JP6267557B2 - 筋萎縮抑制剤 - Google Patents
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Description
セイヨウワサビ(Armoracia rusticana)は、アブラナ科の耐寒性の多年草であり、古くから薬味として広く用いられ、また、本種由来の酵素ペルオキシダーゼは生化学実験で汎用されている。
しかしながら、斯かるクミンやセイヨウワサビに、アトロジン−1の発現抑制作用があること、筋萎縮抑制作用があることはこれまで全く知られていない。
(1)クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアトロジン−1発現抑制剤。
(2)クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制剤。
セイヨウワサビとは、アブラナ科のホースラディッシュ(horseradish、学名:Armoracia rusticana)を意味する。
斯かる植物は、それを圧搾することにより得られる搾汁、植物体自身を乾燥した乾燥物若しくはその粉砕物、あるいはこれらから抽出した抽出物として用いることができるが、抽出物として用いるのが好ましい。
公知の抽出方法としては、例えば、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超臨界抽出、超音波抽出及びマイクロ波抽出等が挙げられる。
より好適な水−アルコール系混合溶剤としては、20%(v/v)以上、好ましくは50%(v/v)以上、そして95%(v/v)以下、90%(v/v)以下のエタノール水溶液が挙げられる。例えば、20〜95%(v/v)エタノール水溶液、好ましくは50〜95%(v/v)エタノール水溶液が挙げられる。
また、本発明の植物又はその抽出物は、アトロジン−1発現抑制剤等を製造するために使用することができる。
より具体的には、フォークヘッド型転写因子であるFoxoを介したアトロジン−1のプロモーター活性の抑制(試験例1)、デキサメタゾン処理培養筋管細胞におけるアトロジン−1の発現抑制(試験例2)が挙げられる。
アトロジン−1プロモーターの上流にはFoxo結合配列が存在し、Foxoがアトロジン−1プロモーターに直接結合することで、アトロジン−1の転写を正に調節することが知られている(Cell 117: 399-412, 2004)。また、種々の筋萎縮においてFoxoの遺伝子発現が増加すること(FEBS Lett. 536: 232-236, 2003)、さらには、筋特異的にFoxo1を過剰発現させたFoxo1トランスジェニックマウスの骨格筋では、筋萎縮が生じるとともに、アトロジン−1遺伝子発現の増加が認められていることから(J Biol
Chem. 279: 41114-41123, 2004)、Foxoを介したアトロジン−1の発現を抑制することが、筋萎縮の抑制に繋がると考えられる。また、デキサメタゾンが、骨格筋においてアトロジン−1の発現を上昇させ、筋萎縮を誘導し(Crit. Care. Med. 35: S602-S608, 2007、J. Cell Biochem. 105: 353-364, 2008)、培養筋管細胞においてもデキサメタゾン処理により、アトロジン−1の発現が上昇することから、デキサメタゾン処理培養筋管細胞におけるアトロジン−1の発現抑制は、筋萎縮抑制の指標となる。
<1>クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアトロジン−1発現抑制剤。
<2>クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制剤。
<3>アトロジン−1発現抑制剤を製造するためのクミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の使用。
<4>筋萎縮抑制剤を製造するためのクミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の使用。
<5>アトロジン−1抑制に使用するためのクミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物。
<6>筋萎縮抑制に使用するためのクミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物。
<7>クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の有効量を投与又は摂取することによるアトロジン−1抑制方法。
<8>クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物の有効量を投与又は摂取することによる筋萎縮抑制方法。
<9>上記<5>〜<6>において、使用は非治療的使用である。
<10>上記<7>〜<8>において、方法は非治療的方法である。
<11>上記<7>〜<8>において、投与又は摂取の対象は、それぞれ筋萎縮抑制を必要とする若しくは希望する動物又はヒトである。
セリ科クミン〔Cuminum cyminum〕の種子(新和物産より入手)40gに、50%エタノール水400mLを加え、室温、静置条件にて、14日間抽出した。その後、ろ過により非抽出部と分離し、クミン50%エタノール抽出液323mLを得た。本抽出液の蒸発残分を測定したところ、1.64%(w/v)であった。
ホースラディッシュパウダー(商品名、ヤスマより入手)10gに、50%EtOH水溶液100mLを加え、室温、静置条件下で1週間抽出した後にろ過することで、抽出液を得た。抽出液の固形分濃度は3.74%(w/v)であった。
(1)マウスアトロジン−1プロモーター領域のクローニング及びレポータープラスミド構築
マウスアトロジン−1プロモーター領域としてエキソン1上流の約3.5kbの長さの領域をクローニングするために、フォワードプライマー(attggtacctcggtggaaggtctctgta[配列番号1])、リバースプライマー(attctcgagacggattgacagccaggaa[配列番号2])を利用し、マウスBACクローン(RP23−391D2;Children’s Hospital Oakland)を鋳型にし、DNAポリメラーゼ(TaKaRa LA−taqTM;宝酒造社)を用い、94℃1分間の後、94℃30秒、60℃30秒、及び72℃4分のサイクルを25回、続いて72℃5分間の条件でPCRを行った。得られたPCR産物をクローニングベクター(pGEMR−T Easy Vector Systems;プロメガ社)にサブクローニングし、制限酵素(Kpn1、Xho1:宝酒造社)処理によりDNA断片を調整した。調整したDNA断片をpGL3−Basicベクター(Promega)のマルチクローニングサイト(Kpn1/Xho1)に挿入し、pGL3−アトロジン−1を得た。
マウスFoxo1は、pENTR223.1ベクターに挿入されたFoxo1のCDS(Open Biosystems)をpcDNA−DEST40ベクター(Invitrogen)にLRクロナーゼ(Invitrogen)により挿入した。
マウス骨格筋細胞株(C2C12)を24穴プレートに播種し、DMEM培地(10%
ウシ胎児血清)中で1日培養した。pGL3−アトロジン−1プラスミドとウミシイタケ(renilla)由来ルシフェラーゼ発現ベクターであるphRL−TK(Promega)、pcDNA−DEST40−Foxo1を同時に各々トランスフェクション試薬(LipofectamineTM Reagent:Invitrogen)を用いて導入した。トランスフェクション4時間後にDMEM(5%チャコール処理ウシ胎児血清)に交換した。さらに4時間後に無血清培地(DMEM)に交換し、同時に被験物質として製造例1及び2で調製した植物抽出物(クミン抽出物:終濃度0.0328%(w/v)、セイヨウワサビ抽出物:終濃度0.0748%(w/v))を添加し、22時間培養した。
PBSにて洗浄後、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を用いて細胞を溶解、溶解液にルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。ルシフェラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼ活性/ウミシイタケルシフェラーゼ活性とし、Foxo1刺激を行っていない群を100とした際の相対値を計算した。統計は、unpaired student’s t−testを用い、有意水準はP<0.05とした。結果を図1に示す。
Foxo1により、アトロジン−1のプロモーター活性は有意に増加した。クミン抽出物及びセイヨウワサビ抽出物は、Foxo1による活性化を有意に抑制した。
マウス骨格筋細胞株C2C12(ATCC)をDMEM培地(10% ウシ胎児血清)にて培養し、DMEM培地(2% 馬血清)で分化誘導を行った。2日ごとに培地を交換し、分化誘導5日目にデキサメタゾン(Dex)終濃度1μMを含む分化培地に交換し、24時間培養した。製造例1及び2で調製した植物抽出物はデキサメタゾン添加時に、クミン抽出物については終濃度0.0328%(w/v)、セイヨウワサビ抽出物については終濃度0.0748%(w/v)で同時に添加した。デキサメタゾン処理後24時間後にRNAを回収した。
細胞のRNA抽出は、RNeasy mini kit(QIAGEN)を用いて、添付のプロトコール通りに行った。
各RNAは濃度を揃えた後、65℃で10分間の熱処理を行い、急冷後に1μgのRNAを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応はHigh Capacity RNA−to−cDNA Kit(アプライドバイオシステム社)を用いて、添付のプロトコールどおりに行った。反応後は4℃で急冷した。サンプルは使用まで−20℃で保存した。
逆転写反応によって得られたcDNAを鋳型として、ABI PRISM7700 Sequence Detector(アプライドバイオシステムズ社)によりリアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRの反応液組成は、10μL Fast SYBR
Green PCR Master Mix(アプライドバイオシステムズ社)、0.1μLの100μM 5’−プライマー及び3’−プライマー、4.8μL dH2Oとして、これに5μLのcDNAを加えて20μLの反応系で行い、得られた解析結果は36B4 mRNAの発現量を基準として補正し、相対的mRNA発現量として示した。用いたプライマーは表1に示した。統計は、unpaired student’s t−testを用い、有意水準はP<0.05とした。結果を図2に示す。
10週齢のBALB/cマウスを2週間予備飼育した後、体重(約27g)が等しくなるように、コントロール−対照食群(n=8)、尾懸垂−対照食群(n=9)、尾懸垂−クミン食群(n=7)、尾懸垂-セイヨウワサビ食群(n=7)の4群に群わけした。
製造例1及び2で調製した植物抽出物を用いて、表2に示す組成(単位は質量%)の各食餌を作製し、各食餌で7日間飼育した後に、尾懸垂処置を施した。尾懸垂処置は、マウスの尾に両面テープなどにより針金を固定し、この針金をケージの金網に固定することにより、マウス後肢が宙に浮いた状態にさせ、7日間放置した。尾懸垂処置終了後、マウス後肢のヒラメ筋重量を測定した。なお、尾懸垂処置期間中も各食餌を自由摂餌させた。統計は、unpaired student’s t−testを用い、有意水準はP<0.05とした。結果を、図3に示す。
Claims (4)
- クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアトロジン−1発現抑制剤。
- クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制剤。
- クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とするアトロジン−1発現抑制用食品組成物。
- クミン及びセイヨウワサビから選ばれる一種以上の植物又はその抽出物を有効成分とする筋萎縮抑制用食品組成物。
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