CN101396421A - 具有雌激素样作用的中药组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有植物雌激素样作用的组合物，主要由下列质量百分比的原料药制备而成：杜仲12～64％、补骨脂6～38％。本发明中药组合物具有植物雌激素样作用，可双向调节机体的雌激素水平，延缓更年期的到来，适用于改善妇女围绝经期综合症：月经紊乱、血管舒缩症状(潮红、潮热)、精神神经紊乱(抑郁、忧虑、易激动和失眠)、心脑血管症状(高血压、高血脂、心悸、动脉粥样硬化、冠心病、老年痴呆症等)、骨及关节症状(骨质疏松、关节痛等)、泌尿生殖道症状等诸病。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有雌激素样作用的中药组合物。另外，本发明还涉及该中药组合物的应用。
背景技术
随着社会人口老龄化程度的日益提高，老年人的生活质量已受到社会的广泛重视，女性的平均寿命逐年上升，意味着她们将有至少三分之一的时间在围绝经期(更年期)渡过。围绝经期是指从接近绝经(menopause)出现与绝经有关的内分泌、生物学和临床特征起至绝经一年内的期间。在围绝经期出现性激素减少为主的神经内分泌、心理和代谢变化所致的各器官的症状和体征的症候群，主要症状：月经紊乱、血管舒缩症状(潮红、潮热)、精神神经紊乱(抑郁、忧虑、易激动和失眠)、心脑血管症状(高血压、高血脂、心悸、动脉粥样硬化、冠心病、老年痴呆症等)、骨及关节症状(骨质疏松、关节痛等)、泌尿生殖道症状等。
化学合成雌激素在防预绝经女性诸多不良症状方面，发挥极为重要的作用。然而，由于雌激素的长期单一使用增加卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌的患病率及其它不良反应，从而限制了其应用。植物雌激素(Phytoestrogen)植物雌激素(PE)存在于植物中，能结合并激活哺乳类动物及人类的雌激素受体，从而发挥雌激素样或抗雌激素样作用，即机体雌激素水平低时表现为雌激素样作用；反之表现为抗雌激素样作用，因此具有一定的安全性。鉴于化学合成激素疗法的潜在的危险性寻找安全、有效、可供长期使用的效能高天然植物雌激素药物尤为重要，也是药学工作者最新研究热点之一。
“青娥方”{杜仲(盐炒)480g、补骨脂(盐炒)240g、核桃仁(炒)150g、大蒜120g}为古今补肾良方，首载于宋代的《和剂局方》中，用于肾虚腰痛，起坐不利，膝软乏力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有雌激素样作用的中药组合物。该中药组合物是一种选择性雌激素受体阻断剂。
本发明所要解决的技术问题是提出该中药组合物在制备治疗雌激素缺乏引起的围绝经期综合症的药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明提出的具有雌激素样作用的中药组合物，主要由下列质量百分比的原料药制备而成：杜仲12～64％、补骨脂6～38％。
作为优选技术方案，本发明上述具有雌激素样作用的中药组合物的原料药中最好进一步包括3～24％的核桃仁，或3～18％的大蒜，或3～24％的核桃仁和3～18％的大蒜。
作为另一优选技术方案，本发明上述具有雌激素样作用的中药组合物中，各原料药的质量百分比最好为：杜仲12～64％、补骨脂6～38％、核桃仁3～24％、大蒜3～18％。
本发明具有雌激素样作用的中药组合物的制备过程并无特别之处。先将大蒜蒸熟，干燥；再将杜仲、补骨脂、核桃仁和干大蒜打粉，或用水、50～95％乙醇、丙酮、乙酸乙酯、汽油或石油醚回流提取，加入常见药用辅料按照常规方法制成任何一种药学上所说的剂型，优选丸剂、片剂、胶囊剂或口服液。
本发明中药组合物具有的雌激素样作用很大可能与如下物质之间的协同作用密切相关：杜仲中的木质素类物质(尤其是松脂醇二葡萄糖苷)、黄酮类物质和环烯醚萜类物质(尤其是杜仲醇)，以及补骨脂中的香豆素类物质(尤其是补骨脂素、异补骨脂素、拟雌内酯类补骨脂定)、黄酮类物质(尤其是补骨脂异黄酮、补骨脂查耳酮、补骨脂异耳而酮、补骨脂二氢黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚)。
随后的药效实验将证明，本发明中药组合物可替代雌激素治疗雌激素缺乏引起的围绝经期综合症：月经紊乱、血管舒缩症状(潮红、潮热)、精神神经紊乱(抑郁、忧虑、易激动和失眠)、心脑血管症状(高血压、高血脂、心悸、动脉粥样硬化、冠心病、老年痴呆症等)、骨及关节症状(骨质疏松、关节痛等)和泌尿生殖道症状等诸病。
随后的药效实验还将证明，本发明首次发现青娥方具有雌激素样作用，并且发现用量减少到原方四分之一仍然有效，在国内外研究青娥方雌激素样作用尚属首例。
本发明中药组合物是药食兼用的纯天然的植物提取物，具有植物雌激素的选择性雌激素受体拮抗剂，对雌激素具有双向调节作用，不同于化学合成的雌激素药物的增加乳腺癌、子宫癌的副作用。
附图说明
图1是小鼠动情周期阴道涂片细胞学变化特征。
图2是本发明组合物对成熟去卵巢小鼠子宫石蜡切片影响。
图3是本发明组合物对成熟去卵巢小鼠子宫ER免疫组化(X40)。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。
实施例1(杜仲粉末混旋液、补骨脂混旋液、杜仲补骨脂混旋液、杜仲补骨脂核桃仁混旋液、杜仲补骨脂大蒜混旋液、杜仲补骨脂核桃仁大蒜混旋液对未成熟小鼠子宫重量的影响)
1.1实验材料
1.1.1受试动物：KM种小鼠，♀，21日龄，体重12～14g(购自中科院动物所)。
1.1.2受试药物及其制备：
杜仲粉末混旋液：杜仲1.67g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
补骨脂混旋液：补骨脂0.835g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
杜仲补骨脂混旋液：杜仲1.67g、补骨脂0.835g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
杜仲补骨脂核桃仁混旋液：杜仲1.67g、补骨脂0.835g、核桃仁0.53g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
杜仲补骨脂大蒜混旋液：杜仲1.67g、补骨脂0.835g、大蒜0.415g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
杜仲补骨脂核桃仁大蒜混旋液：杜仲1.67g补骨脂0.835g核桃仁0.53g大蒜0.415g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
1.2实验方法
1.2.1组合物对未成熟雌小白鼠子宫重量的影响。
选取11-13g健康雌性21日龄小白鼠，随机分为四组，分别给以生理盐水、受试各药物组，每日灌胃(ig)1次，连续5日，未次给药后24小时称重，脱颈椎处死，剖开腹腔，以剪刀摘取子宫及阴道，放于滤纸上，除去脂肪组织、卵巢及阴道，迅速称其湿重，计算子宫重量百分率。比较各组的差异。结果见表1。
表1.本发明中药组合物对未成熟小鼠子宫影响
*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001与空白对照组比较各给药组子宫指数，子宫水摄取增加百分率具有显著性差异。
由表1可知，杜仲混旋液组、补骨脂混旋液组、杜仲大蒜混旋液、补骨脂核桃仁混旋液、补骨脂大蒜混旋液、杜仲补骨脂核桃仁混旋液、杜仲补骨脂大蒜混旋液、杜仲补骨脂核桃仁大蒜全粉混旋液组子宫重量与空白对照组比较有显著性差异，受试各药物组均具有雌激素样作用。且杜仲补骨脂组子宫指数高于杜仲、补骨脂单独用药组，且杜仲、补骨脂、核桃仁和大蒜四味药联合应用子宫指数高于其它给药组，提示该组合物配伍应用的科学性。
实施例2(杜仲、补骨脂、核桃仁、大蒜组合物雌激素样作用研究)
2.1实验材料
2.1.1动物：KM种小鼠，♀，21日龄，购自中国科学院动物所，健康成熟KM种，♀小鼠(40±5g)60只(由中科院动物所提供)。
2.1.1受试药物及其制备：
将杜仲、补骨脂、核桃仁粉碎，大蒜蒸干打粉过150目筛按一定比例混合制成全粉混旋液(0.425g/kg、0.85g/kg、1.7g/kg、3.4g/kg)；尼尔雌醇片(上海医药集团华联制药厂)。
组合物全粉混旋液0.425g/kg：杜仲6份、补骨脂3份、核桃仁1.875份、大蒜1.5份。
组合物全粉混旋液0.850g/kg：杜仲12份、补骨脂6份、核桃仁3.75、大蒜3份。
组合物全粉混旋液1.700g/kg：杜仲24份、补骨脂12份、核桃仁7.5、大蒜6份。
组合物全粉混旋液3.400g/kg：杜仲48份、补骨脂24份、核桃仁15份、大蒜12份。
2.2实验方法
2.2.1组合物对未成熟雌小白鼠子宫重量的影响。
选取11-13g健康雌性21日龄小白鼠，随机分为四组，分别给以生理盐水、组合物各剂量，每日灌胃(ig)1次，连续5日，未次给药后24小时称重，脱颈椎处死，剖开腹腔，以剪刀摘取子宫及阴道，放于滤纸上，除去脂肪组织、卵巢及阴道，迅速称其湿重，计算子宫重量百分率。比较各组的差异。结果见表2。
表2.本发明中药组合物对未成熟小鼠子宫重量影响
*p<0.05代表各组合物组与空白对照组子宫重量比较具有显著性差异，而各剂量组之间比较无统计学意义。
雌激素可促使靶器官RNA合成，蛋白质合成增加，子宫重量增加。由表2可知，各组合物使未成熟小鼠子宫重量增加，提示其可能具有雌激素样作用。
2.2.2组合物对成熟去卵巢小鼠雌激素样作用。
取健康成熟雌熟小白鼠，乙醚协同乌拉坦麻醉，行双侧卵巢摘除，术后缝合，碘酒消毒创口。逐只进行阴道涂片(用滴管吸取生理盐水0.1～0.2ml，轻轻插入小鼠阴道2～3mm，抽吸2～3次，涂片，95％乙醇固定10min，美蓝溶液染色10min，用水轻轻冲洗，淋干，以备读片)，每天1次，观察阴道上皮细胞连续5天处于间情期，以证明去势成功。分为假手术组(Sham组只切除卵巢附近的脂肪，不切除卵巢)、单纯卵巢切除手术组(OVX组)、卵巢切除+组合物混旋液(0.85g/kg)、卵巢切除+组合物混旋液(1.7g/kg)、卵巢切除+组合物混旋液(3.4g/kg)、卵巢切除尼尔雌醇(0.5mg/kg)。ig1次/d，连续给药4weeks，每日作阴道涂片观察小鼠阴道细胞变化；测其子宫、肾上腺湿重；比较各组脏器指数差异；并对子宫4％多聚甲醛固定，石蜡切片、HE染色观察各组子宫切片变化的差异。
2.2.3.1组合物对成熟去卵巢小鼠子宫肾上腺重量的影响。
结果见表3。
表3.本发明中药组合物对去卵巢小鼠子宫系数、肾上腺系数和体重的影响
***代表模型组与其它组子宫湿重比较有显著性差异p<0.001
▲▲▲代表高剂量组与模型组肾上腺湿重比较有显著性差异p<0.001
由表3可知，模型对照组子宫重量与其它各给药组比较具有显著性差异，表明组合物各剂量组均能对抗卵巢摘除后子宫萎缩；组合物随着剂量的增加子宫重量反而降低，提示可能组合物的雌激素样作用与剂量不存在正相关性，3.4g/kg组肾上腺重量与模型对照组比较具有显著性差异，0.85g/kg和1.7g/kg较模型组都有升高趋势，推测可能是启动机体垂体—肾上腺素轴正反馈，增强肾上腺皮质功能。
2.2.3.2组合物对成熟去卵巢小鼠阴道上皮角化的影响。
结果见表4和图1。
如图1所示，小鼠动情周期阴道涂片细胞学变化特征：
间情期：镜下见大量的多核白细胞，少量上皮细胞。
动情前期：大量上皮细胞，少量角化上皮细胞(无核)，无白细胞。
动情期：大量角化上皮细胞，形状大而不规则，尚有少量上皮细胞，
动情后期：大量白细胞，尚有融合的角化上皮细胞。
表4.本发明中药组合物对去卵巢小鼠阴道上皮角化影响
*代表各组与模型组比较阴道上皮细胞角化率具有显著性差异
由表4可知，模型组在自去卵巢至处死前阴道细胞均为白细胞，一直处于间情期。而各给药组小鼠在给药7天内均能恢复卵巢切除的动情期，提示组合物可能具有雌激素样作用。
2.2.3.3组合物对成熟去卵巢小鼠子宫石蜡切片影响。
结果如图2所示，模型组子宫萎缩体积变小，宫腔变细，且子宫内膜变薄，腺体萎缩减少。而给药组和假手术组子宫内膜较模型组增厚，子宫腺增多、增长，腺腔扩大，其中充满了红色分泌物(嗜酸性物质)。固有层结构疏松，细胞间隙增大，处于分泌期。组合物可拮抗激素水平下降的子宫萎缩，提示其具有雌激素样作用。
2.2.3.4组合物对成熟去卵巢小鼠子宫ER免疫组织化学染色及定量分析
免疫组织化学染色采取S.ABC法，石蜡切片脱蜡至水后；抗原修复10min*2，自然冷却至室温，将切片置于0.01mol/柠檬酸缓冲液，PH值6.0中，微波98℃10min*2；PBS洗3*3min；1％正常血清封闭20min，室温；不洗，加一抗ER-ER-α/β稀释度：1:200，4℃，过夜；PBS洗3*3min；Envision试剂30min，37℃；PBS洗3*3min；0.04％DAB+0.03％H2O2显色8min；水洗，苏木素衬染30s，水洗，盐酸乙醇蓝化2s，水洗，微波蓝化，常规树脂封片。镜下观察、摄片。对使用通用医学图像分析仪(TN-8502)，镜下观察各组染色结果，测定细胞灰度值，用OS-9数据分析软件分析相应抗体的表达量。每组取3张切片，每张切片选3个视野，其平均值为该张切片的灰度值。各组数据采用x±s表示，应用SPSS 10.0分析，P<0.05为有显著性差异。
结果如表5和图3所示。
表5.本发明中药组合物对去卵巢小鼠子宫ER影响
*代表与模型组比较有显著性差异p<0.05
从表5可知，*代表与模型组比较ER表达总量具有显著性差异(p<0.05)，且组合物1.7g/kg，3.4g/kg组的ER总量也高于模型组，推测本发明中药组合物是通过增加机体受体含量是其发挥雌激素样作用机制之一。
2.2.3.5组合物对成熟去卵巢小鼠子宫ER免疫组化(X40)。
图3中所示棕黄色代表雌激素受体阳性表达，可知组合物1.7g/kg，3.4g/kg组的ER阳性表达高于模型组。推测本发明中药组合物是通过增加机体受体含量是其发挥雌激素样作用机制之一。
2.2.3.6组合物对成熟去卵巢小鼠体温的影响
去卵巢小鼠于末次给药后1h，2h测其肛温：系将体温计涂上凡士林，使其润滑后插入小鼠肛门，约1cm，稳定后出现报鸣声读数。结果见表6。
表6.本发明中药组合物对去卵巢小鼠肛温的影响
***代表与模型组肛温比较具有显著性差异p<0.001，**代表与模型组肛温比较具有显著性差异p<0.01，*代表与模型组肛温比较具有显著性差异p<0.05，
从表6可知本发明组合物可降低去卵巢小鼠的肛门温度，并且于模型组比较有显著性差异，推测其可缓解围绝经期女性潮热的症状。
实施例3(组合物雌激素样作用拮抗实验)
3.1实验材料
3.1.1受试动物：KM种小鼠，♀，21日龄，体重12～14g(购自中科院动物所)。
3.1.2受试药物：己烯雌酚(购自上海医药集团华联制药厂，国药准字：H3102164)，组合物粉末混旋液(杜仲48份补骨脂24份核桃仁15份大蒜12份)。
3.2实验方法
选取11-13g健康雌性21日龄小白鼠，随机分为3组，分别给以生理盐水、尼尔雌醇混旋液组、尼尔雌醇+组合物粉末混旋液组，每日各组于AM9:00灌胃(ig)，尼尔雌醇+组合物粉末混旋液组于5:00PM，连续ig7日，末次给药后24h称重，脱颈椎处死，剖开腹腔，以剪刀摘取子宫及阴道，放于滤纸上，除去脂肪组织、卵巢及阴道，迅速称其湿重，计算子宫重量百分率。比较各组的差异。结果见表7。
表7.本发明中药组合物拮抗尼尔雌醇子宫增重结果表
***为与空白对照组比较p<0.0001 ▲▲▲为与雌激素组比较p<0.0001
从表7可知，中药拮抗组子宫湿重明显小于尼尔雌醇组，且具有显著性差异，提示组合物可有效的拮抗尼尔雌醇对未成熟小鼠的子宫增重作用。当体内雌激素水平低下时表现为雌激素样作用，体内雌激素水平高时表现为拮抗雌激素样作用，组合物符合植物雌激素的双向调节作用特点。
实施例4(组合物改善睡眠实验研究)
4.1实验材料
4.1.1受试动物：KM种小鼠，♀，体重18～22g购自中科院动物所)。
4.1.2受试药物：组合物粉末混旋液(杜仲48份补骨脂24份核桃仁15份大蒜12份)。
4.2实验方法
4.2.1组合物对阈下剂量戊巴比妥钠催眠实验：
KM小鼠ig组合物3.4g/kg，连续7d，1次/d，末次给药60min后，每只小鼠给予30mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射，注射量0.1m/10g，以小鼠翻正反射消失达1min以上作为入睡判断标准，观察给戊巴比妥钠30min内给药组动物与空白组比较发生睡眠的个数，结果见表8。
表8.本发明中药组合物对小鼠阈下剂量戊巴比妥钠催眠作用的影响
*代表与空白对照组比较睡眠时间具有显著性差异，p<0.05。
2.2组合物对阈剂量戊巴比妥钠催眠实验
KM小鼠ig组合物3.4g/kg，连续7d，1次/d，末次给药60min后，每只小鼠给予50mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射，注射量0.1m/10g，以小鼠翻正反射消失达1min以上作为入睡判断标准，观察给戊巴比妥钠30min内给药组动物与空白组比较发生睡眠的时间，结果见表9。
表9.本发明中药组合物对小鼠阈剂量戊巴比妥钠催眠作用的影响
*代表与空白对照组比较睡眠时间具有显著性差异，p<0.05，**代表与空白对照组比较睡眠时间具有显著性差异p<0.01。
从表8、9可知，*代表*代表与空白对照组比较睡眠时间具有显著性差异，p<0.05，**代表与空白对照组比较睡眠时间具有显著性差异p<0.01。组合物0.85g/kg，3.4g/kg组能增加阈下剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠个数，并且能延长阈剂量戊巴比妥钠小鼠睡眠时间，推测本发明中药组合物可改善围绝经期女性失眠症状。
实施例5(组合物雌激素样作用实验研究)
5.1实验材料
5.1.1受试动物：KM种小鼠，♀，21日龄，体重12～14g(购自中科院动物所)。
5.1.2受试药物及其制备：
杜仲粉末混旋液：杜仲1.67g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
补骨脂混旋液：补骨脂0.835g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
杜仲补骨脂混旋液：杜仲1.67g、补骨脂0.835g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
杜仲核桃仁混旋液：杜仲1.67g、核桃仁0.53g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
杜仲大蒜混旋液：杜仲1.67g、大蒜0.415g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
补骨脂核桃仁混旋液：补骨脂0.835g、核桃仁0.53g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
补骨脂大蒜混旋液：补骨脂0.835g、大蒜0.415g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
杜仲补骨脂核桃仁混旋液：杜仲1.67g、补骨脂0.835g、核桃仁0.53g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
杜仲补骨脂大蒜混旋液：杜仲1.67g、补骨脂0.835g、大蒜0.415g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
青娥方混旋液：杜仲1.67g补骨脂0.835g核桃仁0.53g大蒜0.415g粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
表10.本发明中药组合物拆方对未成熟小鼠子宫影响
*代表P<0.05，与其它给药组比较子宫指数，子宫水摄取增加百分率具有显著性差异。
由表10可知，杜仲混旋液组、补骨脂混旋液组、杜仲大蒜混旋液、补骨脂核桃仁混旋液、补骨脂大蒜混旋液、杜仲补骨脂核桃仁混旋液、杜仲补骨脂大蒜混旋液、杜仲补骨脂核桃仁大蒜全粉混旋液组子宫重量与空白对照组比较有显著性差异，此药物组合物中以上任意组合均具有雌激素样作用。。
实施例6(组合物水提液、青娥方95％醇提液、青娥方乙酸乙酯提取液、青娥方120#汽油提取物、青娥方人工胃肠液提取物雌激素样作用实验研究)
6.1实验材料
6.1.1实验动物：KM种小鼠，♀，21日龄，购自中国科学院动物所。
6.1.2受试药物：
组合物水提液：杜仲16.7g、补骨脂8.35g、炒核桃仁5.3g、干大蒜粉1.47g，加6倍量的水，回流提取1h，提取3次，过滤合并滤液，回收水使成浓度0.34g/ml。
组合物95％醇提液：杜仲16.7g、补骨脂8.35g、炒核桃仁5.3g、干大蒜粉1.47g，加6倍量的95％乙醇，回流提取1h，提取3次，过滤合并滤液，回收乙醇使成浓度0.34g/ml。
组合物乙酸乙酯提取液：杜仲16.7g、补骨脂8.35g、炒核桃仁5.3g、干大蒜粉1.47g，加6倍量的乙酸乙酯，回流提取1h，提取3次，过滤合并滤液，回收乙酸乙酯使成浓度0.34g/ml。
组合物120#汽油提取物：杜仲16.7g、补骨脂8.35g、炒核桃仁5.3g、干大蒜粉1.47g，加6倍量的120#汽油，回流提取1h，提取3次，过滤合并滤液，回收120#汽油使成浓度0.34g/ml。
组合物人工胃肠液提取物：杜仲16.7g、补骨脂8.35g、炒核桃仁5.3g、干大蒜粉1.47g，加6倍量的人工胃液，在摇床(模拟胃肠蠕动)摇动4h，将滤液和药渣放入6倍量的在人工肠液，在摇床上摇动4h，收集肠液，回收使之浓度0.34g/ml。
组合物全粉混旋液：杜仲167g、补骨脂0.835g、核桃仁0.53g、干大蒜粉1.47g，粉碎过150目筛混旋于25ml蒸馏水。
6.1.2实验方法
取未成熟的21日龄雌性小鼠，分别为空白对照组：ig蒸馏水，水提物组：ig组合物水提物；95％醇提物组：ig95％醇提物；乙酸乙酯组：ig乙酸乙酯提取物；120#汽油提取物脂组：ig120#汽油提取物；人工胃肠液提取物：ig人工胃肠液提取物；青娥方粉末组：ig粉末混旋液。阳性对照组：ig尼尔雌醇(0.02mg/只)。每日1次，连续给药5天，脱颈椎处死，剖开腹腔，以剪刀摘取子宫及阴道，放于滤纸上，除去脂肪组织、卵巢及阴道，迅速称其湿重，计算子宫重量百分率。结果见表11。
表11.本发明中药组合物提取物对未成熟小鼠子宫重量影响
*代表与蒸馏水组比较p<0.05，**代表与蒸馏水组比较p<0.01，***代表与蒸馏水组比较p<0.001，▲▲代表与水提物组比较p<0.01，▲▲▲代表与水提物组比较p<0.001
从表11可知，组合物水提液、组合物95％醇提液、组合物乙酸乙酯提取液、组合物120#汽油提取物组均能使未成熟小鼠子宫重量增加，与空白组比较有显著性差异，其中95％醇提液、120#汽油提取物组与水提物子宫重量比较具有显著性差异。其中以组合物全粉混旋液效果最佳。
实施例7(组合物体外雌激素样作用)
7.1组合物95％醇提物对MCF-7细胞增殖作用
MCF-7细胞是ER+雌激素依赖性细胞，雌激素可以促进其增殖。因此发明人研究上述化合物对MCF-7细胞的作用，以探讨这些化合物的雌激素样作用。
7.1.1实验材料
7.1.1.1细胞株来源：人乳腺癌细胞株MCF-7来源于ATCC
7.1.1.2主要试剂：雌二醇(E2)，购自Sigma公司；ICI182，780，购自Sigma公司；DMEM，购自Gibco公司；无酚红的DMEM，购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)，购自杭州四季青公司；四氮唑蓝(MTT)，购自Amerisco公司；二甲亚砜(DMSO)，购自Gibco公司；活性炭灭活血清(Charcoal-dextran stripped human serum)，购自Biowest公司；胰蛋白酶(Trypsin)，购自Amerisco公司。
7.1.1.3药物溶液配制(组合物95％醇提液)：杜仲1.67g、补骨脂0.835g、炒核桃仁0.53g、干大蒜粉0.147g，加6倍量的95％乙醇，回流提取1h，提取3次，过滤合并滤液，回收乙醇至干。以少量DMSO溶解受试物，配成10mg/ml溶液(贮备液)置—20℃冰箱保存，用时稀释至所需浓度。
7.1.1.4主要仪器设备：层流超净台；二氧化碳培养箱，购自Thermo公司；倒置相差显微镜，购自Olympus公司；酶标仪，购自Biotek公司。
7.1.2实验方法
细胞增殖实验(MTT)：用0.25％胰酶消化细胞，1000rpm离心，用含5％活性炭灭活血清，无酚红的DMEM高糖培养液37℃，95％CO2培养48h(以排除内源激素的干扰)，即细胞进入对数生长期，用用0.25％胰酶消化细胞，以2 x 103个/孔接种细胞于96孔培养板上，每孔体积180μl，24h细胞贴壁，每列设5个复孔，分别设溶剂对照、雌二醇阳性对照、实验药物组，加药后继续观察培养48h。
呈色与比色：在加药培养48h后，取出培养板，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃，95％CO2继续培养4h中止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μlDMSO振荡10min，使结晶物充分溶解，选择490nm在自动酶标仪(BIO-TEK)上测定各孔光吸收值(OD，与活细胞数量成正比)。实验结果见表12。
PR％＝实验组OD值 x 100/溶剂组OD值
表12.MTT法检测本发明中药组合物95％乙醇提取物对MCF-7细胞增殖的影响
**代表与溶剂对照组比较P<0.01，*代表代表与溶剂对照组比较P<0.05。
从表12可知，组合物95％醇提物0.1mg/ml、0.01mg/ml均能显著促进雌激素依赖的MCF-7细胞增殖，表现为雌激素样作用。
7.2组合物95％醇提物对转染ERE(cstrogen rcsponse element)报告基因的MCF-7细胞荧光素酶表达的影响。
雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-Luc是将人雌激素反应元件(estrogenresponse element，ERE)核心片段插入pGI3-promoter质粒，将质粒转染入雌激素受体ER阳性的MCF-7细胞，雌激素和雌激素受体结合，雌激素—受体复合物进入细胞核内实现二聚化，二聚体与DNA上特异的核苷酸序列(ERE)结合，启动下游荧光素酶报告基因的表达。
7.2.1实验材料
7.2.1.1细胞株来源：转染ERE-LUC报告质粒的人乳腺癌细胞株MCF-7。
7.2.1.2主要试剂：雌二醇(E2)，购自Sigma公司；雌激素受体拮抗剂ICI182，780，(ICI)购自Sigma公司；DMEM，购自Gibco公司；无酚红的DMEM，购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)，购自杭州四季青公司；四氮唑蓝(MTT)，购自Amerisco公司；二甲亚砜(DMSO)，购自Gibco公司；活性炭灭活血清(Charcoal-dextran stripped human serum)，购自Biowest公司；胰蛋白酶(Trypsin)，购自Amerisco公司。Luciferase Assay System购自Promega公司
7.2.1.3药物溶液配置同上
7.2.1.4主要仪器设备：层流超净台；二氧化碳培养箱，购自Thermo公司；倒置相差显微镜，购自Olympus公司；酶标仪，购自Biotek公司。
7.2.2实验方法
药物溶液配置同上
用0.25％胰酶消化细胞，1000rpm离心，用含5％活性炭灭活血清，无酚红的DMEM高糖培养液37℃，95％CO2培养48h(以排除内源激素的干扰)，即细胞进入对数生长期，用用0.25％胰酶消化细胞，以5 x 103个/孔接种细胞于96孔培养板上，每孔体积180μl，24h细胞贴壁，每列设5个复孔，分别设溶剂对照、雌二醇阳性对照、实验药物组，加药后继续观察培养48h。将含药培液吸弃，加PBS洗2次，每孔加入20μl裂解液，裂解20min后，吸出裂解液加入单荧光素酶报告基因检测液，Bio-tek酶标仪检测荧光监测器检测荧光素酶强度。实验结果见表13。
表13..本发明中药组合物95％醇提物对转染ERE报告基因的MCF-7细胞荧光素酶表达的影响。
**代表与溶剂对照组比较P<0.01，*代表代表与溶剂对照组比较P<0.05。
表13可知，组合物95％醇提物0.1mg/ml、0.01mg/ml均能显著促进转染ERE报告基因的MCF-7细胞荧光素酶表达，与空白对照组比较有显著性差异。当加入雌激素受体阻断剂时荧光素酶荧光强度显著下降；提示组合物雌激素受体结合，雌激素—受体复合物进入细胞核内实现二聚化，二聚体与DNA上特异的核苷酸序列(ERE)结合，诱导或抑制有关调节细胞生长和发育的靶基因的转录，启动一系列激素依赖性生理生化过程。
8.1药物组合物中活性成分的雌激素样作用(体外实验-ESCREEN法)
通过整体动物实验发现组合物中杜仲、补骨脂在方中发挥雌激素样作用，发明人从补骨脂的70％乙醇提取物中分离得到补骨脂素、异补骨脂素(香豆素类)；补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、补骨脂查耳酮、补骨脂异查耳酮(黄酮类)；从杜仲70％乙醇提取物中分离得到松脂醇二葡萄糖苷(木质素类)水提取物中分离得到杜仲醇。MCF-7细胞是ER+雌激素依赖性细胞，雌激素可以促进其增殖。因此发明人研究上述化合物对MCF-7细胞的作用，以探讨这些化合物的雌激素样作用。
8.1.1实验材料
8.1.1.1细胞株来源：人乳腺癌细胞株MCF-7来源于ATCC
8.1.1.2主要试剂：雌二醇(E2)，购自Sigma公司；ICI182，780，购自Sigma公司；DMEM，购自Gibco公司；无酚红的DMEM，购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)，购自杭州四季青公司；四氮唑蓝(MTT)，购自Amerisco公司；二甲亚砜(DMSO)，购自Gibco公司；活性炭灭活血清(Charcoal-dextran stripped human serum)，购自Biowest公司；胰蛋白酶(Trypsin)，购自Amerisco公司。
8.1.1.3主要仪器设备：层流超净台；二氧化碳培养箱，购自Thermo公司；倒置相差显微镜，购自Olympus公司；酶标仪，购自Biotek公司。
8.1.2实验方法
药物溶液配制：以少量DMSO溶解受试物，配成1mM溶液(贮备液)置—20℃冰箱保存，用时稀释至所需浓度。
细胞增殖实验(MTT)：用0.25％胰酶消化细胞，1000rpm离心，用含5％活性炭灭活血清，无酚红的DMEM高糖培养液37℃，95％CO2培养48h(以排除内源激素的干扰)，即细胞进入对数生长期，用用0.25％胰酶消化细胞，以2 x 103个/孔接种细胞于96孔培养板上，每孔体积180μl，24h细胞贴壁，每列设5个复孔，分别设溶剂对照、雌二醇阳性对照、实验药物组，加药后继续观察培养48h。
呈色与比色：在加药培养48h后，取出培养板，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，37℃，95％CO2继续培养4h中止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO振荡10min，使结晶物充分溶解，选择490nm在自动酶标仪(BIO-TEK)上测定各孔光吸收值(OD，与活细胞数量成正比)。实验结果见表14。
表14.MTT法检测本发明中药组合物化合物对MCF-7细胞增殖的影响
**代表与溶剂对照组比较P<0.01，*代表代表与溶剂对照组比较P<0.05。
从表11可知，补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、补骨脂查耳酮、补骨脂异查耳酮；松脂醇二葡萄糖苷、杜仲醇不同浓度均能显著促进雌激素依赖的MCF-7细胞增殖，表现为雌激素样作用。
8.2药物组合物中活性成分的对ER-的MD-MB-231细胞增殖作用
MD-MB-231细胞是ER-的乳腺癌细胞，发明者通过观察组合物中各化合物对其增殖作用来探讨各化合物促进MCF-7细胞的增殖，是否通过ER通路。
8.2.1实验方法同上
8.2.1.1细胞株来源：人乳腺癌细胞株MD-MB-231来源于ATCC
8.3结果
表15.MTT法检测本发明中药组合物化合物对MDA-MB-231细胞增殖的影响
*代表与溶剂对照组比较有显著性差异，p<0.05。
从表15可知，补骨脂查耳酮、补骨脂异查耳酮100μM浓度均能显著促进MDA-MB-231细胞的增殖，而其它化合物不能促进MDA-MB-231细胞的增殖，推测补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、松脂醇二葡萄糖苷、杜仲醇促进雌激素依赖的MCF-7细胞增殖，说明ER通路是其促进细胞增殖通路之一。
8.3药物组合物中活性成分的雌激素样作用对转染ERE(estrogen response element)报告基因的MCF-7细胞荧光素酶表达的影响。
雌激素反应元件调控的报告质粒pERE-Luc是将人雌激素反应元件(estrogenresponse element，ERE)核心片段插入pGI3-promoter质粒，将质粒转染入雌激素受体ER阳性的MCF-7细胞，雌激素和雌激素受体结合，雌激素—受体复合物进入细胞核内实现二聚化，二聚体与DNA上特异的核苷酸序列(ERE)结合，启动下游荧光素酶报告基因的表达。
8.3.1实验材料
8.3.1.1细胞株来源：转染ERE-LUC报告质粒的人乳腺癌细胞株MCF-7。
8.3.1.2主要试剂：雌二醇(E2)，购自Sigma公司；雌激素受体拮抗剂ICI182，780，购自Sigma公司；DMEM，购自Gibco公司；无酚红的DMEM，购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)，购自杭州四季青公司；四氮唑蓝(MTT)，购自Amerisco公司；二甲亚砜(DMSO)，购自Gibco公司；活性炭灭活血清(Charcoal-dextran stripped human serum)，购自Biowest公司；胰蛋白酶(Trypsin)，购自Amerisco公司。Luciferase Assay System购自Promega公司
8.3.1.3药物溶液配置同上
8.3.1.4主要仪器设备：层流超净台；二氧化碳培养箱，购自Thermo公司；倒置相差显微镜，购自Olympus公司；酶标仪，购自Biotek公司。
8.3.2实验方法
用0.25％胰酶消化细胞，1000rpm离心，用含5％活性炭灭活血清，无酚红的DMEM高糖培养液37℃，95％CO2培养48h(以排除内源激素的干扰)，即细胞进入对数生长期，用用0.25％胰酶消化细胞，以5 x 103个/孔接种细胞于96孔培养板上，每孔体积180μl，24h细胞贴壁，每列设5个复孔，分别设溶剂对照、雌二醇阳性对照、实验药物组，加药后继续观察培养48h。将含药培液吸弃，加PBS洗2次，每孔加入20μl裂解液，裂解20min后，吸出裂解液加入单荧光素酶报告基因检测液，Bio-tek酶标仪检测荧光监测器检测荧光素酶强度。实验结果见表15。
表16.本发明中药组合物化合物对转染ERE报告基因的MCF-7细胞荧光素酶表达的影响。
**代表与溶剂对照组比较P<0.01，*代表代表与溶剂对照组比较P<0.05。
从表16可知，补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂异黄酮、补药物溶液配置同上补骨脂二氢黄酮、补骨脂查耳酮、补骨脂异查耳酮；松脂醇二葡萄糖苷、杜仲醇不同浓度均能显著促进转染ERE报告基因的MCF-7细胞荧光素酶表达，与空白对照组比较有显著性差异。当加入雌激素受体阻断剂时荧光素酶荧光强度显著下降；提示组合物雌激素受体结合，雌激素—受体复合物进入细胞核内实现二聚化，二聚体与DNA上特异的核苷酸序列(ERE)结合，诱导或抑制有关调节细胞生长和发育的靶基因的转录，启动一系列激素依赖性生理生化过程。
8.4药物组合物中活性成分的雌激素样作用(体内实验)—对未成熟小鼠子宫重量影响
8.4.1实验材料
8.4.1.1动物：KM种小鼠，♀，21日龄，购自中国科学院动物所，健康成熟KM种，♀小鼠(由中科院动物所提供)。
8.4.1.2受试药物：
补骨脂定64mg/kg：补骨脂定288mg，加入225ul DMSO溶解，加入112μl TWEEN-80超声溶解，加入蒸馏水至45ml，使成浓度为6.4mg/ml。
补骨脂异黄酮64mg/kg：配法同上。
补骨脂二氢黄酮甲醚64mg/kg：配法同上。
8.4.2实验方法
选取11-13g健康雌性21日龄小白鼠，随机分为四组，分别给以受试药物，每日灌胃(ig)1次，连续5日，未次给药后24小时称重，脱颈椎处死，剖开腹腔，以剪刀摘取子宫及阴道，放于滤纸上，除去脂肪组织、卵巢及阴道，迅速称其湿重，计算子宫重量百分率。比较各组的差异。结果见表10。
表17.组合物中活性成分对未成熟小鼠子宫重量影响
*代表与蒸馏水组比较p<0.05，***代表与蒸馏水组比较p<0.01
从表16可知，补骨脂定、补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚组均能使未成熟小鼠子宫重量增加，与空白组比较有显著性差异，其中以补骨脂二氢黄酮甲醚效果最佳。提示此三种化合物具有雌激素样作用。
8.4药物组合物中活性成分的雌激素样作用(体内实验)—对成熟去卵巢小鼠影响
8.4.1实验材料
8.4.1.1动物：KM种小鼠，♀，35日龄，购自中国科学院动物所，健康成熟KM种，♀小鼠(由中科院动物所提供)。
8.4.1.2受试药物：
补骨脂定64mg/kg：补骨脂定288mg，加入225ul DMSO(5‰)溶解，加入112μl(2.5‰)TWEEN-80超声溶解，加入蒸馏水至45ml，使成浓度为6.4mg/ml。
补骨脂定16mg/kg：配法同上。
补骨脂异黄酮64mg/kg：配法同上。
补骨脂素64mg/kg：配法同上。
补骨脂二氢黄酮甲醚64mg/kg：配法同上。
补骨脂二氢黄酮甲醚16mg/kg：配法同上。
雌二醇1mg/kg：配法同上。
8.5.2实验方法
取健康成熟雌熟小白鼠，乙醚协同乌拉坦麻醉，行双侧卵巢摘除，术后缝合，碘酒消毒创口。逐只进行阴道涂片(用滴管吸取生理盐水0.1～0.2ml，轻轻插入小鼠阴道2～3mm，抽吸2～3次，涂片，95％乙醇固定10min，美蓝溶液染色10min，用水轻轻冲洗，淋干，以备读片)，每天1次，观察阴道上皮细胞连续5天处于间情期，以证明去势成功。分为假手术组(Sham组只切除卵巢附近的脂肪，不切除卵巢)、单纯卵巢切除手术组(OVX组)、卵巢切除+补骨脂素混旋液(64mg/kg)、卵巢切除+补骨脂异黄酮混旋液(32mg/kg)、卵巢切除+补骨脂定混旋液(64mg/kg)、卵巢切除+补骨脂定混旋液(16mg/kg)、卵巢切除+补骨脂二氢黄酮甲醚混旋液(64mg/kg)、卵巢切除+补骨脂二氢黄酮甲醚混旋液(16mg/kg)、卵巢切除+补骨脂二氢黄酮甲醚混旋液(1mg/kg)。ig 1次/d，连续给药4weeks，测其子宫、肾上腺湿重；比较各组脏器指数差异。
8.5.2.1组合物对成熟去卵巢小鼠子宫肾上腺重量的影响。
结果见表18。
表18.本发明中药组合物对去卵巢小鼠子宫系数、肾上腺系数和体重的影响
***代表模型组与其它组子宫湿重比较有显著性差异p<0.0001；**代表模型组与其它组子宫湿重比较有显著性差异p<0.001；*代表模型组与其它组子宫湿重比较有显著性差异p<0.05。
▲▲▲代表高剂量组与模型组肾上腺湿重比较有显著性差异p<0.001；▲▲代表模型组与其它组子宫湿重比较有显著性差异p<0.001；▲代表模型组与其它组子宫湿重比较有显著性差异p<0.05。
由表17可知，模型对照组子宫重量与其它各给药组比较具有显著性差异，表明补骨脂定、补骨脂异黄酮、补骨脂素、补骨脂二氢黄酮甲醚组合物各剂量组均能对抗卵巢摘除后子宫萎缩；提示各化合物有弱的雌激素样作用，除补骨脂素组，且各化合物给药组肾上腺重量与模型对照组比较具有显著性差异，推测可能是机体启动下丘脑—垂体—肾上腺素轴，增强肾上腺皮质功能，因肾上腺皮质可分泌少量的雌二醇可补充去卵巢后机体雌二醇分泌的减少。
实施例9(片剂的制备)
称取杜仲480g、补骨脂240g、核桃仁150g和大蒜120g。将大蒜蒸熟，干燥。杜仲、补骨脂、核桃仁、干大蒜，打粉，过100目筛。喷入适量95％乙醇，加入17.5％微晶纤维素，其中内加7.5％微晶纤维素和20％淀粉，制成颗粒，干燥，外加10％微晶纤维素和1％的硬脂酸镁，混匀压片。
实施例10(滴丸剂的制备)
称取杜仲120g、补骨脂60g、核桃仁40g和大蒜30g。将大蒜蒸熟，干燥。杜仲、补骨脂、核桃仁、干大蒜，打粉，用95％乙醇回流提取3次，每次2h，，回收乙醇得浸膏，以PEG4000为基质，与药物的比例为1：1.5，二甲基硅油为冷凝剂，滴制。
实施例11(胶囊剂的制备)
称取杜仲120g、补骨脂60g、核桃仁40g和大蒜30g。将大蒜蒸熟，干燥。杜仲、补骨脂、核桃仁、干大蒜，打粉，用乙酸乙酯回流提取3次，每次2h，，回收乙酸乙酯得浸膏，干燥，粉碎，过100目筛，加入5％的硬脂酸镁，混匀装入硬胶囊。
Claims (9)
1、一种具有雌激素样作用的中药组合物，主要由下列质量百分比的原料药制备而成：杜仲12～64％、补骨脂6～38％。
2、根据权利要求1所述的具有雌激素样作用的中药组合物，其特征是，还包括下列质量百分比的原料药：核桃仁3～24％。
3、根据权利要求1所述的具有雌激素样作用的中药组合物，其特征是，还包括下列质量百分比的原料药：大蒜3～18％。
4、根据权利要求1所述的具有雌激素样作用的中药组合物，其特征是，还包括下列质量百分比的原料药：核桃仁3～24％、大蒜3～18％。
5、根据权利要求4中所述的具有雌激素样作用的中药组合物，其特征是，该中药组合物为水提取物、50％～95％乙醇提取物、丙酮提取物、乙酸乙酯提取物、汽油或石油醚提取物。
6、根据权利要求5中所述的具有雌激素样作用的组合物，其特征是，该中药组合物的组成为杜仲木质素类，环烯醚萜，补骨脂中香豆素类、拟雌内酯类和黄酮类。
7、根据权利要求6中所述的具有雌激素样作用的组合物，其特征是，该中药组合物的组成为杜仲木质素类中的松脂醇二葡萄糖苷，环烯醚萜中的杜仲醇，补骨脂中香豆素类的补骨脂素、异补骨脂素、拟雌内酯类的补骨脂定，黄酮类的补骨脂异黄酮，补骨脂查耳酮，补骨脂异耳酮，补骨脂二氢黄酮和补骨脂二氢黄酮甲醚。
8、根据权利要求1-7中任何一项所述的具有雌激素样作用的中药组合物，其特征是，该中药组合物为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂或口服液。
9、权利要求1-8中任何一项所述的中药组合物在制备防治雌激素缺乏引起的围绝经期综合征的药物中的应用。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090401 |