WO2012048446A1 - 锁阳化学成分作为植物雌激素的新用途 - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a new use of several chemical components in the traditional Chinese medicinal material Cynomorium, in particular, a new use of flavonoids and terpenoids in Cynomorium as phytoestrogens. Background technique
  • Cynomorium Lock P (Herba Cynomorii) is a dry fleshy stem of the Cynomorium «g»Wc « «Rupr. Cynomorium is sweet and warm, and it is a very rare natural rare plant. It has the functions of tonifying kidney yang, benefiting essence and blood, and relaxing the intestines. It is effective in treating impotence, nocturnal emission, weak waist, constipation, blood stasis, hematuria, and neurasthenia. Studies on the chemical constituents of Cynomorium indicate that Cynomorium contains flavonoids, triterpenoids, sugars and glycosides, tannins, body types, volatile constituents, organic acids, amino acids, inorganic elements and ions. The flavonoids include (+)-catechin, (-)-catechin, citrusin 4,-0-glucopyranoside, and citrus aglycones.
  • Estrogen is a key regulatory hormone in women. It is mainly produced by the ovary and placenta. Estrogen is classified as a steroid hormone according to its chemical structure. It is fat-soluble and has many target tissues, including reproductive system, bone and cardiovascular. Estrogen is mainly divided into two categories: steroidal estrogens and non-organic estrogens. Body estrogen is an endogenous component of the ovary secretion of mammals. There are currently three types of steroidal estrogens found in humans: estradiol, estriol and estrone isolated from pregnant women's urine. It is mainly composed of estradiol and has the strongest activity. Steroidal estrogen plays an important role in life-sustaining, regulatory functions, body development, immune regulation, dermatological treatment and fertility.
  • Non-steroidal estrogens are mainly stilbene glycosides. It is generally believed that estrogen binds to the corresponding estrogen receptor (ER) in the cell, thereby triggering a series of downstream events such as initiation of transcription, resulting in physiological effects.
  • the affinity of non-steroidal estrogens to the estrogen receptor is 1/100 or 1/1000 of estradiol. Because clinical long-term use of estrogen can cause shortcomings such as breast cancer, endometriosis and carcinogenesis, people are seeking alternatives to estrogen.
  • Phytoestrogen (PE) is a class of non-steroidal compounds widely found in plants that bind to ER in the body.
  • phytoestrogens have a good preventive and therapeutic effect in preventing tumors, treating cardiovascular diseases and osteoporosis, improving menopausal symptoms, protecting the nervous system, and not finding such defects. influences. Therefore, phytoestrogens are often studied as natural estrogen substitutes. Although the ability of PE to bind to estrogen receptors is only 1/500-1/1000 of estrogen, its side effects in hormone replacement therapy (HRT) are small, so researchers have a great interest in this and hope that PE is in HRT. Play a potential medical value.
  • HRT hormone replacement therapy
  • Estrogen has a wide range of physiological functions in the growth, development, cell differentiation and reproductive system of the body. Estrogen exerts various biological effects mainly through ER.
  • ER has two subtypes, ERoc and ERP, which are expressed differently in many tissues and cells of the human body. The expression levels of the two subtypes are different in the same tissue cells. The expression levels of the same subtypes in different tissue cells are also different, so the interaction of any ligand with Ero and ERP is intricate. The tissue distribution of ERa and ERP is different.
  • the expression of ERO is mainly in the uterus, mammary gland, fallopian tube and vaginal epithelium.
  • the expression of ERP is weak, while the ovary is dominant in the expression of ERP. Most of it is present in granulosa cells, and vascular smooth muscle cells are expressed. ⁇ Main.
  • the object of the present invention is to find phytoestrogens with estrogenic activity and/or no estrogenic side effects, providing a new therapeutic option for the clinic.
  • the present inventors have surprisingly discovered that some chemical components such as flavonoids and terpenoids extracted from the traditional Chinese medicine Cynomorium It has exact estrogenic activity and can be used as a phytoestrogens for the replacement of estrogen.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • a first aspect of the invention provides the use of Cynomorium for the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with insufficient secretion of estrogen from a mammal (e. g., human).
  • a second aspect of the present invention provides a Cynomorium extract comprising at least one component selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin gallate, citrus _4 '-0-glucopyrein, phlorizin.
  • a third aspect of the invention provides one or more active ingredients selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate , citrus _4'-0-glucoside, phlorizin.
  • a fourth aspect of the invention provides the use of a Cynomorium extract for the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a mammal (e.g., human).
  • a mammal e.g., human
  • a fifth aspect of the invention provides the use of a combination of one or more selected from the group consisting of: in the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a mammal (e.g., human): rhubarb Phenol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-gallate, citrus-4'-0-glucoside, phlorizin.
  • a sixth aspect of the invention provides the use of Cynomorium in the preparation of a medicament for phytoestrogens.
  • a seventh aspect of the invention provides the use of a Cynomorium extract for the preparation of a medicament for use as a phytoestrogens.
  • An eighth aspect of the invention provides the use of a combination of one or more selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3 -0-gallate, citrus-4'-0-glucoside, phlorizin.
  • a ninth aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating and/or preventing a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a mammal (e.g., human), comprising a therapeutically and/or prophylactically effective amount of Cynomorium extract And optionally a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a tenth aspect of the invention provides a pharmaceutical composition for treating and/or preventing a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a mammal (e.g., human), comprising a therapeutically and/or prophylactically effective amount of at least one drug Active ingredient and optionally pharmaceutically acceptable
  • the pharmaceutically active ingredient is selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus-4'--glucoside, root Derinoside.
  • An eleventh aspect of the present invention provides a method of treating and/or preventing a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a prophylactically and/or therapeutically effective amount of a lock Yang, Cynomorium extract, or at least one active ingredient selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3->-gallate, citrus 4'-0-glucoside, phlorizin.
  • a first aspect of the invention provides the use of Cynomorium for the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with insufficient secretion of estrogen from a mammal (e. g., human).
  • the disease associated with insufficient secretion of estrogen is selected from the group consisting of: menopausal syndrome, osteoporosis, degenerative osteoporosis, cardiovascular and cerebrovascular diseases, breast cancer .
  • the dose of the medicament is 0.01 to 10 g, preferably 0.02 to 5 g, more preferably 0.05 to lg, per kg body weight per day of the mammal. More preferably, it is 0.05-0.5 g.
  • the medicament comprises an extract of a Cynomorium.
  • the medicament comprises a Cynomorium medicinal material in water, an alcohol (e.g., ethanol), or a water-alcohol (e.g., ethanol) mixture (e.g., 50-98% ethanol, for example 60% ethanol, 95% ethanol) as solvent extract.
  • an alcohol e.g., ethanol
  • a water-alcohol e.g., ethanol
  • 50-98% ethanol for example 60% ethanol, 95% ethanol
  • the medicament comprises an extract of a Cynomorium medicinal material
  • the extract being a mixture of water, an alcohol (e.g., ethanol), or a water-alcohol (e.g., ethanol) (e.g., 50 -9 8 % ethanol, such as 60 % ethanol, 95 % ethanol) was extracted as a solvent, and then extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol.
  • the medicament comprises an extract of Cynomorium
  • the extract being a mixture of water, alcohol (e.g., ethanol), or water-alcohol (e.g., ethanol) (e.g., 50_ 98 % ethanol, for example, 60 % ethanol, 95 % ethanol) was extracted with solvent, and extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol, and extracted with petroleum ether, extracted with chloroform and extracted with ethyl acetate. Part, or a mixture thereof.
  • the extract is a mixture of water, alcohol (such as ethanol), or water-alcohol (such as ethanol).
  • the extract is extracted from water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) mixture (eg, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol).
  • an alcohol eg, ethanol
  • a water-alcohol eg, ethanol
  • 50-98% ethanol such as 60% ethanol, 95% ethanol
  • the extract is extracted from water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) mixture (eg, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol). It was extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol, and the obtained ethyl acetate fraction was extracted.
  • the extract is water, an alcohol (e.g. ethanol), or water - alcohol (e.g.
  • the petroleum ether extract portion was obtained by extracting petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol in that order.
  • the extract is extracted from water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) mixture (eg, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol). Then, it was extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol to obtain a mixture of the ethyl acetate extracting portion and the petroleum ether extracting portion.
  • the medicament comprises an extract of Cynomorium, the extract comprising at least one component selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (- Epicatechin-3-0-gallate, citrus-4'-0-glucoside, phloridzin.
  • the extract comprises the following components: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin gallate, citrus-4'--glucoside, root bark Glycosides.
  • the medicament comprises an extract of Cynomorium, the extract comprising at least one component selected from the group consisting of: catechin, (-) epicatechin gallnut Acid ester, citrusin-4'-0-glucoside, phlorizin.
  • the extract comprises the following components: catechin, (-) epicatechin gallate, citrusin-4'-0-glucoside, phloridin.
  • the extract is a mixture of water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) (eg, For example, 50-98% ethanol, for example, 60% ethanol, 95% ethanol, is extracted as a solvent, and then extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol to obtain an ethyl acetate extract.
  • an alcohol eg, ethanol
  • a water-alcohol eg, ethanol
  • the extract of Cynomorium is prepared by the following steps: using an aqueous ethanol solution for Cynomorium (for example, 50-98%) Extraction of ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol; extracting the obtained alcohol extract with petroleum ether, concentrating the ether layer to obtain a petroleum ether fraction; extracting the petroleum ether extract with chloroform, and concentrating the chloroform layer to obtain a chloroform fraction; The residue of chloroform extraction was extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was concentrated to give ethyl acetate.
  • an aqueous ethanol solution for Cynomorium for example, 50-98%) Extraction of ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol
  • extracting the obtained alcohol extract with petroleum ether concentrating the ether layer to obtain a petroleum ether fraction
  • extracting the petroleum ether extract with chloroform and concentrating the chloroform layer to obtain a chloroform fraction
  • the residue of chloroform extraction was extracted
  • the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and chloroform fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is obtained by combining the above chloroform fraction and the ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and the ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is the ethyl acetate moiety described above.
  • a second aspect of the present invention provides a Cynomorium extract comprising at least one component selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, Citrusin _ 4 '_ glucoside, phlorizin.
  • the Cynomorium extract comprises chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus _4'_ 0 _glucose Glycoside, phlorizin.
  • the Cynomorium extract comprises at least one component selected from the group consisting of: catechin, (-) epicatechin gallate, citrusin-4'-glucoside, root Derinoside. In one embodiment, the Cynomorium extract comprises catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus-4'-0-glucoside, phloridin.
  • a Cynomorium extract according to any one of the second aspects of the present invention wherein the chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrusin-4' - the total amount of glucoside, phlorizin is from 1 to 90% (w/w), preferably from 1 to 80% (w/w), preferably from 2 to 50% (w/w), based on the total weight of the extract. Preferably, it is 2 to 40% (w/w), preferably 2 to 30% (/w), more preferably 2 to 20% (w/w).
  • a Cynomorium extract according to any one of the second aspects of the present invention which is An alcohol (e.g., ethanol), or a mixture of water-alcohol (e.g., ethanol) (e.g., 50-98% ethanol, such as 60 % ethanol, 95 % ethanol) is an extract of the extraction solvent.
  • An alcohol e.g., ethanol
  • a mixture of water-alcohol e.g., ethanol
  • 50-98% ethanol such as 60 % ethanol, 95 % ethanol
  • a Cynomorium extract according to any one of the second aspects of the present invention which is a mixture of water, an alcohol (e.g., ethanol), or a water-alcohol (e.g., ethanol) (e.g., 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95%) Ethanol) is extracted by solvent and extracted by petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol.
  • an alcohol e.g., ethanol
  • a water-alcohol e.g., ethanol
  • Ethanol is extracted by solvent and extracted by petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol.
  • any one extract according to the second aspect of the invention which is water, an alcohol (e.g. ethanol), or water - alcohol (e.g. ethanol) mixture (e.g. 98% ethanol and 50 A, for example 60% ethanol, 95% Ethanol) is a solvent extraction, and is successively extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, n-butanol to obtain a petroleum ether extracting portion, a chloroform extracting portion, an ethyl acetate extracting portion, or a mixture thereof.
  • the extract is water, an alcohol (e.g. ethanol), or water - alcohol (e.g. ethanol) mixture (e.g.
  • the extract is extracted from water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) mixture (eg, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol).
  • an alcohol eg, ethanol
  • a water-alcohol eg, ethanol
  • 50-98% ethanol such as 60% ethanol, 95% ethanol
  • the extract was extracted from water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) mixture (eg, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol). It was extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol, and the obtained ethyl acetate fraction was extracted.
  • an alcohol eg, ethanol
  • a water-alcohol eg, ethanol
  • the extract is extracted from water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) mixture (eg, 50 % to 98 % ethanol, such as 60 % ethanol, 9S% ethanol). And extracting petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol in this order, and extracting the petroleum ether obtained.
  • the extract is extracted from water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) mixture (eg, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol).
  • the extract is an ethyl acetate extraction fraction, and comprises catechin, citrusin-4'-0-glucoside, (-) epicatechin-3-0- Gallate, phlorizin. According to this issue, the extract is a petroleum ether extraction fraction and comprises chrysophanol.
  • the extract is a mixture of an ethyl acetate extraction portion and a petroleum ether extraction portion, and comprises catechin, citrusin-4'-0-glucoside, (-) Tea-3-0-gallate, phloridzin, chrysophanol.
  • the extract is a mixture of an ethyl acetate extraction portion, a petroleum ether extraction portion, or an ethyl acetate extraction portion and a petroleum ether extraction portion, and the extract contains at least one selected from the group consisting of Ingredients: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus-4'-(?-glucoside, phlorizin.
  • the extract is a mixture of an ethyl acetate extracting portion, a petroleum ether extracting portion, or an ethyl acetate extracting portion and a petroleum ether extracting portion, and the extract comprises at least one component selected from the group consisting of: rhubarb Phenol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrusin-4'-glucoside, phlorizin, rhubarb, emodin, catechin
  • the total amount of (-) epicatechin-3-0-gallate, citrusin-4 glucoside and phloridin is from 1 to 90% (w/w) of the total weight of the extract.
  • it is 1 to 80% (w/w), preferably 2 to 50% (w/w), preferably 2 to 40% (w/w), preferably 2 to 30% (w/w), more preferably 2 to 20%.
  • a Cynomorium extract according to any one of the second aspects of the present invention which is prepared by the following steps: extracting Cynomorium with an aqueous ethanol solution (for example, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol); The obtained alcohol extract is extracted with petroleum ether, and the ether layer is concentrated to obtain a petroleum ether fraction; the residue obtained by petroleum ether extraction is extracted with chloroform, and the chloroform layer is concentrated to obtain a chloroform fraction; the residue of chloroform extraction is extracted with ethyl acetate, and ethyl acetate is concentrated.
  • an aqueous ethanol solution for example, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol
  • the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and the chloroform fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is obtained by combining the above-mentioned chloroform fraction and ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and the ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is the ethyl acetate moiety described above.
  • the Cynomorium extract according to any one of the second aspects of the present invention which is prepared by the following steps: a) using 2 to 20 times the amount of the lock (preferably 5 to 15 times, more preferably 8 to 12 times, For example 10 60 to 98% (preferably 70 to 98%, more preferably 80 to 98%, for example, 80%, 85%, 90%, 95% or 98%) of ethanol is soaked for 5 to 24 hours (preferably 5 to 18 hours) More preferably 8 to 15 hours); b) reflux extraction for 0.5 to 10 hours (preferably 0.5 to 8 hours, more preferably 0.5 to 6 hours, more preferably 0.5 to 4 hours, still more preferably 1 to 4 hours, for example, 1 hour, 2 Hour, 3 hours, 4 hours), pour out the extract; c) optionally repeat the step d) and step b) 1-3 times (eg 1 time, 2 times, 3 times) d) combining the extracts of step b) and c), filtering, recovering the ethanol from the filtrate to obtain a concentrate; e) extract
  • the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and chloroform fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is obtained by combining the above chloroform fraction and ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Congyang extract is the ethyl acetate moiety described above.
  • a third aspect of the invention provides an active ingredient comprising from one or more selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0 gallic acid Ester, citrusin-4'--glucoside, phlorizin.
  • the Congyang active ingredient is useful for treating and/or preventing a disease associated with insufficient secretion of estrogen from a mammal (e.g., a human).
  • the chrysophanol is useful for treating and/or preventing a disease associated with insufficient secretion of estrogen from a mammal (e.g., a human).
  • the emodin is useful for treating and/or preventing a disease associated with insufficient estrogen secretion in a mammal (e.g., a human).
  • the catechins are useful for treating and/or preventing diseases associated with insufficient secretion of estrogen from mammals (e.g., humans).
  • the (-) epicatechin-3-0-gallate is useful for treating and/or preventing a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a mammal (e.g., human).
  • the citrusin-4'-6>-glucoside is useful for treating and/or preventing a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a mammal (e.g., human).
  • the phlorizin is useful for treating and/or preventing a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a mammal (e.g., human).
  • An active ingredient according to any one of the third aspects of the present invention wherein one of the following ingredients or A variety of combinations are extracted from Cynomorium: Chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus-4'-0-glucoside, Phlorizin.
  • the Cynomorium is extracted with an aqueous ethanol solution (for example, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol);
  • the obtained alcohol extract is extracted successively with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol, and each extract is separately recovered into a solvent to obtain a solid matter of each extraction solvent portion;
  • the petroleum ether fraction was subjected to silica gel column chromatography, eluted with a petroleum ether-ethyl acetate solvent system gradient, and 3 to 4 fractions were recrystallized from petroleum ether to obtain chrysophanol;
  • the chloroform fraction was subjected to silica gel column chromatography, eluted with a petroleum ether-acetone solvent system gradient, and 19 to 32 fractions were subjected to repeated silica gel column chromatography on a hydroxypropyl dextran gel and a chloroform-decanol solvent system to obtain emodin. ;
  • the ethyl acetate fraction was subjected to silica gel column chromatography, and a gradient of chloroform-decanol solvent system was used to obtain a fraction of 27 to 42 parts of ethyl acetate and a fraction of 43 to 64 parts of ethyl acetate;
  • the fractions of 27 ⁇ 42 were subjected to silica gel column chromatography and eluted with a gradient of chloroform-nonanol-water solvent system to obtain 27 42-4-6 fractions (ie, the ethyl acetate fraction of the previous step, 27 - 42 fractions).
  • the 4-6 fractions obtained by silica gel column chromatography have similar meanings in other places in this paper, 27 ⁇ 42-7 ⁇ 10 fractions, 27 ⁇ 42-11 ⁇ 14 fractions;
  • the 27 ⁇ 42-7 ⁇ 10 fractions are subjected to silica gel column chromatography and skin-phase silica gel column chromatography to obtain citrusin-4 glucoside;
  • the ethyl acetate fraction of 43 to 64 fractions was subjected to polyamide and chloroform column chromatography by a chloroform-methanol solvent system and combined with hydroxypropyldextran gel column chromatography to obtain phlorizin.
  • a sedative extract is prepared for use in therapy and/or prevention Use in a medicament for a mammalian (eg, human) disease associated with insufficient secretion of estrogen.
  • a mammalian disease associated with insufficient secretion of estrogen is selected from the group consisting of: menopausal syndrome, osteoporosis, degenerative osteoporosis, cardiovascular and cerebrovascular diseases, breast cancer .
  • the dose of the extract is 0.01 to 10 g, preferably 0.02 to 5 g, more preferably 0.05 to lg, per kg body weight per day of the mammal. It is preferably 0.05-0.5 g.
  • the extract comprises at least one ingredient selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin gallate, mandarin Anthocyanin-4'-0-glucoside, phlorizin.
  • the chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrusin-4,-0-glucoside, phloridzin The total amount is from 1 to 90% (w/), preferably from 1 to 80% (w/w), preferably from 2 to 50% (w/w), preferably from 2 to 40% (w/w), based on the total weight of the extract. It is preferably 2 to 30% (w/w), more preferably 2 to 20% (w/w).
  • the extract comprises at least one ingredient selected from the group consisting of catechins, (-) epicatechin gallate, citrusin-4'- 0-glucoside, phlorizin.
  • the total amount of the catechin, (-) epicatechin gallate, citrusin-4'-0-glucoside, phloridin is greater than the total weight of the extract 1 to 90% (w/w), preferably 1 to 80% (w/w), preferably 2 to 50% (w/w), preferably 2 to 40% (w/w), preferably 2 to 30% (w) /w), more preferably 2 ⁇ 20% ( / w).
  • any one of the fourth aspect of the invention wherein said extract is cynomorium herbs with water, an alcohol (e.g. ethanol), or water - alcohol (e.g. ethanol) mixture (e.g., 50 A 98% ethanol, 60% e.g. Ethanol, 95% ethanol) is an extract of the extraction solvent.
  • an alcohol e.g. ethanol
  • water - alcohol e.g. ethanol
  • the extract is water, an alcohol (e.g., ethanol), or a water-alcohol (e.g., ethanol) mixture (e.g., 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95) % ethanol) was extracted with solvent and extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol.
  • an alcohol e.g., ethanol
  • a water-alcohol e.g., ethanol
  • ethanol e.g., 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95
  • the extract is water, an alcohol (e.g. ethanol), or water - alcohol (e.g. ethanol) mixture (e.g., 50 A 98% ethanol, 60% e.g. Ethanol, 95% ethanol) is extracted as a solvent, and successively extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate, n-butanol to obtain a petroleum ether extracting portion, a chloroform extracting portion, an ethyl acetate extracting portion, or a mixture thereof.
  • the extract is water, an alcohol (e.g. ethanol), or water - alcohol (e.g. ethanol) mixture (e.g.
  • the extract is water, an alcohol (e.g. ethanol), or water - alcohol (e.g. ethanol) mixture (e.g.
  • the extract is extracted from water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) mixture (eg, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol). It was extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol, and the obtained ethyl acetate fraction was extracted.
  • an alcohol eg, ethanol
  • a water-alcohol eg, ethanol
  • 50-98% ethanol such as 60% ethanol, 95% ethanol
  • the extract is water, an alcohol (e.g. ethanol), or water - alcohol (e.g. ethanol) mixture (e.g. 98% ethanol, 50 A, for example 60% ethanol, 95% ethanol) as solvent extraction,
  • the petroleum ether extraction section was obtained by extracting petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol in that order.
  • the extract is water, an alcohol (e.g. ethanol), or water - alcohol (e.g. ethanol) mixture (e.g.
  • the extract comprises at least one ingredient selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0- Gallic acid ester, citrusin-4'-0-glucoside, phlorizin.
  • the extract comprises the following components: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus-4'-0 - Glucosides, phlorizin.
  • the extract comprises at least one component selected from the group consisting of: catechin, (-) epicatechin-3-gallate, citrus -4'-0-glucoside, phlorizin.
  • the extract comprises the following components: catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus-4'--glucoside, phlorizin .
  • the extract is water, alcohol (eg, Such as ethanol), or water - alcohol (e.g. ethanol) mixture (e.g.
  • Cynomorium extract is prepared by the following steps: using an aqueous ethanol solution for Cynomorium (for example, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol) Extraction; extracting the obtained alcohol extract with petroleum ether, concentrating the ether layer to obtain a petroleum ether fraction; extracting the petroleum ether extract with chloroform, concentrating the chloroform layer to obtain a chloroform fraction; extracting the residue of chloroform extraction with ethyl acetate The ethyl acetate layer is concentrated to obtain an ethyl acetate fraction; the residue extracted with ethyl acetate is extracted with n-butanol, and the n-butanol layer is concentrated to obtain an n-butanol moiety; the petroleum ether fraction, the chloroform fraction and the ethyl acetate fraction are as described above.
  • an aqueous ethanol solution for Cynomorium for example, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95%
  • the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and chloroform fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is obtained by combining the above chloroform fraction and the ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is the ethyl acetate moiety described above.
  • Cynomorium extract is prepared by the following steps: a) using 2 to 20 times the amount of the lock (preferably 5 to 15 times, more preferably 8 to) 60 to 98% (preferably 70 to 98%, more preferably 80 to 98%, for example, 80%, 85%, 90%, 95% or 98%) of 12 times the amount, for example, 10 times the amount of ethanol soaked for 5 to 24 hours.
  • the amount of the lock preferably 5 to 15 times, more preferably 8 to
  • 60 to 98% preferably 70 to 98%, more preferably 80 to 98%, for example, 80%, 85%, 90%, 95% or 98%) of 12 times the amount, for example, 10 times the amount of ethanol soaked for 5 to 24 hours.
  • step b) reflux extraction for 0.5 10 hours (preferably 0.5 to 8 hours, more preferably 0.5 to 6 hours, more preferably 0.5 to 4 hours, still more preferably 1 to 4 hours, For example, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours), the extract is decanted; c) the dregs of step b) are optionally subjected to step a) and step b) 1 to 3 times (eg 1 time, 2) d, 3 times); d) combining the extracts of step b) and c), filtering, recovering ethanol from the filtrate to obtain a concentrate; e) making the concentrate of step d) successively using petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and positive Butanol extraction, each extract is separately recovered into a solvent to obtain a solid matter, and a solid matter of any one or more of a petroleum ether fraction, a chloroform fraction, and an ethyl acetate fraction is combined to
  • the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and chloroform fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is obtained by combining the above chloroform fraction and ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Congyang extract is the ethyl acetate moiety described above.
  • a fifth aspect of the invention provides the use of a combination of one or more selected from the group consisting of: in the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a mammal (e.g., human): rhubarb Phenol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus-4'-0-glucoside, phloridin.
  • the use of chrysophanol for the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with a lack of estrogen secretion in a mammal (e.g., human) is provided.
  • the use of emodin for the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with insufficient secretion of estrogen from a mammal is provided.
  • a mammal e.g., human
  • catechin for the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with insufficient secretion of estrogen from a mammal (e.g., human).
  • (-) epicatechin gallate for the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with insufficient secretion of estrogen from a mammal (e.g., human).
  • citrusin-4 glucoside in the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a mammal (e.g., human) is provided.
  • phlorizin for the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with insufficient secretion of estrogen from a mammal (e.g., human).
  • a combination selected from one or more of the following ingredients for the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a mammal (eg, human): Catechin, (-) epicatechin-3-gallate, citrus-4'--glucoside, phloridzin.
  • the disease associated with insufficient secretion of estrogen is selected from the group consisting of: menopausal syndrome, osteoporosis, degenerative osteoporosis, cardiovascular and cerebrovascular diseases, breast cancer .
  • any of the fifth aspects of the invention which is the use of the following ingredients in the manufacture of a medicament for the treatment and/or prevention of a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a mammal (e.g., human): chrysophanol, rhubarb , catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus _4'-0-glucoside, phloridzin.
  • the Cynomorium is extracted with an aqueous ethanol solution (for example, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol);
  • the obtained alcohol extract is extracted successively with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol, and each extract is separately recovered into a solvent to obtain a solid matter of each extraction solvent portion;
  • the petroleum ether fraction was subjected to silica gel column chromatography, eluted with a petroleum ether-ethyl acetate solvent system gradient, and 3 to 4 fractions were recrystallized from petroleum ether to obtain chrysophanol;
  • the chloroform fraction was subjected to silica gel column chromatography and eluted with a gradient of petroleum ether-acetone solvent system, and 19 to 32 fractions were subjected to repeated silica gel column chromatography through a hydroxypropyl dextran gel and a chloroform-methanol solvent system to obtain emodin;
  • the ethyl acetate fraction was subjected to silica gel column chromatography, and eluted with a gradient of chloroform-methanol solvent system to obtain a fraction of 27 to 42 parts of ethyl acetate and a fraction of 43 to 64 parts of ethyl acetate; 42 fractions were subjected to silica gel column chromatography and eluted with a gradient of chloroform-nonanol-water solvent system to obtain 27 ⁇ 42-4 ⁇ 6 fractions (ie, the ethyl acetate fraction of the previous step, 27 ⁇ 42 fractions).
  • the 4-6 fractions obtained after column chromatography have similar meanings in other places in this paper, 27 ⁇ 42-7 ⁇ 10 fractions, 27 - 42-11 - 14 fractions;
  • the 27 ⁇ 42-7 - 10 fractions are subjected to silica gel column chromatography and reversed-phase silica gel column chromatography to obtain citrusin -4'-(?-glucoside;
  • the ethyl acetate fraction 43 to 64 fractions were subjected to polyamide and chloroform column chromatography by a chloroform-decanol solvent system and combined with hydroxypropyldextran gel column chromatography to obtain phlorizin.
  • a sixth aspect of the invention provides the use of Cynomorium in the preparation of a medicament for phytoestrogens.
  • the medicament is for treatment And/or prevent climacteric syndrome, osteoporosis, degenerative osteoporosis, cardiovascular and cerebrovascular diseases, breast cancer.
  • the dose of the medicament is 0.01 to 10 g, preferably 0.02 to 5 g, more preferably 0.05 to lg, more preferably, per kg body weight per day of the mammal. 0.05-0.5g.
  • the medicament comprises an extract of Cynomorium.
  • the medicament comprises a Cynomorium medicinal material in water, an alcohol (e.g., ethanol), or a water-alcohol (e.g., ethanol) mixture (e.g., 50-98% ethanol, such as 60%).
  • an alcohol e.g., ethanol
  • a water-alcohol e.g., ethanol
  • Ethanol, 95% ethanol is an extract of the extraction solvent.
  • the medicament comprises an extract of Cynomorium
  • the extract being a mixture of water, alcohol (e.g., ethanol), or water-alcohol (e.g., ethanol) (e.g., 50 -9 8 % ethanol, such as 60 % ethanol, 95 % ethanol) was extracted as a solvent, and then extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol.
  • the medicament comprises an extract of a Cynomorium medicinal material
  • the extract being a mixture of water, an alcohol (e.g., ethanol), or a water-alcohol (e.g., ethanol) (e.g., 50_ 9 8% ethanol, such as 60 % ethanol, 95 % ethanol) is extracted as a solvent, and extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol to obtain a petroleum ether extract, chloroform extract, ethyl acetate. Extracting the fraction, or a mixture thereof.
  • an alcohol e.g., ethanol
  • a water-alcohol e.g., ethanol
  • 50_ 9 8% ethanol such as 60 % ethanol, 95 % ethanol
  • the extract is extracted from water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) mixture (eg, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol).
  • the mixture was extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol to obtain a mixture of a petroleum ether extract portion, a chloroform extract portion and an ethyl acetate extract portion.
  • the extract is extracted from water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) mixture (eg, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol).
  • the extract is water, an alcohol (e.g. ethanol), or water - alcohol (e.g. ethanol) mixture (e.g. 98% ethanol and 50 A, for example 60% ethanol, 95% ethanol) as solvent extraction, and It was extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol, and the obtained ethyl acetate extract fraction.
  • an alcohol e.g. ethanol
  • water - alcohol e.g. ethanol
  • the extracting Is extracted with water, alcohol (such as ethanol), or a mixture of water-alcohol (such as ethanol) (such as 50-98 % ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol), and then petroleum ether, chloroform, acetic acid
  • the ethyl ether and n-butanol are extracted, and the obtained petroleum ether is extracted.
  • the extract is extracted from water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) mixture (eg, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol).
  • the medicament comprises an extract of Cynomorium, the extract comprising at least one component selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (- Epicatechin-3-0-gallate, citrus-4'-0-glucoside, phloridzin.
  • the extract comprises the following components: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin gallate, citrus-4'-(?-glucoside, Phlorizin.
  • the medicament comprises an extract of Cynomorium, the extract comprising at least one component selected from the group consisting of: catechin, (-) epicatechin - 3-0-gallate, citrus-4'->-glucoside, phlorizin.
  • the extract comprises the following components: catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus-4'--glucoside, phlorizin .
  • the extract is extracted from water, an alcohol (eg, ethanol), or a water-alcohol (eg, ethanol) mixture (eg, 50-98% ethanol, such as 60% ethanol, 95% ethanol). It was extracted with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol, and the obtained ethyl acetate fraction was extracted.
  • the extract of Cynomorium is prepared by the following steps: using an aqueous ethanol solution for Cynomorium (for example, 50-98%) Extraction of ethanol, for example, 60% ethanol, 95% ethanol; extracting the obtained alcohol extract with petroleum ether, concentrating the ether layer to obtain a petroleum ether fraction; extracting the petroleum ether extract with chloroform, and concentrating the chloroform layer to obtain a chloroform fraction; The residue of chloroform extraction was extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was concentrated to give ethyl acetate.
  • an aqueous ethanol solution for Cynomorium for example, 50-98%) Extraction of ethanol, for example, 60% ethanol, 95% ethanol
  • Extraction of ethanol for example, 60% ethanol, 95% ethanol
  • extracting the obtained alcohol extract with petroleum ether concentrating the ether layer to obtain a petroleum ether fraction
  • extracting the petroleum ether extract with chloroform and concentrating the chloroform
  • the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and chloroform fraction. In one implementation, the Cynomorium extract is obtained by combining the above chloroform fraction and ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is obtained by combining the above petroleum ether fraction and ethyl acetate fraction. In one embodiment, the Cynomorium extract is the ethyl acetate moiety described above.
  • the extract has the characteristics of the extract of any of the first, second or third aspects of the invention.
  • a seventh aspect of the invention provides the use of a Cynomorium extract for the preparation of a medicament for use as a phytoestrogens.
  • the medicament is for the treatment and/or prevention of climacteric syndrome, osteoporosis, degenerative osteoporosis, cardiovascular and cerebrovascular diseases, breast cancer.
  • the dose of the drug is 0.01 to 10 g, preferably 0.02 to 5 g, more preferably 0.05 to lg, more preferably, per kg body weight per day of the mammal. 0.05-0.5g.
  • An eighth aspect of the invention provides the use of a combination of one or more selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3 -0 ⁇ gallate, citrus-4'--glucoside, phlorizin.
  • the medicament is for the treatment and/or prevention of climacteric syndrome, osteoporosis, degenerative osteoporosis, cardiovascular and cerebrovascular diseases, breast cancer.
  • any one of the eighth aspects of the invention which is the use of the following ingredients in the preparation of a medicament for phytoestrogens: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3- - galle Acid ester, citrusin-4'-0-glucoside, phlorizin.
  • a ninth aspect of the invention provides a method for treating and/or preventing a mammal
  • a pharmaceutical composition of a disease associated with insufficient estrogen secretion comprising a therapeutically and/or prophylactically effective amount of Cynomorium extract and optionally a pharmaceutically acceptable excipient.
  • Cynomorium extract comprises at least one component selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin Gallic acid ester, citrusin-4'-0-glucoside, phlorizin.
  • Cynomorium extract comprises the following components: Rhubarb, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0- Gallic acid ester, citrusin-4'--glucoside, phlorizin.
  • composition according to any one of the ninth aspects of the present invention, wherein the pharmaceutical composition is administered to the mammal at a dose of 0.01 to 10 g , preferably 0.02-kg per kg of body weight per day of the mammal. 5 g, more preferably 0.05-lg, still more preferably 0.05-0.5 g.
  • an alcohol e.g., ethanol
  • a mixture of water-alcohol e.g., ethanol
  • -98% ethanol such as 60% ethanol, 95% ethanol
  • a tenth aspect of the invention provides a pharmaceutical composition for treating and/or preventing a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a mammal (e.g., human), comprising a therapeutically and/or prophylactically effective amount of at least one drug An active ingredient, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient, selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin gallate, citrusin-4' -(?-glucoside, phlorizin.
  • a pharmaceutical composition according to any one of the tenth aspects of the present invention which comprises a therapeutically and/or prophylactically effective amount of chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate Ester, citrusin-4'-glucoside, phlorizin, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a pharmaceutical composition according to any one of the tenth aspects of the present invention which comprises a therapeutically and/or prophylactically effective amount of catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrusin-4' -0- Glucosin, phlorizin, and optionally a pharmaceutically acceptable excipient.
  • An eleventh aspect of the present invention provides a method of treating and/or preventing a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a prophylactically and/or therapeutically effective amount of a lock Yang.
  • the Cynomorium is administered to the subject in the form of a drug.
  • the medicament has the features of any of the first aspects of the invention.
  • An eleventh aspect of the present invention also provides a method of treating and/or preventing a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a prophylactically and/or therapeutically effective amount
  • the Cynomorium extract according to any one of the second aspects of the present invention.
  • An eleventh aspect of the present invention also provides a method of treating and/or preventing a disease associated with insufficient secretion of estrogen in a subject in need thereof, comprising administering to the subject a prophylactically and/or therapeutically effective amount At least one active ingredient selected from the group consisting of: chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus-4'-0-glucoside, Phlorizin.
  • the chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus-4'-0-glucoside, phloridin Independently having the features of any of the third aspects of the invention.
  • the disease associated with insufficient secretion of estrogen is selected from the group consisting of: climacteric syndrome, osteoporosis, degenerative osteoporosis, cardiovascular and cerebrovascular diseases, breast cancer.
  • any aspect of the invention or any one of the aspects of the invention is equally applicable to any of the other aspects or any of the other aspects, as long as they do not contradict each other, of course, when applied to each other , if necessary, appropriate modifications to the corresponding features.
  • the "any item” means Any of the sub-aspects of the first aspect of the invention; when otherwise mentioned in a similar manner, also have the same meaning.
  • the term "effective amount” refers to a dose that can achieve a treatment, prevention, alleviation, and/or alleviation of a disease or condition described herein in a subject.
  • composition As used herein, the term “pharmaceutical composition”, which may be used interchangeably with “composition,” and may be used to achieve treatment, prevention, alleviation, and/or alleviation of the disease of the invention in a subject, A substance of a condition or symptom.
  • the term "subject,” or “patient” may refer to an animal that receives the compositions and extracts of the invention to treat, prevent, ameliorate, and/or alleviate the diseases, disorders, and conditions of the invention.
  • mammals such as humans, dogs, monkeys, cows, horses, etc.
  • disease or condition refers to a subject's condition in the subject that is associated with the disease or condition described herein.
  • % generally refers to a weight/weight percentage for a solid material and a weight/volume percentage for a liquid when the total material is liquid.
  • the percentage characterizing the liquid solute generally refers to the volume/volume percentage.
  • ethanol for example, 95% ethanol, which has well-known meanings in the art, for example, see the definition in the 2005 edition of the Pharmacopoeia of the People's Republic of China.
  • disease associated with insufficient secretion of estrogen has the art A person skilled in the art, and generally refers to a disease or condition caused by insufficient estrogen secretion in a female mammal, such as a human, especially a climacteric woman, including but not limited to climacteric syndrome, osteoporosis, Degenerative osteoporosis, cardiovascular and cerebrovascular diseases, breast cancer.
  • extract refers to the "extract" of Cynomorium.
  • catechin may refer to (-) catechin, (+) catechin, or racemic catechin.
  • petroleum ether fraction refers to an effective part of a plant obtained by treatment (extraction) with petroleum ether, which may also be referred to as a "petroleum ether moiety.”
  • Other similar terms such as “ethyl acetate moiety” also have similar meanings, i.e., plant-derived parts obtained by liquid-liquid extraction.
  • the amount of the six components or parts thereof in the extract, the drug, the composition, etc. (for example, the ratio of each component to the total extract, drug, composition, etc., the components The ratio between the two, etc.) is not particularly limited, and the dose of the drug can be calculated by converting it into a Cynomorium.
  • estradiol as a positive control, chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-0-gallate, mandarin Both glucoside-4'-0-glucoside and phloridzin have been shown to be involved in estrogen receptor activation.
  • the single active ingredient of Cynomorium or a combination thereof or the Cynomorium extract having an estrogenic active ingredient in Cynomorium may be mixed with one or more pharmaceutically acceptable excipients, using conventional techniques in the field of formulation.
  • the desired dosage form is formed to prepare a pharmaceutical composition of the invention.
  • the "pharmaceutically acceptable excipient" used in the pharmaceutical composition of the present invention may be a drug Any conventional excipient in the field of formulation.
  • the choice of a particular excipient will depend on the mode of administration or the type and state of the disease used to treat a particular patient.
  • the preparation of suitable pharmaceutical compositions for a particular mode of administration is well within the knowledge of those skilled in the pharmaceutical arts.
  • it may be a pharmaceutically acceptable excipient including conventional diluents, carriers, fillers, binders, wetting agents, disintegrating agents, absorption enhancers, surfactants, adsorption carriers, lubricants and the like in the pharmaceutical field.
  • a flavoring agent, a preservative, a sweetener, and the like may also be added to the pharmaceutical composition as necessary.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated into various forms such as tablets, powders, granules, capsules, oral liquids, ointments, creams, injections (injectable sterile powders).
  • the above various dosage forms of the drug can be prepared according to a conventional method in the field of pharmacy.
  • the compounds obtained according to the invention have varying degrees of pseudoestrogens. Therefore, the obtained compound of the present invention (for example, chrysophanol, emodin, catechin, (-) epicatechin-3-gallate, citrus-4'-0-glucoside, etc., can be expected,
  • the phlorizin) or a pharmaceutical composition containing the same can be used for the treatment of climacteric syndrome, breast cancer and/or cardiovascular and cerebrovascular diseases.
  • the invention may be used to prepare a medicament for the treatment of climacteric syndrome, breast cancer and/or cardiovascular and cerebrovascular diseases.
  • the invention utilizes the method of cell transfection and luciferase reporter chemiluminescence detection to investigate the effects of ten monomer compounds in Cynomorium on the transcriptional activities of ERa and ERP, thereby indicating which components of Cynomorium have estrogen activity, and Explain its target and path of action.
  • the hormonal activity is about 1/1000-1/10 of estradiol.
  • Two steroids in Cynomorium, chrysophanol and emodin can activate receptor transcriptional activity at high concentration of 10 ⁇ 6 ,, no receptor selectivity. Its activity is about 1/1000-1/100 of estradiol. detailed description
  • the present invention provides a general and/or specific description of the materials and test methods used in the tests. While many of the materials and methods of operation used to accomplish the objectives of the present invention are well known in the art, the present invention is still described in detail herein. It will be apparent to those skilled in the art that, hereinafter, the materials and methods of operation of the present invention are well known in the art unless otherwise stated.
  • the petroleum ether fraction contains 0.282% (WAV) of chrysophanol
  • the chloroform fraction contains 0.031% (WAV) of emodin
  • the ethyl acetate fraction contains 10.84% (w/w) of catechin.
  • the content of citrusin-4'-0-glucoside is 0.304% (WAV), and the ethyl acetate fraction contains (-) epicatechin-3-0-gallate content of 0.88% ( W/W), the ethyl acetate fraction contains 0.28% by weight of phlorizin (W/W).
  • Cynomorium chloroform was purified by silica gel column chromatography using a petroleum ether-acetone solvent system gradient, and 19 to 32 fractions were passed through a hydroxypropyl dextran gel and a chloroform-nonanol solvent system. Thereafter, orange-red cluster crystals of 35 m g were obtained , which were identified as emodin.
  • the ethyl acetate fraction of 27 to 42 fractions was subjected to silica gel column chromatography eluting with a gradient of chloroform-decanol-water solvent system.
  • the obtained 27 ⁇ 42-4 ⁇ 6 fractions were subjected to silica gel column chromatography on petroleum ether-ethyl acetate solvent system to obtain 13 g of white cluster crystals, which were identified as catechins (racemates).
  • the obtained 27 to 42-7 -10 fractions were subjected to silica gel column chromatography and reversed-phase silica gel column chromatography to give a white powder of 300 m g which was identified as citrusin-4 glucoside.
  • Example 6 compounds obtained in Example 1 i.e., chrysophanol, emodin, catechin (racemate), (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus-4' - -Glucosidin, phlorizin
  • chrysophanol, emodin, catechin (racemate), (-) epicatechin-3-0-gallate, citrus-4' - -Glucosidin, phlorizin was structurally confirmed (entered by Tianjin University Analytical Testing Center, 500MHz nuclear magnetic). The results of the analysis showed that the structures of these compounds were consistent with those reported in the literature, as follows.
  • estrogen shows its biological activity by regulating the transcription of estrogen-responsive genes.
  • the ER a or ERpDNA fragment carrying the reporter gene was separately transfected into Hela cells without ER expression, and after the test substance was added to the cell culture solution, whether the test substance can pass the £1 by detecting the transcriptional activation of the reporter gene ⁇ or ERp exerts an estrogen-like effect.
  • the ethyl acetate fraction (taken from the 147 g obtained in the examples) and the petroleum ether fraction (taken from the 55 g of the material obtained in the examples) were accurately weighed and dissolved in DMSO, corresponding to the high dose group (50 ug/ Ml), diluted a certain number of low dose groups (5 ug / ml, 0.5 ug / ml and 0.05 ug / ml).
  • Hela cells were cultured in a cell culture incubator using a phenol red high glucose DMEM medium containing 10% calf serum, and the cells were spread at a density of 60% when the cell density was about 90%.
  • a 96-well plate 150 ⁇ l of a phenol red-free DMEM medium containing 10% serum was added to each well, and cultured overnight.
  • 0.4 g plasmid ptk-ERE-hic 2 g, tk-Renila lpg, ERa or ERp 1 ⁇ ⁇ ) was transfected.
  • the firefly luciferase/Renila luciferase value was used as the result in each well.
  • the ratio of the estrogen plus the test substance group to the control group was calculated by using the estrogen-free wells in each group as a control. The average of three wells per group. The results are shown in Table 1, Table 2 and Table 3.
  • the extract of the present invention has a desired biological activity. It is understood by those skilled in the art that although only the activity of the ethyl acetate fraction and the petroleum ether fraction is provided in the table, it is foreseen that the extract before extraction with petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and n-butanol and extraction with four solvents Any one or several combinations of the various effective fractions obtained thereafter are expected to have the desired biological activity.
  • Table 2 Effect of flavonoids on ERoc or ERP transcriptional activity in Hela cells
  • Estrogen exerts its effects mainly through the estrogen receptor (ER). Studies have confirmed that ER is widely distributed in the cardiovascular system, osteoblasts, osteoclasts, breast and reproductive systems. Estrogen has a wide therapeutic effect on this, and phytoestrogens are a natural selective estrogen receptor.
  • the regulator which has a mechanism and function similar to that of estrogen, binds to the estrogen receptor and has estrogen-like biological activity. The results of the study showed that the compounds of the present invention can activate the estrogen receptor in a concentration-dependent manner.
  • catechin, epicatechin gallate, citrus glucoside, phloridzin, emodin, and chrysophanol can be used in women with climacteric syndrome, osteoporosis, and degenerative bone. Osteoporosis, cardiovascular and cerebrovascular diseases.

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Description

锁阳化学成分作为植物雌激素的新用途
技术领域
本发明涉及传统中药材锁阳中的若干化学成分的新用途，特别是 锁阳中的黄酮类化合物和蒽醌类化合物的作为植物雌激素的新用途。 背景技术
锁 P日 {Herba Cynomorii)为锁阳科植物锁 P日 (Cynomorium «g«Wc« « Rupr.)的干燥肉质茎。锁阳味甘性温， 归肝、 肾、大肠经， 是一种十分奇特的天然沙生珍稀植物。 具有补肾阳， 益精血， 润肠通 便的功效， 主治阳痿遗精、 腰膝酸软、 肠燥便秘、 血枯、 尿血、 神经 衰弱等症。 锁阳的化学成分研究表明， 锁阳含有黄酮类、 三萜类、 糖 和糖苷类、 鞣质、 体类、 挥发性成分、 有机酸、 氨基酸、 无机元素 和离子等成分。 其中黄酮类成分包括 (+)-儿茶素、 （-) -儿茶素、 柑桔素 4，-0-吡喃葡糖苷、 柑桔素为苷元的配糖体。
雌激素是是女性关键的调节激素， 主要由卵巢和胎盘产生， 雌激 素按其化学结构归属为类固醇激素， 呈脂溶性， 其靶组织众多， 包括 生殖系统、 骨骼、 心血管等。 雌激素主要分为两大类： 甾体类雌激素 和非 体类雌激素。 体类雌激素是哺乳动物体的卵巢分泌的内源性 成分， 目前在人体内发现的甾体类雌激素有三种： 雌二醇， 从孕妇尿 中分离得到的雌三醇、 雌酮， 其中以雌二醇为主， 且活性最强。 甾体 类雌激素在维持生命、 调节性机能、 对机体发育、 免疫调节、 皮肤病 治疗及生育方面具有十分重要的作用。 非甾体类雌激素主要是二苯乙 烯苷类化合物。 一般认为雌激素是通过和细胞内相应的雌激素受体 (ER)结合， 从而引发启动转录等一系列下游事件， 产生生理学效应。 非甾体类雌激素与雌激素受体的亲和力是雌二醇的 1/100或 1/1000。 由于临床长期使用雌激素可造成乳腺癌、 子宫内膜异位生长和致癌变 等缺点，人们致力于寻求雌激素的替代物。植物雌激素 (Phytoestrogen, PE)是一类广泛存在于植物中的非甾体类化合物， 可与体内 ER结合， 流行病学研究以及动物实验已经证实植物雌激素在预防肿瘤、 治疗心 血管疾病和骨质疏松、 改善绝经期症状等方面有着很好的预防和治疗 作用， 保护神经系统， 且未发现有上述不良影响。 因此， 植物雌激素 常被作为天然雌激素替代物来研究。 虽然 PE与雌激素受体结合的能 力只是雌激素的 1/500-1/1000， 但其在激素替代疗法 (HRT)中副作用 小，因而研究者对此产生了巨大的兴趣并希望 PE在 HRT中发挥潜在 的医疗价值。
雌激素在机体的生长、发育、细胞分化及生殖系统中具有广泛的 生理作用。雌激素主要通过 ER发挥各种生物效应， ER有两种亚型， ERoc和 ERP, 其在人体许多组织和细胞中的表达是不同的， 两种亚 型在同一组织细胞中的表达水平存在差异，同种亚型在不同组织细胞 中的表达水平也存在差异， 因此任何配体与 ERo和 ERP的相互作用 所表现的效应是错综复杂的。 ERa和 ERP的组织分布有差异性， 其 中在子宫、 乳腺、 输卵管、 阴道上皮以表达 ERo为主， ERP表达微 弱， 而卵巢以表达 ERP 占优势， 大部分存在于颗粒细胞， 血管平滑 肌细胞以表达 Εί 为主。
妇女到更年期后因为卵巢不断衰竭，雌激素分泌减少， 由雌激素 介导的各种生理过程都受到影响， 产生心悸、 胸闷、 忧虑、 抑郁、 易 激动、 失眠、记忆力减退等生理和心理症状， 这些症状统称为更年期 综合征；由于雌激素分泌减少的影响造成的骨质疏松症称为退行性骨 质疏松症。 为了治疗和 /或预防上述病症， 一种有益的方法就是补充 雌激素。 但是， 多年来的临床实践发现， 长期服用雌激素会大大增加 乳腺癌发病的风险。 因此， 寻找具有雌激素活性和 /或没有雌激素副 作用的植物雌激素，为临床提供新的治疗选择，仍是本领域技术人员 期待的。 发明内容
本发明的目的是寻找具有雌激素活性和 /或没有雌激素副作用的 植物雌激素， 为临床提供新的治疗选择。 本发明人令人惊奇地发现， 从中药材锁阳中提取到的部分化学成分例如黄酮类和蒽醌类化合物 具有确切的雌激素活性， 可作为植物雌激素用于雌激素的替代治疗。 本发明基于上述发现而得以完成。
发明概迷
本发明第一方面提供了锁阳在制备用于治疗和 /或预防与哺乳动 物 (例如， 人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。
本发明第二方面提供一种锁阳提取物，其中包含至少一种选自以 下的成分： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 _4'-0-葡菊糖苷、 根皮苷。
本发明第三方面提供了可得自锁阳的一种或多种选自下列的活 性成分： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 _4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。
本发明第四方面提供了锁阳提取物在制备用于治疗和 /或预防与 哺乳动物 (例如， 人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。
本发明第五方面提供了选自下列成分的一种或多种的组合在制 备用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例如，人)雌激素分泌不足相关的疾 病的药物中的用途： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3- -没 食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。
本发明第六方面提供了锁阳在制备作为植物雌激素的药物中的 用途。
本发明第七方面提供了锁阳提取物在制备作为植物雌激素的药 物中的用途。
本发明第八方面提供了选自下列成分的一种或多种的组合在制 备作为植物雌激素的药物中的用途： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-) 表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。
本发明第九方面提供了一种用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例 如， 人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物组合物， 其中包含治疗和 / 或预防有效量的锁阳提取物以及任选的药学可接受的赋形剂。
本发明第十方面提供了一种用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例 如， 人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物组合物， 其中包含治疗和 / 或预防有效量的至少一种药物活性成分以及任选的药学可接受的赋 形剂， 所述的药物活性成分选自： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿 茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'- -葡萄糖苷、 根皮苷。
本发明第十一方面提供了在有需要的受试者中治疗和 /或预防与 雌激素分泌不足相关的疾病的方法，其包括给所述受试者施用预防和 /或治疗有效量的锁阳， 锁阳提取物， 或者至少一种选自下列的活性 成分选自： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3- >-没食子酸酯、 柑桔素 _4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。
发明详迷
本发明第一方面提供了锁阳在制备用于治疗和 /或预防与哺乳动 物 (例如， 人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的与雌激素分泌不 足相关的疾病选自：更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、 心脑血管疾病、 乳腺癌。
才艮据本发明第一方面任一项的用途，其中所述药物的剂量为所述 哺乳动物每天每 kg体重相当于锁阳药材 0.01-10g， 优选 0.02-5g， 更 优选 0.05-lg， 再更优选 0.05-0.5g。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材 的提取物。
才艮据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的药物包含锁阳药 材以水、醇 (例如乙醇）、或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为提取溶剂的提取物。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的药物包含锁阳药 材的提取物， 该提取物是以水、 醇 (例如乙醇)、 或水-醇 (例如乙醇)混 合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并 依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取获得的。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的药物包含锁阳药 材的提取物， 该提取物是以水、 醇 (例如乙醇)、 或水-醇 (例如乙醇)混 合物 (例如 50_98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并 依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的石油醚萃取部 分、 氯仿萃取部分、 乙酸乙酯萃取部分、 或其混合物。 在一个实施方 案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇)、 或水-醇 (例如乙醇)混合物
(例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次 经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的石油醚萃取部分、 氯仿萃取部分、 和乙酸乙酯萃取部分的混合物。 在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油 醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的氯仿萃取部分和乙酸乙酯 萃取部分的混合物。 在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例 如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙 醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正 丁醇萃取， 得到的乙酸乙酯萃取部分。 在一个实施方案中， 所述提取 物是以水、 醇 (例如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50_98%乙 醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分。在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇）混合物（例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油 醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的乙酸乙酯萃取部分和石油 醚萃取部分的混合物。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材 的提取物， 该提取物中包含至少一种选自以下的成分： 大黄酚、 大黄 素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。在一个实施方案中，所述提取物中包含以下的成分：大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'- -葡萄糖 苷、 根皮苷。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材 的提取物， 该提取物中包含至少一种选自以下的成分： 儿茶素、 （-) 表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个 实施方案中， 所述提取物中包含以下的成分： 儿茶素、 （-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案 中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例 如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经 石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的乙酸乙酯萃取部分。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材 的提取物，该锁阳的提取物是经如下步骤制备的：将锁阳用含水乙醇 溶液 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)提取； 使所得醇提 取物用石油醚萃取， 浓缩醚层得石油醚部分；将石油醚萃取的残余物 用氯仿萃取， 浓缩氯仿层得氯仿部分；将氯仿萃取的残余物用乙酸乙 酯萃取， 浓缩乙酸乙酯层得乙酸乙酯部分；将乙酸乙酯萃取的残余物 用正丁醇萃取， 浓缩正丁醇层得正丁醇部分； 将上述石油醚部分、 氯 仿部分和乙酸乙酯部分合并， 得到提取物。 在一个实施方案中， 所述 锁阳提取物是上述石油醚部分、氯仿部分合并得到的。在一个实施方 案中， 所述锁阳提取物是上述氯仿部分、 乙酸乙酯部分合并得到的。 在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、 乙酸乙酯部 分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述乙酸乙酯 部分。
本发明第二方面提供一种锁阳提取物，其中包含至少一种选自以 下的成分： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 _4'_ 葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案中， 所述锁阳提取 物中包含大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 _4'_0_葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案中， 所述锁阳提取 物中包含至少一种选自以下的成分： 儿茶素、 （-)表儿茶素 没食 子酸酯、 柑桔素 -4'- ·葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案中， 所述 锁阳提取物中包含儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。
根据本发明第二方面任一项的锁阳提取物，其中所述大黄酚、大 黄素、儿茶素、（-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、柑桔素 -4'- -葡萄糖苷、 根皮苷的总量占所述提取物总重量的 l-90%(w/w)， 优选 l~80%(w/w), 优选 2 ~ 50 %(w/w), 优选 2 ~ 40 %(w/w), 优选 2 ~ 30 %( /w), 更优选 2 ~ 20 %(w/w)。
根据本发明第二方面任一项的锁阳提取物， 其是锁阳药材以水、 醇（例如乙醇）、 或水-醇（例如乙醇）混合物（例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为提取溶剂的提取物。
根据本发明第二方面任一项的锁阳提取物， 其是以水、 醇 (例如 乙醇)、或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50-98%乙醇，例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇 萃取获得的。
根据本发明第二方面任一项的锁阳提取物， 其是以水、 醇 (例如 乙醇）、或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50_98%乙醇，例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇 萃取， 得到的石油醚萃取部分、 氯仿萃取部分、 乙酸乙酯萃取部分、 或其混合物。在一个实施方案中， 所述提取物是以水、醇 (例如乙醇)、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50_98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95% 乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的石油醚萃取部分、氯仿萃取部分、和乙酸乙酯萃取部分的混合 物。 在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇）、 或水- 醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇） 为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到 的氯仿萃取部分和乙酸乙酯萃取部分的混合物。 在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇）混合物（例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油 醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的乙酸乙酯萃取部分。 在一 个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇)、 或水-醇 (例如乙 醇)混合物 (例如 50_98%乙醇，例如 60%乙醇、 9S%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的石油醚萃取 部分。 在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇)、 或水 -醇 (例如乙醇）混合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇) 为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到 的乙酸乙酯萃取部分和石油醚萃取部分的混合物。根据本发明的任一 方面， 所述提取物是乙酸乙酯萃取部分， 并且其中包含儿茶素、柑桔 素 -4'-0-葡萄糖苷、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 根皮苷。 根据本发 明的任一方面，所述提取物是石油醚萃取部分，并且其中包含大黄酚。 根据本发明的任一方面，所述提取物是乙酸乙酯萃取部分和石油醚萃 取部分的混合物， 并且其中包含儿茶素、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 （-) 表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 根皮苷、 大黄酚。 根据本发明的任一方 面， 所述提取物是乙酸乙酯萃取部分、石油醚萃取部分、或者乙酸乙 酯萃取部分和石油醚萃取部分的混合物，并且该提取物中包含至少一 种选自以下的成分： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没 食子酸酯、柑桔素 -4'-(?-葡萄糖苷、根皮苷。根据本发明的任一方面， 所述提取物是乙酸乙酯萃取部分、石油醚萃取部分、或者乙酸乙酯萃 取部分和石油醚萃取部分的混合物，并且该提取物中包含至少一种选 自以下的成分： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子 酸酯、 柑桔素 -4'- ·葡萄糖苷、 根皮苷， 所述大黄酴、 大黄素、 儿茶 素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4 葡萄糖苷和根皮苷的 总量占所述提取物总重量的 l-90%(w/w)， 优选 l~80%(w/w), 优选 2 〜50 %(w/w)， 优选 2 ~ 40 %(w/w)， 优选 2〜30 %(w/w)， 更优选 2 ~ 20 %(w/w)0
根据本发明第二方面任一项的锁阳提取物，其是经如下步骤制备 的： 将锁阳用含水乙醇溶液 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95% 乙醇)提取； 使所得醇提取物用石油醚萃取， 浓缩醚层得石油醚部分； 将石油醚萃取的残余物用氯仿萃取， 浓缩氯仿层得氯仿部分；将氯仿 萃取的残余物用乙酸乙酯萃取， 浓缩乙酸乙酯层得乙酸乙酯部分；将 乙酸乙酯萃取的残余物用正丁醇萃取， 浓缩正丁醇层得正丁醇部分； 将上述石油醚部分、 氯仿部分和乙酸乙酯部分合并， 得到提取物。 在 一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、氯仿部分合并 得到的。 在一个实施方案中， 所述锁阳提取物是上述氯仿部分、 乙酸 乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石 油醚部分、 乙酸乙酯部分合并得到的。 在一个实施方案中， 所述锁阳 提取物是上述乙酸乙酯部分。
根据本发明第二方面任一项的锁阳提取物，其是经如下步骤制备 的： a)将锁阳用 2~20倍量 (优选 5〜15倍量， 更优选 8~12倍量， 例如 10 倍量)的 60~98% (优选 70~98%， 更优选 80〜98%， 例如 80%、 85%、 90%、 95%或 98%)乙醇浸泡 5~24小时 (优选 5~18小时， 更优选 8~15小 时）； b)回流提取 0.5~10小时 (优选 0.5~8小时， 更优选 0.5~6小时， 更优 选 0.5~4小时， 更优选 1~4小时， 例如 1小时、 2小时、 3小时、 4小时）， 倾出提取液； c)任选地使步骤 b)的药渣重复进行步骤 a)和步骤 b) 1-3 次 (例如 1次、 2次、 3次)； d)合并步骤 b)和步骤 c)的提取液， 过滤， 滤 液回收乙醇， 得浓缩液； e)使步骤 d)的浓缩液依次用石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯和正丁醇萃取，将各萃取物分别回收溶剂后得固形物，合并 石油醚部分、 氯仿部分、 和乙酸乙酯部分中任一种或多种的固形物， 得提取物。 在一个实施方案中， 所述锁阳提取物是上述石油醚部分、 氯仿部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述氯 仿部分、 乙酸乙酯部分合并得到的。 在一个实施方案中， 所述锁阳提 取物是上述石油醚部分、 乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案 中， 所述锁阳提取物是上述乙酸乙酯部分。
本发明第三方面提供了可得自锁阳的包含一种或多种选自下列 的活性成分： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0·没食子酸 酯、 柑桔素 -4'- -葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案中， 所述锁阳 活性成分可用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例如，人)雌激素分泌不足 相关的疾病。 在一个实施方案中， 所述大黄酚可用于治疗和 /或预防 与哺乳动物 (例如， 人)雌激素分泌不足相关的疾病。 在一个实施方案 中， 所述大黄素可用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例如，人)雌激素分 泌不足相关的疾病。 在一个实施方案中， 所述儿茶素可用于治疗和 / 或预防与哺乳动物 (例如， 人)雌激素分泌不足相关的疾病。 在一个实 施方案中， 所述 (-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯可用于治疗和 /或预防与 哺乳动物 (例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病。在一个实施方案中， 所述柑桔素 -4'-6>-葡萄糖苷可用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例如， 人)雌激素分泌不足相关的疾病。 在一个实施方案中， 所述根皮苷可 用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例如， 人)雌激素分泌不足相关的疾 病
根据本发明第三方面任一项的活性成分，其中下列成分的一种或 多种的组合是从锁阳中提取得到： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿 茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。
根据本发明第三方面任一项的活性成分，其中从锁阳中提取大黄 酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0- 葡萄糖苷、 根皮苷的步骤如下：
将锁阳用含水乙醇溶液 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95% 乙醇)提取；
使所得醇提取物依次用石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯和正丁醇萃取， 将各萃取物分别回收溶剂后得各萃取溶剂部分的固形物；
石油醚部分经硅胶柱层析， 采取石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度 洗脱， 3 ~ 4流份经过石油醚重结晶处理， 得到大黄酚；
氯仿部分经过硅胶柱层析，采取石油醚-丙酮溶剂系统梯度洗脱， 19 ~ 32流份通过羟丙基葡聚糖凝胶及氯仿-曱醇溶剂系统反复硅胶柱 层析后， 得到大黄素；
乙酸乙酯部分经过硅胶柱层析， 釆取氯仿-曱醇溶剂系统梯度洗 脱，得到的乙酸乙酯部分 27 ~ 42流份、和乙酸乙酯部分 43 ~ 64流份； 该乙酸乙酯部分 27 ~ 42 流份经过硅胶柱层析， 釆用氯仿-曱醇- 水溶剂系统梯度洗脱， 分别得到 27 42-4 ~ 6流份 (即上一步骤的乙 酸乙酯部分 27 - 42流份经硅胶柱层析后得到的 4 ~ 6流份，本文其它 地方出现类似表述具有类似含义)、 27 ~ 42-7 ~ 10流份、 27 ~ 42-11 ~ 14流份；
所述 27 ~ 42-4 ~ 6流份经石油醚-乙酸乙酯溶剂系统硅胶柱层析， 得到儿茶素；
所述 27 ~ 42-7 ~ 10流份经过硅胶柱层析以及皮相硅胶柱层析处 理， 得到柑桔素 -4 葡萄糖苷；
所述 27 ~ 42-11 ~ 14流份经过羟丙基葡聚糖凝胶及反相硅胶柱层 析， 得到 (-)表儿茶素 -3- -没食子酸酯；
所述乙酸乙酯部分 43 ~ 64 流份通过氯仿-甲醇溶剂系统进行聚 酰胺以及硅胶柱层析并结合羟丙基葡聚糖凝胶柱层析， 得到根皮苷。
本发明第四方面提供了锁阳提取物在制备用于治疗和 /或预防与 哺乳动物 (例如， 人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。 根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述的与雌激素分泌不 足相关的疾病选自：更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、 心脑血管疾病、 乳腺癌。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物的剂量为所 述哺乳动物每天每 kg体重相当于锁阳药材 0.01-10g， 优选 0.02-5g， 更优选 0.05-lg， 再更优选 0.05-0.5g。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物中包含至少 一种选自以下的成分： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案中， 所述大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔 素 -4,-0-葡萄糖苷、 根皮苷的总量占所述提取物总重量的 l-90%(w/ ), 优选 l~80%(w/w), 优选 2 ~ 50 %(w/w) , 优选 2〜 40 %(w/w), 优选 2 ~ 30 %(w/w)， 更优选 2〜20 %(w/w)。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物中包含至少 一种选自以下的成分： 儿茶素、 （-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔 素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案中， 其中所述儿茶素、 (-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷的总量 占所述提取物总重量的 l-90%(w/w)， 优选 l~80%(w/w)， 优选 2 - 50 %(w/w), 优选 2 ~ 40 %(w/w)， 优选 2 ~ 30 %(w/w)， 更优选 2 ~ 20 %( /w).
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述的提取物是锁阳药 材以水、醇 (例如乙醇）、或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50_98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为提取溶剂的提取物。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物是以水、醇 (例如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60% 乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取获得的。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物是以水、醇 (例如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50_98%乙醇， 例如 60% 乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的石油醚萃取部分、 氯仿萃取部分、 乙酸乙酯萃取 部分、 或其混合物。 在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例 如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50_98%乙醇， 例如 60%乙 醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正 丁醇萃取， 得到的石油醚萃取部分、 氯仿萃取部分、 和乙酸乙酯萃取 部分的混合物。 在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙 醇）、 或水-醇 (例如乙醇）混合物 (例如 50_98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇 萃取，得到的氯仿萃取部分和乙酸乙酯萃取部分的混合物。在一个实 施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇)、 或水-醇 (例如乙醇)混 合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并 依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的乙酸乙酯萃取 部分。 在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇)、 或水 -醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50_98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇) 为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到 的石油醚萃取部分。 在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例 如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50_98%乙醇， 例如 60%乙 醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正 丁醇萃取， 得到的乙酸乙酯萃取部分和石油醚萃取部分的混合物。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物中包含至少 一种选自以下的成分： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0- 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案中， 所述提取物中包含以下的成分： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶 素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物中包含至少 一种选自以下的成分： 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3- -没食子酸酯、 柑桔 素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案中， 所述提取物中包含 以下的成分： 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'- - 葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例 如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50_98%乙醇， 例如 60%乙 醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正 丁醇萃取， 得到的乙酸乙酯萃取部分。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述的锁阳提取物是经 如下步骤制备的： 将锁阳用含水乙醇溶液 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)提取； 使所得醇提取物用石油醚萃取， 浓缩醚 层得石油醚部分；将石油醚萃取的残余物用氯仿萃取，浓缩氯仿层得 氯仿部分； 将氯仿萃取的残余物用乙酸乙酯萃取， 浓缩乙酸乙酯层得 乙酸乙酯部分；将乙酸乙酯萃取的残余物用正丁醇萃取， 浓缩正丁醇 层得正丁醇部分；将上述石油醚部分、氯仿部分和乙酸乙酯部分合并， 得到提取物。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、 氯仿部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述氯 仿部分、 乙酸乙酯部分合并得到的。 在一个实施方案中， 所述锁阳提 取物是上述石油醚部分、 乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案 中， 所述锁阳提取物是上述乙酸乙酯部分。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述的锁阳提取物是经 如下步骤制备的： a)将锁阳用 2~20倍量 (优选 5~15倍量， 更优选 8〜12 倍量， 例如 10倍量)的 60~98% (优选 70~98%， 更优选 80〜98%， 例如 80%、 85%、 90%、 95%或 98%)乙醇浸泡 5〜24小时 (优选 5~18小时， 更优选 8~15小时）； b)回流提取 0.5 10小时 (优选 0.5~8小时， 更优选 0.5~6小时， 更优选 0.5~4小时， 更优选 1~4小时， 例如 1小时、 2小时、 3小时、 4小时)， 倾出提取液； c)任选地使步骤 b)的药渣重复进行步骤 a)和步骤 b) 1〜3次 (例如 1次、 2次、 3次)； d)合并步骤 b)和步骤 c)的提 取液， 过滤， 滤液回收乙醇， 得浓缩液； e)使步骤 d)的浓缩液依次用 石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯和正丁醇萃取， 将各萃取物分别回收溶剂后 得固形物， 合并石油醚部分、 氯仿部分、 和乙酸乙酯部分中任一种或 多种的固形物， 得提取物。 在一个实施方案中， 所述锁阳提取物是上 述石油醚部分、 氯仿部分合并得到的。 在一个实施方案中， 所述锁阳 提取物是上述氯仿部分、 乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案 中， 所述锁阳提取物是上述石油醚部分、 乙酸乙酯部分合并得到的。 在一个实施方案中， 所述锁阳提取物是上述乙酸乙酯部分。
本发明第五方面提供了选自下列成分的一种或多种的组合在制 备用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例如，人)雌激素分泌不足相关的疾 病的药物中的用途： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没 食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案中， 提 供了大黄酚在制备用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例如，人)雌激素分 泌不足相关的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，提供了大黄 素在制备用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例如，人)雌激素分泌不足相 关的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，提供了儿茶素在制备 用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病 的药物中的用途。 在一个实施方案中， 提供了 (-)表儿茶素 没食 子酸酯在制备用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例如，人)雌激素分泌不 足相关的疾病的药物中的用途。 在一个实施方案中， 提供了柑桔素 -4 葡萄糖苷在制备用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例如， 人)雌激 素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，提供了 根皮苷在制备用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例如，人)雌激素分泌不 足相关的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，提供了选自下列 成分的一种或多种的组合在制备用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例 如， 人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途： 儿茶素、 （-)表 儿茶素 -3- -没食子酸酯、 柑桔素 -4'- -葡萄糖苷、 根皮苷。
根据本发明第五方面任一项的用途，其中所述的与雌激素分泌不 足相关的疾病选自：更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、 心脑血管疾病、 乳腺癌。
根据本发明第五方面任一项的用途，其为下列成分在制备用于治 疗和 /或预防与哺乳动物 (例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物 中的用途： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 _4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。
才艮据本发明第五方面任一项的用途，其中下列成分的一种或多种 的组合是从锁阳中提取得到： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。 根据本发明笫五方面任一项的用途， 其中从锁阳中提取大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖 苷、 根皮苷的步驟如下：
将锁阳用含水乙醇溶液 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95% 乙醇)提取；
使所得醇提取物依次用石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯和正丁醇萃取， 将各萃取物分别回收溶剂后得各萃取溶剂部分的固形物；
石油醚部分经硅胶柱层析， 釆取石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度 洗脱， 3 ~ 4流份经过石油醚重结晶处理， 得到大黄酚；
氯仿部分经过硅胶柱层析，采取石油醚-丙酮溶剂系统梯度洗脱， 19 ~ 32流份通过羟丙基葡聚糖凝胶及氯仿-甲醇溶剂系统反复硅胶柱 层析后， 得到大黄素；
乙酸乙酯部分经过硅胶柱层析， 采取氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗 脱，得到的乙酸乙酯部分 27 ~ 42流份、和乙酸乙酯部分 43 ~ 64流份； 该乙酸乙酯部分 27 ~ 42 流份经过硅胶柱层析， 采用氯仿-曱醇- 水溶剂系统梯度洗脱， 分别得到 27 ~ 42-4 ~ 6流份 (即上一步骤的乙 酸乙酯部分 27 ~ 42流份经硅胶柱层析后得到的 4 ~ 6流份，本文其它 地方出现类似表述具有类似含义)、 27 ~ 42-7 ~ 10流份、 27 - 42-11 - 14流份；
所述 27 ~ 42-4 - 6流份经石油醚-乙酸乙酯溶剂系统硅胶柱层析， 得到儿茶素；
所述 27 ~ 42-7 - 10流份经过硅胶柱层析以及反相硅胶柱层析处 理， 得到柑桔素 -4'-(?-葡萄糖苷；
所述 27 ~ 42-11 - 14流份经过羟丙基葡聚糖凝胶及反相硅胶柱层 析， 得到 (-)表儿茶素 -3-(?-没食子酸酯；
所述乙酸乙酯部分 43 ~ 64 流份通过氯仿-曱醇溶剂系统进行聚 酰胺以及硅胶柱层析并结合羟丙基葡聚糖凝胶柱层析， 得到根皮苷。
本发明第六方面提供了锁阳在制备作为植物雌激素的药物中的 用途。
才艮据本发明第六方面任一项的用途，其中所述的药物可用于治疗 和 /或预防更年期综合征、 骨质疏松症、 退行性骨质疏松症、 心脑血 管疾病、 乳腺癌。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述药物的剂量为所述 哺乳动物每天每 kg体重相当于锁阳药材 0.01-10g， 优选 0.02-5g， 更 优选 0.05-lg， 再更优选 0.05-0.5g。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材 的提取物。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述的药物包含锁阳药 材以水、醇 (例如乙醇）、或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为提取溶剂的提取物。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述的药物包含锁阳药 材的提取物， 该提取物是以水、 醇 (例如乙醇)、 或水-醇 (例如乙醇)混 合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并 依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取获得的。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述的药物包含锁阳药 材的提取物， 该提取物是以水、 醇 (例如乙醇)、 或水-醇 (例如乙醇)混 合物 (例如 50_98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并 依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的石油醚萃取部 分、 氯仿萃取部分、 乙酸乙酯萃取部分、 或其混合物。 在一个实施方 案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇)、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次 经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的石油醚萃取部分、 氯仿萃取部分、 和乙酸乙酯萃取部分的混合物。 在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇）混合物（例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油 醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的氯仿萃取部分和乙酸乙酯 萃取部分的混合物。 在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例 如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例如 50_98%乙醇， 例如 60%乙 醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正 丁醇萃取， 得到的乙酸乙酯萃取部分。 在一个实施方案中， 所述提取 物是以水、 醇 (例如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇）混合物 (例如 50-98%乙 醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分。在一个实施方案中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇）混合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经石油 醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的乙酸乙酯萃取部分和石油 醚萃取部分的混合物。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材 的提取物， 该提取物中包含至少一种选自以下的成分： 大黄酚、 大黄 素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。在一个实施方案中，所述提取物中包含以下的成分：大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-(?-葡萄糖 苷、 根皮苷。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材 的提取物， 该提取物中包含至少一种选自以下的成分： 儿茶素、 （-) 表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'- >-葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个 实施方案中， 所述提取物中包含以下的成分： 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'- -葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案 中， 所述提取物是以水、 醇 (例如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇)混合物 (例 如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依次经 石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 得到的乙酸乙酯萃取部分。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材 的提取物，该锁阳的提取物是经如下步骤制备的： 将锁阳用含水乙醇 溶液 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)提取； 使所得醇提 取物用石油醚萃取， 浓缩醚层得石油醚部分； 将石油醚萃取的残余物 用氯仿萃取， 浓缩氯仿层得氯仿部分；将氯仿萃取的残余物用乙酸乙 酯萃取， 浓缩乙酸乙酯层得乙酸乙酯部分； 将乙酸乙酯萃取的残余物 用正丁醇萃取， 浓缩正丁醇层得正丁醇部分； 将上述石油醚部分、 氯 仿部分和乙酸乙酯部分合并， 得到提取物。 在一个实施方案中， 所述 锁阳提取物是上述石油醚部分、氯仿部分合并得到的。在一个实施方 案中， 所述锁阳提取物是上述氯仿部分、 乙酸乙酯部分合并得到的。 在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、 乙酸乙酯部 分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述乙酸乙酯 部分。
在本发明第六方面任一项所述用途的一个实施方案中，所述提取 物具有本发明第一方面、第二方面或第三方面任一项中所述提取物的 特征。
本发明第七方面提供了锁阳提取物在制备作为植物雌激素的药 物中的用途。
根据本发明笫七方面任一项的用途，其中所述的药物可用于治疗 和 /或预防更年期综合征、 骨质疏松症、 退行性骨质疏松症、 心脑血 管疾病、 乳腺癌。
根据本发明第七方面任一项的用途，其中所述药物的剂量为所述 哺乳动物每天每 kg体重相当于锁阳药材 0.01-10g， 优选 0.02-5g, 更 优选 0.05-lg， 再更优选 0.05-0.5g。
根据本发明第七方面任一项的用途，其中所述提取物具有本发明 第二方面任一项所述提取物的特征。
本发明第八方面提供了选自下列成分的一种或多种的组合在制 备作为植物雌激素的药物中的用途： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-) 表儿茶素 -3-0·没食子酸酯、 柑桔素 -4'- -葡萄糖苷、 根皮苷。
根据本发明第八方面任一项的用途，其中所述的药物可用于治疗 和 /或预防更年期综合征、 骨质疏松症、 退行性骨质疏松症、 心脑血 管疾病、 乳腺癌。
根据本发明第八方面任一项的用途，其为下列成分在制备作为植 物雌激素的药物中的用途：大黄酚、大黄素、儿茶素、（-)表儿茶素 -3- - 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。
根据本发明第八方面任一项的用途， 其中所述大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3- -没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮 苷各自独立地具有本发明第三方面任一项所述的特征。
本发明第九方面提供了一种用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例 如， 人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物组合物， 其中包含治疗和 / 或预防有效量的锁阳提取物以及任选的药学可接受的赋形剂。
根据本发明第九方面任一项的药物组合物，其中所述的锁阳提取 物中包含至少一种选自以下的成分： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-) 表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。
根据本发明第九方面任一项的药物组合物，其中所述的锁阳提取 物中包含以下的成分： 大黄酴、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0- 没食子酸酯、 柑桔素 -4'- -葡萄糖苷、 根皮苷。
根据本发明第九方面任一项的药物组合物，其中所述大黄酚、大 黄素、儿茶素、（-)表儿茶素 -3- -没食子酸酯、柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷的总量占所述提取物总重量的 l-90%(w/w)， 优选 l~80%(w/w), 优选 2 ~ 50 %(w/w), 优选 2 ~ 40 %(w/w), 优选 2 〜 30 %(w/ ), 更优选 2 ~ 20 %(w/w
根据本发明第九方面任一项的药物组合物，其中所述的药物组合 物给予所述哺乳动物的剂量为所述哺乳动物每天每 kg体重相当于锁 阳药材 0.01-10g， 优选 0.02-5g, 更优选 0.05-lg, 再更优选 0.05-0.5g。
根据本发明第九方面任一项的药物组合物，其中所述的锁阳提取 物是经如下步骤制备的： 以水、 醇 (例如乙醇）、 或水-醇 (例如乙醇)混 合物 (例如 50-98%乙醇， 例如 60%乙醇、 95%乙醇)为溶剂提取， 并依 次经石油醚、氯仿、 乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分、 氯仿萃取部分、 乙酸乙酯萃取部分、 或其混合物。
根据本发明第九方面任一项的药物组合物，其中所述锁阳提取物 具有本发明第二方面任一项所述提取物的特征。
本发明第十方面提供了一种用于治疗和 /或预防与哺乳动物 (例 如， 人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物组合物， 其中包含治疗和 / 或预防有效量的至少一种药物活性成分以及任选的药学可接受的赋 形剂， 所述的药物活性成分选自： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿 茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-(?-葡萄糖苷、 根皮苷。
根据本发明第十方面任一项的药物组合物， 其中包含治疗和 /或 预防有效量的大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸 酯、 柑桔素 -4'- -葡萄糖苷、 根皮苷， 以及任选的药学可接受的赋形 剂。
根据本发明第十方面任一项的药物组合物， 其中包含治疗和 /或 预防有效量的儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0- 葡萄糖苷、 根皮苷， 以及任选的药学可接受的赋形剂。
根据本发明第十方面任一项的药物组合物，其中所述大黄酚、大 黄素、儿茶素、（-)表儿茶素 -3- -没食子酸酯、柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷各自独立地具有本发明第三方面任一项所述的特征。
本发明第十一方面提供了在有需要的受试者中治疗和 /或预防与 雌激素分泌不足相关的疾病的方法，其包括给所述受试者施用预防和 /或治疗有效量的锁阳。 在一个实施方案中， 所述锁阳是以药物的形 式给所述受试者施用的。在一个实施方案中，所述药物具有本发明第 一方面任一项所述的特征。
本发明第十一方面还提供了在有需要的受试者中治疗和 /或预防 与雌激素分泌不足相关的疾病的方法，其包括给所述受试者施用预防 和 /或治疗有效量的本发明第二方面任一项所述锁阳提取物。
本发明第十一方面还提供了在有需要的受试者中治疗和 /或预防 与雌激素分泌不足相关的疾病的方法,其包括给所述受试者施用预防 和 /或治疗有效量的至少一种选自下列的活性成分选自： 大黄酚、 大 黄素、儿茶素、（-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。 在一个实施方案中， 所述大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿 茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷各自独立地具 有本发明第三方面任一项所述的特征。
根据本发明第十一方面任一项的方法，其中所述的与雌激素分泌 不足相关的疾病选自： 更年期综合征、 骨质疏松症、 退行性骨质疏松 症、 心脑血管疾病、 乳腺癌。
本发明任一方面或该任一方面的任一项所具有的特征同样适用 于其它任一方面或该其它任一方面的任一项， 只要它们不会相互矛 盾， 当然在相互之间适用时， 必要的话可对相应特征作适当修饰。 在 本发明中， 例如， 提及"本发明第一方面任一项"时， 该"任一项 "是指 本发明第一方面的任一子方面；在其它方面以类似方式提及时， 亦具 有相同含义。
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献， 它们的全部内容通过引用并入本文， 并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述 为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知 的一般含义， 即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更 详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的， 以 本发明所表述的含义为准。
本文中使用的术语 "锁阳，，，符合 2005年版《中华人民共和国药典 一部》 "锁阳"项下的规定。
本文中使用的术语"约"，其通常是指本领域允许的误差范围，例 如士 10%， 例: δ口 ±5%， 例如 ±2%。
如本文所述的，术语"有效量 "是指可在受试者中实现治疗、预防、 减轻和 /或緩解本发明所述疾病或病症的剂量。
如本文所述的， 术语"药物组合物"， 其可以与 "组合物" 互换使 用， 并且可以指可用于在受试者中实现治疗、 预防、 减轻和 /或緩解 本发明所述疾病、 病症、 症状的物质。
如本文所述的，术语"受试者，，或 "患者"，可以指接受本发明组合 物和提取物以治疗、 预防、 减轻和 /或緩解本发明所述疾病、 病症、 症状的动物， 特别是哺乳动物， 例如人、 狗、 猴、 牛、 马等。
如本文所述的，术语"疾病或症状"是指所述受试者的一种身体状 态， 该身体状态与本发明所述疾病或症状有关。
如本文所述的， "％"， 如未特别指明， 对于总物料是固体时一般 是指重量 /重量的百分比， 对于总物料是液体时一般是指重量 /体积的 百分比。 当然， 对于总物料是液体并且溶盾是液体时， 表征该液态溶 质的百分比一般是指体积 /体积的百分比。对于描述乙醇时使用的％， 例如 95%乙醇， 其具有本领域公知的含义， 例如可参见 2005年版《中 华人民共和国药典二部》凡例中的定义。
本文中使用的短语"与雌激素分泌不足相关的疾病"具有本领域 技术人员公知的含义，并且通常是指雌性哺乳动物例如人特别是更年 期的女性因雌激素分泌不足而产生的一些疾病或症状，这些疾病或症 状包括但不限于更年期综合征、 骨质疏松症、 退行性骨质疏松症、 心 脑血管疾病、 乳腺癌。
如本文所述的， 术语"提取物"， 如未另外指明， 是指锁阳的 "提 取物"。
如本文所述的， 术语"儿茶素"， 可以是指 (-)儿茶素、 （+)儿茶素、 或者外消旋的儿茶素。
如本文所述的，术语"石油醚部分"是指一种由石油醚处理（萃取） 获得的植物有效部位，亦可称为"石油醚部位"。其它类似术语例如 "乙 酸乙酯部分"亦具有类似含义， 即例如是通过液液萃取获得的植物有 效部位。
尽管本发明对所涉及的活性成分作了详细描述，本发明人仍然愿 意在此强调， 这些活性成分 (其包括， 但不限于， 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮 苷)具有本领域技术人员已知的化学结构、 物理化学性质。
根据本发明， 由于大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0- 没食子酸酯、柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、根皮苷 6种成分均具有相关的植 物雌激素作用， 因此这 6种成分或其部分在提取物、 药物、 组合物等 中的量 (例如， 各成分占总提取物、 药物、 组合物等重量的比率， 各 成分之间的比率， 等等)无需作特别限定， 药物的用药剂量可通过折 算成锁阳药材来计算。
分离得到的一系列化合物做雌激素受体激活实验， 以雌二醇为 阳性对照组， 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸 酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷均显示与雌激素受体激活有关。
可釆用制剂领域中的常规技术， 将锁阳的单一活性成分或其组 合或者含有锁阳中具有雌激素活性成分的锁阳提取物与一种或多种 药学可接受的赋形剂混合， 并形成所需的剂型，来制备本发明的药物 组合物。
本发明药物组合物中使用的"药学可接受的赋形剂"可以是药物 制剂领域中任何常规的赋形剂。 特定赋形剂的选择将取决于用于治疗 特定患者的给药方式或疾病类型和状态。 用于特定给药模式的合适药 物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。 例如， 可以作为药学可接受的赋形剂包括药学领域常规的稀释剂、载体、填 充剂、 粘合剂、 湿润剂、 崩解剂、 吸收促进剂、 表面活性剂、 吸附载 体和润滑剂等。 必要时， 还可以在药物组合物中加入香味剂、 防腐剂 和甜味剂等。
本发明的药物组合物可以制成片剂、 粉剂、 颗粒剂、 胶嚢、 口服 液、 膏剂、 霜剂、 注射乳剂 (注射用无菌粉针)等多种形式。 上述各种 剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
经研究表明，本发明所得到的化合物具有不同程度的拟雌激素作 用。 因此， 可以预期本发明的所得到的化合物 (例如大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3- -没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮 苷)或含有它的药物组合物可以用于治疗更年期综合征、 乳腺癌和 /或 心脑血管疾病。 或者， 本发明所得到的可用于制备药物， 该药物用于 治疗更年期综合征、 乳腺癌和 /或心脑血管疾病。
本发明利用细胞转染及萤光素酶报告基因化学发光检测的方法， 探讨锁阳中十个单体化合物对 ERa和 ERP转录活性的影响， 从而说 明锁阳中哪些成分具有雌激素活性， 同时说明其作用靶点及作用途 径。 结果令人惊奇的发现， 四个黄酮类化合物 (儿茶素、 根皮苷、 柑 桔素- 4'-0-葡萄糖苷和 (-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯)具有强的雌激素 活性， 儿茶素（10·5Μ)和根皮苷 (10·6-10·5Μ)均可激动 ERot和 ΕΙ 转录 活性， 对受体亚型无明显选择性； 柑桔素 - 4'-0-葡萄糖苷 (10·9-10-5Μ) 可剂量依赖性地激动 ERot和 ΕΚβ转录活性， 对于 ΕΙ 的选择性强于 ERot;而 (-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯 (10·8-1(Γ5Μ)可激动 ERa和 ER ， 转录活性以 1(Γ7Μ为最强， 并且对于 ERa的选择性强于 ERP。 黄酮 类化合物的雌激素活性约是雌二醇的 1/1000-1/10。 锁阳中两个蒽醌 类化合物， 大黄酚与大黄素在高浓度 10·6Μ能激活受体转录活性， 无 受体选择性， 其活性约是雌二醇的 1/1000-1/100。 具体实施方式
下面通过具体的实施例和实验例进一步说明本发明， 但是， 应 当理解为， 这些实施例和实验例仅仅是用于更详细具体地说明之 用， 而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和 / 或具体的描述。 虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方 法是本领域公知的， 但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。 本领 域技术人员清楚， 在下文中， 如果未特别说明， 本发明所用材料和 操作方法是本领域公知的。
实施例 1： 锁阳中四个黄酮类化合物和 2个蒽醌类化合物的制备
1、 提取物的制备
将 40.0 千克锁阳药材 (购自内蒙古阿拉善盟)粉碎成小块， 加入 400升 95%乙醇浸泡过夜。 回流提取 2小时， 倾出提取液， 药渣再加 入 400升 60%乙醇回流提取 2小时。 提取液合并后过滤， 旋蒸滤液 回收乙醇。 将浓缩所得残余物依次用石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯和正丁 醇萃取， 分别回收溶剂后得固形物。 结果： 石油醚部分固形物 55 g， 氯仿部分固形物 229 g， 乙酸乙酯部分固形物 147 g， 正丁醇部分固形 物 867 g。 石油醚部分含大黄酚质量百分含量 0.082% ( WAV ), 氯仿 部分含大黄素 0.031% ( WAV ), 乙酸乙酯部分含儿茶素质量百分含 量 10.84% ( W/W ), 乙酸乙酯部分含柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷质量百分 含量 0.304% ( WAV ), 乙酸乙酯部分含 (-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯 质量百分含量 0.88% ( W/W ), 乙酸乙酯部分含根皮苷质量百分含量 0.28% ( W/W )。
2、 活性成分单体的制备
锁阳石油醚部分 55 g, 通过硅胶柱层析， 采取石油醚-乙酸乙酯 溶剂系统梯度洗脱， 3 ~ 4 流份经过石油醚重结晶处理， 得到橙红色 簇状结晶， 30mg， 经鉴定为大黄酚。
锁阳氯仿部分 229 g， 通过硅胶柱层析， 采取石油醚 -丙酮溶剂系 统梯度洗脱， 19 ~ 32流份通过羟丙基葡聚糖凝胶及氯仿 -曱醇溶剂系 统反复硅胶柱层析后，得到橙红色簇状结晶 35mg，经鉴定为大黄素。 锁阳乙酸乙酯部分 147 g, 通过硅胶柱层析， 釆取氯仿-曱醇溶剂 系统梯度洗脱， 分别得到乙酸乙酯部分 27 ~ 42流份和乙酸乙酯部分 43 ~ 64流份。
乙酸乙酯部分 27 ~ 42 流份通过硅胶柱层析， 采用氯仿-曱醇-水 溶剂系统梯度洗脱。 得到的 27 ~ 42-4 ~ 6流份经石油醚 -乙酸乙酯溶 剂系统硅胶柱层析后， 得到白色簇状结晶 13g， 经鉴定为儿茶素 (外 消旋体)。 得到的 27 ~ 42-7 - 10流份经过硅胶柱层析以及反相硅胶柱 层析处理， 得到白色粉末 300mg， 经鉴定为柑桔素 -4 葡萄糖苷。 得到的 27 ~ 42-11 ~ 14 流份经过羟丙基葡聚糖凝胶及反相硅胶柱层 析， 得到灰白色粉末 lg， 经鉴定为 (-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯。
乙酸乙酯部分 43 ~ 64 流份通过氯仿 -曱醇溶剂系统进行聚酰胺 以及硅胶柱层析并结合羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，得到棕色针状结晶 200mg, 经鉴定为根皮苷。 实施例 2: 锁阳中 6个化合物结构确证
对实施例 1获得的 6个化合物 (即， 大黄酚、 大黄素、 儿茶素 (外 消旋体)、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'- -葡萄糖苷、 根 皮苷)进行了结构确认 (委托天津大学分析测试中心检测， 500MHz核 磁)。 分析结果显示这些化合物的结构与文献报道的结构一致， 具体 如下。
大黄酚， 橙红色簇状结晶。 NMR (CDC13， 500 MHz), δ: 7.09 (1H， br s, H-2), 7.64 (1H， br s， H-4), 7.81 (1H， br d, / = 7.5 Hz, H-5), 7.67 (1H， br d， = 8.0 Hz, H-6), 7.28 (1H, br d， = 8.5 Hz, H-7), 2.47 (3H, s， -CH3), 12.00 (1H, s, -OH), 12.12 (1H， s， -OH) ； 13C NMR (CDC13), δ: 162.6 (C-1), 124.8 (C-2), 149.6 (C-3), 121.6 (C-4)， 124.6 (C-5), 137.1 (C-6), 120.1 (C-7), 162.9 (C-8), 192.7 (C-9), 182.1 (C-10), 133.8 (C-ll), 113.9 (C-12), 116.0 (C-13), 133.5 (C-14), 22.5 (-£ )。
大黄素，橙红色簇状结晶。 NMR (DMSO-i 6, 500 MHz), δ: 7.06 (1H， d， = 2 Hz, H-2), 7.39 (1H， d， = 2 Hz, H-4), 7.03 (1H， d, = 3.0 Hz, H-5), 6.50 (1H, d, = 3.0 Hz, H-7), 2.36 (3H, s， C6-CH3)。 儿茶素 (夕卜消旋体），白色簇状结晶。 NMR (CD3OD， 500 MHz), δ: 4.56 (1H， d, = 7.5 Hz, H-2), 3.97 (1H， m， H-3), 2.85 (1H， dd, = 16.0, 5.5 Hz, H-4a), 2.50 (IH, dd, = 16.0, 8.0 Hz, H-4b)， 5.93 (1H， d， /= 1.0 Hz, H-6), 5.86 (1H， br s， H-8), 6.84 (1H， br s， H-2'), 6.76 (1H， d / = 8.0 Hz, H-5')， 6.72 (1H， d， / = 8.5 Hz, H-6'). 13C NMR (CD3OD， 500 MHz), δ: 81.7 (C-2), 67.6 (C-3), 27.3 (C-4), 99.8 (C-4a), 156.4 (C-5), 95.1 (C-6), 156.6 (C-7), 94.3 (C-8), 155.7 (C-8a), 131.0 (C-l')， 114.1 (C-2')， 145.1 (C-3'), 145.1 (C-4'), 114.9 (C-5')， 118.9 (C-6').样品 1.0 g/100 ml及 0.1 g/100 ml的甲醇溶液比旋光度均为零。
(-)表儿茶素 -3-0·没食子酸酯， 灰白色粉末。 NMR (CD3OD，
500 MHz), δ: 5.03 (lH, s, H-2), 5.53 (lH, s, H-3), 2.99 (IH, dd, = 17.5, 4.5 Hz, H-4a), 2.85 (IH, dd, = 17.0, 1.5 Hz, H-4b), 5.96 (IH, s， H-6), 5.96 (IH, s, H-8), 6.93 (IH, d, = 2.0 Hz, H-2'), 6.70 (IH, d, = 7.5 Hz, H-5')， 6.81 (IH, dd， = 8.0， 2.0 Hz, H-6'), 6.95 (2H, s, H-2"和 H-6 )。 13C NMR (CD3OD, 500 MHz), δ: 78.5 (C-2), 69.9 (C-3), 26.8 (C-4), 99.4 (C-4a), 157.7 (C-5和 C-7)， 96.5 (C-6), 95.8 (C-8), 157.2 (C-8a)， 131.4 (C-l'), 115.0 (C-2'), 145.8 (C-3'和 C-4')， 116.0 (C-5')， 119.3 (C-6'), 121.3 (C-l"), 110.1 (C-2〃和 C-6")， 146.2 (C-3 "和 C-5")， 139.7 (C-4"), 167.6 (C-CO).
柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷， 白色粉末。 1 H-NMR (DMSO-i/6， 500
MHz), δ: 5.52 (IH, dd, = 13, 3.0 Hz, H-2), 2.72-3.20 (2H， m， H-3), 5.88 (1H， d， = 1.5 Hz, H-6), 5.87 (1H， d, = 2.0 Hz, H-8), 7.42 (2H, d, /= 8.5 Hz, H-2'和 H-6')， 7.05 (2H， d， = 9.0 Hz， H-3'和 H-5')， 4.88 (1H， d, = 7.5 Hz,糖 H-l), 3.17-4.55 (6H, m，糖质子）， 12.13 (1H， s, C5-OH)。
根皮苷，棕色针状结晶。 ^ NMR (CD3OD, 500 MHz), δ: 7.06 (2H d, = 8.5 Hz, H-2, 6), 6.68 (2H, d, /= 8.5 Hz, H-3, 5), 6.18 (IH, d, = 2.0 Hz, H-3'), 5.95 (IH, d, = 2.0 Hz, H-5，）， 5.04 (IH, d, = 7.0 Hz, H-l"), 3.43-3.48 (3H, 重叠的， H-2，'， 3"， 5 ")， 3.43 (IH, m, H-4"), 3.91 (IH, d, = 2.0, 12.5 Hz, H-6a")， 3.72 (1H， d， = 5.5， 12.5 Hz, H-6b'，）， 3.40 (2H, t, = 7.5 Hz, H-a), 2.88 (2H, t, = 7.5 Hz, H-P). 13C NMR (CD3OD, 500 MHz), δ: 133.8 (C-l), 130.4 (C-2, 6), 116.1 (C-3, 5)， 156.3 (C-4), 46.9 (C-a), 30.8 (C-β), 106.8 (C-l'), 162.3 (C-2'), 95.4 (C-3'), 165.9 (C-4'), 98.3 (C-5'), 167.5 (C-6')， 102.2 (C-l"), 74.7 (C-2"), 78.4 (C-3 ), 71.1 (C-4"), 78.4 (C-5"), 62.4 (C-6")。 实施例 3、 化合物对雌激素受体的激活作用
采用细胞转染的方法观察儿茶素、（-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 _4'- 葡萄糖苷、 根皮苷、 大黄素、 大黄酚对雌激素受体的选 择性激活。 实际上，雌激素正是通过调节雌激素反应基因转录来显示 其生物活性。
将带有报告基因的 ERa或 ERpDNA片段分别转染于无 ER表达 的 Hela细胞， 在细胞培养液中加入被测物后， 通过对报告基因转录 激活的检测观察被测物是否可通过 £1^或 ERp发挥雌激素样作用。
儿茶素、 （-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷、 大黄素、 大黄盼 (分别得自实施例 1)样品液的配制：
分别精密称取儿茶素、 （-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-(?-葡萄糖苷、根皮苷、 大黄素、 大黄盼相应质量后加入 DMSO溶 解， 对应得样品液高剂量组 (ΙΟμΜ或 1μΜ)， 稀释一定倍数分别得到 低剂量组 (ΙμΜ至 0.001μΜ)。
乙酸乙酯部分和石油醚部分溶液的配制：
分别精密称取锁阳乙酸乙酯部分 (取自实施例所得 147g 的物料) 和石油醚部分 (取自实施例所得 55g的物料)相应质量加入 DMSO溶 解， 对应得样品液高剂量组（50ug/ml )， 稀释一定倍数分别得到低剂 量组 ( 5 ug/ml, 0.5 ug/ml和 0.05 ug/ml )。
在 37。C， 5%C02的条件下， 在细胞培养箱中使用含有 10%小牛 血清的无酚红高糖 DMEM培养液培养 Hela细胞， 至细胞密度 90% 左右时将细胞按 60%密度铺于 96孔板中，每孔中加入含 10%血清的 无酚红 DMEM培养液 150ul， 培养过夜。 按 96孔板每孔 lOOul无血 清 DMEM培养基， 0.4 g质粒 (ptk-ERE-hic 2 g， tk-Renila lpg, ERa 或 ERp 1μδ)进行转染。 转染 6个小时后， 每孔加入 150ul无血清无 酚红 DMEM培养液。 选取每组三个孔， 加入 10― 8M雌二醇 E2， 以及不同浓度的受试物 15ul/孔 (样品 4~5 个浓度梯度组）， 37°C , 5%C02条件下继续培养 24小时。 24小时后每孔加入 80μ1细胞裂解 液， 并冻融细胞一次以使其充分裂解。对每孔的细胞裂解液分别测定 其对萤火虫萤光素酶及 Reiiila萤光素酶的活性。 每孔均用萤火虫萤 光素酶 / Renila萤光素酶值作为结果， 分别以各组中未加雌激素处理 的孔作为对照，计算加雌激素或被测物组相对于对照组的比值，每组 三个孔取平均值。 结果见表 1、 表 2和表 3。
表 1、 锁阳石油醚部分和乙酸乙酯部分对 Hela 细胞中 ERa或 ERP转录活性的影响
Figure imgf000030_0001
从表中结果可见，本发明的提取物具有期望的生物学活性。本领 域技术人员理解，虽然表中仅提供了乙酸乙酯部分和石油醚部分的活 性， 但是可以预见在用石油醚、 氯仿、 乙酸乙酯和正丁醇萃取之前的 提取物以及用四种溶剂萃取后所得各有效部位的任一种或几种组合 均预期具有期望的生物学活性。 表 2、 黄酮类化合物对 Hela细胞中 ERoc或 ERP转录活性的影响
Figure imgf000031_0001
表中， *P<0.05, **P<0.01 , 与对照比较 表 3、 蒽醌类化合物对 Hela细胞中 ERa或 ΕΚβ转录活性的影响
Figure imgf000032_0001
表中， *P<0.05, **P<0.01 , 与对照比较
雌激素主要通过雌激素受体 (ER)发挥其效应。研究已证实 ER广 泛存在于心血管系统、 成骨细胞、 破骨细胞、 乳腺及生殖系统等， 雌 激素对此有着广泛的治疗作用，而植物雌激素是一种天然的选择性雌 激素受体调节剂，其机构与功能与雌激素相似，能与雌激素受体结合， 具有雌激素样的生物活性。研究结果显示，本发明化合物可浓度依赖 性地激活雌激素受体， 我们研究证实锁阳中多成分能够与 ER结合， 提高其转录活性，证实其具有雌激素样作用。也就预示着锁阳中儿茶 素、 表儿茶素没食子酸酯、 柑桔素葡萄糖苷、 根皮苷、 大黄素、 大黄 酚可以用于妇女更年期综合征、 骨质疏松症、 退行性骨质疏松症、 心 脑血管疾病。
本发明不仅仅局限于以上实施例，本领域技术人员也可以根据本 发明的精神和范围获得本发明的其它变型实施方案中 ,而不会脱离本 发明的精神和范围。

Claims

权 利 要 求
1、锁阳在制备用于治疗和 /或预防与哺乳动物雌激素分泌不足相 关的疾病的药物中的用途。
2、根据权利要求 1的用途，其中所述的与雌激素分泌不足相关的 疾病选自： 更年期综合征、 骨质疏松症、 退行性骨质疏松症、 心脑血 管疾病、 乳腺癌。
3、根据权利要求 1的用途，其中所述的药物包含锁阳药材以水、 醇、 或水 -醇混合物为提取溶剂的提取物。
4、 根据权利要求 1的用途， 其中所述药物包含锁阳药材的提取 物， 该提取物中包含至少一种选自以下的成分： 大黄酚、 大黄素、 儿 茶素、（-)表儿茶素 -3- -没食子酸酯、柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、根皮苷。
5、 锁阳提取物， 其中包含至少一种选自以下的成分： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖 苷、 根皮苷。
6、 根据权利要求 5的锁阳提取物， 其是以水、 醇或水-醇混合物 为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、 乙酸乙酯、正丁醇萃取获得的。
7、锁阳提取物在制备用于治疗和 /或预防与哺乳动物雌激素分泌 不足相关的疾病的药物中的用途。
8、根据权利要求 7的用途，其中所述的与雌激素分泌不足相关的 疾病选自： 更年期综合征、 骨质疏松症、 退行性骨质疏松症、 心脑血 管疾病、 乳腺癌。
9、 根据权利要求 7的用途， 其中所述提取物中包含至少一种选 自以下的成分： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子 酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。
10、根据权利要求 7的用途，其中所述的提取物是锁阳药材以水、 醇、 或水-醇混合物为提取溶剂的提取物。
11、 根据权利要求 7的用途， 其中所述的锁阳提取物是经如下步 骤制备的：将锁阳用含水乙醇溶液提取；使所得醇提取物用石油醚萃 取， 浓缩醚层得石油醚部分； 将石油醚萃取的残余物用氯仿萃取， 浓 缩氯仿层得氯仿部分；将氯仿萃取的残余物用乙酸乙酯萃取， 浓缩乙 酸乙酯层得乙酸乙酯部分; 将乙酸乙酯萃取的残余物用正丁醇萃取， 浓缩正丁醇层得正丁醇部分；将上述石油醚部分、氯仿部分和乙酸乙 酯部分合并， 得到提取物。
12、 选自下列成分的一种或多种的组合在制备用于治疗和 /或预 防与哺乳动物雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0-没食子酸酯、 柑桔素 -4'-6>-葡萄糖 苷、 根皮苷。
13、根据权利要求 12的用途，其中所述的与雌激素分泌不足相关 的疾病选自： 更年期综合征、 骨质疏松症、 退行性骨质疏松症、 心脑 血管疾病、 乳腺癌。
14、 锁阳在制备作为植物雌激素的药物中的用途。
15、 锁阳提取物在制备作为植物雌激素的药物中的用途。
16、选自下列成分的一种或多种的组合在制备作为植物雌激素的 药物中的用途： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3- -没食子 酸酯、 柑桔素 -4'-0-葡萄糖苷、 根皮苷。
17、 用于治疗和 /或预防与哺乳动物雌激素分泌不足相关的疾病 的药物组合物， 其中包含治疗和 /或预防有效量的锁阳提取物以及任 选的药学可接受的赋形剂。
18、 用于治疗和 /或预防与哺乳动物雌激素分泌不足相关的疾病 的药物组合物， 其中包含治疗和 /或预防有效量的至少一种药物活性 成分以及任选的药学可接受的赋形剂，所述的药物活性成分选自： 大 黄酚、 大黄素、 儿茶素、 （-)表儿茶素 -3-0·没食子酸酯、 柑桔素 -4'-0- 葡萄糖苷、 根皮苷。
19、 在有需要的受试者中治疗和 /或预防与雌激素分泌不足相关 的疾病的方法，其包括给所述受试者施用有效量的锁阳，锁阳提取物， 或者至少一种选自下列的活性成分选自： 大黄酚、 大黄素、 儿茶素、 (-)表儿茶素 -3- -没食子酸酯、 柑桔素 -4'- -葡萄糖苷、 根皮苷。
20、根据权利要求 20的方法，其中所述的与雌激素分泌不足相关 的疾病选自： 更年期综合征、 骨质疏松症、 退行性骨质疏松症、 心脑 血管疾病、 乳腺癌。
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