DE859514C - Verfahren zur Gewinnung antianaemischer Wirkstoffe aus Leber - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung antianämischer Wirkstoffe aus Leber Seitdem bekannt ist, daß Leber bzw. Auszüge derselben das mit den verschiedenen Formen der Anämie auftretende Krankheitsbild im günstigen Sinn zu beeinflussen vermögen, sind zahlreiche Vorschläge zur Anreicherung der vermuteten antianämischen Faktoren gemacht worden. In systematischer Verfolgung der für die Extraktion von tierischen Organen und Isolierung darin enthaltener Wirkstoffe zu Gebot stehenden Methoden ist es neuerdings unter Anwendung offenbar recht komplizierter Verfahren gelungen, einen kristallisierten kobalt- und plhosphorhaltigen Komplex zu gewinnen, welcher als der eigentliche Antiperniciosafaktor angesehen wird und der unter der Bezeichnung Vitamin B12 in die Literatur eingegangen ist.
• Bezüglich der Löslichkeitsverhältnisse dieses Körpers wird angegeben, daß er in Wasser, in schwach verdünntem Alkohol und Aceton sowie in Essigsäure löslich, dagegen in Äther, Chloroform und anderen unpolaren Lösungsmitteln unlöslich sei (vgl. u. a. »Nature« I6I, 638/I948).
• Wir haben nun in Weiterführung unserer schon früh begennenenG Arbeiten zur Untersiucihung tienscher Organe auf darin enthaltene haematopoetische Faktoren und zur Anreicherung derselben gefunden, daß sich aus Leber antianämische Wirkstoffe hoher Aktivität, welche aber mit dem Vitamin B12 nicht identisch sind, in besonders einfacher Weise gewinnen lassen, wenn man die aus den Org.anteilen durch Auspressen und/odér Extraktion mittels Wasser oder wäßriger Flüssigkeiten erhaltenen Preßsäfte bzw. Extrakte so lange abwechselnd bei. saurem bis neutralem pn mit hydrophoben Lösungsmitteln und im sauren oder alkalischen Medium mit hydrophilen Lösungsmitteln in der Weise extrahiert, daß jeweils der mit dem hydrophoben Mittel gewonnene Auszug mit dem hydrophilen Lösungsmittel und der mit dem hydrophilen Lösungsmittel gewonnene Auszug jeweils mit dem hydrophoben Lösungsmittel weiterbehandelt und diese Extraktionen so lange fortgesetzt werden, bis gegenüber einer vorangegangenen hydrophoben Ausschüttelung- die nächstfolgende hydrophobe Ausschüttelung keine Steigerung der Wirksamlieit in physikalischer und biologischer Hinsicht mehr aufweist (es werden bei dem Verfahren also jeweils die gewonnenen Auszüge weiterbehandelt bzw. die nicht extrahierten Anteile verworfen). Durch diese wechselnde Behandlung des ursprünglich vorliegenden, aus Lipoiden, Einveißstoffen, Peptiden usw. sowie Wirkstoffen mannigfaltiger Wirkungsrichtung bestehenden Nonglomerats tritt eine steigende Verarmung der jeweils anfallenden Auszüge an lipoidlöslichen Bestandteilen ein, bis offenbar der Gehalt daran den für eine Lösungsvermittlung der vorliegenden antianämischen Wirkstoffe in hydrophoben Lösungsmitteln erforderlichen Wert unterschreitet (Ob es sich hierbei um eine hinsichtlich der antianämischen Faktoren lösungsvermittelnde Wirkung dieser Begleitstoffe oder um Bindungen zwischen ihnen besonderer Art handelt, sei dahingestellt; Tatsache ist, daß bis zu einem gewissen Reinheitsgrad überraschenderweise ein Übergang der die antianämischer Wirlistoffe enthaltenden Komplexe in beide Arten der erfindungsgemäß anzuwendenden Medien stattfindet). Über dieses Stadium hinaus können die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung anzuwendenden Ausschüttelungsmaßnamen zu keiner weiteren Anreicherung an den antianämischen Faktoren führen.
• Die so gewonnenen Extrakte zunächst maximale; Wirksamkeit können nach Entfernung des Lösungsmittels im allgemeinen für die Therapie direkt zur Anwendung gelangen. Wie sich gezeigt hat, kann man aber gewünschtenfalls aus diesen Konzentraten bzw. ihren Lösungen in Wasser oder wäßrigorganischen Lösungsmitteln durch Anwendung von Adsorptionsmitteln (z. B. Tierkohle, Kaolin, Silicagel, Aluminiumoxyd usw.) und entsprechende Eluierung, vor allem im Rahmen der C'hromatographie, oder durch Anwendung von Fällungsmitteln (Zugabe größerer Mengen von mit Wasser mischbarem organischem Lösungsmittel, Phosphorwolframsäure, Pikrinsäure usw.) oder auch durch Kombination derartiger für die Reindarstellung von Naturstoffen bekannten Maßnahmen kristallisierte Produkte erhalten Wie unsere Untersuchungen weiterhin ergeben haben, bewährt sich für die Rein darstellung der in den Endextrakten vorhandenen Wirkstoffe besonders das folgende Verfahren: Man dampft dieselben völlig zur Trockne ein und digeriert den Rückstand, gegebenenfalls wiederholt. mit einem hydrophoben Lösungsmittel, vorzugsweise Äther-Petroläther.
• Der nach Abtrennung der flüssigen Phase hinterbleibende feste Rückstand liefert nach Umkristallisation aus Alkohol, Aceton oder einem anderen geeigneten hydrophilen Lösungsmittel rotgefärbte Kristalle, deren UV-Maximum zwar dem des Vitamin B12 ähnelt (allerdings mit erhöhter Extinktion), welche sich aber in ihrer chemischen Zusammensetzung erheblich von diesen unterscheiden.
• Als Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemäße Verfahren dienen primär die in üblicher Weise durch Zerkleinerung der Organe hergestellten Massen, welche einem Autolysierungsprozeß unterworfen oder sonst, z. B. zwecks Abbau der Eiweißstoffe, fermentativ vorbehandelt sein können. Im engeren Sinn werden die durch Auspressen der Organteile und/oder Extraktion derselben mittels Wasser oder wäßriger Flüssigkeiten (Salzlösungen und/oder Gemische von Wasser mit hydrophilen organischen Lösungsmitteln) erhaltenen Extrakte oder Preßsäfte eingesetzt. Diese Vorextrakte können, bevor sie dem den Gegenstand dieser Erfindung bildenden eigentlichen Ausschüttelungsprozeß unterworfen werden, durch Zugabe geeigneter Reagenzien bereits von einem Teil der genuinen oder abgebauten Eiweißstoffe befreit sein.
• Als hydrophile Lösungsmittel kommen insbesondere niedrigsiedende aliphatische Alkohole, Aceton, Dioxan und Essigsäure in Betracht; sie müssen zum Ausschütteln sauer oder alkalisch sein, da der Übergang des aufzuarbeitenden Produktes in sie sonst nicht oder nur teilweise erfolgt. Von; den hydrophoben Lösungsmitteln haben sich insbesondere chlorierte Kohlenwasserstoffe, höhere Alkohole, Äther sowie aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe als vorteilhaft gezeigt; die mit ihnen zu behandelnden hydrophilen Extrakte müssen sauer bis neutral sein. Die erhaltenen hydrophoben Auszüge können natürlich vor iihrer Weiterverarbeitung einem neutralen Waschprozeß mittels wäßriger Flüssigkeiten unterworfen werden; ebenso kann es zweckmäßig sein, die hydrophilen Extrakte vor der nächstfälligen Ausschüttelung im Sinn des Verfahrens der vorliegenden Erfindung im alkalischen Medium mit geeigneten Mitteln zu waschen.
• Beide Arten von Extrakte können gegebenenfalls, schon zur Herabminderung des zu bewältigenden Flüssigkeitsvolumens, jeweils eingeengt werden.
• Zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung wird auf die Beispiele verwiesen, ohne daß durch die Zusammenstellung derselben eine Einschränkung hinsichtlich Art und Menge der an gewandten Maßnahmen bzw. Hilfsmittel ausgesprochen werden soll.
• Beispiele I. 100 kg frische Leber werden gemahlen und bei einer Temperatur von 5 @ mit 400 1 Wasser 4 Stunden lang verrührt. Hierauf wird abgeseiht und der Rückstand abgepreßt. Das Filtrat wird im Vakuum bei + 20° auf 501 eingeengt und mit 1001 Äthylalkohol versetzt. Es wird abgesaugt und der Rückstand mit 20 1 Alkohol gewaschen.
• Die vereinigten Filtrate werden nun viermal mit je 18 1 Toluol geschüttelt. Die vereinigten Toluolfraktionen werden sodann zweimal mit je 50 l 700/Oigem Alkohol, der einDrittel normal an Salzsäure ist ausgeschüttelt. Die alkoholischenAuszüge werden hierauf zweimal mit je 25 1 Chloroform erschöpfend extrahiert, worauf die vereinigten und gewaschenen Chloroformextrakte ihrerseits zweimal mit je 30 1 5o0/oigem Methanol, dessen PH mit Ammoniak auf 9,5 eingestellt ist, ausgeschüttelt werden. Nun wird der Methanolauszug nach Neutralisation zwei- bis dreimal mit je 10 1 Äthylenchlorid extrahiert. Nach Wiederholung der vorgenannten Methanolaus schüttelung einerseits und Äthylenchloridextraktion andererseits ergibt sich bei der klinischen Prüfung, daß die aus den beiden Äthylenchloridausschüttelungen durch Eindampfen erhaltenen Konzentrate die gleiche Wirks!amkeit Zeigen. Zur weiteren Reinigung wirtd der zuletzt erhaltene Äthylen chloridextrakt im Vakuum völlig zur Trockne eingedampft, worauf der Rückstand einige Zeit mit 51 Petroläther digeriert wird. Man erhält so einen festen, zunächst noch amorphen Rückstand, welcher nach dem Umkristallisieren aus Alkohol etwa 0,I g rötliche Kristalle ergibt. Die Substanz bewirkt in einer Menge von 100 y, gelöst in 2 ccm pflanzlichem Öl, bei sekundären Anämien eine Normalisierung des Hämoglobingehaltes und der Zahl der Erythrocyten.
• 2. 100 kg frische Leber werden gemahlen und nach Zugabe von 500 g Natriuinfluorid als Desinfektionsmittel mit 100 1 Wasser verrührt, worauf man das Gemisch 4 Wochen bei Zimmertemperatur unter öfterem Umrühren stehenläßt. Nach Ablauf dieser Zeit werden noch 200 1 Methanol eingerührt uad nach 2 Tagen weiterem Stehenlassen wird die Masse durch Filterpressen abgetrennt und der Preßrückstand hydraulisch abgepreßt. Die vereinigen Filtrate werden im Vakuum bei 220 auf etwa 35 kg eingeengt, worauf mit 100 1 Methanol versetzt wird'. Hierauf wird koliert und der Kolierrückstand nochmals mit 20 1 Methanol ausgeschüttelt. Die vereinigten methylalkoholischen Extrakte werden sodann mit Wasser auf einen Methanolgehalt von 700/0 gebracht.
• Nun wird dreimal mit je 15 1 niedrigsiedendem Petroläther ausgeschüttelt. Die vereinigten und mit verdünntem Alkohol gewaschenen Petrolätherauszüge werden zweimal mit je 20 1 7o0/oigem Methanol extrahiert, dem 600 ccm 10 n-H Cl zugefügt sind. Die Methanollösung wird nach Einengung auf etwa 10 1 dreimal mit je 5 1 Isopropyläther ausgeschüttelt. Der Isopropylätherauszug wird, nach dem er zunächst mit 5o0/oigem Methanol gewaschen ist, viermal mit je 5 1 60%igen Aceton, das auf ein p, von etwa 2 eingestellt ist, extrahiert. Nach Einengen dieses Extraktes auf die Hälfte wird er dreimal mit je 5 1 Isoamylalkohol ausgeschüttelt.
• Zur Probe (Beispiel 1) werden die beiden letzten Ausschüttelungen wiederholt, worauf Jeder Isoamylalkoholauszug im Vakuum völlig abdestilliert wird.
• Der Destillationsrückstand wird mit 21/2 1 Äther verrührt; es hinterbleibt ein fester Rückstand, welcher nach Umkristallisation aus Aceton die gleichen Kristalle wie nach Beispiel I ergibt.

Claims (2)

1. P A T E N T A N S P R Ü C H E : I. Verfahren zur Gewinniung antianämischer Wirkstoffe aus Leber durch Extraktion der gegebenenfalls fermentativ vorbehandelten und/ oder autolysierten Organteile mittels Wasser oder wäßriger Flüssigkeiten und/oder durch Auspressen derselben, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltenen wäßrigen Extrakte bzw.

   Preßsäfte so lange abwechselnd bei saurem bis neutralem Pn mit hydrophoben Lösungsmitteln und im sauren oder alkalischen Medium mit hydrophilen Lösungsmitteln in der Weise extrahiert werden, daß jeweils der mit dem hydrophoben Mittel gewonnene Auszug mit dem hydrophilen Lösungsmittel und der mit dem hydrophilen Lösungsmittel gewonnene Auszug jeweils mit dem hydrophoben Lösungsmittel weiterbehandelt und diese Extraktionen so lange fortgesetzt werden, bis gegenüber einer vorangegangenen hydrophoben Ausschüttelung die nächstfolgende hydrophobe Ausschüttelungkeine Steigerung der Wirksamkeit in physikalischer und biologischer Hinsicht mehr aufweist, worauf man gewünschtenfalls aus den so gewonnenen Endextrakten die in ihnen enthaltenen Wirkstoffe in kristalliner Form zurAbscheildung bringt.
2. 2. Verfahren gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man die gewonnenen Endextrakte völlig zur Trockne dampft, den Rückstand mit hydrophoben Lösungsmitteln digeriert und ihn hierauf, gegebenenfallls wiederholt, aus mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln umkristallisiert.