WO2021210673A1 - 更年期症状改善剤 - Google Patents

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delphinidin
cyanidin
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menopausal symptoms
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真由美 大塚
夏海 長森
英雄 大南
尚也 北村
尚基 山本
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花王株式会社
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    • A23V2200/302—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having a modulating effect on age

Definitions

  • the present invention relates to a menopausal symptom improving agent.
  • HRT hormone replacement therapy
  • estrogen or estrogen and progesterone are administered.
  • menopausal symptoms involve not only a decrease in estrogen but also social and psychological factors caused by work and home environment in a complicated manner.
  • HRT has a negative aspect such as increasing the incidence of breast cancer and endometrial cancer, and it is required to improve the indefinite complaints of menopause more safely.
  • cassis (scientific name: Ribes nigrum) is a plant classified into the genus Currant of the family Saxifragaceae, which is also called black currant and black currant, and contains a large amount of four types of anthocyanins.
  • the cassis anthocyanins the lucinosides delphinidin-3-lucinoside and cyanidin-3-lucinoside are characteristic components of cassis anthocyanin. It has been reported that cassis anthocyanin has a blood flow improving action, relieves stiff shoulders, general malaise, etc. (Patent Document 1), and has an estrogen action (Non-Patent Document 1). However, it is not clear whether cassis anthocyanins have an improving effect on menopausal symptoms.
  • Patent Document 1 International Publication No. 2001/01798
  • Non-patent document 1 Molecules, 23 (1), 74, 2018
  • the present invention relates to the following 1) to 7).
  • a menopausal symptom improving agent containing delphinidin-3-lucinoside, cyanidin-3-lucinoside or a combination thereof as an active ingredient.
  • a food for improving menopausal symptoms containing delphinidin-3-lucinoside, cyanidin-3-lucinoside or a combination thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to providing a climacteric symptom improving agent useful for improving climacteric symptoms.
  • delphinidin-3-lucinoside and cyanidin-3-lucinoside have the effect of improving menopausal symptoms such as hot flashes (hot flashes, hot flashes) and sweating.
  • climacteric symptoms such as hot flashes (hot flashes, hot flashes) and sweating can be improved.
  • delphinidin-3-lucinoside is a glycoside in which rhamnosyl- ( ⁇ 1 ⁇ 6) -glucose is bound to the hydroxyl group at the 3-position of delphinidin, and has the following structure.
  • cyanidin-3-lucinoside is a glycoside in which ramnosyl- ( ⁇ 1 ⁇ 6) -glucose is bound to the hydroxyl group at the 3-position of cyanidin, and has the following structure.
  • Delphinidin-3-lucinoside and cyanidin-3-lucinoside may be salts or solvates, both of which are included. In addition, these may be used individually or in combination of two or more. Of these, delphinidin-3-lucinoside is preferably used because it is easy to obtain the desired effect. Delphinidin-3-lucinoside and cyanidin-3-lucinoside can be obtained by chemical synthesis or extraction / purification from natural products containing them, particularly plants. In addition, commercially available reagents can be used. Since delphinidin-3-lucinoside and cyanidin-3-lucinoside are found in blackcurrant (scientific name: Ribes nigrum), it is preferable to use those derived from blackcurrant extract. Blackcurrant extracts may be used as delphinidin-3-lucinoside and cyanidin-3-lucinoside.
  • the site where cassis is used is not particularly limited, and may be the whole plant, leaves, stems, flowers, buds, buds, pericarp, fruits, roots, rhizomes, seeds, etc. or a combination thereof, but is rich in cassis anthocyanins. It is preferable to use fruit or peel.
  • Blackcurrants can be used raw, dried or treated with them. Examples of the treatment include cutting, crushing, grinding, crushing and the like.
  • the extraction method can be appropriately selected, and may be any of immersion, brewing, leaching, reflux extraction, supercritical extraction, ultrasonic extraction, microwave extraction and the like.
  • a polar solvent or a non-polar solvent can be used as the solvent for extraction.
  • the solvent include, for example, water; monovalent or divalent or polyvalent alcohols; ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; chains such as diethyl ether and tetrahydrofuran or Cyclic ethers; Polyethers such as polyethylene glycol; Saturated or unsaturated hydrocarbons such as hexane; Aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene; Halogenized hydrocarbons such as dichloromethane, chloroform, dichloroethane, carbon tetrachloride, etc.
  • Hydrocarbons pyridines; dimethylsulfoxide; acetonitrile; carbon dioxide, supercritical carbon dioxide; fats and oils, waxes, other oils; and mixtures thereof.
  • Preferred examples thereof include alcohols and aqueous solutions thereof, and examples of the alcohols include methanol, ethanol, 1,3-butylene glycol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, sec-butanol, t-butanol and the like. These are preferably ethanol and an aqueous ethanol solution.
  • the amount of solvent used in the extraction and the extraction conditions are not particularly limited as long as sufficient extraction can be performed, and can be appropriately adjusted.
  • the cassis extract may be a crude product as long as it conforms to the standards acceptable for foods and pharmaceuticals, contains cassis anthocyanins, and exhibits the effects of the present invention.
  • treatments such as removal of inert contaminants, deodorization, and decolorization by known techniques such as liquid distribution, solid-liquid distribution, filtration membrane, activated carbon, synthetic adsorption resin, ion exchange resin, and starching are used. Can be applied.
  • known separation and purification methods may be appropriately combined to increase their purity. Examples of the purification means include organic solvent precipitation, centrifugation, microfiltration membrane, high performance liquid chromatograph, column chromatograph and the like.
  • the cassis extract may be used as it is, may be used as a diluted solution diluted with an appropriate solvent, or may be a concentrated extract, a dry powder, or a paste. It can also be freeze-dried and diluted with a solvent usually used for extraction, for example, a solvent such as water, ethanol, or a mixed solution of water / ethanol. It can also be used by being encapsulated in vesicles such as liposomes or microcapsules.
  • the cassis extract is preferably contained in an amount of 0.1% by mass or more, more preferably 10% by mass or more, in the total amount of delphinidin-3-lucinoside and cyanidin-3-lucinoside.
  • delphinidin-3-lucinoside and cyanidin-3-lucinoside are considered to improve menopausal symptoms regardless of estrogen activation.
  • delphinidin-3-lucinoside and cyanidin-3-lucinoside are contacted with transformed cells (TRPV4-expressing cells) in which TRPV4 is functionally expressed by human TRPV4 gene transfer in the presence of a TRPV4 agonist.
  • TRPV4-expressing cells transformed cells in which TRPV4 is functionally expressed by human TRPV4 gene transfer in the presence of a TRPV4 agonist.
  • TRPV4 Transient receptor potential cation channel subfamily V member 4
  • TRPV4 is one of the proteins constituting the temperature-sensitive TRP channel.
  • TRPV4 is expressed in a wide range of tissues such as kidney, lung, bladder, heart, skin, brain, and digestive tract, and various physical chemistry such as osmotic pressure change, temperature change, shear stress caused by blood flow, and organ volume change. It is thought to function as a sensor molecule that senses specific stimuli and transmits them to cells. Chlorogenic acid, caffeic acid, and ferulic acid, which are known to suppress the activity of TRPV4, have been reported to improve autonomic nervous function and indefinite complaints (Patent No. 6075830, Patent No. 5931633, Patent No. 6).
  • delphinidin-3-lucinoside, cyanidin-3-lucinoside or a combination thereof can be a climacteric symptom improving agent, can be used for improving climacteric symptoms, and is used for producing a climacteric symptom improving agent. can do.
  • "use” is use in a human or non-human animal and may be therapeutic or non-therapeutic use.
  • Non-therapeutic is a concept that does not include medical practice, that is, a concept that does not include a method of operating, treating or diagnosing a human, more specifically, a doctor or a person who has been instructed to perform surgery on a human. , A concept that does not include a method of performing treatment or diagnosis.
  • menopause is defined as a condition that interferes with daily life among the symptoms of menopause (Menopause Guidebook, 2014 edition, Japan Society for Menopause).
  • Menopausal symptoms include, for example, dizziness, headache, insomnia, hot flashes, hot flashes, sweating, palpitation, nausea, constipation, diarrhea, stiff shoulders, lower back pain, joint pain, pollakiuria, dry skin and mucous membranes, eczema and the like.
  • improved of menopausal symptoms means improvement of menopausal symptoms, preferably hot flashes and improvement of sweating.
  • hot flash refers to a feeling of heat (hot flashes, hot flashes) that occurs suddenly in the head, chest, or whole body during menopause.
  • Improvement means improvement of a symptom or condition, prevention or delay of deterioration of the symptom or condition, or reversal, prevention or delay of progression of the symptom or condition.
  • the climacteric symptom improving agent of the present invention becomes a drug, quasi-drug, or food for humans or animals that exerts the effect of improving the climacteric symptom by itself, or is added to the drug, quasi-drug, or food.
  • Can be the material or formulation used in The foods include foods with functional claims, foods for specified health use, supplements, etc., which are based on the concept of improving menopausal symptoms and are labeled to that effect as necessary. Since these foods are foods for which functional labeling is permitted, they can be distinguished from general foods.
  • the drug (including quasi-drugs) contains delphinidin-3-lucinoside, cyanidin-3-lucinoside or a combination thereof as an active ingredient for improving menopausal symptoms.
  • the pharmaceutical product may contain a pharmaceutically acceptable carrier, other active ingredient, pharmacological ingredient and the like, if necessary, as long as the function of the active ingredient is not lost.
  • Dosage forms of the drug include, for example, tablets (including chewable tablets), capsules, granules, powders, oral solid preparations such as troches, oral liquids, syrups and the like. Examples thereof include parenteral preparations such as oral liquid preparations, injections, suppositories, inhalants, transdermal absorbents, and external preparations.
  • the preferred dosage form is oral administration.
  • the formulations of these dosage forms contain cassis anthocyanins as pharmaceutically acceptable carriers (eg, excipients, binders, bulking agents, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives).
  • a flavoring agent, a fragrance, a coating agent, a diluent, etc.), and other medicinal ingredients, etc. can be appropriately combined and prepared according to a conventional method.
  • the food contains delphinidin-3-rutinoside, cyanidin-3-rutinoside or a combination thereof as an active ingredient for improving menopausal symptoms.
  • the form of the food can be solid, semi-solid or liquid (eg beverage).
  • the food include soft drinks, tea-based beverages, coffee beverages, fruit juice beverages, carbonated beverages, jelly-like beverages, near-water beverages, and foods and drinks such as jelly, wafers, biscuits, bread, noodles, and sausages.
  • the food product may be a supplement in the form of an orally administered preparation such as tablets, capsules, granules, powders, liquids and syrups.
  • the food may contain delphinidin-3-rutinoside, cyanidin-3-rutinoside or a combination thereof in any food material, or other active ingredient, or food-acceptable additives (eg, solvents, softeners, oils, emulsifiers).
  • food-acceptable additives eg, solvents, softeners, oils, emulsifiers.
  • Preservatives, acidulants, sweeteners, bitterness agents, pH regulators, stabilizers, colorants, UV absorbers, antioxidants, moisturizers, thickeners, fixatives, dispersants, fluidity improvers, wet It can be prepared according to a conventional method by appropriately combining it with an agent, a fragrance, a seasoning, a flavor adjusting agent, or the like.
  • the content of delphinidin-3-rutinoside, cyanidin-3-rutinoside or a combination thereof in the above-mentioned pharmaceutical products, quasi-drugs or foods may vary depending on their dosage forms and forms.
  • the total amount of delphinidin-3-lutinoside and cyanidin-3-lucinoside is 0.1% by mass or more. Is more preferable, 0.5% by mass or more is more preferable, 1% by mass or more is further preferable, 5% by mass or more is further preferable, and 10% by mass or more is further preferable.
  • the total amount of delphinidin-3-lutinoside and cyanidin-3-lutinoside is 0.001% by mass. % Or more is preferable, 0.005% by mass or more is more preferable, 0.01% by mass or more is further preferable, and 0.05% by mass or more is further preferable.
  • the dosage and dosing regimen of delphinidin-3-lucinoside, cyanidin-3-lucinoside or a combination thereof can be appropriately determined by those skilled in the art according to the species, weight, sex, age, condition, or other factors of interest.
  • Hormone replacement therapy for menopausal symptoms is a complex combination of risks and benefits, and while suitable for symptom management in some women, it has been suggested that it may increase the risk of serious illness (JAMA,). 288 (3), 321-333, 2002; JAMA, 310 (13), 1353, 2013). Therefore, it is important to improve the indefinite complaints of menopause within the range where hormone-like action is not expressed.
  • the dose of delphinidin-3-rutinoside, cyanidin-3-rutinoside or a combination thereof is the total amount of delphinidin-3-rutinoside and cyanidin-3-rutinoside, for example, per day for one adult (60 kg). From the viewpoint of the intake concentration that does not exhibit hormonal action, it is preferably 1 mg or more, more preferably 10 mg or more, further preferably 25 mg or more, and preferably 150 mg or less, more preferably 100 mg or less, still more preferably 50 mg or less. Is.
  • the dose of delphinidin-3-lucinoside, cyanidin-3-lutinoside or a combination thereof is the total amount of delphinidin-3-lucinoside and cyanidin-3-lucinoside, and is 1 to 1 to 1 adult (60 kg) per day. It is 150 mg, more preferably 10 to 100 mg, still more preferably 25 to 50 mg.
  • the administration or ingestion period is not particularly limited, but is preferably continuous, more preferably 1 week or longer, still more preferably 2 weeks or longer.
  • the timing of administration or ingestion is not particularly limited, but is preferably after breakfast and / or between dinner and bedtime, and between dinner and bedtime, 30 minutes to 3 hours before the desired time of sleep is more preferable. It is preferable, and more preferably 1 to 2 hours before.
  • the subject to which the climacteric symptom improving agent of the present invention is administered or ingested is preferably a human or non-human animal that needs or desires to improve the climacteric symptom. More preferably, ingestion or administration to humans or non-human animals in which hot flashes and sweating are observed as menopausal symptoms is effective.
  • the human is preferably a climacteric human, more preferably a climacteric female.
  • the present invention further discloses the following aspects.
  • ⁇ 3> Use of delphinidin-3-rutinoside, cyanidin-3-rutinoside or a combination thereof for producing a menopausal symptom improving agent.
  • ⁇ 4> Use of delphinidin-3-lutinoside, cyanidin-3-lutinoside or a combination thereof for producing foods for improving menopausal symptoms.
  • a method for improving menopausal symptoms in which delphinidin-3-rutinoside, cyanidin-3-rutinoside or a combination thereof is administered or ingested in an effective amount to a subject in need thereof.
  • the menopausal symptoms are preferably dizziness, headache, insomnia, hot flashes, hot flashes, sweating, palpitation, nausea, constipation, diarrhea, stiff shoulders, lower back pain, joint pain, frequent urination, skin and Dry mucous membranes or eczema, more preferably hot flashes or sweating.
  • delphinidin-3-lucinoside and cyanidin-3-lucinoside are preferably derived from blackcurrant extract.
  • the dose of delphinidin-3-lucinoside, cyanidin-3-lucinoside or a combination thereof is the total amount of delphinidin-3-lucinoside and cyanidin-3-lucinoside, and is one adult.
  • it is preferably 1 mg or more, more preferably 10 mg or more, still more preferably 25 mg or more, and preferably 150 mg or less, more preferably 100 mg or less, still more preferably 50 mg or less, per day. Further, it is preferably 1 to 150 mg, more preferably 10 to 100 mg, still more preferably 25 to 50 mg.
  • Example 1 Purification of blackcurrant anthocyanin>
  • Crude fraction of blackcurrant extract Fractionation of anthocyanins and others using commercially available blackcurrant extract (cassis polyphenol AC10, total amount of blackcurrant anthocyanin 11.8 wt%, manufactured by Meiji Food Materia Co., Ltd.) It was decided to. Fractionation with synthetic adsorbent resin was performed with reference to the literature (polyphenols: functional ingredients of medicinal plants and foods, CMC Publishing, 250-251, 2012).
  • Example 2 Human efficacy test for menopausal symptoms of blackcurrant extract> (1) Subjects There were 17 healthy women in their 40s to 50s, and the average age of the subjects at the start of the study was 51.5 ⁇ 1.4 years.
  • cassis extract containing D3R and C3R (cassis polyphenol AC10, total amount of cassis anthocyanin 11.8 wt%, D3R 5.4 wt%, C3R 3.8 wt%, manufactured by Meiji Food Materia Co., Ltd.) was made into sugar-coated grains, and the amount of blackcurrant extract was 100 mg per sugar-coated grain.
  • the cassis extract has an effect of reducing climacteric symptoms, particularly hot flashes and sweating, and that ingestion of the cassis extract can improve climacteric symptoms, especially hot flashes and sweating.
  • TRPV4 activity inhibitory effect (1) Preparation of human TRPV4 gene expression vector Human TRPV4 published by using the cDNA obtained by reverse transcription of totalRNA extracted from human duodenal-derived cells (Hutu-80 cells, purchased from American Type Culture Collection) as a template. A polymerase chain reaction (PCR) was carried out under the following conditions using a primer set consisting of oligonucleotides represented by the nucleotide sequences shown below, which was synthesized with reference to the gene sequence.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR conditions > a) PCR solution composition cDNA (Template) 15 ⁇ L 5x PrimeStar GXL Buffer 10 ⁇ L dNTPs mixture (2.5 mM) 4 ⁇ L PrimeStar GXL DNA Polymerase (Takara Bio) 1 ⁇ L Forward Primer (10 ⁇ M) 1 ⁇ L Reverse Primer (10 ⁇ M) 1 ⁇ L Water 18 ⁇ L b) Temperature and cycle conditions 95 ° C 2min ⁇ 98 °C 10sec 33 cycles 70 °C 2min
  • the obtained PCR product was purified using High Pure PCR Product Purification Kit (manufactured by Roche).
  • a human TRPV4 gene expression vector was prepared using the purified PCR product and pcDNA3.1DirectionalTOPOExpressionKit (manufactured by Invitrogen).
  • the intracellular calcium ion influx activity was measured using Calcium Kit II-fluo 4 (trade name, DOJINDO).
  • a loading buffer containing Fluo4-AM was added to the human TRPV4-expressing cells prepared in (2) above at 90 ⁇ L / well, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the fluorescence intensity (excitation wavelength: 488 nm, fluorescence wavelength: 524 nm) was measured every 2 seconds using a fluorescence plate reader (FDSS / ⁇ CELL drug discovery screening support system C13299, manufactured by Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) at 37 ° C.
  • GSK1016790a manufactured by Sigma
  • D3R, C3R, D3G, and C3G were diluted with the dilution buffer of the measurement kit, respectively, and they were diluted.
  • a mixed solution (mixed immediately before addition) was added at 20 ⁇ L / well, and the change in fluorescence intensity was measured every 2 seconds for up to 300 seconds.
  • GSK1016790a was added so as to have a final concentration of 10 nM, and the evaluation concentration of each anthocyanin was set based on the content in the blackcurrant extract.
  • the TRPV4 activity of the sample was calculated by the following formula, assuming that the calcium ion influx rate by the treatment of GSK1016790a, which is a TRPV4 agonist, was 100%.
  • Fluorescence intensity F0 Fluorescence intensity of the same well as F300 immediately after the start of measurement
  • F0C1 Fluorescence intensity of the same well as F300C1 immediately after the start of measurement
  • F0C2 Fluorescence intensity of the well to which only the solvent immediately after the start of measurement is added
  • the cassis extract and the ethanol fraction of the cassis extract significantly reduced the calcium ion influx.
  • a mixture (MIX) of D3R, C3R, D3G, and C3G, which are the main components of the ethanol fraction significantly reduces calcium ion influx, and in particular, D3R significantly reduces calcium ion influx, and C3R contains calcium. There was a tendency to reduce ion influx.
  • TRPV4 activity is suppressed by applying cassis extract or D3R, C3R.
  • the blackcurrant extract or D3R, C3R is effective in suppressing TRPV4 activity.
  • cassis extract or D3R, C3R having an action of suppressing TRPV4 activity is effective in improving menopausal symptoms.

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Abstract

更年期症状の改善に有用な更年期症状改善剤の提供。　デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを有効成分とする更年期症状改善剤。

Description

更年期症状改善剤
　本発明は、更年期症状改善剤に関する。
　女性の更年期には、不定愁訴として全身倦怠感、めまい、頭痛、不眠、のぼせ、ほてり、発汗、動悸、吐き気、下痢、肩こり、腰痛、頻尿等の様々な身体的愁訴が出現する。なかでも、ホットフラッシュ（のぼせ、ほてり）、発汗は更年期に特徴的な症状であり、多くの女性にみられる。
　更年期の症状は、加齢に伴う女性ホルモン（エストロゲン）の分泌低下によるものと考えられている。そのため、更年期症状に対する一般的な治療法はホルモン補充療法（ＨＲＴ）である。ＨＲＴでは、エストロゲン又はエストロゲンとプロゲステロンが投与される。
　しかしながら、更年期症状はエストロゲンの減少だけでなく、仕事や家庭環境等に起因する社会的、心理的な要因が複雑に関与するといわれている。また、ＨＲＴには乳がんや子宮体がんの発症率を高めるといったマイナスの面が指摘されており、より安全に更年期の不定愁訴を改善することが求められている。
　一方、カシス（学名：Ribes nigrum）は黒すぐり、ブラックカラントとも呼ばれるユキノシタ科スグリ属に分類される植物で、４種類のアントシアニンを多く含む。カシスアントシアニンのうちルチノシド体であるデルフィニジン‐３‐ルチノシドとシアニジン‐３‐ルチノシドはカシスアントシアニンの特徴的成分である。カシスアントシアニンは、血流改善作用を有し、肩凝り、全身倦怠感等を緩和すること（特許文献１）、エストロゲン作用を有すること（非特許文献１）が報告されている。
　しかしながら、カシスアントシアニンに更年期症状の改善作用があるかは明らかになっていない。
　　（特許文献１）国際公開第２００１／０１７９８号
　　（非特許文献１）Molecules, 23(1), 74, 2018
　本発明は、以下の１）～７）に係るものである。
１）デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを有効成分とする更年期症状改善剤。
２）デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを有効成分とする更年期症状改善用食品。
３）更年期症状改善剤を製造するためのデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの使用。
４）更年期症状改善用食品を製造するためのデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの使用。
５）更年期症状改善に使用するためのデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせ。
６）更年期症状を改善するためのデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの非治療的使用。
７）デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを、それを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する更年期症状の改善方法。
カシスアントシアニン精製の流れを示すグラフ。 カシスアントシアニンの分取ＨＰＬＣのクロマトグラム。 Ｆｒ．Ｅ－３～－６の1Ｈ、13Ｃ－ＮＭＲスペクトル。
発明の詳細な説明
　本発明は、更年期症状の改善に有用な更年期症状改善剤を提供することに関する。
　本発明者は、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドにホットフラッシュ（のぼせ、ほてり）、発汗といった更年期の症状を改善する効果があることを見出した。
　本発明の更年期症状改善剤によれば、ホットフラッシュ（のぼせ、ほてり）、発汗等の更年期の症状を改善することができる。
　本発明においてデルフィニジン‐３‐ルチノシドは、デルフィニジン３位の水酸基にラムノシル－（α１→６）－グルコースが結合した配糖体で、以下の構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明においてシアニジン‐３‐ルチノシドは、シアニジン３位の水酸基にラムノシル－（α１→６）－グルコースが結合した配糖体で、以下の構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドは、塩や溶媒和物であってもよく、いずれも包含される。また、これらは各々単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。なかでも、所望の効果を得やすい点で、デルフィニジン‐３‐ルチノシドを用いることが好ましい。
　デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドは、化学合成すること、或いはこれらを含有する天然物、特に植物から抽出・精製することにより取得することができる。また、試薬として市販されているものを用いることができる。デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドは、カシス（学名：Ribes nigrum）に見出されることから、カシス抽出物に由来するものを使用することが好ましい。カシス抽出物をデルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドとして使用してもよい。
　カシスの使用部位は、特に限定されず、植物全体、葉、茎、花、芽、蕾、果皮、果実、根、根茎、種子等又はそれらの組み合わせであり得るが、カシスアントシアニンを豊富に含むことから果実又は果皮を用いるのが好ましい。カシスは、生のまま、乾燥又はそれらを処理して用いることができる。処理としては、例えば、切断、破砕、磨砕、粉砕等が挙げられる。
　抽出方法は、適宜選択することができ、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超臨界抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出等のいずれでもよい。
　抽出の為の溶媒には、極性溶媒、非極性溶媒のいずれをも使用することができる。溶媒の具体例としては、例えば、水；１価、２価又は多価のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等の鎖状又は環状のエーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ヘキサン等の飽和又は不飽和の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ピリジン類；ジメチルスルホキシド；アセトニトリル；二酸化炭素、超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他のオイル類；並びにこれらの混合物が挙げられる。好適には、アルコール類及びその水溶液が挙げられ、アルコール類としてはメタノール、エタノール、１，３－ブチレングリコール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔ－ブタノール等が挙げられ、好ましくはエタノール及びエタノール水溶液である。
　抽出における溶媒の使用量、抽出条件は、十分な抽出が行える条件であれば特に限定されず、適宜調整することができる。
　カシス抽出物は、食品や医薬品上許容し得る規格に適合し、カシスアントシアニンを含み本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよい。また、必要に応じて、液々分配、固液分配、濾過膜、活性炭、合成吸着樹脂、イオン交換樹脂、澱出し等の公知の技術によって不活性な夾雑物の除去、脱臭、脱色等の処理を施すことができる。
　また、さらに公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
　カシス抽出物は、そのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、あるいは濃縮エキスや乾燥粉末としたもの、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、水・エタノール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
　カシス抽出物は、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの合計量で、０．１質量％以上含有することが好ましく、１０質量％以上含有することがより好ましい。
　後述する実施例に示すように、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの経口摂取によって、更年期症状であるホットフラッシュ及び発汗が改善する。カシスアントシアニンは、エストロゲン作用を有することが報告されているが（Molecules, 23(1), 74, 2018）、カシスアントシアニンのエストロゲン作用はエストラジオールの１０００分の１程度の作用であることから（同文献）、今般のヒト有効性試験で用いたカシスアントシアニンは、ホルモン補充療法（ＨＲＴ）の１０分の１程度のエストロゲン作用を有すると考えられる。よって、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドはエストロゲン活性化に因らずに更年期症状を改善すると考えられる。
　一方、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドは、ＴＲＰＶ４作動薬の存在下で、ヒトＴＲＰＶ４遺伝子導入によりＴＲＰＶ４が機能的に発現している形質転換細胞（ＴＲＰＶ４発現細胞）と接触させた場合、ＴＲＰＶ４作動薬による細胞内の陽イオン（Ｃａ2+）量の流入を抑制するという、ＴＲＰＶ４の活性を抑制する作用を有することが確認された（参考例１）。
　ＴＲＰＶ４（Transient receptor potential cation channel subfamily V member 4）は、温度感受性ＴＲＰチャネルを構成するタンパク質の１つである。ＴＲＰＶ４は、腎臓、肺、膀胱、心臓、皮膚、脳、消化管等の幅広い組織で発現しており、浸透圧変化・温度変化・血流によって生じるせん断応力・臓器の容積変化といった様々な物理化学的刺激を感知し、細胞に伝達するセンサー分子として機能すると考えられている。
　ＴＲＰＶ４の活性抑制作用が知られているクロロゲン酸、カフェ酸、フェルラ酸は、自律神経機能及び不定愁訴を改善することが報告されていることから（特許第６０７５８３０号、特許第５９３１６３３号、特許第４０７７１４９号）、ＴＲＰＶ４の活性を抑制することで、更年期女性の不定愁訴を改善できると考えられる。よって、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドはＴＲＰＶ４の活性抑制を介して更年期症状を改善すると推察される。
　従って、デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせは、更年期症状改善剤となり得、更年期症状の改善のために使用することができ、また、更年期症状改善剤を製造するために使用することができる。
　ここで、「使用」は、ヒト又は非ヒト動物における使用であり、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
　日本産科婦人科学会は、更年期症状及び更年期障害を「閉経の前後５年間を更年期といい、この期間に現れる多種多様な症状の中で、器質的変化に起因しない症状を更年期症状と呼び、これらの症状の中で日常生活に支障を来す病態を更年期障害とする」と定義している（女性医学ガイドブック　更年期医療編　２０１４年度版，日本女性医学学会編）。
　更年期症状としては、例えば、めまい、頭痛、不眠、のぼせ、ほてり、発汗、動悸、吐き気、便秘、下痢、肩こり、腰痛、関節痛、頻尿、皮膚や粘膜の乾燥、湿疹等が挙げられる。本明細書における「更年期症状改善」とは、更年期症状を改善することを意味し、好ましくはホットフラッシュ、発汗の改善である。
　本明細書において、「ホットフラッシュ」とは、更年期において突発的に自覚する頭部、胸部、又は全身に起こる熱感（のぼせ、ほてり）をいう。
　「改善」とは、症状若しくは状態の好転、症状若しくは状態の悪化の防止若しくは遅延、又は症状若しくは状態の進行の逆転、防止若しくは遅延をいう。
　本発明の更年期症状改善剤は、それ自体、更年期症状の改善の作用効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、食品となり、或いは当該医薬品、医薬部外品、食品に配合して使用される素材又は製剤となり得る。
　当該食品には、更年期症状の改善効果をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した機能性表示食品、特定保健用食品、サプリメント等が包含される。これらの食品は機能表示が許可された食品であるため、一般の食品と区別することができる。
　当該医薬品（医薬部外品も含む）は、デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを、更年期症状の改善のための有効成分として含有する。さらに、該医薬品は、該有効成分の機能が失われない限りにおいて、必要に応じて薬学的に許容される担体、又は他の有効成分、薬理成分等を含有していてもよい。
　当該医薬品（医薬部外品も含む）の剤形としては、例えば、錠剤（チュアブル錠等を含む）、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤等の経口固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口液状製剤、注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等の非経口投与製剤が挙げられる。好ましい投与形態は経口投与である、
　これらの剤形の製剤は、カシスアントシアニンを、薬学的に許容される担体（例えば賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、希釈剤等）、他の薬効成分等と適宜組み合わせて、定法に従って調製することができる。
　当該食品は、デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを、更年期症状の改善のための有効成分として含有する。食品の形態は、固形、半固形又は液状（例えば飲料）であり得る。該食品の例としては、例えば、清涼飲料水、茶系飲料、コーヒー飲料、果汁飲料、炭酸飲料、ゼリー状飲料、ニアウォーター等の飲料、ゼリー、ウエハース、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品や栄養食等の各種食品、ならびにそれらの原料が挙げられる。あるいは、該食品は、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、液剤、シロップ等の経口投与製剤の形態を有するサプリメントであってもよい。
　当該食品は、デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを、任意の食品材料、もしくは他の有効成分、又は食品に許容される添加物（例えば、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、酸味料、甘味料、苦味料、ｐＨ調整剤、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤、固着剤、分散剤、流動性改善剤、湿潤剤、香科、調味料、風味調整剤）等と適宜組み合わせて、定法に従って調製することができる。
　上記医薬品、医薬部外品又は食品におけるデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの含有量は、それらの剤形や形態により異なり得る。例えば、食品若しくは経口投与製剤で且つ錠剤、顆粒剤、丸剤、散剤、グミ剤等の固形の場合は、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの合計量で、０．１質量％以上が好ましく、０．５質量％以上がより好ましく、１質量％以上がさらに好ましく、５質量％以上がさらに好ましく、１０質量％以上がさらに好ましい。
　食品若しくは経口投与製剤で且つ液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤、ゼリー剤等の液体の場合は、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの合計量で、０．００１質量％以上が好ましく、０．００５質量％以上がより好ましく、０．０１質量％以上がさらに好ましく、０．０５質量％以上がさらに好ましい。
　デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの投与量及び投与計画は、対象の種、体重、性別、年齢、状態、又はその他の要因に従って当業者により適宜決定することができる。
　更年期症状に対するホルモン補充療法はリスクとベネフィットが複雑に絡み合っており、一部の女性の症状管理には適しているが、重篤な疾病のリスクを増加させる可能性が示唆されている（JAMA, 288(3), 321-333, 2002; JAMA, 310(13), 1353, 2013）。その為、ホルモン様作用の発現が無い範囲で更年期の不定愁訴を改善することが重要になる。したがって、デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの投与量は、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの合計量で、例えば、成人１人（６０ｋｇ）に対して１日あたり、ホルモン作用を発現しない摂取濃度の観点から、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上、更に好ましくは２５ｍｇ以上であり、また、好ましくは１５０ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下、更に好ましくは５０ｍｇ以下である。
　デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの投与量は、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの合計量で、成人１人（６０ｋｇ）に対して１日あたり、１～１５０ｍｇ、より好ましくは１０～１００ｍｇ、更に好ましくは２５～５０ｍｇである。
　本発明では、上記の用量を、例えば、１日に１回、２回又は３回以上に分け、投与又は摂取することが好ましい。投与又は摂取期間は、特に限定されないが、好ましくは継続的であり、より好ましくは１週間以上、さらに好ましくは２週間以上である。
　投与又は摂取のタイミングは、特に限定されないが、朝食後及び／又は夕食後から就寝までの間が好ましく、夕食後から就寝までの間では、睡眠を希望する時間の３０分間～３時間前がより好ましく、１時間～２時間前がより好ましい。
　本発明の更年期症状改善剤を投与又は摂取させる対象者としては、更年期症状の改善を必要とする或いは望むヒト又は非ヒト動物が好ましい。より好ましくは更年期症状としてホットフラッシュ、発汗が認められるヒト又は非ヒト動物への摂取又は投与が有効である。該ヒトは、好ましくは更年期のヒトであり、より好ましくは更年期の女性である。
　上述した実施形態に関し、本発明は以下の態様をさらに開示する。
＜１＞デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを有効成分とする更年期症状改善剤。
＜２＞デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを有効成分とする更年期症状改善用食品。
＜３＞更年期症状改善剤を製造するためのデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの使用。
＜４＞更年期症状改善用食品を製造するためのデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの使用。
＜５＞更年期症状改善に使用するためのデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせ。
＜６＞更年期症状を改善するためのデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの非治療的使用。
＜７＞デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを、それを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する更年期症状の改善方法。
＜８＞＜１＞～＜７＞において、更年期症状は、好ましくはめまい、頭痛、不眠、のぼせ、ほてり、発汗、動悸、吐き気、便秘、下痢、肩こり、腰痛、関節痛、頻尿、皮膚や粘膜の乾燥、又は湿疹であり、より好ましくはホットフラッシュ、又は発汗である。
＜９＞＜１＞～＜８＞において、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドは、好ましくはカシス抽出物に由来する。
＜１０＞＜１＞～＜９＞において、デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの投与量は、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの合計量で、成人１人（６０ｋｇ）に対して１日あたり、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上、更に好ましくは２５ｍｇ以上であり、また、好ましくは１５０ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下、更に好ましくは５０ｍｇ以下であり、また、好ましくは１～１５０ｍｇ、より好ましくは１０～１００ｍｇ、更に好ましくは２５～５０ｍｇである。
＜実施例１　カシスアントシアニンの精製＞
（１）カシス抽出物の粗分画
　市販品のカシス抽出物（カシスポリフェノールＡＣ１０、カシスアントシアニン総量１１．８ｗｔ％、（株）明治フードマテリア社製）を用いて、アントシアニン類とそれ以外に分画することとした。文献（ポリフェノール：薬用植物および食品の機能性成分, シーエムシー出版, ２５０－２５１, ２０１２）を参考に、合成吸着樹脂による分画を行った。その結果、アントシアニン類含有画分（ＥｔＯＨ溶出画分、ＨＰＬＣ分析クロマトにおける４つのピークがそれらに該当と判断、４２．２ｗｔ％）と、それより高極性の画分（Ｈ2Ｏ溶出画分、６０．０ｗｔ％）とに分画された（図１参照）。
（２）ＥｔＯＨ画分からのアントシアニン精製
　ＥｔＯＨ画分（アントシアニン類含有画分）より、アントシアニン類の精製を行った。分析ＨＰＬＣの条件を参考に、ＯＤＳ分取ＨＰＬＣによる分画を行った。その結果、４種のアントシアニン類精製画分とそれ以外の画分の計８画分（Ｆｒ．Ｅ－１：１４．９ｗｔ％、Ｆｒ．Ｅ－２：１．９１ｗｔ％、Ｆｒ．Ｅ－３：１．９１ｗｔ％、Ｆｒ．Ｅ－４：６．４１ｗｔ％、Ｆｒ．Ｅ－５：１．１０ｗｔ％、Ｆｒ．Ｅ－６：４．６５ｗｔ％、Ｆｒ．Ｅ－７：０．４４ｗｔ％、Ｆｒ．Ｅ－８：６．２７ｗｔ％）に分画された（図２参照）。
（３）精製アントシアニン類の同定
　分取ＨＰＬＣで４つの主要ピークをそれぞれ分離精製したので、次にそれらの同定を行った。文献（J Agric Food Chem, 50(11), 3228-3231, 2002）のＨＰＬＣ分析クロマトと比較すると、Ｆｒ．Ｅ－３がデルフィニジン－３－グルコシド（１，Ｄ３Ｇ），Ｆｒ．Ｅ－４がデルフィニジン－３－ルチノシド（２、Ｄ３Ｒ）、Ｆｒ．Ｅ－５がシアニジン－３－グルコシド（３、Ｃ３Ｇ）、Ｆｒ．Ｅ－６がシアニジン－３－ルチノシド（４，Ｃ３Ｒ）の可能性が高いと考えられた。そこで、それぞれの1Ｈ、13Ｃ－ＮＭＲを測定し、各シグナルの帰属および、文献（J Sep Sci, 40(17), 3506-3512, 2017）との比較をおこなったところ、推定通りであることが確認された（図３参照）。
＜実施例２　カシス抽出物の更年期症状に対するヒト有効性試験＞
（１）対象者
　４０歳代～５０歳代の健常女性１７名で、試験開始時における対象者の平均年齢は５１．５±１．４歳であった。
（２）試験品の作製
　Ｄ３Ｒ及びＣ３Ｒを含む市販品のカシス抽出物（カシスポリフェノールＡＣ１０、カシスアントシアニン総量１１．８ｗｔ％、Ｄ３Ｒ５．４ｗｔ％、Ｃ３Ｒ３．８ｗｔ％、（株）明治フードマテリア社製）を糖衣粒にし、糖衣粒１粒当たりカシス抽出物が１００ｍｇになるよう作製した。
（３）糖衣粒の摂取方法
　糖衣粒（２粒／回）を１５０ｍＬのミネラルウォーターと一緒に、１日２回（朝食後３０分以内、及び就寝６０～３０分前）で２８日間摂取した。
（４）更年期症状の評価方法
　カシス抽出物含有糖衣粒の摂取前後において、更年期症状の程度をクッパーマン更年期障害指数を用いて評価した。また、ホットフラッシュ及び発汗回数は、生活日誌を用いて評価した。なお、試験期間中は、下記の点に注意して試験を行った。
（注意事項）
（ｉ）普段通りの生活スタイルを維持するよう心がける。
（ii）普段と同様の食生活を心がける。
（iii）運動習慣を変えない。
（iv）暴飲暴食や極端な減食（ダイエット）は控える。
（ｖ）新たなサプリメントの摂取を始めない。
（５）統計学的検定
　得られた結果は、平均値±標準誤差で示し、カシス抽出物含有糖衣粒の摂取前後の比較にはウィルコクソンの符号順位検定を用いた。
　カシス抽出物含有糖衣粒の摂取前後において、クッパーマン更年期障害指数の合計点が、２３．７±１．９から１７．６±２．０に有意に低減するとともに、クッパーマン更年期障害指数の重症度評価段階も、２．８±０．２から１．９±０．２に有意に低減した（Ｐ＜０．０５）。また、クッパーマン更年期障害指数の血管運動神経様症状である「顔が熱くなる（ほてる）」「汗をかきやすい」という設問のスコアが、それぞれ６．８±０．８から４．５±０．７に、また６．８±０．８から４．０±０．９に有意に低減した（Ｐ＜０．０５）。
　カシス抽出物含有糖衣粒の摂取前後において、１日あたりのホットフラッシュ発生回数が１．２±０．３（回）から０．５±０．３（回）に有意に低減するとともに、１日あたりの発汗回数も、１．２±０．４（回）から０．６±０．３（回）に有意に低減した（Ｐ＜０．０５）
　以上の結果から、カシス抽出物は更年期症状、特にホットフラッシュ及び発汗を軽減する効果を有し、これを摂取することにより更年期症状、特にホットフラッシュ及び発汗を改善できることが明らかとなった。
＜参考例１　ＴＲＰＶ４活性抑制作用の評価＞
（１）ヒトＴＲＰＶ４遺伝子発現ベクターの作製
　ヒト十二指腸由来細胞（Hutu-80細胞、American Type Culture Collectionより購入）から抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡを鋳型にして、公開されているヒトＴＲＰＶ４遺伝子配列を参考に合成した、下記に示す塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて、下記の条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
＜プライマーセット＞
フォワードプライマー；５’－CACCATGGCGGATTCCAGCGAAGGCCC－３’（配列番号１）
リバースプライマー；５’－CTAGAGCGGGGCGTCATCAGTCC－３’（配列番号２）
＜ＰＣＲ条件＞
ａ）ＰＣＲ溶液組成
　cDNA（Template）　　　　　　　　　　　　　　　　１５μＬ
　5x PrimeStar GXL Buffer                         １０μＬ
　dNTPs mixture（２．５ｍＭ）　　　　　　　　　 　　４μＬ
　PrimeStar GXL DNA Polymerase（タカラバイオ）　　　１μＬ
　Forward Primer（１０μＭ）　　　　　　　　　　　　１μＬ
　Reverse Primer（１０μＭ）　　　　　　　　　　　　１μＬ
　Water                                           １８μＬ
ｂ）温度とサイクル条件
　９５℃　２min
　↓
　９８℃　１０sec  ３３　cycles
　７０℃　　２min
　得られたＰＣＲ産物をHigh Pure PCR Product Purification Kit（ロッシュ社製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物と、pcDNA3.1 Directional TOPO Expression Kit（インビトロジェン社製）を用いて、ヒトＴＲＰＶ４遺伝子発現ベクターを作製した。
（２）ヒトＴＲＰＶ４発現細胞の作製
　１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン社製）を用いて、ヒト子宮頸癌由来細胞株（ＨｅＬａ細胞、American Type Culture Collectionより購入）の培養を行った。ＨｅＬａ細胞を１０ｃｍ細胞培養用ディッシュに２×１０5ｃｅｌｌｓ／ディッシュで播種した。培養２日後、前記（１）で作製したヒトＴＲＰＶ４遺伝子発現用ベクター（７．７μｇ）をTransIT-HeLaMONSTER Transfection Kit(Mirus社製）を用いて細胞にトランスフェクションし、１日培養した。
　Detachin(Genlantis社製）で細胞をはがし96well Optical bottom plate(Nunc社製）に１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２．０×１０4ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ｗｅｌｌの細胞密度で播き、さらに１日培養した。
（３）細胞内カルシウムイオン流入活性の測定
　細胞内カルシウムイオン流入活性の測定は、Calcium Kit II- fluo 4(商品名、DOJINDO）を用いて行った。Fluo4-AMを含有したLoading bufferを前記（２）で作製したヒトＴＲＰＶ４発現細胞に９０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。その後、３７℃で蛍光プレートリーダー（FDSS/μCELL　創薬スクリーニング支援システムC13299、浜松ホトニクス社製）を用いて蛍光強度（励起波長：４８８ｎｍ、蛍光波長：５２４ｎｍ）を２秒毎に測定した。測定開始３０秒後にＴＲＰＶ４作動薬であるGSK1016790a(Sigma社製）と検体として前記製造例で調製したカシス抽出物、またはＤ３Ｒ、Ｃ３Ｒ、Ｄ３Ｇ、Ｃ３Ｇをそれぞれ測定キットの希釈ｂｕｆｆｅｒで希釈し、それらの混合溶液（添加直前に混合）を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３００秒まで２秒毎に蛍光強度変化を測定した。なお、GSK1016790aは終濃度１０ｎＭとなるように添加し、各アントシアニンの評価濃度は、カシス抽出物中の含有率を基に設定した。
　検体のＴＲＰＶ４活性は、ＴＲＰＶ４作動薬であるGSK1016790aの処理によるカルシウムイオン流入率を１００％として、次式により算出した。
（数式）
　カルシウムイオン流入率（％）＝［（F300/F0）－（F300C2/F0C2）］／［（F300C1/F0C1）－（F300C2/F0C2）］×100
　F300：測定開始３００秒後のGSK1016790aと検体を添加したウェルの蛍光強度
　F300C1：測定開始３００秒後のGSK1016790aと溶媒を添加したウェルの蛍光強度
　F300C2：測定開始３００秒後の溶媒のみを添加したウェルの蛍光強度
　F0：測定開始直後のF300と同じウェルの蛍光強度
　F0C1：測定開始直後のF300C1と同じウェルの蛍光強度
　F0C2：測定開始直後の溶媒のみを添加したウェルの蛍光強度
　検体を添加した場合のカルシウムイオン流入率を、GSK1016790a＋溶媒添加時と比較しDunnett's testを用いて検定した。カシス抽出物、またはＤ３Ｒ、Ｃ３Ｒ、Ｄ３Ｇ、Ｃ３Ｇを添加した場合の結果を、平均値±標準誤差として表に示す（表中、GSK1016790a、カシス抽出物、カシス抽出物エタノール画分、カシス抽出物水画分、Ｄ３Ｒ、Ｃ３Ｒ、Ｄ３Ｇ、Ｃ３Ｇ４種の混合物（Ｄ３Ｒ：４５．６ｗｔ％、Ｃ３Ｒ：３３．０ｗｔ％、Ｄ３Ｇ：１３．６ｗｔ％、Ｃ３Ｇ：７．８ｗｔ％）は、それぞれＧＳＫ、ＣａＥ、ＥｔＯＨ、Ｈ2Ｏ、ＭＩＸと略記）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表１より、カシス抽出物及びカシス抽出物のエタノール画分はカルシウムイオン流入を有意に低下させた。また、エタノール画分の主要成分であるＤ３Ｒ、Ｃ３Ｒ、Ｄ３Ｇ、Ｃ３Ｇ４種の混合物（ＭＩＸ）は、カルシウムイオン流入を有意に低下させ、特にＤ３Ｒはカルシウムイオン流入を有意に低下させ、Ｃ３Ｒにはカルシウムイオン流入を低下させる傾向が認められた。
　以上の結果から、カシス抽出物又はＤ３Ｒ、Ｃ３Ｒを適用することにより、ＴＲＰＶ４活性が抑制される。これは、カシス抽出物又はＤ３Ｒ、Ｃ３Ｒが、ＴＲＰＶ４活性の抑制に有効であることを示している。
　さらに、ＴＲＰＶ４活性を抑制する作用を有するカシス抽出物又はＤ３Ｒ、Ｃ３Ｒは更年期症状の改善に有効であることを示している。

Claims (25)

  1. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを有効成分とする更年期症状改善剤。
  2. 　更年期症状がホットフラッシュ、発汗である請求項１記載の更年期症状改善剤。
  3. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドがカシス抽出物に由来する請求項１又は２記載の更年期症状改善剤。
  4. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせが、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの合計量で、成人１人（６０ｋｇ）に対して１日あたり１～１５０ｍｇとなる量で投与又は摂取される請求項1～３のいずれか１項記載の更年期症状改善剤。
  5. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを有効成分とする更年期症状改善用食品。
  6. 　更年期症状がホットフラッシュ、発汗である請求項４記載の更年期症状改善用食品。
  7. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドがカシス抽出物に由来する請求項４又は５記載の更年期症状改善用食品。
  8. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせが、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの合計量で、成人１人（６０ｋｇ）に対して１日あたり１～１５０ｍｇとなる量で投与又は摂取される請求項５～７のいずれか１項記載の更年期症状改善用食品。
  9. 　更年期症状改善剤を製造するためのデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの使用。
  10. 　更年期症状改善用食品を製造するためのデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの使用。
  11. 　更年期症状がホットフラッシュ、発汗である請求項９又は１０記載の使用。
  12. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドがカシス抽出物に由来する請求項９～１１のいずれか１項記載の使用。
  13. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせが、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの合計量で、成人１人（６０ｋｇ）に対して１日あたり１～１５０ｍｇとなる量で投与又は摂取される請求項９～１２のいずれか１項記載の使用。
  14. 　更年期症状改善に使用するためのデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせ。
  15. 　更年期症状がホットフラッシュ、発汗である請求項１４記載のデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせ。
  16. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドがカシス抽出物に由来する請求項１４又は１５記載のデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせ。
  17. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの合計量で、成人１人（６０ｋｇ）に対して１日あたり１～１５０ｍｇとなる量で投与又は摂取される請求項１４～１６のいずれか１項記載のデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせ。
  18. 　更年期症状を改善するためのデルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせの非治療的使用。
  19. 　更年期症状がホットフラッシュ、発汗である請求項１８記載の非治療的使用。
  20. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドがカシス抽出物に由来する請求項１８又は１９記載の非治療的使用。
  21. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせが、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの合計量で、成人１人（６０ｋｇ）に対して１日あたり１～１５０ｍｇとなる量で投与又は摂取される請求項１８～２０のいずれか１項記載の非治療的使用。
  22. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを、それを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する更年期症状の改善方法。
  23. 　更年期症状がホットフラッシュ、発汗である請求項２２記載の方法。
  24. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドがカシス抽出物に由来する請求項２２又は２３記載の方法。
  25. 　デルフィニジン‐３‐ルチノシド、シアニジン‐３‐ルチノシド又はその組み合わせを、デルフィニジン‐３‐ルチノシド及びシアニジン‐３‐ルチノシドの合計量で、成人１人（６０ｋｇ）に対して１日あたり１～１５０ｍｇとなる量で投与又は摂取する請求項２２～２４のいずれか１項記載の方法。
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