）ＬＨ−２０（アマシャムファルマシア製）等が挙げられる。吸着性担体は分離する物質の吸着性を利用して分離を行い、ダイヤイオン（登録商標）（三菱化学（株）製）等が挙げられる。

各分離用担体の中でも、抽出成分の分離効率が高いために逆相担体又は分配性担体が好ましく、エストロゲン様作用剤が結合するエストロゲン受容体により表面がコーティングされているアフィニティ担体が、エストロゲン様作用剤を特異的に分離することができるためにより好ましい。

分離用担体の粒径は０．１〜３００μｍが好ましい。粒径が０．１μｍ未満では、分離用担体が細かすぎるために分離用溶液の展開に時間を要し、エストロゲン様作用剤の製造効率が低下するおそれがある。一方、３００μｍを超えると、抽出物の分離精度が低下するおそれがある。分離温度（分離用担体が充填されたカラムの温度）は４〜３０℃が好ましく、１０〜２５℃がより好ましい。分離温度が４℃未満では、カラムの操作性が悪化するおそれがある。一方、３０℃を超えると、分離によって得られるエストロゲン様作用剤が熱によって損なわれるおそれがある。分離用担体は有機溶媒に対する耐性を有するものが好ましく、医薬品や食品を製造するために用いられるものが、得られるエストロゲン様作用剤に分離用担体由来の不純物が混合されるのを防止することができるためにより好ましい。具体的には、前記各分離用担体の中でも、ＤＭ１０２０Ｔ、セファデックスＬＨ−２０又はダイヤイオンが、前記効果が高いために好ましい。

分離用溶液の溶媒である分離用溶媒は分離用担体の種類により適宜選択され、例えば分離用担体として逆相担体、イオン交換性担体又は吸着性担体を用いるときにはメタノール、エタノール等の低級アルコール又は低級アルコールと水との混合液が好ましい。また、アフィニティ担体又は分配性担体を用いるときにはクロロホルム、メタノール、酢酸又はそれらの混合液が好ましく、分子篩用担体を用いるときには低級アルコールが好ましい。これら分離溶媒の中でも、エタノールが、得られたエストロゲン様作用剤を経口剤等の原料として容易に用いることができるために好ましい。

分離用溶媒の量は、抽出成分の１質量に対して１〜５０倍量が好ましく、３〜２０倍量がより好ましい。分離用溶媒の量が１倍量未満では、分離用溶媒中の抽出成分の濃度が高すぎるために抽出成分の分離が困難になる。一方、５０倍量を超えると、分離用溶媒の体積が大きくなるために抽出成分の分離に時間を要し、エストロゲン様作用剤の製造効率が低下するおそれがある。

抽出成分を分離するときには、カラムによる分離を複数回繰返すことが、分離用溶液中の不純物を確実に取除いてエストロゲン様作用剤の精製を行うことができるために好ましい。このとき、同一又は異なる分離用担体や分離用溶媒を用いてもよい。さらに、抽出成分の分離工程は、低速クロマトグラムシステム、精製用クロマトグラムシステム、膜分離クロマトグラムシステム等のシステム化された装置を用いることが、エストロゲン様作用剤の分離を容易に行うことができるために好ましい。さらに、抽出成分の分離工程を行うときには、分離用溶液中のエストロゲン様作用剤の存在を確認することが好ましい。エストロゲン様作用剤の存在を確認する方法としては、エストロゲンレセプター（ＥＲ）結合アッセイによる試験、エストロゲンに感受性を示すヒト乳癌細胞株を用いた増殖試験等が挙げられる。

分離処理の後、カラムに供された分離用溶液を濃縮及び乾燥して粉末化することにより、エストロゲン様作用剤を得る。濃縮及び乾燥には、減圧蒸留装置、真空乾燥機等が好適である。減圧蒸留装置を用いて乾燥するときには、乾燥温度は２０〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。一方、真空乾燥機を用いて乾燥するときには、乾燥温度は２０〜６０℃が好ましく、２５〜４０℃がより好ましい。乾燥温度が２０℃未満では、乾燥に時間を要しエストロゲン様作用剤の製造効率が低下するおそれがある。一方、５０℃又は６０℃を超えると、エストロゲン様作用剤が熱によって損なわれるおそれがある。

前記の実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 第１及び第２のエストロゲン様作用剤は前記一般式（１）若しくは（２）で示される化合物又はその塩からなるために、優れたエストロゲン様作用をそれぞれ発揮することができる。さらに、エストロゲン様作用剤は、その優れたエストロゲン様作用により、子宮内膜の増殖、子宮筋の発育、乳腺管の増殖分泌等の促進や月経周期の成立の媒介として作用することができる。このため、エストロゲン様作用剤は、無月経や月経異常の治療、月経の人為的移動、乳癌等に対するホルモン療法、無排卵性子宮出血等の消退出血の治療等に用いることができる。

・ エストロゲン様作用剤の製造方法は、前記抽出工程により抽出成分を得た後、分離工程による抽出成分の抽出、濃縮及び乾燥によりエストロゲン様作用剤を得る。よって、このエストロゲン様作用剤の製造方法は、抽出工程の後に分離工程を行うという簡単な操作により、エストロゲン様作用剤を容易に得ることができる。

次に、試験例を挙げて前記実施形態をさらに具体的に説明する。
（試験例１）
抽出工程として、動物素材としての生ローヤルゼリー（中国産）２ｋｇに有機溶媒としての１００容量％エタノール４リットルを加え２０℃で２時間撹拌した後、濾紙（アドバンテック東洋（株）製、Ｎｏ．２）を用いて吸引濾過を行い濾液を得た。次いで、残渣に１００容量％エタノール８リットルを加え２０℃で２時間撹拌した後、前記濾紙を用いて吸引濾過を行い濾液を得た。続いて、各濾液を混合してエタノール抽出液を得た後、該エタノール抽出液を濃縮乾固して抽出成分を得た。次に、抽出成分３８５ｇを水及びクロロホルムを用いて分配し、クロロホルム層を取出した後に濃縮乾固してクロロホルム抽出物を得た。次いで、クロロホルム抽出物７２ｇにヘキサンを加え２０℃で２時間撹拌した後、前記濾紙を用いて濾液（ヘキサン抽出液）を得た。続いて、ヘキサン抽出液を濃縮乾固し、ヘキサン抽出物５．３２ｇを得た。

次に、分離工程として、ヘキサン抽出物５．３２ｇを２容量％メタノール含有クロロホルム５０ｍｌに溶解させた後、シリカゲルカラム（富士シリシア化学（株）製、カラム直径：４．１ｃｍ、カラム長さ：３０ｃｍ、分離用担体：粒径７５μｍのシリカゲル、４００ｍｌ、溶出溶媒：クロロホルム、２０００ｍｌ）を用いた分画を行い、分離用担体に担持されている成分が溶出した溶出液（画分）を得た。

続いて、得られた各画分について、エストロゲン受容体と親和性を示す物質の受容体結合実験によるエストロゲン様作用の確認及び薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ、展開溶媒：クロロホルム）による含有成分の分析を行い、エストロゲン様作用を有するとともに２４−メチレンコレステロールを含有しない画分Ａを得た。２４−メチレンコレステロールはエストロゲン様作用を有している。

画分Ａについて、セファデックス（登録商標）ＬＨ−２０を分離用担体としたカラム（カラム直径：３．４ｃｍ、カラム長さ：２４ｃｍ、分離用担体の量：２２０ｍｌ、溶出溶媒：クロロホルム、２５０ｍｌ）を用いた分画、及び得られた各画分についての前記受容体結合実験を行い、エストロゲン様作用を有する画分Ｂを得た。続いて、画分Ｂについて、高速液体クロマトグラフィ（カラム直径：２０ｍｍ、カラム長さ：２５０ｍｍ、分離用担体：シリカゲル（（株）資生堂製のＡＣＲタイプ）、溶出溶媒：０．１容量％酢酸添加７０容量％メタノール水溶液、検出波長：２３０ｎｍ）を用いた分画、及び得られた各画分についての前記受容体結合実験を行い、エストロゲン様作用を有する画分Ｃを得た。
（試験例２）
抽出工程として、前記試験例１と同様にしてクロロホルム抽出物を得た。次いで、クロロホルム抽出物７２ｇにヘキサンを加え２０℃で２時間撹拌した後、前記濾紙を用いて残渣（ヘキサン不溶物）を得た。

次に、分離工程として、ヘキサン不溶物５ｇを２容量％メタノール含有クロロホルム５０ｍｌに溶解させた後、オクタデシル（ＯＤＳ）カラム(富士シリシア社製、カラム直径：５．０ｃｍ、カラム長さ：２８ｃｍ、分離用担体：粒径１００μｍ、５５０ｍｌ、溶出溶媒：０．１容積％トリフルオロ酢酸添加４０容積％メタノール水溶液、３０００ｍｌ)を用いた分画、及び得られた各画分についての前記受容体結合実験を行い、エストロゲン様作用を有する画分Ｄを得た。
＜成分の同定＞
試験例１の画分Ｃ、及び試験例２の画分Ｄ中の成分を核磁気共鳴測定装置（ＮＭＲ、バリアン社製、３００ＭＨｚ）によって解析した。この結果、データは示さないが、画分Ｃはトランス−２−デセン酸のみを含有し、画分Ｄは１０−ヒドロキシ−２−デセン酸のみを含有していることを確認した。
＜ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７細胞を用いたエストロゲン様作用に関する試験＞
試験例１の画分Ｃ及び試験例２の画分Ｄをそれぞれ溶媒留去したもの並びに１０−ヒドロキシデカン酸標品について、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７細胞を用いたエストロゲン様作用に関する試験を行った。ＭＣＦ−７細胞はエストロゲンに対して感受性を示し、エストロゲン濃度に依存して増殖する。本試験においては、ＭＣＦ−７細胞は東北大学加齢医学研究所附属医用細胞資源センターより供給を受けたＴＫＧ０４７９を用い、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社製、＃Ｒ８７５８）で３７℃、５容量％二酸化炭素存在下においてＭＣＦ−７細胞の継代培養を行った。

次いで、ＭＣＦ−７細胞を培地から剥離した後に洗浄し、活性炭処理を施したＦＢＳを１０質量％添加した改変型ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社製、＃Ｒ７５０９、フェノールレッドなし）によりＭＣＦ−７細胞を希釈した。そして、９６ウェルプレート（ヌンク社製、＃１６７００８）に、１ウェル当たり希釈後の培地０．１ｍｌ（ＭＣＦ−７細胞：８０００細胞）を添加し３７℃、５容量％二酸化炭素存在下で２４時間培養した。

続いて、試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に混合した後、混合液１μｌを前記２４時間培養後の培地に添加しさらに４８時間培養した。ここで、混合液中の固形分濃度を表１に示す。そして、培地を取除いた後、ＭＣＦ−７細胞に０．１ｍｌのＰＢＳ（１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、８ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．３）を加えた。続いて、ＭＴＴアッセイキット（Chemicon International, Inc.製、#28835、Colorimetric assay for cell survival and proliferation kit）を用い該キットの取扱説明書に従い反応を行った。次いで、マイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments, Inc.製、μQuant）を用い６３０ｎｍを対照にとるとともに５７０ｎｍの吸光度を測定してＭＣＦ−７細胞数を求め、ＭＣＦ−７細胞の増殖割合を算出した。

一方、混合液をＤＭＳＯに変更した以外は前記と同様にして培養及び測定したものを陰性対照群とし、試料を１７βエストラジオール（シグマ社製、＃Ｅ８８７５、終濃度１００ｐｇ／ｍｌ）に変更した以外は前記と同様にして培養及び測定したものを陽性対照群とした。これらの結果を表１に示す。尚、表１において、各試料のＭＣＦ−７細胞の増殖割合を、ＭＣＦ−７細胞の増殖率（陰性対照群の増殖割合を１００としたときにおける各試料の増殖割合の相対値）として示した。さらに、陰性対照群に対するｔ−検定を行い危険率５％未満を有意差ありとし、＊は危険率５％未満、＊＊は危険率１％未満をそれぞれ示す。試験は各固形分濃度について６回行い、それらの平均値を表１に示す。また、生細胞数を顕微鏡により数えた値及び前記マイクロプレートリーダーで測定した値は比例関係にあることを予備的試験において確認した。

表１に示すように、各画分及び１０−ヒドロキシデカン酸は、固形分が低濃度、即ちトランス−２−デセン酸、１０−ヒドロキシ−２−デセン酸、又は１０−ヒドロキシデカン酸の濃度が低い状態でＭＣＦ−７細胞を増殖させることができ、優れたエストロゲン様作用をそれぞれ示した。
＜未性成熟動物を用いたエストロゲン様作用に関する試験＞
試験例１の画分Ｃ及び試験例２の画分Ｄをそれぞれ溶媒留去したもの並びに１０−ヒドロキシデカン酸標品について、Sprague Dawleyラット（日本エスエルシー株式会社より購入、雌、１３日齢、ＳＰＦ動物）を用いたエストロゲン様作用に関する試験を行った。これは、エストロゲン様作用剤が、性成熟していない動物の子宮重量を増加させることに基づくものである。

具体的には、カゼイン、卵白タンパク質、異性化糖を主体としエストロゲン様作用剤を含有しない餌（オリエンタル酵母（株）製）を食餌としてラットを１週間予備飼育した。また、試料を生理食塩水で調製した０．５質量％カルボキシメチルセルロースに懸濁して試料分散液を調製した。そして、予備飼育後のラットに、試料分散液を２０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で５日間皮下投与した。一方、前記試料分散液を生理食塩水で調製した０．５質量％カルボキシメチルセルロースに変更した以外は前記と同様にしてラットに皮下投与したものを陰性対照群とし、１７α−エチニルエストラジオール（シグマ社製、投与量：５μｇ／ｋｇ／日）に変更した以外は前記と同様にしてラットに投与したものを陽性対照群とした。

皮下投与終了後にラットから子宮を摘出し、子宮重量を測定した。試験は１群５匹で行い、これら子宮重量の平均値及び標準偏差を求めた。この結果を表２に示す。尚、表２において、陰性対照群に対するｔ−検定を行い危険率５％未満を有意差ありとし、＊は危険率５％未満、＊＊は危険率１％未満をそれぞれ示す。

表２に示すように、各画分及び１０−ヒドロキシデカン酸標品は陰性対照群に比べて子宮重量を増加させることができ、優れたエストロゲン様作用をそれぞれ示した。
（試験例３）
試験例１の画分Ｃを溶媒留去したもの０．０５ｇ、乳糖５．０ｇ及びステアリン酸マグネシウム４．９９５ｇの混合物をハードカプセルに充填することにより、エストロゲン様作用剤を含有するカプセル状の骨粗しょう症予防剤（１錠中の混合物の含有量：５００ｍｇ）を得た。
＜骨密度改善に関する試験＞
試験例３の骨粗しょう症予防剤について、骨粗しょう症改善に関する試験を行った。具体的には、６０〜７０才の閉経女性３例に、試験例３の骨粗しょう症予防剤を毎日３食後に１錠ずつ４週間それぞれ服用させた。そして、各例の服用前及び服用後の腰椎の骨密度をＸ線骨密度測定装置（ＱＤＲ４５００Ａ、東洋メティック（株）製）を用いて測定した。この結果、３例ともに骨粗しょう症予防剤の服用によって腰椎の骨密度が増加し、骨密度の増加率の平均は１１％であった。さらに、自覚症状、臨床症状、尿検査値、血液検査値、血液生化学検査値、体温、呼吸、心拍及び血圧等に異常は認められず、血液凝固系の亢進及び性器出血等の異常も認められなかった。このため、試験例３の骨粗しょう症予防剤は、骨密度の低下を防止して骨粗しょう症の発症を予防することができた。
（試験例４）
試験例１の画分Ｃを溶媒留去したもの０．０１ｇ、異性化糖３ｇ、食用セルロース１．９９８ｇ、アスコルビン酸０．０１ｇ及び食用香料０．１ｇの比率で混合した後に打錠し、質量が０．３ｇの三角形錠剤状の食品製剤を得た。
＜更年期障害改善に関する試験＞
試験例４の食品製剤について、更年期障害改善に関する試験を行った。具体的には、５０〜６０才の女性（更年期障害の自覚症状あり）３例に、試験例４の食品製剤を１日６錠、７日間摂食させた。そして、各例の摂食前及び摂食後の精神状態を聴取した。この結果、３例ともに、摂食後は摂食前に比べてイライラ感、のぼせ感、脱力感等の不定愁訴が減少した。さらに、摂食による苦情はなく、尿検査値、血液検査値及び血液生化学的検査値に異常は認められなかった。このため、試験例４の食品製剤は、更年期障害の自覚症状を低減して更年期障害を改善することができた。

なお、本実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・ エストロゲン様作用剤を、炭素数が１０の直鎖飽和脂肪酸若しくは直鎖不飽和脂肪酸又はその塩から構成してもよい。直鎖飽和脂肪酸若しくは直鎖不飽和脂肪酸の塩としては、前記金属塩や有機アミン塩が挙げられる。

・ エストロゲン様作用剤を乳癌等のエストロゲン欠乏に起因する疾患の治療や予防に用いてもよい。このように構成した場合は、エストロゲン様作用剤は優れたエストロゲン様作用を発揮することにより、乳癌等を治療したり発症を予防したりすることができる。

・ エストロゲン様作用剤と、自律神経調節剤等の更年期障害治療剤やビタミンＤ製剤等とを組み合わせて医薬品又は医薬部外品を製造してもよい。また、エストロゲン様作用剤と、ゲニステイン、ダイズイン等のイソフラボン類、花粉、オリーブオイル、胎盤エキス等とを組み合わせて用いてもよい。

・ エストロゲン様作用剤を、動物素材又は植物素材からの抽出ではなく化学合成によって得てもよい。

Claims (6)

1. 下記一般式（１）若しくは（２）で示される化合物からなることを特徴とするエストロゲン様作用剤。
   

   

   

   （式中、Ｘは水素又は水酸基を示す。）
2. 下記一般式（１）若しくは（２）で示される化合物の金属塩或いは有機アミン塩からなることを特徴とするエストロゲン様作用剤。
   

   

   

   （式中、Ｘは水素又は水酸基を示す。）
3. 下記一般式（２）で示される化合物又は下記一般式（２）で示される化合物の金属塩或いは有機アミン塩からなるエストロゲン様作用剤の製造方法であって、ローヤルゼリーから有機溶媒によって抽出成分を抽出する抽出工程と、抽出成分を分離する分離工程とを備えることを特徴とするエストロゲン様作用剤の製造方法。
   

   
4. 下記一般式（２）で示される化合物又は下記一般式（２）で示される化合物の金属塩或いは有機アミン塩からなるエストロゲン様作用剤の製造方法であって、ローヤルゼリーから有機溶媒及び油脂の混合液によって抽出成分を抽出する抽出工程と、抽出成分を分離する分離工程とを備えることを特徴とするエストロゲン様作用剤の製造方法。
   

   
5. 請求項１又は請求項２に記載のエストロゲン様作用剤を有効成分として含有することを特徴とする骨粗しょう症予防剤
6. 請求項１又は請求項２に記載のエストロゲン様作用剤を有効成分として含有することを特徴とする骨粗しょう症治療剤。