CN103118688B - 锁阳化学成分作为植物雌激素的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明一般地涉及锁阳化学成分作为植物雌激素的新用途。特别地，本发明涉及锁阳，锁阳提取物，或者至少一种选自以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病或者在制备作为植物雌激素的药物中的用途。本发明还涉及锁阳提取物，包含锁阳提取物或其活性成分的组合物，以及治疗和/或预防与雌激素分泌不足相关的疾病的方法。根据本发明，所述锁阳、锁阳提取物、或其活性成分可用于预防和/或治疗更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、心脑血管疾病、乳腺癌。

Description

锁阳化学成分作为植物雌激素的新用途
技术领域
本发明涉及传统中药材锁阳中的若干化学成分的新用途，特别是锁阳中的黄酮类化合物和蒽醌类化合物的作为植物雌激素的新用途。
背景技术
锁阳(HerbaCynomorii)为锁阳科植物锁阳(CynomoriumsongaricumRupr.)的干燥肉质茎。锁阳味甘性温，归肝、肾、大肠经，是一种十分奇特的天然沙生珍稀植物。具有补肾阳，益精血，润肠通便的功效，主治阳痿遗精、腰膝酸软、肠燥便秘、血枯、尿血、神经衰弱等症。锁阳的化学成分研究表明，锁阳含有黄酮类、三萜类、糖和糖苷类、鞣质、甾体类、挥发性成分、有机酸、氨基酸、无机元素和离子等成分。其中黄酮类成分包括(+)-儿茶素、(-)-儿茶素、柑桔素4’-O-吡喃葡糖苷、柑桔素为苷元的配糖体。
雌激素是是女性关键的调节激素，主要由卵巢和胎盘产生，雌激素按其化学结构归属为类固醇激素，呈脂溶性，其靶组织众多，包括生殖系统、骨骼、心血管等。雌激素主要分为两大类：甾体类雌激素和非甾体类雌激素。甾体类雌激素是哺乳动物体的卵巢分泌的内源性成分，目前在人体内发现的甾体类雌激素有三种：雌二醇，从孕妇尿中分离得到的雌三醇、雌酮，其中以雌二醇为主，且活性最强。甾体类雌激素在维持生命、调节性机能、对机体发育、免疫调节、皮肤病治疗及生育方面具有十分重要的作用。非甾体类雌激素主要是二苯乙烯苷类化合物。一般认为雌激素是通过和细胞内相应的雌激素受体(ER)结合，从而引发启动转录等一系列下游事件，产生生理学效应。非甾体类雌激素与雌激素受体的亲和力是雌二醇的1/100或1/1000。由于临床长期使用雌激素可造成乳腺癌、子宫内膜异位生长和致癌变等缺点，人们致力于寻求雌激素的替代物。植物雌激素(Phytoestrogen,PE)是一类广泛存在于植物中的非甾体类化合物，可与体内ER结合，流行病学研究以及动物实验已经证实植物雌激素在预防肿瘤、治疗心血管疾病和骨质疏松、改善绝经期症状等方面有着很好的预防和治疗作用，保护神经系统，且未发现有上述不良影响。因此，植物雌激素常被作为天然雌激素替代物来研究。虽然PE与雌激素受体结合的能力只是雌激素的1/500-1/1000，但其在激素替代疗法(HRT)中副作用小，因而研究者对此产生了巨大的兴趣并希望PE在HRT中发挥潜在的医疗价值。
雌激素在机体的生长、发育、细胞分化及生殖系统中具有广泛的生理作用。雌激素主要通过ER发挥各种生物效应，ER有两种亚型，ERα和ERβ，其在人体许多组织和细胞中的表达是不同的，两种亚型在同一组织细胞中的表达水平存在差异，同种亚型在不同组织细胞中的表达水平也存在差异，因此任何配体与ERα和ERβ的相互作用所表现的效应是错综复杂的。ERα和ERβ的组织分布有差异性，其中在子宫、乳腺、输卵管、阴道上皮以表达ERα为主，ERβ表达微弱，而卵巢以表达ERβ占优势，大部分存在于颗粒细胞，血管平滑肌细胞以表达ERβ为主。
妇女到更年期后因为卵巢不断衰竭，雌激素分泌减少，由雌激素介导的各种生理过程都受到影响，产生心悸、胸闷、忧虑、抑郁、易激动、失眠、记忆力减退等生理和心理症状，这些症状统称为更年期综合征；由于雌激素分泌减少的影响造成的骨质疏松症称为退行性骨质疏松症。为了治疗和/或预防上述病症，一种有益的方法就是补充雌激素。但是，多年来的临床实践发现，长期服用雌激素会大大增加乳腺癌发病的风险。因此，寻找具有雌激素活性和/或没有雌激素副作用的植物雌激素，为临床提供新的治疗选择，仍是本领域技术人员期待的。
发明内容
本发明的目的是寻找具有雌激素活性和/或没有雌激素副作用的植物雌激素，为临床提供新的治疗选择。本发明人令人惊奇地发现，从中药材锁阳中提取到的部分化学成分例如黄酮类和蒽醌类化合物具有确切的雌激素活性，可作为植物雌激素用于雌激素的替代治疗。本发明基于上述发现而得以完成。
发明概述
本发明第一方面提供了锁阳在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。
本发明第二方面提供一种锁阳提取物，其中包含至少一种选自以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
本发明第三方面提供了可得自锁阳的一种或多种选自下列的活性成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
本发明第四方面提供了锁阳提取物在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。
本发明第五方面提供了选自下列成分的一种或多种的组合在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
本发明第六方面提供了锁阳在制备作为植物雌激素的药物中的用途。
本发明第七方面提供了锁阳提取物在制备作为植物雌激素的药物中的用途。
本发明第八方面提供了选自下列成分的一种或多种的组合在制备作为植物雌激素的药物中的用途：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
本发明第九方面提供了一种用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物组合物，其中包含治疗和/或预防有效量的锁阳提取物以及任选的药学可接受的赋形剂。
本发明第十方面提供了一种用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物组合物，其中包含治疗和/或预防有效量的至少一种药物活性成分以及任选的药学可接受的赋形剂，所述的药物活性成分选自：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
本发明第十一方面提供了在有需要的受试者中治疗和/或预防与雌激素分泌不足相关的疾病的方法，其包括给所述受试者施用预防和/或治疗有效量的锁阳，锁阳提取物，或者至少一种选自下列的活性成分选自：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
发明详述
本发明第一方面提供了锁阳在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的与雌激素分泌不足相关的疾病选自：更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、心脑血管疾病、乳腺癌。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述药物的剂量为所述哺乳动物每天每kg体重相当于锁阳药材0.01-10g，优选0.02-5g，更优选0.05-1g，再更优选0.05-0.5g。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材的提取物。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的药物包含锁阳药材以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为提取溶剂的提取物。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的药物包含锁阳药材的提取物，该提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取获得的。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述的药物包含锁阳药材的提取物，该提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分、氯仿萃取部分、乙酸乙酯萃取部分、或其混合物。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分、氯仿萃取部分、和乙酸乙酯萃取部分的混合物。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的氯仿萃取部分和乙酸乙酯萃取部分的混合物。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯萃取部分。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯萃取部分和石油醚萃取部分的混合物。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材的提取物，该提取物中包含至少一种选自以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述提取物中包含以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材的提取物，该提取物中包含至少一种选自以下的成分：儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述提取物中包含以下的成分：儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯萃取部分。
根据本发明第一方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材的提取物，该锁阳的提取物是经如下步骤制备的：将锁阳用含水乙醇溶液(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)提取；使所得醇提取物用石油醚萃取，浓缩醚层得石油醚部分；将石油醚萃取的残余物用氯仿萃取，浓缩氯仿层得氯仿部分；将氯仿萃取的残余物用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得乙酸乙酯部分；将乙酸乙酯萃取的残余物用正丁醇萃取，浓缩正丁醇层得正丁醇部分；将上述石油醚部分、氯仿部分和乙酸乙酯部分合并，得到提取物。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、氯仿部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述氯仿部分、乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述乙酸乙酯部分。
本发明第二方面提供一种锁阳提取物，其中包含至少一种选自以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述锁阳提取物中包含大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述锁阳提取物中包含至少一种选自以下的成分：儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述锁阳提取物中包含儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第二方面任一项的锁阳提取物，其中所述大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷的总量占所述提取物总重量的1-90%(w/w)，优选1～80%(w/w)，优选2～50%(w/w)，优选2～40%(w/w)，优选2～30%(w/w)，更优选2～20%(w/w)。
根据本发明第二方面任一项的锁阳提取物，其是锁阳药材以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为提取溶剂的提取物。
根据本发明第二方面任一项的锁阳提取物，其是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取获得的。
根据本发明第二方面任一项的锁阳提取物，其是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分、氯仿萃取部分、乙酸乙酯萃取部分、或其混合物。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分、氯仿萃取部分、和乙酸乙酯萃取部分的混合物。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的氯仿萃取部分和乙酸乙酯萃取部分的混合物。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯萃取部分。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯萃取部分和石油醚萃取部分的混合物。根据本发明的任一方面，所述提取物是乙酸乙酯萃取部分，并且其中包含儿茶素、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、根皮苷。根据本发明的任一方面，所述提取物是石油醚萃取部分，并且其中包含大黄酚。根据本发明的任一方面，所述提取物是乙酸乙酯萃取部分和石油醚萃取部分的混合物，并且其中包含儿茶素、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、根皮苷、大黄酚。根据本发明的任一方面，所述提取物是乙酸乙酯萃取部分、石油醚萃取部分、或者乙酸乙酯萃取部分和石油醚萃取部分的混合物，并且该提取物中包含至少一种选自以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。根据本发明的任一方面，所述提取物是乙酸乙酯萃取部分、石油醚萃取部分、或者乙酸乙酯萃取部分和石油醚萃取部分的混合物，并且该提取物中包含至少一种选自以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷，所述大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷和根皮苷的总量占所述提取物总重量的1-90%(w/w)，优选1～80%(w/w)，优选2～50%(w/w)，优选2～40%(w/w)，优选2～30%(w/w)，更优选2～20%(w/w)。
根据本发明第二方面任一项的锁阳提取物，其是经如下步骤制备的：将锁阳用含水乙醇溶液(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)提取；使所得醇提取物用石油醚萃取，浓缩醚层得石油醚部分；将石油醚萃取的残余物用氯仿萃取，浓缩氯仿层得氯仿部分；将氯仿萃取的残余物用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得乙酸乙酯部分；将乙酸乙酯萃取的残余物用正丁醇萃取，浓缩正丁醇层得正丁醇部分；将上述石油醚部分、氯仿部分和乙酸乙酯部分合并，得到提取物。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、氯仿部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述氯仿部分、乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述乙酸乙酯部分。
根据本发明第二方面任一项的锁阳提取物，其是经如下步骤制备的：a)将锁阳用2～20倍量(优选5～15倍量，更优选8～12倍量，例如10倍量)的60～98%(优选70～98%，更优选80～98%，例如80%、85%、90%、95%或98%)乙醇浸泡5～24小时(优选5～18小时，更优选8～15小时)；b)回流提取0.5～10小时(优选0.5～8小时，更优选0.5～6小时，更优选0.5～4小时，更优选1～4小时，例如1小时、2小时、3小时、4小时)，倾出提取液；c)任选地使步骤b)的药渣重复进行步骤a)和步骤b)1～3次(例如1次、2次、3次)；d)合并步骤b)和步骤c)的提取液，过滤，滤液回收乙醇，得浓缩液；e)使步骤d)的浓缩液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将各萃取物分别回收溶剂后得固形物，合并石油醚部分、氯仿部分、和乙酸乙酯部分中任一种或多种的固形物，得提取物。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、氯仿部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述氯仿部分、乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述乙酸乙酯部分。
本发明第三方面提供了可得自锁阳的包含一种或多种选自下列的活性成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述锁阳活性成分可用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病。在一个实施方案中，所述大黄酚可用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病。在一个实施方案中，所述大黄素可用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病。在一个实施方案中，所述儿茶素可用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病。在一个实施方案中，所述(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯可用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病。在一个实施方案中，所述柑桔素-4′-O-葡萄糖苷可用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病。在一个实施方案中，所述根皮苷可用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病。
根据本发明第三方面任一项的活性成分，其中下列成分的一种或多种的组合是从锁阳中提取得到：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第三方面任一项的活性成分，其中从锁阳中提取大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷的步骤如下：
将锁阳用含水乙醇溶液(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)提取；
使所得醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将各萃取物分别回收溶剂后得各萃取溶剂部分的固形物；
石油醚部分经硅胶柱层析，采取石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱，3～4流份经过石油醚重结晶处理，得到大黄酚；
氯仿部分经过硅胶柱层析，采取石油醚-丙酮溶剂系统梯度洗脱，19～32流份通过羟丙基葡聚糖凝胶及氯仿-甲醇溶剂系统反复硅胶柱层析后，得到大黄素；
乙酸乙酯部分经过硅胶柱层析，采取氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，得到的乙酸乙酯部分27～42流份、和乙酸乙酯部分43～64流份；
该乙酸乙酯部分27～42流份经过硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇-水溶剂系统梯度洗脱，分别得到27～42-4～6流份(即上一步骤的乙酸乙酯部分27～42流份经硅胶柱层析后得到的4～6流份，本文其它地方出现类似表述具有类似含义)、27～42-7～10流份、27～42-11～14流份；
所述27～42-4～6流份经石油醚-乙酸乙酯溶剂系统硅胶柱层析，得到儿茶素；
所述27～42-7～10流份经过硅胶柱层析以及反相硅胶柱层析处理，得到柑桔素-4′-O-葡萄糖苷；
所述27～42-11～14流份经过羟丙基葡聚糖凝胶及反相硅胶柱层析，得到(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯；
所述乙酸乙酯部分43～64流份通过氯仿-甲醇溶剂系统进行聚酰胺以及硅胶柱层析并结合羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，得到根皮苷。
本发明第四方面提供了锁阳提取物在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述的与雌激素分泌不足相关的疾病选自：更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、心脑血管疾病、乳腺癌。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物的剂量为所述哺乳动物每天每kg体重相当于锁阳药材0.01-10g，优选0.02-5g，更优选0.05-1g，再更优选0.05-0.5g。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物中包含至少一种选自以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷的总量占所述提取物总重量的1-90%(w/w)，优选1～80%(w/w)，优选2～50%(w/w)，优选2～40%(w/w)，优选2～30%(w/w)，更优选2～20%(w/w)。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物中包含至少一种选自以下的成分：儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，其中所述儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷的总量占所述提取物总重量的1-90%(w/w)，优选1～80%(w/w)，优选2～50%(w/w)，优选2～40%(w/w)，优选2～30%(w/w)，更优选2～20%(w/w)。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述的提取物是锁阳药材以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为提取溶剂的提取物。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取获得的。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分、氯仿萃取部分、乙酸乙酯萃取部分、或其混合物。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分、氯仿萃取部分、和乙酸乙酯萃取部分的混合物。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的氯仿萃取部分和乙酸乙酯萃取部分的混合物。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯萃取部分。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯萃取部分和石油醚萃取部分的混合物。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物中包含至少一种选自以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述提取物中包含以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述提取物中包含至少一种选自以下的成分：儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述提取物中包含以下的成分：儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯萃取部分。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述的锁阳提取物是经如下步骤制备的：将锁阳用含水乙醇溶液(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)提取；使所得醇提取物用石油醚萃取，浓缩醚层得石油醚部分；将石油醚萃取的残余物用氯仿萃取，浓缩氯仿层得氯仿部分；将氯仿萃取的残余物用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得乙酸乙酯部分；将乙酸乙酯萃取的残余物用正丁醇萃取，浓缩正丁醇层得正丁醇部分；将上述石油醚部分、氯仿部分和乙酸乙酯部分合并，得到提取物。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、氯仿部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述氯仿部分、乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述乙酸乙酯部分。
根据本发明第四方面任一项的用途，其中所述的锁阳提取物是经如下步骤制备的：a)将锁阳用2～20倍量(优选5～15倍量，更优选8～12倍量，例如10倍量)的60～98%(优选70～98%，更优选80～98%，例如80%、85%、90%、95%或98%)乙醇浸泡5～24小时(优选5～18小时，更优选8～15小时)；b)回流提取0.5～10小时(优选0.5～8小时，更优选0.5～6小时，更优选0.5～4小时，更优选1～4小时，例如1小时、2小时、3小时、4小时)，倾出提取液；c)任选地使步骤b)的药渣重复进行步骤a)和步骤b)1～3次(例如1次、2次、3次)；d)合并步骤b)和步骤c)的提取液，过滤，滤液回收乙醇，得浓缩液；e)使步骤d)的浓缩液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将各萃取物分别回收溶剂后得固形物，合并石油醚部分、氯仿部分、和乙酸乙酯部分中任一种或多种的固形物，得提取物。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、氯仿部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述氯仿部分、乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述乙酸乙酯部分。
本发明第五方面提供了选自下列成分的一种或多种的组合在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，提供了大黄酚在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，提供了大黄素在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，提供了儿茶素在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，提供了(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，提供了柑桔素-4′-O-葡萄糖苷在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，提供了根皮苷在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。在一个实施方案中，提供了选自下列成分的一种或多种的组合在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途：儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第五方面任一项的用途，其中所述的与雌激素分泌不足相关的疾病选自：更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、心脑血管疾病、乳腺癌。
根据本发明第五方面任一项的用途，其为下列成分在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第五方面任一项的用途，其中下列成分的一种或多种的组合是从锁阳中提取得到：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第五方面任一项的用途，其中从锁阳中提取大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷的步骤如下：
将锁阳用含水乙醇溶液(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)提取；
使所得醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，将各萃取物分别回收溶剂后得各萃取溶剂部分的固形物；
石油醚部分经硅胶柱层析，采取石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱，3～4流份经过石油醚重结晶处理，得到大黄酚；
氯仿部分经过硅胶柱层析，采取石油醚-丙酮溶剂系统梯度洗脱，19～32流份通过羟丙基葡聚糖凝胶及氯仿-甲醇溶剂系统反复硅胶柱层析后，得到大黄素；
乙酸乙酯部分经过硅胶柱层析，采取氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，得到的乙酸乙酯部分27～42流份、和乙酸乙酯部分43～64流份；
该乙酸乙酯部分27～42流份经过硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇-水溶剂系统梯度洗脱，分别得到27～42-4～6流份(即上一步骤的乙酸乙酯部分27～42流份经硅胶柱层析后得到的4～6流份，本文其它地方出现类似表述具有类似含义)、27～42-7～10流份、27～42-11～14流份；
所述27～42-4～6流份经石油醚-乙酸乙酯溶剂系统硅胶柱层析，得到儿茶素；
所述27～42-7～10流份经过硅胶柱层析以及反相硅胶柱层析处理，得到柑桔素-4′-O-葡萄糖苷；
所述27～42-11～14流份经过羟丙基葡聚糖凝胶及反相硅胶柱层析，得到(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯；
所述乙酸乙酯部分43～64流份通过氯仿-甲醇溶剂系统进行聚酰胺以及硅胶柱层析并结合羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，得到根皮苷。
本发明第六方面提供了锁阳在制备作为植物雌激素的药物中的用途。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述的药物可用于治疗和/或预防更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、心脑血管疾病、乳腺癌。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述药物的剂量为所述哺乳动物每天每kg体重相当于锁阳药材0.01-10g，优选0.02-5g，更优选0.05-1g，再更优选0.05-0.5g。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材的提取物。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述的药物包含锁阳药材以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为提取溶剂的提取物。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述的药物包含锁阳药材的提取物，该提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取获得的。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述的药物包含锁阳药材的提取物，该提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分、氯仿萃取部分、乙酸乙酯萃取部分、或其混合物。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分、氯仿萃取部分、和乙酸乙酯萃取部分的混合物。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的氯仿萃取部分和乙酸乙酯萃取部分的混合物。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯萃取部分。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯萃取部分和石油醚萃取部分的混合物。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材的提取物，该提取物中包含至少一种选自以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述提取物中包含以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材的提取物，该提取物中包含至少一种选自以下的成分：儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述提取物中包含以下的成分：儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述提取物是以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的乙酸乙酯萃取部分。
根据本发明第六方面任一项的用途，其中所述药物包含锁阳药材的提取物，该锁阳的提取物是经如下步骤制备的：将锁阳用含水乙醇溶液(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)提取；使所得醇提取物用石油醚萃取，浓缩醚层得石油醚部分；将石油醚萃取的残余物用氯仿萃取，浓缩氯仿层得氯仿部分；将氯仿萃取的残余物用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得乙酸乙酯部分；将乙酸乙酯萃取的残余物用正丁醇萃取，浓缩正丁醇层得正丁醇部分；将上述石油醚部分、氯仿部分和乙酸乙酯部分合并，得到提取物。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、氯仿部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述氯仿部分、乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述石油醚部分、乙酸乙酯部分合并得到的。在一个实施方案中，所述锁阳提取物是上述乙酸乙酯部分。
在本发明第六方面任一项所述用途的一个实施方案中，所述提取物具有本发明第一方面、第二方面或第三方面任一项中所述提取物的特征。
本发明第七方面提供了锁阳提取物在制备作为植物雌激素的药物中的用途。
根据本发明第七方面任一项的用途，其中所述的药物可用于治疗和/或预防更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、心脑血管疾病、乳腺癌。
根据本发明第七方面任一项的用途，其中所述药物的剂量为所述哺乳动物每天每kg体重相当于锁阳药材0.01-10g，优选0.02-5g，更优选0.05-1g，再更优选0.05-0.5g。
根据本发明第七方面任一项的用途，其中所述提取物具有本发明第二方面任一项所述提取物的特征。
本发明第八方面提供了选自下列成分的一种或多种的组合在制备作为植物雌激素的药物中的用途：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第八方面任一项的用途，其中所述的药物可用于治疗和/或预防更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、心脑血管疾病、乳腺癌。
根据本发明第八方面任一项的用途，其为下列成分在制备作为植物雌激素的药物中的用途：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第八方面任一项的用途，其中所述大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷各自独立地具有本发明第三方面任一项所述的特征。
本发明第九方面提供了一种用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物组合物，其中包含治疗和/或预防有效量的锁阳提取物以及任选的药学可接受的赋形剂。
根据本发明第九方面任一项的药物组合物，其中所述的锁阳提取物中包含至少一种选自以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第九方面任一项的药物组合物，其中所述的锁阳提取物中包含以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第九方面任一项的药物组合物，其中所述大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷的总量占所述提取物总重量的1-90%(w/w)，优选1～80%(w/w)，优选2～50%(w/w)，优选2～40%(w/w)，优选2～30%(w/w)，更优选2～20%(w/w)。
根据本发明第九方面任一项的药物组合物，其中所述的药物组合物给予所述哺乳动物的剂量为所述哺乳动物每天每kg体重相当于锁阳药材0.01-10g，优选0.02-5g，更优选0.05-1g，再更优选0.05-0.5g。
根据本发明第九方面任一项的药物组合物，其中所述的锁阳提取物是经如下步骤制备的：以水、醇(例如乙醇)、或水-醇(例如乙醇)混合物(例如50-98%乙醇，例如60%乙醇、95%乙醇)为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到的石油醚萃取部分、氯仿萃取部分、乙酸乙酯萃取部分、或其混合物。
根据本发明第九方面任一项的药物组合物，其中所述锁阳提取物具有本发明第二方面任一项所述提取物的特征。
本发明第十方面提供了一种用于治疗和/或预防与哺乳动物(例如，人)雌激素分泌不足相关的疾病的药物组合物，其中包含治疗和/或预防有效量的至少一种药物活性成分以及任选的药学可接受的赋形剂，所述的药物活性成分选自：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。
根据本发明第十方面任一项的药物组合物，其中包含治疗和/或预防有效量的大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷，以及任选的药学可接受的赋形剂。
根据本发明第十方面任一项的药物组合物，其中包含治疗和/或预防有效量的儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷，以及任选的药学可接受的赋形剂。
根据本发明第十方面任一项的药物组合物，其中所述大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷各自独立地具有本发明第三方面任一项所述的特征。
本发明第十一方面提供了在有需要的受试者中治疗和/或预防与雌激素分泌不足相关的疾病的方法，其包括给所述受试者施用预防和/或治疗有效量的锁阳。在一个实施方案中，所述锁阳是以药物的形式给所述受试者施用的。在一个实施方案中，所述药物具有本发明第一方面任一项所述的特征。
本发明第十一方面还提供了在有需要的受试者中治疗和/或预防与雌激素分泌不足相关的疾病的方法，其包括给所述受试者施用预防和/或治疗有效量的本发明第二方面任一项所述锁阳提取物。
本发明第十一方面还提供了在有需要的受试者中治疗和/或预防与雌激素分泌不足相关的疾病的方法，其包括给所述受试者施用预防和/或治疗有效量的至少一种选自下列的活性成分选自：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷。在一个实施方案中，所述大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷各自独立地具有本发明第三方面任一项所述的特征。
根据本发明第十一方面任一项的方法，其中所述的与雌激素分泌不足相关的疾病选自：更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、心脑血管疾病、乳腺癌。
本发明任一方面或该任一方面的任一项所具有的特征同样适用于其它任一方面或该其它任一方面的任一项，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。在本发明中，例如，提及“本发明第一方面任一项”时，该“任一项”是指本发明第一方面的任一子方面；在其它方面以类似方式提及时，亦具有相同含义。
下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本文中使用的术语“锁阳”，符合2005年版《中华人民共和国药典一部》“锁阳”项下的规定。
本文中使用的术语“约”，其通常是指本领域允许的误差范围，例如±10%，例如±5%，例如±2%。
如本文所述的，术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
如本文所述的，术语“药物组合物”，其可以与“组合物”互换使用，并且可以指可用于在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病、病症、症状的物质。
如本文所述的，术语“受试者”或“患者”，可以指接受本发明组合物和提取物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病、病症、症状的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
如本文所述的，术语“疾病或症状”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病或症状有关。
如本文所述的，“%”，如未特别指明，对于总物料是固体时一般是指重量/重量的百分比，对于总物料是液体时一般是指重量/体积的百分比。当然，对于总物料是液体并且溶质是液体时，表征该液态溶质的百分比一般是指体积/体积的百分比。对于描述乙醇时使用的%，例如95%乙醇，其具有本领域公知的含义，例如可参见2005年版《中华人民共和国药典二部》凡例中的定义。
本文中使用的短语“与雌激素分泌不足相关的疾病”具有本领域技术人员公知的含义，并且通常是指雌性哺乳动物例如人特别是更年期的女性因雌激素分泌不足而产生的一些疾病或症状，这些疾病或症状包括但不限于更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、心脑血管疾病、乳腺癌。
如本文所述的，术语“提取物”，如未另外指明，是指锁阳的“提取物”。
如本文所述的，术语“儿茶素”，可以是指(-)儿茶素、(+)儿茶素、或者外消旋的儿茶素。
如本文所述的，术语“石油醚部分”是指一种由石油醚处理（萃取）获得的植物有效部位，亦可称为“石油醚部位”。其它类似术语例如“乙酸乙酯部分”亦具有类似含义，即例如是通过液液萃取获得的植物有效部位。
尽管本发明对所涉及的活性成分作了详细描述，本发明人仍然愿意在此强调，这些活性成分(其包括，但不限于，大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷)具有本领域技术人员已知的化学结构、物理化学性质。
根据本发明，由于大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷6种成分均具有相关的植物雌激素作用，因此这6种成分或其部分在提取物、药物、组合物等中的量(例如，各成分占总提取物、药物、组合物等重量的比率，各成分之间的比率，等等)无需作特别限定，药物的用药剂量可通过折算成锁阳药材来计算。
分离得到的一系列化合物做雌激素受体激活实验，以雌二醇为阳性对照组，大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷均显示与雌激素受体激活有关。
可采用制剂领域中的常规技术，将锁阳的单一活性成分或其组合或者含有锁阳中具有雌激素活性成分的锁阳提取物与一种或多种药学可接受的赋形剂混合，并形成所需的剂型，来制备本发明的药物组合物。
本发明药物组合物中使用的“药学可接受的赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的赋形剂。特定赋形剂的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的赋形剂包括药学领域常规的稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。
本发明的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、注射乳剂(注射用无菌粉针)等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
经研究表明，本发明所得到的化合物具有不同程度的拟雌激素作用。因此，可以预期本发明的所得到的化合物(例如大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷)或含有它的药物组合物可以用于治疗更年期综合征、乳腺癌和/或心脑血管疾病。或者，本发明所得到的可用于制备药物，该药物用于治疗更年期综合征、乳腺癌和/或心脑血管疾病。
本发明利用细胞转染及萤光素酶报告基因化学发光检测的方法，探讨锁阳中十个单体化合物对ERα和ERβ转录活性的影响，从而说明锁阳中哪些成分具有雌激素活性，同时说明其作用靶点及作用途径。结果令人惊奇的发现，四个黄酮类化合物(儿茶素、根皮苷、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷和(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯)具有强的雌激素活性，儿茶素(10-5M)和根皮苷(10-6-10-5M)均可激动ERα和ERβ转录活性，对受体亚型无明显选择性；柑桔素-4′-O-葡萄糖苷(10-9-10-5M)可剂量依赖性地激动ERα和ERβ转录活性，对于ERβ的选择性强于ERα；而(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯(10-8-10-5M)可激动ERα和ERβ，转录活性以10-7M为最强，并且对于ERα的选择性强于ERβ。黄酮类化合物的雌激素活性约是雌二醇的1/1000-1/10。锁阳中两个蒽醌类化合物，大黄酚与大黄素在高浓度10-6M能激活受体转录活性，无受体选择性，其活性约是雌二醇的1/1000-1/100。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和实验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和实验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
实施例1：锁阳中四个黄酮类化合物 和2个蒽醌类化合物的制备
1、提取物的制备
将40.0千克锁阳药材(购自内蒙古阿拉善盟)粉碎成小块，加入400升95%乙醇浸泡过夜。回流提取2小时，倾出提取液，药渣再加入400升60%乙醇回流提取2小时。提取液合并后过滤，旋蒸滤液回收乙醇。将浓缩所得残余物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别回收溶剂后得固形物。结果：石油醚部分固形物55g，氯仿部分固形物229g，乙酸乙酯部分固形物147g，正丁醇部分固形物867g。石油醚部分含大黄酚质量百分含量0.082%（W/W），氯仿部分含大黄素0.031%（W/W），乙酸乙酯部分含儿茶素质量百分含量10.84%（W/W），乙酸乙酯部分含柑桔素-4′-O-葡萄糖苷质量百分含量0.304%（W/W），乙酸乙酯部分含(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯质量百分含量0.88%（W/W），乙酸乙酯部分含根皮苷质量百分含量0.28%（W/W）。
2、活性成分单体的制备
锁阳石油醚部分55g，通过硅胶柱层析，采取石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度洗脱，3～4流份经过石油醚重结晶处理，得到橙红色簇状结晶，30mg，经鉴定为大黄酚。
锁阳氯仿部分229g，通过硅胶柱层析，采取石油醚-丙酮溶剂系统梯度洗脱，19～32流份通过羟丙基葡聚糖凝胶及氯仿-甲醇溶剂系统反复硅胶柱层析后，得到橙红色簇状结晶35mg，经鉴定为大黄素。
锁阳乙酸乙酯部分147g，通过硅胶柱层析，采取氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，分别得到乙酸乙酯部分27～42流份和乙酸乙酯部分43～64流份。
乙酸乙酯部分27～42流份通过硅胶柱层析，采用氯仿-甲醇-水溶剂系统梯度洗脱。得到的27～42-4～6流份经石油醚-乙酸乙酯溶剂系统硅胶柱层析后，得到白色簇状结晶13g，经鉴定为儿茶素(外消旋体)。得到的27～42-7～10流份经过硅胶柱层析以及反相硅胶柱层析处理，得到白色粉末300mg，经鉴定为柑桔素-4′-O-葡萄糖苷。得到的27～42-11～14流份经过羟丙基葡聚糖凝胶及反相硅胶柱层析，得到灰白色粉末1g，经鉴定为(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯。
乙酸乙酯部分43～64流份通过氯仿-甲醇溶剂系统进行聚酰胺以及硅胶柱层析并结合羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，得到棕色针状结晶200mg，经鉴定为根皮苷。
实施例2：锁阳中6个化合物结构确证
对实施例1获得的6个化合物(即，大黄酚、大黄素、儿茶素(外消旋体)、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷)进行了结构确认(委托天津大学分析测试中心检测，500MHz核磁)。分析结果显示这些化合物的结构与文献报道的结构一致，具体如下。
大黄酚，橙红色簇状结晶。1HNMR(CDCl3,500MHz),δ:7.09(1H,brs,H-2),7.64(1H,brs,H-4),7.81(1H,brd,J=7.5Hz,H-5),7.67(1H,brd,J=8.0Hz,H-6),7.28(1H,brd,J=8.5Hz,H-7),2.47(3H,s,-CH3),12.00(1H,s,-OH),12.12(1H,s,-OH);13CNMR(CDCl3),δ：162.6(C-1),124.8(C-2),149.6(C-3),121.6(C-4),124.6(C-5),137.1(C-6),120.1(C-7),162.9(C-8),192.7(C-9),182.1(C-10),133.8(C-11),113.9(C-12),116.0(C-13),133.5(C-14),22.5(-CH3)。
大黄素，橙红色簇状结晶。1HNMR(DMSO-d6,500MHz),δ:7.06(1H,d,J=2Hz,H-2),7.39(1H,d,J=2Hz,H-4),7.03(1H,d,J=3.0Hz,H-5),6.50(1H,d,J=3.0Hz,H-7),2.36(3H,s,C6-CH3)。
儿茶素(外消旋体)，白色簇状结晶。1HNMR(CD3OD,500MHz),δ:4.56(1H,d,J=7.5Hz,H-2),3.97(1H,m,H-3),2.85(1H,dd,J=16.0,5.5Hz,H-4a),2.50(1H,dd,J=16.0,8.0Hz,H-4b),5.93(1H,d,J=1.0Hz,H-6),5.86(1H,brs,H-8),6.84(1H,brs,H-2′),6.76(1H,d,J=8.0Hz,H-5′),6.72(1H,d,J=8.5Hz,H-6′)。13CNMR(CD3OD,500MHz),δ:81.7(C-2),67.6(C-3),27.3(C-4),99.8(C-4a),156.4(C-5),95.1(C-6),156.6(C-7),94.3(C-8),155.7(C-8a),131.0(C-1′),114.1(C-2′),145.1(C-3′),145.1(C-4′),114.9(C-5′),118.9(C-6′)。样品1.0g/100ml及0.1g/100ml的甲醇溶液比旋光度均为零。
(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯，灰白色粉末。1HNMR(CD3OD,500MHz),δ:5.03(1H,s，H-2)，5.53(1H,s，H-3)，2.99(1H,dd,J=17.5,4.5Hz，H-4a)，2.85(1H,dd,J=17.0,1.5Hz，H-4b)，5.96(1H,s，H-6)，5.96(1H,s，H-8)，6.93(1H,d,J=2.0Hz，H-2′)，6.70(1H,d,J=7.5Hz，H-5′)，6.81(1H,dd,J=8.0,2.0Hz，H-6′)，6.95(2H,s，H-2′′和H-6′′)。13CNMR(CD3OD,500MHz),δ:78.5(C-2)，69.9(C-3)，26.8(C-4)，99.4(C-4a)，157.7(C-5和C-7)，96.5(C-6)，95.8(C-8)，157.2(C-8a)，131.4(C-1′)，115.0(C-2′)，145.8(C-3′和C-4′)，116.0(C-5′)，119.3(C-6′)，121.3(C-1′′)，110.1(C-2′′和C-6′′)，146.2(C-3′′和C-5′′)，139.7(C-4′′)，167.6(C-CO)。
柑桔素-4′-O-葡萄糖苷，白色粉末。1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)，δ:5.52(1H,dd,J=13,3.0Hz，H-2)，2.72-3.20(2H,m，H-3)，5.88(1H,d,J=1.5Hz，H-6)，5.87(1H,d,J=2.0Hz，H-8)，7.42(2H,d,J=8.5Hz，H-2′和H-6′)，7.05(2H,d,J=9.0Hz，H-3′和H-5′)，4.88(1H,d,J=7.5Hz，糖H-1)，3.17-4.55(6H,m，糖质子)，12.13(1H,s，C5-OH)。
根皮苷，棕色针状结晶。1HNMR(CD3OD,500MHz),δ:7.06(2H,d,J=8.5Hz，H-2,6)，6.68(2H,d,J=8.5Hz，H-3,5)，6.18(1H,d,J=2.0Hz，H-3')，5.95(1H,d,J=2.0Hz，H-5')，5.04(1H,d,J=7.0Hz，H-1'')，3.43～3.48(3H,重叠的，H-2'',3'',5'')，3.43(1H,m，H-4'')，3.91(1H,d,J=2.0,12.5Hz，H-6a'')，3.72(1H,d,J=5.5,12.5Hz，H-6b'')，3.40(2H,t,J=7.5Hz，H-α)，2.88(2H,t,J=7.5Hz，H-β)。13CNMR(CD3OD,500MHz),δ:133.8(C-1)，130.4(C-2,6)，116.1(C-3,5)，156.3(C-4)，46.9(C-α)，30.8(C-β)，106.8(C-1')，162.3(C-2')，95.4(C-3')，165.9(C-4')，98.3(C-5')，167.5(C-6')，102.2(C-1'')，74.7(C-2'')，78.4(C-3'')，71.1(C-4'')，78.4(C-5'')，62.4(C-6'')。
实施例3、化合物对雌激素受体的激活作用
采用细胞转染的方法观察儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷、大黄素、大黄酚对雌激素受体的选择性激活。实际上，雌激素正是通过调节雌激素反应基因转录来显示其生物活性。
将带有报告基因的ERα或ERβDNA片段分别转染于无ER表达的Hela细胞，在细胞培养液中加入被测物后，通过对报告基因转录激活的检测观察被测物是否可通过ERα或ERβ发挥雌激素样作用。
儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷、大黄素、大黄酚(分别得自实施例1)样品液的配制：
分别精密称取儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷、大黄素、大黄酚相应质量后加入DMSO溶解，对应得样品液高剂量组(10μM或1μM)，稀释一定倍数分别得到低剂量组(1μM至0.001μM)。
乙酸乙酯部分和石油醚部分溶液的配制：
分别精密称取锁阳乙酸乙酯部分(取自实施例所得147g的物料)和石油醚部分(取自实施例所得55g的物料)相应质量加入DMSO溶解，对应得样品液高剂量组（50ug/ml），稀释一定倍数分别得到低剂量组（5ug/ml，0.5ug/ml和0.05ug/ml）。
在37℃，5%CO2的条件下，在细胞培养箱中使用含有10%小牛血清的无酚红高糖DMEM培养液培养Hela细胞，至细胞密度90%左右时将细胞按60%密度铺于96孔板中，每孔中加入含10%血清的无酚红DMEM培养液150ul，培养过夜。按96孔板每孔100ul无血清DMEM培养基，0.4μg质粒(ptk-ERE-luc2μg，tk-Renila1μg，ERα或ERβ1μg)进行转染。转染6个小时后，每孔加入150ul无血清无酚红DMEM培养液。选取每组三个孔，加入10－8M雌二醇E2，以及不同浓度的受试物15ul/孔(样品4～5个浓度梯度组)，37℃，5%CO2条件下继续培养24小时。24小时后每孔加入80μl细胞裂解液，并冻融细胞一次以使其充分裂解。对每孔的细胞裂解液分别测定其对萤火虫萤光素酶及Renila萤光素酶的活性。每孔均用萤火虫萤光素酶/Renila萤光素酶值作为结果，分别以各组中未加雌激素处理的孔作为对照，计算加雌激素或被测物组相对于对照组的比值，每组三个孔取平均值。结果见表1、表2和表3。
表1、锁阳石油醚部分和乙酸乙酯部分对Hela细胞中ERα或ERβ转录活性的影响
从表中结果可见，本发明的提取物具有期望的生物学活性。本领域技术人员理解，虽然表中仅提供了乙酸乙酯部分和石油醚部分的活性，但是可以预见在用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取之前的提取物以及用四种溶剂萃取后所得各有效部位的任一种或几种组合均预期具有期望的生物学活性。
表2、黄酮类化合物对Hela细胞中ERα或ERβ转录活性的影响
表中，*P<0.05,**P<0.01，与对照比较
表3、蒽醌类化合物对Hela细胞中ERα或ERβ转录活性的影响
表中，*P<0.05,**P<0.01，与对照比较
雌激素主要通过雌激素受体(ER)发挥其效应。研究已证实ER广泛存在于心血管系统、成骨细胞、破骨细胞、乳腺及生殖系统等，雌激素对此有着广泛的治疗作用，而植物雌激素是一种天然的选择性雌激素受体调节剂，其机构与功能与雌激素相似，能与雌激素受体结合，具有雌激素样的生物活性。研究结果显示，本发明化合物可浓度依赖性地激活雌激素受体，我们研究证实锁阳中多成分能够与ER结合，提高其转录活性，证实其具有雌激素样作用。也就预示着锁阳中儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、柑桔素葡萄糖苷、根皮苷、大黄素、大黄酚可以用于妇女更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、心脑血管疾病。
本发明不仅仅局限于以上实施例，本领域技术人员也可以根据本发明的精神和范围获得本发明的其它变型实施方案中，而不会脱离本发明的精神和范围。

Claims (9)

1.锁阳提取物，其中包含至少一种选自以下的成分：大黄酚、大黄素、儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷、根皮苷；并且所述锁阳提取物是以水、醇或水-醇混合物为溶剂提取，并依次经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取获得。
2.权利要求1所述的锁阳提取物在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途。
3.根据权利要求2的用途，其中所述的与雌激素分泌不足相关的疾病选自：更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、心脑血管疾病、乳腺癌。
4.根据权利要求2的用途，其中所述的锁阳提取物是经如下步骤制备的：将锁阳用含水乙醇溶液提取；使所得醇提取物用石油醚萃取，浓缩醚层得石油醚部分；将石油醚萃取的残余物用氯仿萃取，浓缩氯仿层得氯仿部分；将氯仿萃取的残余物用乙酸乙酯萃取，浓缩乙酸乙酯层得乙酸乙酯部分；将乙酸乙酯萃取的残余物用正丁醇萃取，浓缩正丁醇层得正丁醇部分；将上述石油醚部分、氯仿部分和乙酸乙酯部分合并，得到提取物。
5.选自下列成分的一种或多种的组合在制备用于治疗和/或预防与哺乳动物雌激素分泌不足相关的疾病的药物中的用途：儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷。
6.根据权利要求5的用途，其中所述的与雌激素分泌不足相关的疾病选自：更年期综合征、骨质疏松症、退行性骨质疏松症、心脑血管疾病、乳腺癌。
7.权利要求1所述的锁阳提取物在制备作为植物雌激素的药物中的用途。
8.选自下列成分的一种或多种的组合在制备作为植物雌激素的药物中的用途：儿茶素、(-)表儿茶素-3-O-没食子酸酯、柑桔素-4′-O-葡萄糖苷。
9.用于治疗和/或预防与哺乳动物雌激素分泌不足相关的疾病的药物组合物，其中包含治疗和/或预防有效量的权利要求1所述的锁阳提取物以及任选的药学可接受的赋形剂。
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