CN105920086A - 一种补骨脂提取物的制备方法及补骨脂提取物 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药领域，涉及一种补骨脂提取物的制备方法及补骨脂提取物。制备方法具体包括步骤1)－5)或1)‑6)：1)补骨脂用1－20倍量50％－95％的乙醇浸泡1－36小时；2)用50％－95％乙醇渗漉提取，流速4－16mL/min/Kg；3)收集补骨脂投料量5－20倍体积渗漉液；4)将渗漉液浓缩；5)静置分层，倾去上层液，取下层得补骨脂稠浸膏；6)将补骨脂稠浸膏以适量乙醇稀释，搅拌下分次加至辅料粉末中，补骨脂生药量与辅料量的比例为(10:2.5)－(10:3)；搅匀，干燥，粉碎，过筛，得补骨脂浸膏粉。本发明的补骨脂提取物对肝脏基本上无毒性，能有效防治体内雌激素水平失调有关的疾病或改善其症状。

Description

一种补骨脂提取物的制备方法及补骨脂提取物

本发明是申请号为201310524167.3、申请日为2013年10月30日、发明名称为“一种调节雌激素水平的药物组合物、其制备方法及用途”申请的分案申请。

技术领域

本发明属于中药领域，涉及一种补骨脂提取物的制备方法，以及补骨脂提取物。

背景技术

补骨脂为豆科植物补骨脂Psoraleacorylifolia L.的干燥成熟果实，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻的功效，主要用于治疗腰膝冷痛，滑精，遗尿，尿频，五更泄泻，虚寒咳嗽；外用治白癜风。

补骨脂中主要含有香豆素、黄酮、单萜酚等成分，现代药理研究表明：补骨脂具有扩张血管、增加心肌收缩力、抗菌、抗肿瘤、增强免疫、雌性激素样作用。中华人民共和国药典2010版一部规定：补骨脂素、异补骨脂素作为补骨脂的含量测定指标，补骨脂素、异补骨脂素的含量以干品计不得低于0.7％。

目前已经从补骨脂中分离得到香豆素苷(补骨脂苷、异补骨脂苷)、香豆素(补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定)、黄酮(补骨脂异黄酮、异补骨脂查耳酮、补骨脂二氢黄酮、corylifol A、新补骨脂异黄酮)、单萜酚(补骨脂酚)等化合物，并开展了其雌激素样活性的研究。研究结果表明：补骨脂素和异补骨脂素通过激活ERα发挥雌激素样作用；异补骨脂查耳酮、补骨脂二氢黄酮、corylifol A、新补骨脂异黄酮、补骨脂酚等化合物通过激活ERα和ERβ发挥雌激素样作用(Xin,D.,H.Wang,J.Yang,Y.F.Su,G.W.Fan,Y.F.Wang,Y.Zhu andX.M.Gao(2010)."Phytoestrogens from Psoralea corylifolia reveal estrogenreceptor-subtype selectivity."Phytomedicine 17(2):126-131)。

然而，随着补骨脂的临床应用范围不断扩大，补骨脂的肝脏毒性逐渐引起科研工作者的重视。

邓平香等报道了去卵巢术造模的SD大鼠灌服补骨脂高剂量水提液(折合补骨脂生药1.6g)，给药12周后大鼠组织学观察可见部分区域的肝细胞出现混浊肿胀和脂肪变性,个别区域可见部分肝细胞坏死(邓平香,徐敏.补骨脂单味应用和复方应用对大鼠肝脏毒性的比较.广西中医药,2005,28(2):49-50.)。Soon Woo Nam等于2007年在Clinicaltoxicology发表了“补骨脂导致急性黄疸型肝炎一例”，报道了一例绝经后妇女在连续7周口服(用红茶冲服)10倍正常剂量的补骨脂后引起急性胆汁郁积型肝炎。肝组织检查发现肝脏中三个区域出现坏死、细胞变异、胆汁郁积及炎症细胞浸润(Soon Woo Nam,Jong Tae Baek,DongSoo Lee,Sang Bum Kang,Byung Min Ahn,Kyu Won Chung.A case of acute cholestatichepatitis associated with the seeds of Psoralea corylifolia(Boh-Gol-Zhee).Clinical Toxicology,2005,43:589–591)。2009年Wing I Cheung等在Clinicaltoxicology又发表了“应用补骨脂及含有补骨脂的中成药导致肝损伤”，文中报道了在服用补骨脂和含有补骨脂的中成药后出现了三例急性肝炎病例。补骨脂的相关成分可能是引起肝脏毒性的化学成分(Wing I Cheung,Man Li Tse,Teresa Ngan,Jieru Lin,Ws Ken Lee,Wing Tat Poon,Tony Wl Mak,Vincent King Sun Leung,Tai Nin Chau.Liver injuryassociated with the use of Fructus Psoraleae(Bol-gol-zhee or Bu-gu-zhi)andits related proprietary medicine.Clinical Toxicology,2009,47:683–685)。

因此，目前尚需要新的补骨脂提取物和补骨脂提取工艺，其对肝脏的毒性降至可接受范围甚至无肝脏毒性，同时确保活性成分和药效作用。

丹参是鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhizaBge.)的干燥根及根茎，味苦，性微寒。归心、肝经。具有活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神功效。主治月经不调，经闭痛经，症瘕积聚，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠；肝脾肿大，心绞痛。丹参化学成分可以分为脂溶性成分和水溶性成份两大类。脂溶性成分包括丹参酮I、IIA、IIB，隐丹参酮等。水溶性成分包括丹参素，丹参酚酸A、B、C，原儿茶醛，咖啡酸，阿魏酸，迷迭香酸，紫草酸等。

前期研究发现，丹参的脂溶性成分丹参酮IIA(Tan IIA)在转染ERα或ERβ的Hela细胞中，Tan IIA呈现与雌二醇相同的作用趋势，Tan IIA对于雌激素受体α和β两种亚型的转录活性呈现促进作用，而ER拮抗剂ICI 182,780能够显著抑制其诱导效应，提示其具有雌激素样活性，因此丹参脂溶性成分是重要的药效成分之一。

然而，前期研究结果表明，丹参直接水回流提取固形物达到50％左右，不利于制剂成型，丹参酮类成分为脂溶性成分，水回流提取转移率较低。

杜仲是杜仲科植物杜仲(Eucommiaulmoides Oliver)的干燥树皮，是名贵中药材，“主治腰膝痛，补中，益精气，坚筋骨，除阴下痒湿，小便余沥。久服，轻身耐老”。性温，味甘微辛，入肝、肾经。用于补肝肾，强筋骨，安胎。现代药理研究表明，杜仲具有降压、抗肿瘤、补肾和增强机体免疫等作用。杜仲有效成分主要是绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷、丁香素二葡萄糖苷、松脂醇单糖苷、丁香素单糖苷、桃叶珊瑚苷、京尼平、京尼平苷和京尼平苷酸等，该类成分均为极性较大成分。

杜仲中有效的环烯醚萜和木脂素类成分，水提取和一定浓度乙醇提取转移率均较高。

知母为百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根茎，味苦、甘，性寒，归肺、胃、肾经，甘寒质润，善清肺胃气分实热，而除烦止渴。知母中含皂苷、黄酮、双苯吡酮、木脂素等多种化学成分，皂苷类成分含量较高，其根茎含皂苷约6％，也是其主要的活性成分。较早发现的皂苷成分的苷元类型有菝葜皂苷元，马尔可皂苷元，新吉托皂苷元，薯蓣皂苷元、螺留皂苷和呋甾皂苷。知母中含量较高的有双苯吡酮类化合物芒果苷，皂苷类化合物知母皂苷B，知母皂苷B2和知母皂苷A3，均为极性较大成分。

一种理想的杜仲丹参知母提取物和提取工艺，应该考虑如下几点：①丹参酮类成分应予以保留，因其脂溶性强，提取工艺应该考虑丹参单独提取丹参脂溶性成分；②丹参水提取出膏率太高，为了降低固形物利于制剂成型应进一步处理；③杜仲水或低浓度乙醇提取环烯醚萜和木脂素类有效成分转移率均较高。

目前，尚需要一种新的包含补骨脂、杜仲、丹参、知母的有效成分的药物组合物，其能够有效地用于防治体内雌激素水平失调有关的疾病或改善其症状或者有效地调节体内雌激素水平对肝脏基本上无毒性。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，发现补骨脂药材中的补骨脂苷和异补骨脂苷是对肝脏产生毒性的重要物质。本发明人惊奇地发现，当补骨脂苷和异补骨脂苷的含量降低至一定程度时，得到的补骨脂提取物对肝脏的毒性降至可接受范围甚至无肝脏毒性，并且能够保留活性成分和药效作用。本发明人还得到了该补骨脂提取物的制备方法。此外，本发明人还得到了一种杜仲丹参知母提取物和提取工艺。本发明人惊奇地发现，包含本发明的补骨脂提取物和杜仲丹参知母提取物的药物组合物对肝脏基本上无毒性，能够有效地用于防治体内雌激素水平失调有关的疾病或改善其症状或者有效地调节体内雌激素水平。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种制备药物组合物的方法，包括制备补骨脂提取物和制备杜仲丹参知母提取物的步骤。

根据本发明任一项所述的方法，其中，所述制备补骨脂提取物的步骤包括下述步骤1)－5)或者1)－6)：

1)将补骨脂用1－20倍量的50％－95％的乙醇浸泡1－36小时；

2)使用50％－95％乙醇进行渗漉提取，流速为4－16mL/min/Kg；

3)收集补骨脂投料量5－20倍体积渗漉液；

4)将渗漉液进行浓缩；

5)静置分层，倾去上层液，取下层得补骨脂稠浸膏。

6)将步骤5)得到的补骨脂稠浸膏以适量乙醇稀释，搅拌下分次加至辅料粉末中，补骨脂生药量与辅料量的比例为(10:2.5)－(10:3)；搅匀，干燥，粉碎，过筛，得补骨脂浸膏粉。

根据本发明任一项所述的方法，其中，其特征在于如下的(1)－(10)中的任一项或者多项：

(1)步骤1)中，乙醇的用量为1－5倍量，优选为2倍量；

(2)步骤1)中，乙醇的浓度为50％－70％，优选为70％；

(3)步骤1)中，浸泡时间为12－24小时，优选为12小时；

(4)步骤2)中，使用50％－70％乙醇渗漉提取，优选使用70％乙醇；

(5)步骤2)中，控制流速为4－8mL/min/Kg，优选为8mL/min/Kg；

(6)步骤3)中，收集补骨脂投料量10－18倍体积渗漉液；优选地，，收集补骨脂投料量15倍体积渗漉液；

(7)步骤4)中，所述浓缩为减压浓缩；

(8)步骤4)中，将渗漉液浓缩至药材重量(g)：浓缩液体积(ml)≤1:0.5或≤1:1或≤1:1.5；

(9)步骤5)中，进行冷藏静置分层；

(10)步骤6)中，将倍他环糊精与等量的微晶纤维素混匀，得到辅料粉末；将补骨脂稠浸膏以适量乙醇稀释，搅拌下分次加至上述辅料粉末中，补骨脂生药量与辅料量比例为(10：2.5)－(10：3)，搅匀，干燥，粉碎，过80目筛，得补骨脂浸膏粉。

根据本发明任一项所述的方法，其中，所述制备杜仲丹参知母提取物的步骤包括将丹参进行渗漉法提取，将丹参药渣合并杜仲和知母进行提取(例如水煎煮)的步骤；

具体地，包括下述步骤：

1)将丹参用乙醇浸泡，进行渗漉法提取，浓缩干燥得到丹参脂溶性部分提取物和丹参药渣；

2)将步骤1)中得到的丹参药渣合并杜仲和知母进行水煎煮提取1次或多次，得到提取液；

3)将步骤2)中得到的提取液进行浓缩、乙醇沉淀，取上清液；

4)将步骤3)中得到的上清液过滤、浓缩、干燥，得到杜仲丹参知母干膏；

5)将步骤1)中的丹参脂溶性部分提取物与步骤4)中的杜仲丹参知母干膏合并。

根据本发明任一项所述的方法，其特征在于如下的(1)－(15)中的任一项或者多项：

(1)步骤1)中，浸泡乙醇的用量为1－5倍量，优选为2倍量；

(2)步骤1)中，浸泡时间为1－36小时，优选为24小时；

(3)步骤1)中，浸泡所用乙醇为大于70％的乙醇，优选95％乙醇；

(4)步骤1)中，渗漉所用乙醇为大于70％的乙醇，优选95％乙醇；

(5)步骤1)中，收集丹参投料量2－6倍量体积渗漉液，优选4－6倍量；

(6)步骤1)中，所述渗漉控制流速为10－23mL/min/Kg，优选为16mL/min/Kg；

(7)步骤1)中，浓缩至相对密度1.1－1.2(50℃)，优选为1.15；所述干燥为真空干燥；

(8)步骤2)中，煎煮所用水量为6－10倍量，优选8倍量；

(9)步骤2)中，煎煮时间为1－5小时，优选3小时；

(10)步骤3)中，所述浓缩为减压浓缩，并且浓缩至相对密度1.1－1.2(50℃)，优选为1.15；

(11)步骤3)中，使用1－5倍量的90％以上的乙醇进行沉淀；优选使用3倍量95％乙醇沉淀；

(12)步骤3)中，静置过夜后取上清液；

(13)步骤4)中，将上清液滤液浓缩得到稠膏，稠膏重量：药材重量为1：1.2至1：1.3，优选为1：1.25；

(14)步骤4)中，所述干燥尚未喷雾干燥；

(15)步骤5)中，将步骤1)中的丹参脂溶性部分提取物与步骤4)中的杜仲丹参知母干膏合并之后进行粉碎，并混合均匀得杜仲丹参知母浸膏粉。

根据权利要求1所述的方法，其中，所述补骨脂、杜仲、丹参和知母的重量比为1：(0.2－10)：(0.2－10)：(0.2－5)，更优选为1：(0.5－4)：(0.5－4)：(0.5－4)，进一步优选为1:2:2:1、1:4:2:0.5或者1：0.5：2：2。

本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其由上面任一项所述的制备方法制得；可选地，其还包含药学上可接受的辅料。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其含有补骨脂提取物和杜仲丹参知母提取物；可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物的药效成分为补骨脂提取物和杜仲丹参知母提取物。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其中，按照生药(补骨脂药材)的重量计算，所述补骨脂提取物中的补骨脂苷和异补骨脂苷的含量为≤20mg/g、≤18mg/g、≤15mg/g、≤10mg/g、≤6.9mg/g、≤6.8mg/g、≤5mg/g、≤2mg/g、≤1mg/g、≤0.5mg/g、≤0.1mg/g、≤0.01mg/g或者≤0.001mg/g。

在本发明的一个实施方案中，所述补骨脂提取物中的补骨脂苷和异补骨脂苷的含量为零或者检测不到。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其中，所述补骨脂提取物中含有补骨脂素和异补骨脂素；按照补骨脂药材的重量计算，优选地，所述补骨脂素和异补骨脂素的含量为≥0.7mg/g、≥1.1mg/g、≥1.2mg/g、≥2mg/g、≥3mg/g、≥4mg/g、≥4.4mg/g、≥5mg/g、≥5.5mg/g或者≥6mg/g。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其中，所述补骨脂提取物中还含有补骨脂黄酮类成分，并且所述补骨脂黄酮类成分选自补骨脂异黄酮、新补骨脂异黄酮、补骨脂查耳酮、异补骨脂查耳酮(补骨脂乙素)、补骨脂二氢黄酮(补骨脂甲素)、补骨脂二氢黄酮甲醚和corylifol A中的一种、多种或全部；具体地，其含有异补骨脂查耳酮(补骨脂乙素)和补骨脂二氢黄酮(补骨脂甲素)；按照补骨脂药材的重量计算，优选地，所述补骨脂二氢黄酮(补骨脂甲素)的含量为≥4mg/g、≥2.5mg/g或者≥2.9mg/g，所述异补骨脂查耳酮(补骨脂乙素)的含量为≥4mg/g、≥4.5mg/g、≥5mg/g、≥5.3mg/g或者≥5.5mg/g。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其中，所述补骨脂提取物中还含有补骨脂酚；按照补骨脂药材的重量计算，优选地，所述补骨脂酚的含量为≥0.5mg/g、≥5mg/g、≥10mg/g、≥15mg/g、≥20mg/g、≥30mg/g、≥40mg/g、≥50mg/g或者≥55mg/g。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其中，所述补骨脂提取物，通过渗漉法或者冷浸法制备，并且将出膏率控制在30％以下(例如21％以下、20％以下、19％以下、18％以下或者15％以下)。

不拘于理论的限制，补骨脂提取物中含有大量的补骨脂酚(油状物质)，提取物为沥青状稠浸膏，在干燥时无法干燥成干膏，需要加入环糊精进行粉末化处理，因此减少稠浸膏出膏率，可减少粉末化时环糊精用量，从而减少最终的固体量。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其中，所述渗漉法包括下述步骤：

1)将补骨脂用1－20倍量的50％－95％的乙醇浸泡1－36小时；

2)使用50％－95％乙醇进行渗漉提取，流速为4－16mL/min/Kg；

3)收集补骨脂投料量5－20倍体积渗漉液；

4)将渗漉液进行浓缩；

5)静置分层，倾去上层液，取下层得补骨脂稠浸膏。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其特征在于如下的(1)－(9)中的任一项或者多项：

(1)步骤1)中，乙醇的用量为1－5倍量，优选为2倍量；

(2)步骤1)中，乙醇的浓度为50％－70％，优选为70％；

(3)步骤1)中，浸泡时间为12－24小时，优选为12小时；

(4)步骤2)中，使用50％－70％乙醇渗漉提取，优选使用70％乙醇；

(5)步骤2)中，控制流速为4－8mL/min/Kg，优选为8mL/min/Kg；

(6)步骤3)中，收集补骨脂投料量10－18倍体积渗漉液；优选地，，收集补骨脂投料量15倍体积渗漉液；

(7)步骤4)中，所述浓缩为减压浓缩；

(8)步骤4)中，将渗漉液浓缩至药材重量(g)：浓缩液体积(ml)≤1:0.5或≤1:1或≤1:1.5；

(9)步骤5)中，进行冷藏静置分层。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其中，所述杜仲丹参知母提取物的制备方法包括将丹参进行渗漉法提取，将丹参药渣合并杜仲和知母进行提取(例如水煎煮)的步骤；

具体地，包括下述步骤：

1)将丹参用乙醇浸泡，进行渗漉法提取，浓缩干燥得到丹参脂溶性部分提取物和丹参药渣；

2)将步骤1)中得到的丹参药渣合并杜仲和知母进行水煎煮提取1次或多次，得到提取液；

3)将步骤2)中得到的提取液进行浓缩、乙醇沉淀，取上清液；

4)将步骤3)中得到的上清液过滤、浓缩、干燥，得到杜仲丹参知母干膏；

5)将步骤1)中的丹参脂溶性部分提取物与步骤4)中的杜仲丹参知母干膏合并。

本发明人通过研究发现，杜仲丹参知母三味药合并水提取，各种化学成分(药效成分，例如芒果苷、松脂醇二糖苷、丹参酚酸B等)提取量最高，得到的干膏量也是很高。如此高的干膏量，只能制成颗粒剂，很难制成片剂或胶囊。本发明人还发现，这三味药合并提取产物加入补骨脂稠浸膏后进行品尝，口感很差，并且补骨脂稠浸膏不溶于水很难制成均匀颗粒，水分散性也很差，而通常情况下本品用药时间较长，患者会很难接受。

本发明人创造性地将丹参进行渗漉法提取，将丹参药渣合并杜仲和知母进行提取(例如水煎煮)，得到的提取物易于制成剂型特别是片剂，并且患者易于接收。

根据本发明任一项所述的杜仲丹参知母提取物，其特征在于如下的(1)－(15)中的任一项或者多项：

(1)步骤1)中，浸泡乙醇的用量为1－5倍量，优选为2倍量；

(2)步骤1)中，浸泡时间为1－36小时，优选为24小时；

(3)步骤1)中，浸泡所用乙醇为大于70％的乙醇，优选95％乙醇；

(4)步骤1)中，渗漉所用乙醇为大于70％的乙醇，优选95％乙醇；

(5)步骤1)中，收集丹参投料量2－6倍量体积渗漉液，优选4－6倍量；

(6)步骤1)中，所述渗漉控制流速为10－23mL/min/Kg，优选为16mL/min/Kg；

(7)步骤1)中，浓缩至相对密度1.1－1.2(50℃)，优选为1.15；所述干燥为真空干燥；

(8)步骤2)中，煎煮所用水量为6－10倍量，优选8倍量；

(9)步骤2)中，煎煮时间为1－5小时，优选3小时；

(10)步骤3)中，所述浓缩为减压浓缩，并且浓缩至相对密度1.1－1.2(50℃)，优选为1.15；

(11)步骤3)中，使用1－5倍量的90％以上的乙醇进行沉淀；优选使用3倍量95％乙醇沉淀；

(12)步骤3)中，静置过夜后取上清液；

(13)步骤4)中，将上清液滤液浓缩得到稠膏，稠膏重量：药材重量为1：1.2至1：1.3，优选为1：1.25；

(14)步骤4)中，所述干燥尚未喷雾干燥；

(15)步骤5)中，将步骤1)中的丹参脂溶性部分提取物与步骤4)中的杜仲丹参知母干膏合并之后进行粉碎，并混合均匀得杜仲丹参知母浸膏粉。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述杜仲丹参知母提取物采用如下方法制备：

(1)丹参饮片用2倍量95％乙醇浸泡24小时，以约16ml/kg.min的流速，用95％乙醇渗漉提取，收集丹参投料量6倍量体积渗漉液。渗漉液减压回收乙醇，浓缩至相对密度约1.15左右(50℃)后真空干燥得丹参脂溶性部分提取物；

(2)杜仲饮片、渗漉后的丹参药渣和知母饮片合并，用水煎煮两次，每次8倍量水，每次煎煮3小时，合并两次水提取液，减压浓缩至相对密度约1.15(50℃)，浓缩液加入3倍量95％乙醇沉淀，静置过夜，取上清液，过滤，滤液合并上清液，回收乙醇并浓缩至1：1.25(稠膏重量：药材重量，m：m，糖度约25度)，喷雾干燥得杜仲丹参知母干膏，加入丹参脂溶性部分提取物，粉碎，混合均匀得杜仲丹参知母浸膏粉。

根据本发明任一项所述的药物组合物，其中，所述补骨脂、杜仲、丹参和知母的重量比为1：(0.2－10)：(0.2－10)：(0.2－5)，更优选为1：(0.5－4)：(0.5－4)：(0.5－4)，进一步优选为1:2:2:1、1:4:2:0.5或者1：0.5：2：2。

本发明的药物组合物的具体剂型可根据本领域已知的方法制备。可将本发明的补骨脂提取物和/或杜仲丹参知母提取物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。

不拘于理论的限制，补骨脂稠浸膏为棕黑色沥青状流浸膏，有气味，粘腻，难于处理；杜仲丹参知母浸膏粉为淡棕黄色粉末，有气味，易吸湿、结块。因此，将它们制成适当的制剂形式的难度较大。

不拘于理论的限制，补骨脂稠浸膏油状物含量较高，优选用淀粉、预胶化淀粉、糊精、微晶纤维素、和/或倍他环糊精(β-CD)等具有油脂吸附作用的辅料。

本发明人在研究中发现，从分散效果和粉末性状看，选用微晶纤维素和/或倍他环糊精处理浸膏效果较好。

在本发明的一个实施方案中，补骨脂稠浸膏(以生药量计)与辅料质量比宜确定为(10：2)－(10：6)。

本发明人在研究中发现，补骨脂稠浸膏与辅料质量比低于10：2时，补骨脂稠浸膏无法粉化，所得为棕黑色膏体；当补骨脂稠浸膏与辅料质量比达到10：2时，补骨脂稠浸膏开始粉化，但油性较大，粉体流动性差，无法测其休止角；当补骨脂稠浸膏与辅料质量比达到10：3时，所得粉末性状较佳，可以达到补骨脂稠浸膏粉化的要求。优选地，补骨脂稠浸膏(以生药量计)与辅料质量比宜确定为(10：2)－(10：3)，更优选为(10：2.5)－(10：3)。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体提取物，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

可改变本发明药物组合物中各提取物的实际剂量水平，以便能有效针对具体患者、药物组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体提取物、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，给药的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明还涉及制备上面任一项所述的药物组合物的方法、制备补骨脂提取物的方法以及制备杜仲丹参知母提取物的方法。

本发明的另一方面涉及本发明中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗或预防治疗和/或预防和/或辅助治疗受试者中与体内雌激素水平失调有关的疾病或改善其症状的药物或者调节体内雌激素水平的药物中的用途；具体地，所述与体内雌激素水平失调有关的疾病或症状选自更年期综合征以及绝经后妇女的冠状动脉性心脏病、动脉粥样硬化、血管内皮损伤、高血压和骨质疏松症。

本发明的再一方面涉及一种治疗和/预防和/或辅助治疗受试者中与体内雌激素水平失调有关的疾病或改善其症状的方法或者一种调节体内雌激素水平的方法，包括给予有效量的本发明中任一项所述的补骨脂提取物和/或本发明的杜仲丹参知母提取物或者本发明的药物组合物的步骤。具体地，其中所述与体内雌激素水平失调有关的疾病或症状选自更年期综合征以及绝经后妇女的冠状动脉性心脏病、动脉粥样硬化、血管内皮损伤、高血压和骨质疏松症。

术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。

术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。

术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。

但应认识到，本发明药物组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体药物组合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体药物组合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体药物组合物使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，给药的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

根据本发明的药物组合物或提取物可以有效地预防和/或治疗本发明所述的各种疾病或病症。

本发明中，

如果没有特别说明，所述补骨脂、丹参、杜仲、知母分别为补骨脂药材、丹参药材、杜仲药材、知母药材，优选地，分别为补骨脂饮片、丹参饮片、杜仲饮片、知母饮片。

优选地，所述补骨脂药材或者补骨脂饮片为经过雷公法炮制。本发明人通过研究发现，雷公法炮制补骨脂后补骨脂苷、异补骨脂苷等水溶性成分明显降低(炮制品中补骨脂苷、异补骨脂苷的含量较生品下降约30％)。

如果没有特别说明，所述“补骨脂苷和异补骨脂苷的含量”是指补骨脂苷的含量和异补骨脂苷的含量之和。

如果没有特别说明，所述“补骨脂素和异补骨脂素的含量”是指补骨脂素的含量和异补骨脂素的含量之和。

如果没有特别说明，本文中提到的“两素”是指“补骨脂素和异补骨脂素”。

如果没有特别说明，具体化合物的含量或者某一指标成分的含量均按照生药的重量计算。

发明的有益效果

本发明的包含补骨脂提取物和杜仲丹参知母提取物的药物组合物对肝脏基本上无毒性，能够有效地用于防治体内雌激素水平失调有关的疾病或改善其症状，或者有效地调节体内雌激素水平。

附图说明

图1：丹知青娥方对4-VCD诱导围绝经期小鼠血清E2、T水平的影响。图1A.丹知青娥方对小鼠E2血清中水平的影响；图1B.丹知青娥方对小鼠血清中T水平的影响；图1C.丹知青娥方对小鼠血清中T/E2水平的影响。

图1中的各组从左到右依此为正常对照组、模型组、丹知青娥方高剂量组(14g/kg)、丹知青娥方中剂量组(7g/kg)、丹知青娥方低剂量组(3.5g/kg)、雌二醇(0.13mg/kg)、希明婷(78mg/kg)。

图2：丹知青娥方对4-VCD诱导围绝经期小鼠血清LH、FSH水平的影响。图2A.丹知青娥方对小鼠LH血清中水平的影响；图2B.丹知青娥方对小鼠血清中FSH水平的影响；图2C.丹知青娥方对小鼠血清中LH/FSH水平的影响。

图2中的各组从左到右依此为正常对照组、模型组、丹知青娥方高剂量组(14g/kg)、丹知青娥方中剂量组(7g/kg)、丹知青娥方低剂量组(3.5g/kg)、雌二醇(0.13mg/kg)、希明婷(78mg/kg)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下面的实施例中，如果没有特别说明，HPLC条件如下：

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×150mm，5μm)；

流动相：乙腈-0.1％甲酸水梯度洗脱；

流速：1mL/min；

柱温：50℃；

检测波长：246nm。

流动相梯度时间如下面的表1。

表1：流动相梯度时间表

实施例1：不同提取方法对补骨脂提取物各指标成分含量的影响

一、样品制备：

1.热回流提取法：补骨脂药材100g，70％乙醇加热回流2次(10倍量、8倍量)，每次1.5h，合并提取液，减压浓缩得稠浸膏。

2.冷浸法：补骨脂药材500g，70％乙醇冷浸提取3次(5倍量、4倍量、4倍量)，每次36h，冷浸期间不断搅拌，合并提取液，1:1减压浓缩至约500ml，静置分层后，倾去上层液(除去水溶性成分，经减压回收可得干膏粉)，得下层稠浸膏。

3.渗漉法：补骨脂药材500g，70％乙醇渗漉(12倍量)，合并渗漉液，减压浓缩至约500ml，静置分层后，倾去上层液(经减压回收可得干膏粉)，得下层稠浸膏。

二、检测方法

以补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂甲素、补骨脂乙素、补骨脂酚为检测指标，采用HPLC法测定各提取路线工艺中指标成分的含量并计算其转移率。

转移率＝提取物中指标成分的量/药材中指标成分的量*100％。

三、检测结果

上述三条提取工艺路线样品的测定结果见表2－5。

表2：各提取工艺路线出膏率结果

方法	投料量(g)	稠浸膏(g)	出膏率(％)
				热回流法	100	30.7	30.7
冷浸法	500	101.9	20.4
				渗漉法	500	92.2	18.4

表3：各提取工艺路线得到的提取物样品中补骨脂苷和异补骨脂苷的含量(mg/g药材)

表4：冷浸法和渗漉法各样品中指标成分的含量(mg/g原药材)

表5：冷浸法和渗漉法各指标成分的转移率％

结果表明：热回流提取法，出膏率过高不利于后期的制剂研究，提取物中含有较多补骨脂苷、异补骨脂苷为代表的水溶性成分(引起肝脏毒性的化学成分)，而且热回流后期的能耗较大；冷浸法和渗漉法提取物中基本不含有补骨脂苷、异补骨脂苷为代表的水溶性成分，能耗较少。

不拘于理论的限制，综合考虑后期制剂成型、临床用药风险、能耗等问题，热回流法不适合本研究中补骨脂的提取，冷浸法和渗漉法从以下几方面分析：

(1)冷浸法和渗漉法操作简单，能源消耗小，适应大规模生产的要求；

(2)冷浸法和渗漉法溶剂用量相当，各指标成分都有较高的转移率；

(3)冷浸法和渗漉法均能除去水溶性成分；

(4)渗漉法能够显著节约药材的提取时间，提高提取效率。

本发明优选渗漉法对补骨脂进行提取。

实施例2：渗漉法提取补骨脂的条件和参数比较

1.不同提取溶剂对补骨脂中两素提取率的影响

(1)实验目的

考察不同提取溶剂(50％、70％、95％乙醇)对两素(补骨脂素和异补骨脂素，下同)提取率的影响。

(2)实验方法

补骨脂的装填量(500g)达到渗漉筒(径高比1:3，10cm x 30cm)的2/3处，浸泡时间12h，流速8mL/min/Kg，以渗漉液：药材(v：m)1:1收集流分，每个流分500ml，共收集15个流分，合并渗漉液，50℃下减压浓缩至750ml，静置分层，得下层稠浸膏。

(3)实验结果

如下面的表6所示。

表6：不同提取溶剂对补骨脂中两素提取率的影响

注：95％乙醇提取液浓缩(1：1.5)后，为黑褐色乳浊液，不能分层得到稠浸膏。

表6的结果表明，70％乙醇作提取溶剂时，出膏率适中，稠浸膏中不含有补骨脂苷、异补骨脂苷为代表的水溶性成分，两素提取率最高；其它提取溶剂两素的提取率偏低。因此优选70％乙醇作为提取溶剂。

2.不同浸泡时间对补骨脂中两素提取率的影响

(1)实验目的

考察不同浸泡时间(12h、24h)对两素提取率的影响。

(2)实验方法

补骨脂的装填量(500g)达到渗漉筒(径高比1:3，10cm x30cm)的2/3处，分别浸泡12和24h，浸泡后渗滤流速8mL/min/Kg，以渗漉液：药材(v：m)1：1收集流分，每个流分500ml，收集15个流分，合并渗漉液，50℃下减压浓缩至750ml，静置分层，得下层稠浸膏。

(3)实验结果

如下面的表7所示。

表7：不同浸泡时间对补骨脂中两素提取率的影响

表7的结果表明，各稠浸膏中均不含补骨脂苷和异补骨脂苷等水溶性成分；12h和24h作为浸泡时间时，出膏率和指标成分的提取率基本一致。考虑到生产实际，优选浸泡时间为12h。

3.不同尺寸渗漉筒对补骨脂中两素提取率的影响

(1)实验目的

考察补骨脂在不同尺寸渗漉筒上的渗漉效果。

(2)实验方法

共考察了5cm(径高比1:3，装填补骨脂100g)和10cm(径高比1:3，装填补骨脂500g)，补骨脂的装填量达到渗漉筒的2/3处，浸泡时间为12h，流速为8mL/min/Kg，以渗漉液：药材(v：m)1：1收集流分，收集流分分别为100和500ml，每个样品分别收集17个流分。

(3)实验结果

如下面的表8所示。

表8：不同柱径对两素提取率的影响(径高比1:3)

表8的结果表明，不同尺寸渗漉筒对补骨脂中两素提取率没有明显影响。

4.不同流速和溶剂用量对补骨脂中两素提取率的影响

(1)实验目的

考察不同流速对补骨脂中两素提取率的影响。

(2)实验方法

采用10cm渗漉筒(装填补骨脂500g)，浸泡时间12h，溶剂为70％乙醇，收集17个流分，每个流分为500ml。共考察了三种流速(4mL/min/Kg、8mL/min/Kg、16mL/min/Kg)。

(3)实验结果

如下面的表9所示。

表9的结果表明，随着流速的增加，两素提取率随之降低，综合考虑两素的提取率和大生产过程中的效率，确定渗漉的流速为8mL/min/Kg，收集15个流分。

5.浓缩工艺研究

(1)实验方法

取同一批次70％乙醇渗漉液在50℃下减压浓缩，回收乙醇，分别浓缩至药材重量：浓缩液体积(m：v)1:0.5、1:1、1:1.5，静置分层，倾去上层液，得到下层稠浸膏，每个浓缩比平行做3份。分别测定不同浓缩比的上层液、稠浸膏中两素的转移率(％)。

(2)实验结果

测定结果如下面的表10所示。

表10：浓缩比1:1.5时补骨脂稠浸膏中两素转移率(％)

表10的结果表明，在浓缩比为1:0.5和1:1时，稠浸膏中两素转移率较低且不同样品间的结果差异较大；而浓缩比为1:1.5时，稠浸膏中两素总转移率较高且不同样品间的结果基本一致。因此，本工艺浓缩比确定为1:1.5，即50℃下减压浓缩至药材重量：浓缩液体积(m:v)1:1.5。

实施例3：杜仲丹参知母提取物样品与配方颗粒的比较

1.杜仲丹参知母提取物的制备：

丹参饮片用2倍量95％乙醇浸泡24小时，以约16ml/kg.min的流速，用95％乙醇渗漉提取，收集丹参投料量6倍量体积渗漉液。渗漉液减压回收乙醇，浓缩至相对密度约1.15左右(50℃)后真空干燥得丹参脂溶性部分提取物(丹参脂溶性干膏)，备用。处方量杜仲饮片、渗漉后的丹参药渣和知母饮片合并，用水煎煮两次，每次8倍量水，每次煎煮3小时，合并两次水提取液，减压浓缩至相对密度约1.15(50℃)，浓缩液加入3倍量95％乙醇沉淀，静置过夜，取上清液，过滤，滤液合并上清液，回收乙醇并浓缩至1：1.15，干燥得杜仲丹参知母干膏，备用。

样品的配制：按照上述工艺路线制备杜仲丹参知母干膏，丹参脂溶性干膏。精密称取丹参脂溶性干膏0.306mg，甲醇溶解并定容10ml备用；精密称取杜仲丹参知母干膏5.25mg，70％甲醇充分溶解后定容至10ml，备用。

2.配方颗粒

杜仲、丹参和知母均有制成的配方颗粒上市销售，本研究选用三九制药有限公司生产的三种配方颗粒通过多成分定量的方式，比较杜仲丹参知母选定工艺制备的样品与杜仲、丹参、知母配方颗粒的差异。

精密称取杜仲配方颗粒1.0mg，丹参配方颗粒1.5mg，知母配方颗粒0.5mg，分别70％甲醇充分溶解并定容至10ml，备用。

3.测定方法

使用LC-MS分析方法分别进样对照品和样品10μl，计算样品中各成分含量。具体步骤如下：

仪器：使用UHPLC-DAD-MS(Q-TOF)超高液相高分辨质谱联用仪定性定量。

MS条件：质谱系统使用Agilent 6520 Q-TOF系统(Agilent Corp.,Santa Clara,CA,USA).快速分离液相色谱使用Agilent 1290UHPLC系统(Agilent,Waldbronn,Germany)二元泵，二极管阵列监测器，自动进样器，和柱温箱。色谱柱为waters Acquity UPLC@BEHC18柱(1.7μm,100×2.1mm USA).

UPLC条件：流动相为CH₃CN和H₂O(0.1％甲酸)。梯度洗脱，流速0.25ml/min，柱温35℃。具体如下面的表11：

表11：UPLC条件

时间min	CH3CN％	流速ml/min
			0	8	0.25
5	10	0.25
			25	20	0.25
39	26	0.25
			53	26	0.25
70	35	0.25
			80	50	0.25
90	50	0.25
			100	60	0.25
110	90	0.25
			120	90	0.25
121	8	0.25
			135	8	0.25

对照品溶液配制：

杜仲：京尼平、绿原酸、京尼平苷酸、京尼平苷、松脂醇单葡萄糖苷、丁香脂素单葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香脂素二葡萄糖苷，千叶素A、汉黄芩素、白桦酯酸、由天津大学药学院提供。

丹参：原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹参酚酸A、丹参酚酸B；丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA、二氢丹参酮，购自中国生物制品检定所。

知母：芒果苷、知母皂苷A3、知母皂苷B2，由北京军事医学科学院提供。

精密称定，甲醇溶解至刻度，配制成标准品溶液。按UPLC-MS方法进样，分别提取每个化合物的准确分子离子峰，ESI负离子模式，提取离子积分得对照品峰面积。

4.实验结果

结果如表12所示。

表12：杜仲丹参知母提取物样品与配方颗粒的比较(杜仲10g；丹参10g；知母5g)

由表12结果可以看出，相同生药量情况下(杜仲10g，丹参10g，知母5g)所有检测的成分含量，本发明工艺条件下样品均高于配方颗粒组，其中杜仲中松脂醇二葡萄糖苷为2.3：1，丹参中丹参酚酸B为1.4：1，丹参酮IIA为74.6：1，知母中芒果苷为5.3：1，最高隐丹参酮达到202.5：1。中药由药效物质基础发挥药效作用，因此，这不仅证明了本发明方法所制备的杜仲丹参知母干膏相对于杜仲丹参和知母配方颗粒具有优势，也证明了本发明的杜仲丹参知母提取物及其制备方法的合理性。

实施例4：提取物的制备

处方

补骨脂100kg、杜仲200kg、丹参200kg、知母100kg。

(1)处方量补骨脂饮片加入2倍量70％乙醇浸泡12小时后，用70％乙醇渗漉提取，控制流速为8mL/min/Kg，收集补骨脂投料量15倍体积渗漉液。渗漉液减压回收乙醇，浓缩至1:1.5(药材重量：浓缩液体积，m：v)冷藏静置分层，倾去上层液(经减压回收可得干膏粉)，取下层得补骨脂稠浸膏。

(2)丹参饮片用2倍量95％乙醇浸泡24小时，以约16ml/kg.min的流速，用95％乙醇渗漉提取，收集丹参投料量6倍量体积渗漉液。渗漉液减压回收乙醇，浓缩至相对密度约1.15左右(50℃)后真空干燥得丹参脂溶性部分提取物，备用。

(3)处方量杜仲饮片、渗漉后的丹参药渣和知母饮片合并，用水煎煮两次，每次8倍量水，每次煎煮3小时，合并两次水提取液，减压浓缩至相对密度约1.15(50℃)，浓缩液加入3倍量95％乙醇沉淀，静置过夜，取上清液，过滤，滤液合并上清液，回收乙醇并浓缩至1：1.25(稠膏重量：药材重量，m：m，糖度约25度)，喷雾干燥得杜仲丹参知母干膏，加入丹参脂溶性部分提取物，粉碎，混合均匀得杜仲丹参知母浸膏粉，备用。

取处方量的倍他环糊精及与之等量的微晶纤维素，混匀。取补骨脂稠浸膏，以适量乙醇(每1g稠浸膏约需85％乙醇0.5ml)稀释后，分次加至上述辅料中，搅拌至均匀，干燥，粉碎，过80目筛，得补骨脂浸膏粉，备用。

所得补骨脂浸膏粉和杜仲丹参知母浸膏粉混合均匀，得混合提取物，用于下面的实施例和试验例；下文中，该混合物提取物又称为丹知青娥混合提取物或丹知青娥方。

实施例5：制剂的制备(以片剂为例)

1.处方

补骨脂0.333kg、杜仲0.667kg、丹参0.667kg、知母0.333kg。

制成1000片。

2.提取物生产工艺

按照实施例4中的方法制得补骨脂稠浸膏、杜仲丹参知母浸膏粉。

3.片剂的制备

取处方量的倍他环糊精及与之等量的微晶纤维素，混匀。取补骨脂稠浸膏，以适量乙醇(每1g稠浸膏约需85％乙醇0.5ml)稀释后，分次加至上述辅料中，搅拌至均匀，干燥，粉碎，过80目筛，得补骨脂浸膏粉，备用。

按处方配比，称取杜仲丹参知母浸膏粉、补骨脂浸膏粉、微晶纤维素，混匀，以80％乙醇溶液制软材，16目筛制颗粒，于40℃下干燥，14目筛整粒，加入L-HPC、硬脂酸镁和PEG6000，混匀，压片机压片。

试验例1：补骨脂提取物的毒性试验

(1)实验样品

原药。

水层干膏粉：按照实施例4中渗漉方法得到的渗漉液，减压浓缩静置分层得到的上层液，分取上层液浓缩干燥后所得粉末。

药渣：按照实施例4中的渗漉方法得到。

浸膏粉：取倍他环糊精；将补骨脂稠浸膏(按照实施例4中的方法得到)以适量乙醇稀释，搅拌下分次加至上述辅料粉末中(补骨脂生药量与辅料量比例为(10:2.5)－(10:3)，搅匀，干燥，粉碎，过80目筛，得补骨脂浸膏粉。

(2)实验方法

灌胃给药，给药剂量、给药时间、大鼠数目和分组如下面的表13－15所示。

(3)实验结果

如下面的表13－15所示。

表13：补骨脂提取物给药4周对大鼠脏器系数的影响

注：与对照组比较，¹⁾P<0.05，²⁾P<0.01，³⁾P<0.001。

表14：补骨脂提取物给药4周对大鼠MDA的影响

注：与对照组比较，¹⁾P<0.05，²⁾P<0.01，³⁾P<0.001。

表15：补骨脂提取物给药12周对大鼠脏器系数的影响

注：与对照组比较，¹⁾P<0.05，²⁾P<0.01，³⁾P<0.001。

结果表明：补骨脂原药连续灌胃4周和12周，大鼠血液生化和血液学指标无显著变化，但可导致大鼠肝脏肿大、肝系数显著升高、肝组织内MDA水平升高；而补骨脂经过工艺处理后最终得到粉末化样品(由稠浸膏制得的混合物)，连续灌胃4周和12周，动物肝肿大程度明显低于原药组、肝组织内MDA水平正常。可见，补骨脂原药经该工艺处理后毒性明显降低。

试验例2：比格犬灌胃给药9个月长期毒性试验

1.实验动物和筛选分组

品系为比格犬等级；普通级年龄约6－9月龄；引进时体重5.50－7.90kg，适应期结束选择7.25－9.50kg动物进入试验。数量：24只，雌性来源：上海新冈实验动物场；生产许可证：SCXK沪2007-0009动物合格证号：0073789。

动物筛选：动物适应期最后一天，在检验完成后，剔除异常动物；称量动物体重，剔除体重及体重增长偏离较大的动物，选用24只动物，进行分组。剩余动物移出观察室，单独饲养。

给药前分组：以适应期最后一天的体重进行分组，参考动物血液学及血液生化的值，采用体重随机区组的方法，将动物随机分成4组(生理对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组)，每组6只，记录分组过程和分组结果。

给药270天剖杀：各组均剖杀4只动物，以给药过程中最后一次体重称量时的体重进行分组，各剂量组剖杀每个组的最大和最小的2只动物，剩余2只动物留为恢复。

2.所用提取物、药物配制、给药剂量、给药方式

所用提取物为实施例4所制备的丹知青娥混合提取物。

药物配制：供试品用去离子水配制。准确称取供试品溶于去离子水中，搅拌混匀。低剂量组配制浓度为0.5g生药/ml；中剂量组配制浓度为1.25g生药/ml；高剂量组配制浓度为3.125g生药/ml。根据动物体重适量配制所需用药。药物配制后72小时内使用。

给药浓度及体积见下面的表16。

表16：分组给药剂量

给药剂量

大鼠为2.5、5.0、10.0g生药/kg，以大鼠主要药效学剂量(5.0g生药/kg)计，犬等效剂量为1.69g生药/kg(大鼠以250g、犬以12kg计)；临床拟用药量为6.0g生药/日/人，犬等效剂量为0.16g生药/kg(人以70kg、犬以12kg计)。

参考长毒预试结果，设计长毒试验剂量拟定为2.0、5.0、12.5g生药/kg(12.5g生药/kg剂量组给药已接近犬最大给药量)，分别相当于药效剂量的1.2、3.0、7.4倍，相当于临床拟用等效剂量的12.5、31.3、78.1倍。

生理对照组给予去离子水。

给药方式

根据动物体重用注射器抽取相应浓度的药液量。从比格犬犬齿间隙插入灌胃管，注入药液，再抽取少量空气将管中剩余药液排净。

每日给药时间应固定，一般在给药日的每日上午08:00－11：00给药。

3.检测项目和指标

(1)一般观察

内容：观察比格犬给药过程中及给药后的外观、精神、活动、饮食等，记录在一般观察表上。可以用简洁的符号描记，也可以用文字描述。

频率：每日观察一次药后的毒性反应。饮食观察每日二次，分别在食后。

(2)体重检查

检查项目：检查动物空腹体重(动物饥饿18小时左右)。一般在上午8－9点左右，动物进食前。

检查方法：应用OCS-W-100kg型电子吊秤，最小称量值0.05kg。

频率：适应1、20天，给药14、28、45、59、74、89、104、119、134、150、164、179、194、209、224、238、255、270天，恢复14、28天各进行一次。

(3)肛温检查

检查项目：检查动物肛温。一般在上午9点左右。

检查方法：应用MT1622电子体温计

频率：适应期10、18天，给药42、87、137、178、223、269天，恢复29天各进行一次。

(4)血液学检查

检查项目：红细胞计数(RBC)、红细胞容积(HCT)、血红蛋白(HB)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、网织红细胞计数(RET)、白细胞计数(WBC)及其分类(中性粒细胞N、淋巴细胞L、单核细胞M、嗜酸性粒细胞E)、血小板计数(PLT)、凝血酶原时间(PT)、部分活化凝血酶原时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)。

检查方法：血液分析仪检测、血凝分析仪检测。

检测试剂：如下面的表17所示。

表17：检测试剂和用途

频率：适应期11、20天，给药45、89、138、179、224、270天，恢复28天各进行一次。

(5)血液生化检查

检查项目：AST(天门冬氨酸氨基转换酶)、ALT(丙氨酸氨基转换酶)、γ-GT(γ-谷氨酰转移酶)、AKP(碱性磷酸酶)、BUN(血清尿素氮)、CREA(肌酐)、TCHO(总胆固醇)、GLU(血糖)、TP(总蛋白)、ALB(白蛋白)、TBIL(总胆红素)、TG(甘油三酯)、CK(肌酸磷酸激酶)、HDL(高密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)、血清K⁺(钾)、Na⁺(钠)、Cl^-(氯)离子。

检查方法：血清K+(钾)、Na+(钠)、Cl-(氯)离子采用EASYLUTE或AC9900电解质分析仪检测。其它指标采用日立7080型全自动生化分析仪进行测定，测定方法及参数见下面的表18。

表18：血液生化检查项目和试剂

血清钾、钠、氯离子使用EASYLUTE或AC9900电解质分析仪检测，应用选择电极的方法。

质控血清：北京中生北控生物科技股份有限公司生产

频率：适应期11、20天，给药45、89、138、179、224、270天，恢复28天各进行一次。

(6)尿液生化检查

检查项目：新鲜尿液检查胆红素、尿胆原、酮体、抗坏血酸、尿糖、尿蛋白、隐血、pH、亚硝酸盐、白细胞、尿比重等。

检查方法：尿液分析仪检测

检测试纸：机测尿试纸。

频率：适应18天，给药42、87、137、178、223、269天，恢复29天各进行一次。

(7)心电图检查

检查项目：心率、P波电压、R波电压、T波电压、P-R间期、QRS时限、Q－T间期、ST段电压等。

检查方法：心电工作站记录后，自动和手工测量相结合。

频率：适应期10、18天，给药42、87、137、178、223、269天，恢复29天各进行一次。

(8)眼科检查

检查项目：

眼睑：有无红肿、水肿或眼球粘连。

结膜：有无充血、出血、水肿、粘连等。

角膜：角膜的大小、弯曲度、有无混浊、异物、新生血管等。

巩膜：颜色是否正常、有无结节、局限性隆起等。

瞳孔：双侧瞳孔是否等大等圆，瞳孔的形态有无异常等。

玻璃体：有无混浊、积血等。

眼底：视神经乳头、中央动脉、视网膜有无异常等。

检查方法：眼底镜检查。

频率：适应期18天、给药270天、恢复期29天各进行一次。

(9)骨髓涂片检查

检查项目：有核红细胞的增生程度、巨核细胞系统增生情况、粒细胞系统、红细胞系统、单核细胞系统中各期细胞数量及百分率等。

检查方法：胸骨骨髓涂片、染色后显微镜下检查。

频率：给药结束后剖杀时和恢复结束后剖杀时各进行一次。

(10)大体剖检

检查项目：体表及灌胃脂肪检查、乳腺检查、颈部检查、胸腔及胸腔脏器检查、腹腔及腹腔脏器检查、盆腔及盆腔脏器检查、头部检查、脊髓、坐骨神经检查、给药部位等。

检查方法：给药期结束和恢复期结束后动物麻醉放血处死后进行，动物处死前饥饿24小时，动物处死后表观或剖开肉眼检查。

频率：给药结束后剖杀时和恢复结束后剖杀时各进行一次。

(11)脏器重量检查

检查项目：心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺、甲状腺、胸腺、附睾、睾丸、子宫、卵巢。

检查方法：给药结束和恢复期结束动物饥饿24小时后麻醉放血处死，称取各脏器重量，同时计算各脏器系数，脏器湿重/体重＝g/kg(体重)。

频率：给药结束后剖杀时和恢复结束后剖杀时各进行一次。

(12)组织学检查

检查项目：脑(大脑、小脑、脑干)、脊髓(颈、胸、腰段)、垂体、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、食管、唾液腺、胃、小肠和大肠、肝脏、胰腺、肾脏、肾上腺、脾脏、心脏、气管、肺脏、主动脉、雄性动物睾丸、雄性动物附睾、雌性动物子宫、雌性动物卵巢、雌性动物乳腺、雄性动物前列腺、膀胱、坐骨神经、骨髓、淋巴结(包括给药局部淋巴结、肠系膜淋巴结)。

检查方法：组织固定、包埋、切片、染色后显微镜下进行组织形态学检查。

频率：给药结束后剖杀时和恢复结束后剖杀时各进行一次。

(13)性激素检查

检查项目：雌二醇，孕激素，睾酮。

检查方法：采用放免试剂盒，根据试剂盒说明书方法检测。

频率：给药90、180、270天各一次。

4.统计方法

计量资料采用组间t检验或非参数检验，计数资料采用x²或等级指数检验。各组与生理对照组之间进行差异性比较。根据实际情况综合分析药物对动物各项指标的影响。

5.实验结果

(1)一般观察

比格犬连续灌胃给药9个月，一般观察中、高剂量组个别动物见口水增多，流涎等症状，高剂量动物出现频率及动物数均明显高于中剂量，具有明显剂量关系，分析是高浓度药物本身物理性质较为粘稠且给药体积较大，对比格犬胃部具有一定刺激，引起不适造成的影响；高剂量组个别动物偶发药后活动减少及呕吐等现象。

(2)对饮食和体重的影响

比格犬连续灌胃给药9个月，高剂量组部分动物在给药90天前饮食情况明显异常，致使动物体重在给药74天，89天与生理对照组比较明显降低，在给药90天之后，动物饮食异常逐渐消失，动物体重逐渐恢复；给药90天后高剂量组动物各次体重检查与生理对照组比较未见明显差异。

中、低剂量组动物饮食及体重未见明显药物引起的明显影响。

(3)对体温(肛温)的影响

比格犬连续灌胃给药9个月，2.0g生药/kg剂量组动物在给药42天与生理对照组比较出现明显差异，但在给药前该组动物体重与生理对照组比较也偏高，且变化幅度不大，分析认为是动物自身生理波动，非药物影响。

实施例4所制得的丹知青娥混合提取物连续灌胃给药，各个剂量组动物体温均未见药物引起的明显影响。

(4)对血液学的的影响

对血细胞指标的影响：白细胞(WBC)：比格犬连续灌胃重复给药45天，12.5g生药/kg剂量组与生理对照组比较偏低，给药224天5.0g生药/kg剂量组与生理对照组比较偏高，分析认为这些均为动物自身生理波动，非药物影响。血小板(PLT)：12.5g生药/kg剂量组在给药89天，179天，224天与生理对照组比较偏高，但在给药270天未见该差异，且该变化幅度在其正常范围内，影响不大。红细胞(RBC)：12.5g生药/kg剂量组在给药89天，与生理对照组比较偏低，5.0g生药/kg剂量组在给药224天，与生理对照组比较偏低，其他时间检查中未见此差异，分析认为这些均为动物自身生理波动，非药物影响。其余指标在不同阶段出现的差异，均未有剂量相关性，且波动幅度在正常范围内，故分析该影响是由动物个体差异及正常生理波动造成的，非药物毒性影响。

(5)对血清生化的的影响

比格犬连续灌胃重复给药9个月，部分组别在不同时间段内与生理对照组比较偶见差异，经分析是这些差异未有剂量相关性，且变化幅度不大，均在正常范围内，分析为由动物个体差异及正常生理波动造成的，非药物毒性反应，故不一一讨论。血液生化检查未见明显由药物所引起的毒性反应。

(6)对尿液生化的影响

比格犬连续灌胃重复给予实施例4制备的丹知青娥混合提取物给药42、87、137、178、223、269天，恢复29天尿液检查，未发现动物尿液中胆红素、尿胆原、酮体、抗坏血酸、尿糖、尿蛋白、隐血、pH、亚硝酸盐、白细胞、尿比重等的明显变化。

(7)对心电图的影响

检查项目：心率、P波电压、R波电压、T波电压、P-R间期、QRS时限、Q－T间期、ST段电压等。

检查方法：心电工作站记录后，自动和手工测量相结合。

频率：适应期10、18天，给药42、87、137、178、223、269天，恢复29天各进行一次。

给药期以及恢复期心电图检查未见明显由药物引起的毒性反应。

(8)眼科检查

比格犬连续灌胃给药9个月，给药结束以及停药恢复结束时检查，未发现药物对眼睑、结膜、角膜、巩膜、瞳孔、玻璃体、眼底(视神经乳头、中央动脉、视网膜)产生明显影响。

长期安全性评价结果显示，本发明的药物组合物具有良好的安全性。

试验例3：小鼠灌胃给药急性毒性试验

1.实验动物和分组

实验共设6组：5个给药组和1个生理对照组。生理对照组给予去离子水。每组10只小鼠，雌性。

2.所用提取物、剂量和给药方式

所用提取物为实施例4所制备的丹知青娥混合提取物。

药物配制

配制方法见表19。药液用前现配，配制后室温放置，有效期1天。

表19：药物配制方法表

剂量设置

根据预实验结果：小鼠灌胃给药，134.4g生药/kg组动物死亡率为9/10，69.1g生药/kg组死亡率为1/11。因此本试验剂量设计为：160.0g生药/kg、128.0g生药/kg、102.4g生药/kg、81.9g生药/kg、65.5g生药/kg。剂距比k＝0.8。

给药途径

本发明的药物组合物的优选临床用药途径为口服给药，根据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》(指导原则编号：[Z]GPT2-1)的要求，选用灌胃给药途径进行急性毒性实验。小鼠灌胃给药前禁食不禁水约4－6小时。小鼠在禁食约4－6小时后称重，按40ml/kg体重灌胃给药。

给药周期

单次给药，药后恢复观察14天。

2.检查项目和指标

(1)一般观察及死亡情况

给药当天观察约7小时；给药次日至药后14日，每日观察记录1次，共观察14天。观察内容包括动物外观、运动、精神行为、分泌物、排泄物等，以及动物的死亡情况。

(2)体重检查

给药前和给药后第1、3、7、14天，称量并记录存活动物体重。

(3)解剖检查

试验过程中的任何死亡动物及时进行解剖检查；药后14天，对所有存活动物进行解剖检查，并详细记录。

(4)组织病理学检查

由于肉眼观察仅发现部分小鼠肺有暗红色斑点，因此对有上述异常改变的小鼠肺取材进行组织病理学检查，药后14天对6只存活的生理对照组小鼠进行正常肺脏取材，进行组织病理学对比检查。

3.数据统计

一般观察：采用文字和表格进行总结描述。

体重：计算各组动物体重的平均值和标准差，给药组动物与生理对照组之间采用组间t-检验进行差异性比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

4.实验结果

(1)一般观察及死亡情况

一般观察

生理对照：动物在给药当天和药后14天观察期内未见任何异常。

给药组小鼠主要毒性反应为：

1)自发活动、刺探、梳理毛发、运动减少(B3)：各剂量组均有部分动物(4/10－10/10)药后7－28min出现B3症状，65.5、81.9和102.4g生药/kg剂量组该症状除个别动物外均于药后3hr内消失，而128.0、160.0g生药/kg剂量组大部分动物该症状至当天观察结束尚未恢复；

2)上睑下垂(E5)：各剂量组均有部分动物(2/10－10/10)药后6-33min出现E5症状，65.5、81.9和102.4g生药/kg剂量组该症状除个别动物外均于药后3hr内消失，而128.0、160.0g生药/kg剂量组大部分动物该症状至当天观察结束尚未恢复；

3)俯卧(B7)：81.9g生药/kg及其以上剂量组均有部分动物(1/10－8/10)药后2－4hr左右出现B7症状，该症状至当天观察结束均未恢复。

各组出现上述毒性反应的动物数、反应出现时间及持续时间均有明显的剂量相关性。见下面的表20－22。

表20：单次灌胃给药小鼠出现B3症状的统计列表

表21：单次灌胃给药出现E5症状的统计列表

表22：单次灌胃给药出现B7症状的统计列表

注：B3：自发活动、刺探、梳理毛发、运动减少；E5:上睑下垂；B7俯卧。“——”表示至当天观察结束未恢复。

死亡情况

实施例4所制得的丹知青娥混合提取物以65.5、81.9、102.4、128.0、160.0g生药/kg组动物试验期间死亡动物数分别为0、0、1、5、9只，除160.0g生药/kg组1只小鼠于药后2天死亡外，其它小鼠死亡均发生于药后24小时之内。用Bliss法计算，灌胃给药的半数致死量(LD₅₀)为128.20g生药/kg，其95％可信限为(117.03－140.44)g生药/kg。见表23。

表23：各组死亡动物表及LD₅₀计算结果

由上面的结果可见：

实施例4所制得的丹知青娥混合提取物单次灌胃给药，各剂量组小鼠药后均出现了不同程度的毒性反应，主要包括自发活动、刺探、梳理毛发、运动减少,上睑下垂及俯卧症状，其中102.4g生药/kg及其以上剂量组出现动物死亡。各组出现毒性反应的动物数、反应出现时间及持续时间均有明显的剂量相关性。单次灌胃给药小鼠的半数致死量(LD₅₀)为128.20g生药/kg，其95％可信限为(117.03－140.44)g生药/kg。

(2)体重检查

各剂量组存活小鼠平均体重与生理对照组比较，各检查时间点均无明显差异，表明本发明的药物组合物单次灌胃给药对小鼠体重增长无明显影响(见表24)。

表24:单次灌胃给药对小鼠体重的影响

注：n表示存活动物只数。

(3)解剖检查

生理对照组

药后14天对10只存活小鼠剖检，各只大鼠体表、皮下及颈部检查均未见异常，胸腔、腹腔浆膜光滑无积液，心、肺、脑、肝、肾、脾、胃、肠、胸腺、胰腺、性腺及膀胱等脏器色泽、体积和质地正常，未见异常改变。

给药组

死亡小鼠：小鼠灌胃给药1次后，共死亡15只小鼠(160.0g生药/kg组9只，128.0g生药/kg组5只，102.4g生药/kg组1只)，死亡时间为给药后1天－药后2天。剖检可见部分动物肺叶有暗红色片状斑点，其余被检主要脏器如：心、肝、肾、脾、胸腺、肾上腺、甲状腺、胰腺、性腺、胃肠道、淋巴结等形态、颜色、位置正常，未见肉眼可见的病理改变。

存活小鼠：药后14天剖检，除160g生药/kg组、128.0g生药/kg组和102.4g生药/kg组各有1只动物肺有暗红色斑点外，其余各组小鼠及各主要被检脏器形态、颜色、位置正常，未见明显肉眼可见的病理改变。

(4)组织病理学检查

镜检仅见102.4g生药/kg组1只小鼠(7号动物，药后1天死亡)局部肺组织内轻度出血，且病变程度较轻，不足以导致动物死亡。其他各组送检肺脏标本与生理对照组比较，均未见明显由药物引起的病理改变。

(5)影响研究可靠性和造成研究工作偏离试验方案的异常情况

无。

5.实验结果讨论

160.0g、128.0g及102.4g生药/kg剂量组药后均出现了部分小鼠死亡，各组死亡动物数有明显的剂量正相关性。组织学检查仅见1只死亡小鼠局部肺组织内轻度出血。

雌性小鼠单次灌胃给药主要毒性反应为自发活动、刺探、梳理毛发、运动减少，上睑下垂，俯卧，102.4g生药/kg及其以上剂量组出现动物死亡。雌性小鼠单次灌胃给药的半数致死量(LD₅₀)及其95％可信限为128.20(117.03－140.44)g生药/kg。

试验例4：制剂生物学活性或药效实验(1)

1.药品及试剂

丹知青娥方：实施例4所制备的丹知青娥混合提取物

戊酸雌二醇：商品名：补佳乐。生产企业：法国DELPHARM Lille S.A.S.。分包装企业：拜耳医药保健有限公司广州分公司。成分：戊酸雌二醇片。进口药品注册号：H20080108，药品批准文号：国药准字J20080036，生产批号：012A，生产日期：2010-10-26，有效期至2015-10-25.规格：1mg/片。

希明婷：升麻总皂苷。薄膜衣片，临床推荐剂量：1片/次，3次/日，四周为一个疗程，规格：100mg/片，每盒30片，生产批号：20091225，生产日期：2009-12-09，有效期至：2012-11。国药准字Z20050748。生产厂商：山东绿叶制药有限公司。

2.实验方法

(1)选择实验动物和饲养条件，随机分组

实验动物：260只6月龄经产型健康Sprague-Dawley大鼠，体重281±22g，SPF级。购于天津动物饲养中心，合格证号：SCXK 2010-0002。

饲养条件：饲养于天津实验动物饲养中心，每笼10只，室温由空调控制在22±2℃，相对湿度58-65％。高压垫料，每周更换两次。标准维持鼠料，自由饮用净化水及食物。

分组：大鼠适应性喂养1周，造模后按体重随机分组。共分8组，每组30只，分别为丹知青娥方正常组，Sham组(假手术组)、OVX组(去卵巢组)、丹知青娥方10g/kg组、丹知青娥方5g/kg组、丹知青娥方2.5g/kg组、希明婷组、雌二醇组。

(2)去卵巢动物模型的建立

去卵巢模型的建立：大鼠术前24小时禁食不禁水，10％的水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉生效后，仰面固定，剔除下腹部毛，碘伏消毒，75％酒精脱碘后，距耻骨联合上约2-3cm处，正中切口依次切开皮肤、皮下组织、腹部肌肉至腹膜，切口1.5～2.0cm长，止血钳分开切口，找到Y型子宫，拉出部分子宫于每侧子宫末端找到卵巢，为一表现凹凸不平小球状物。在子宫及卵巢分界处绕线结扎，完整切除双侧卵巢后腹腔脏器复位，依次缝合腹部肌肉及皮肤，术后清理干净血渍并碘伏消毒伤口。手术按照无菌要求操作。术后侧卧位，保持呼吸通畅，自然清醒。术后连续两天肌注青霉素预防感染，剂量为4万单位/只/天。假手术组不切除双侧卵巢，仅切除卵巢附近与卵巢大小相当的部分脂肪组织，余操作相同。灌胃给药前5天起连续行阴道细胞学检查，去卵巢大鼠阴道细胞学涂片为大量的白细胞或白细胞中混杂少量角化细胞、上皮细胞，符合动情后期和动情间期的表现，连续观察没有随着时间的改变而发生变化，证明去卵巢手术的成功，造模成立。

(3)药物干预

2天配液一次，称取药物配制相应的剂量：丹知青娥方10g/kg，丹知青娥方5g/kg，丹知青娥方2.5g/kg；希明婷60mg/kg，雌二醇0.1mg/kg。

去卵巢模型建立手术后第3周开始，每日上午10时，实验组按体重10ml/kg灌胃给药，正常对照组、假手术组、模型组按体重10ml/kg灌胃给予溶剂0.5％CMC－Na(羧甲基纤维素钠)，持续给药12周。

3.实验结果

(1)丹知青娥方给药12周对去势大鼠子宫湿重及子宫系数的影响

大鼠去势后子宫明显萎缩，重量及系数均明显降低，与假手术组和正常对照组比较差异显著(P＜0.01)；给药组能够明显对抗大鼠去势后子宫萎缩(P＜0.05-0.01)；其中丹知青娥方10g/kg和5g/kg剂量组可剂量依赖地显著对抗由于去势造成的子宫萎缩，提高子宫重量及子宫系数，与模型组比较差异显著(P＜0.01)。

表25：丹知青娥方给药12周对去势大鼠子宫湿重及子宫系数的影响

注：丹知青娥方给药12周对去势大鼠子宫湿重及子宫系数的影响(n＝11-17模型组与假手术组比较：P＜0.01；各给药组与模型组比较：*P<0.05，**P＜0.01)

(2)丹知青娥方给药12周对去势大鼠血脂的影响

大鼠去势后与假手术组比较，除血清中的LDL水平升高(P＜0.01)外，TC、TG、HDL、HDL/TC均无明显改变(P＞0.05)；

丹知青娥方10g/kg、5g/kg、2.5g/kg剂量组均能够明显降低血清中的TC水平，与模型组比较差异显著(P＜0.01)；希明婷组、雌二醇组也均能够降低血清中TC水平(P＜0.05)；丹知青娥方5g/kg剂量组能够明显降低血清中的TG水平，与模型组比较差异显著(P＜0.01)；其余各组对血清TG水平有降低趋势，但无统计学差异(P＞0.05)；丹知青娥方10g/kg、5g/kg、2.5g/kg剂量组均能够明显降低血清中的HDL水平，与模型组比较差异显著(P＜0.05-0.01)；希明婷组、雌二醇组也均能够降低血清中HDL水平(P＜0.05)。

表26：丹知青娥方给药12周对去势大鼠血脂的影响

注：丹知青娥方给药12周对去势大鼠血脂的影响(n＝11-17模型组与假手术组比较：P＜0.01；各给药组与模型组比较：*P<0.05，**P＜0.01)

(3)丹知青娥方给药12后对去势大鼠血清E₂、FSH、LH含量的影响

大鼠去势后，模型组与假手术组比较无差异(p>0.05)，药物组对雌二醇无明显影响(p>0.05)。

表27：丹知青娥方给药12后对去势大鼠血清E₂、FSH、LH含量的影响

注：各给药组与模型组比较：*P<0.05，**P＜0.01

(4)丹知青娥方给药12周对去势大鼠子宫壁、子宫内膜上皮细胞、子宫腺的影响

HE染色可见模型组大鼠子宫整体发生明显萎缩，体积缩小；内膜层萎缩，上皮呈扁平或立方状，胞体缩小；纤维组织明显增多，间质细胞变为长梭形，细胞排列密集，核浓缩致密，深染；内膜腺体数量减少，体积和腺腔变小，腺细胞变为扁平样，胞浆少，核浓缩致密，深染，有的腺腔塌陷，有的囊性扩大，腺体发生退行性变；肌层萎缩，肌细胞变为长梭形。丹知青娥丸10g/kg、5g/kg治疗组可见子宫壁明显增厚，其中上皮、内膜增殖明显，肌层稍增厚。内膜上皮呈立方或高柱状，胞浆多透亮；内膜层间质细胞核变为卵圆形，胞体大，胞浆分泌增多，核淡染；内膜腺体数量稍增加，体积和腺腔增大，腺细胞变为立方状，胞浆分泌增多，胞体大，核淡染。丹知青娥丸2.5g/kg治疗组子宫病理变化与模型组大致相同，无明显变化。雌二醇对照组：子宫壁明显增厚，其中上皮、内膜增殖和肌层增厚明显。上皮呈立方或高柱状，胞体大，透亮；内膜层间质细胞核变为卵圆形核淡染，胞体大；内膜层纤维组织明显增多，腺体数量增加，体积和腺腔均增大，腺细胞变为立方状，胞浆分泌增多，核淡染。

丹知青娥方给药12周能够降低去势大鼠体重的升高，明显升高子宫重量及子宫系数，升高肾上腺重量及肾上腺系数；能够降低血清中TC、TG水平，对HDL/TC和LDL无明显影响；对肝功能无明显影响。对性激素无明显影响。

摘除大鼠双侧卵巢后，可引起子宫明显萎缩，用丹知青娥丸治疗12周，10g/kg和5g/kg剂量对子宫萎缩具有明显的改善作用，其作用的靶组织主要为子宫内膜，形态学表现为：内膜明显增殖，上皮由扁平变为立方或高柱状，腺体数量增加，腺细胞分泌增加，胞浆透亮，间质细胞核由长梭形变为卵园形，细胞大，淡染；肌层稍增厚。

试验例5：制剂生物学活性或药效实验(2)

1.药物及配制

受试药物丹知青娥方

丹知青娥方药物，为实施例4所制备的丹知青娥混合提取物。

以上药物在小鼠灌胃前各称取一定量的干膏，按着14g生药/kg、7g生药/kg、3.5g生药/kg高、中、低三个剂量，以0.5％CMC-Na配制成混悬液，口服灌胃给药，每日一次，给药体积为0.15ml/10g体重。

戊酸雌二醇(西药对照组)

商品名：补佳乐。规格：1mg。成分：戊酸雌二醇片。每盒21片，临床推荐剂量1片/天，口服用。生产企业：法国DELPHARM Lille S.A.S.。分包装企业：拜耳医药保健有限公司广州分公司，性状：淡黄色糖衣片，除去糖衣后显白色。进口药品注册号：H20080108，药品批准文号：国药准字J20080036，生产批号：012A，生产日期：2010-10-26，有效期至2015-10-25。试验前以0.5％CMC-Na配制成0.13mg/kg的混悬液。口服灌胃给药，剂量为0.13mg/kg，每日一次，给药体积为0.15ml/10g。

希明婷(中药对照组)

希明婷成份：升麻总皂苷。薄膜衣片，临床推荐剂量：1片/次，3次/日，四周为一个疗程，规格：100mg/片，每盒30片，生产批号：20091225，生产日期：2009年12月09日，有效期至：2012年11月。国药准字Z20050748。山东绿叶制药有限公司。试验前以0.5％CMC-Na配制成78mg/kg的混悬液。口服灌胃给药，剂量为78mg/kg，每日一次，给药体积为0.15ml/10g。

4-二氧化乙烯基环己烯(SIGMA)，化学品英文名称：4-cinylcyclohexenedioxide，简称4-VCD，分子式为C₈H₁₂0₂，分子量为140.18，透明水溶性液体，有微弱烯烃气味，给药浓度为160mg/kg。2.实验方法

(1)小鼠围绝经期模型的建立

实验动物采用21天B6C3F1小鼠，体重20±2g，SPF级。由北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证编号：0237345，动物饲养于天津中医药大学实验动物饲养中心，室温由空调控制在22±2℃，相对湿度58-65％。

小鼠围绝经期模型的建立采用化合物4-VCD皮下注射160mg/kg，20g小鼠给药0.2ml(浓度为16mg/ml)，即0.01ml/g，连续15d，制备围绝经期小鼠模型。

(2)分组及给药

动物适应性饲养一周后，按4-VCD 160mg/kg连续腹腔注射15d，经阴道涂片检查和血清AMH测定判断模型成功与否。将动物随机分组为正常组、模型组、丹知青娥方(3.5、7、14g/kg)组、希明婷组和戊酸雌二醇组，以上各组药物均以0.5％羧甲基纤维素钠中制成混悬液，给药体积均为0.1ml/20g体重。此后每周固定称重一次，每组小鼠定食不定水，正常组灌胃给予等量的生理盐水。

戊酸雌二醇：临床推荐剂量1片/天。药物剂量：1mg/d，60kg成人，实验小鼠剂量：0.0026×1mg/d×50＝0.13mg/kg。

希明婷：每1mg含有升麻总皂苷0.33mg，临床60kg成年人剂量为300mg/d.60kg，按体表面积计算：折算成20g小鼠，乘以系数0.0026，则需要希明婷片：0.0026mg/d×300×50＝39mg/kg，2倍剂量为实验用药78mg/kg，78mg/15ml。

具体分组情况，见表28。

表28：4-VCD小鼠实验分组及给药情况

分组	给药剂量
		正常对照组
模型组
		丹知青娥方高剂量组	14g/kg
丹知青娥方中剂量组	7g/kg
		丹知青娥方低剂量组	3.5g/kg
雌二醇	0.13mg/kg
		希明婷	78mg/kg

3.实验结果

(1)丹知青娥方对4-VCD诱导围绝经期小鼠血清E2、T的影响

4-VCD诱导围绝经期的小鼠血清E2水平，模型组显著低于正常组(P<0.05)，丹知青娥方提取物3.5、7、14g/kg提高血清E2水平，且丹知青娥方提取14g/kg与模型组比较有统计学差异，P<0.05。见图1A。

4-VCD诱导围绝经期的小鼠血清T和T/E2水平，模型组显著高于正常组(P<0.05)，

丹知青娥方提取物有降低血清T水平趋势，但与模型组比较无统计学差异，但是与模型组相比，丹知青娥方可明显降低血清中T/E2水平(P<0.01和P<0.05)。说明丹知青娥方和希明婷、戊酸雌二醇均可以调节T/E2平衡。见图1B、图1C。

(2)丹知青娥方对4-VCD诱导围绝经期小鼠血清LH、FSH的影响

4-VCD诱导围绝经期的小鼠血清LH、FSH水平，模型组显著高于正常组(P<0.05，P<0.01)；丹知青娥方提取物3.5、7、14g/kg,希明婷78mg/kg、戊酸雌二醇0.13mg/kg降低血清E2水平，各用药组与模型组比较均有统计学差异，P<0.05。但4-VCD诱导围绝经期的小鼠血清LH/FSH值明显下降，而各用药组显著使其升高。说明丹知青娥方可以调节LH、FSH变化。见图2A、2B、2C。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种补骨脂提取物的制备方法，包括下述步骤1)－5)或者1)-6)：

1)将补骨脂用1－20倍量的50％－95％的乙醇浸泡1－36小时；

2)使用50％－95％乙醇进行渗漉提取，流速为4－16mL/min/Kg；

3)收集补骨脂投料量5－20倍体积渗漉液；

4)将渗漉液进行浓缩；

5)静置分层，倾去上层液，取下层得补骨脂稠浸膏；

6)将步骤5)得到的补骨脂稠浸膏以适量乙醇稀释，搅拌下分次加至辅料粉末中，补骨脂生药量与辅料量的比例为(10:2.5)－(10:3)；搅匀，干燥，粉碎，过筛，得补骨脂浸膏粉。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于如下的(1)－(10)中的任一项或者多项：

(1)步骤1)中，乙醇的用量为1－5倍量，优选为2倍量；

(2)步骤1)中，乙醇的浓度为50％－70％，优选为70％；

(3)步骤1)中，浸泡时间为12－24小时，优选为12小时；

(4)步骤2)中，使用50％－70％乙醇渗漉提取，优选使用70％乙醇；

(5)步骤2)中，控制流速为4－8mL/min/Kg，优选为8mL/min/Kg；

(6)步骤3)中，收集补骨脂投料量10－18倍体积渗漉液；优选地，收集补骨脂投料量15倍体积渗漉液；

(7)步骤4)中，所述浓缩为减压浓缩；

(8)步骤4)中，将渗漉液浓缩至药材重量(g)：浓缩液体积(ml)≤1:0.5或≤1:1或≤1:1.5；

(9)步骤5)中，进行冷藏静置分层；

(10)步骤6)中，将倍他环糊精与等量的微晶纤维素混匀，得到辅料粉末；将补骨脂稠浸膏以适量乙醇稀释，搅拌下分次加至上述辅料粉末中，补骨脂生药量与辅料量比例为(10：2.5)－(10：3)，搅匀，干燥，粉碎，过80目筛，得补骨脂浸膏粉。

3.一种补骨脂提取物，由权利要求1或2所述的制备方法得到。

4.一种补骨脂提取物，其中，按照补骨脂药材的重量计算，所述补骨脂提取物中的补骨脂苷和异补骨脂苷的含量为≤20mg/g、≤18mg/g、≤15mg/g、≤10mg/g、≤6.9mg/g、≤6.8mg/g、≤5mg/g、≤2mg/g、≤1mg/g、≤0.5mg/g、≤0.1mg/g、≤0.01mg/g或者≤0.001mg/g；优选地，所述补骨脂提取物为补骨脂稠浸膏。

5.根据权利要求4所述的补骨脂提取物，其中，所述补骨脂提取物中的补骨脂苷和异补骨脂苷的含量为零或者检测不到。

6.根据权利要求4或5所述的补骨脂提取物，其中，所述补骨脂提取物中含有补骨脂素和异补骨脂素；优选地，按照补骨脂药材的重量计算，所述补骨脂素和异补骨脂素的含量为≥0.7mg/g、≥1.1mg/g、≥1.2mg/g、≥2mg/g、≥3mg/g、≥4mg/g、≥4.4mg/g、≥5mg/g、≥5.5mg/g或者≥6mg/g。

7.根据权利要求4或5所述的补骨脂提取物，其中，所述补骨脂提取物中含有补骨脂黄酮类成分，并且所述补骨脂黄酮类成分选自补骨脂异黄酮、新补骨脂异黄酮、补骨脂查耳酮、异补骨脂查耳酮、补骨脂二氢黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚和corylifol A中的一种、多种或全部；优选地，其含有异补骨脂查耳酮和补骨脂二氢黄酮；更优选地，按照补骨脂药材的重量计算，所述补骨脂二氢黄酮的含量为≥4mg/g、≥2.5mg/g或者≥2.9mg/g，所述异补骨脂查耳酮的含量为≥4mg/g、≥4.5mg/g、≥5mg/g、≥5.3mg/g或者≥5.5mg/g。

8.根据权利要求4或5所述的补骨脂提取物，其中，所述补骨脂提取物中含有补骨脂酚。

9.根据权利要求8所述的补骨脂提取物，其中，按照补骨脂药材的重量计算，所述补骨脂酚的含量为≥0.5mg/g、≥5mg/g、≥10mg/g、≥15mg/g、≥20mg/g、≥30mg/g、≥40mg/g、≥50mg/g或者≥55mg/g。

10.根据权利要求4或5所述的补骨脂提取物，其通过渗漉法或者冷浸法制备，并且出膏率控制在30％以下。