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Verfahren zur Trennung von Hypophysenhormonen Bekanntlich gewinnt
man aus der Hypophyse eine große Anzahl von Hormonen, und zwar sowohl aus- dem Vorderlappen
wie aus dem Hinterlappen dieser Drüse. Die Trennung dieser beiden Teile voneinander
ist jedoch wegen der Kleinheit dieser Organe, insbesondere bei den Drüsen des Schafes,
Schweines oder .noch kleinerer Tiere, praktisch nicht oder nur schwer durchführbar.
Man stellt daher für technische Zwecke Trockenpulver aus der Gesamtdrüse dieser
Tiere her, aus welchem man dann nach verschiedenen Verfahren einzelne Hormone mehr
oder weniger gereinigt isoliert. Besondere Schwierigkeiten macht hier die Gewinnung
der Vorderlappenhormone, von denen einzelne bei der Anwendung warmer Extraktionsmittel
leicht zerstört werden. Auch ist es bisher bei Verwendung der Gesamtdrüse bei keinem
der bekannten Verfahren möglich, Hormone des Vorderlappens frei von den blubdruck-
und. uteruswirksamen Hormonen des Hinterlappens zu erhalten. Geringe Mengen dieser
Hinterlappenhormone sind allen -bisher bekannten Präparaten des thyreotropen, des
gonadotropen. und des corticotropen Hormons und dem Prolaktin beigemischt. Derartige
Beimischungen von Hypophysenhinterlappenhormonen beeinträchtigen aber die therapeutische
Verwendung der Vorderlappenhormone, da sie durch Blutdrucksteigerung, Hervorrufen
von Schwindelanfällen und Uteruskontraktionen usw. unerwünschte und schädigende
Nebenwirkungen zeitigen.
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Es hat sich nun gezeigt, -daß man auch bei Verwendung der Gesamthypophyse
als Ausgangsmaterial zu Vorderlappenhormonpräpa raten gelangen kann, die frei von
den Wirkungen der Hinterlappenhormone sind, wenn man die Drüsen einer Behandlung
.mit geeigneten wasserhaltigen, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln
bei alkalischer Reaktion unterwirft. Dabei werden nur die Hinterlappenhormone @
extrahiert und können aus diesem Extrakt zusätzlich gewonnen werden, während aus
dem Extraktionsrückstand in an sich bekannter Weise die Vorderlappenhormone isoliert
werden können. "" Das Verfahren
ist anwendbar sowohl auf frische
Gesamthypophysen aller Tiere als auch auf das übliche Acetontrockenpulver oder anderweitig
entfettetes ;Material.
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Das Verfahren ist weiterhin anwendbar auf Vorderlappenhormonpräparate,
die nach bekannten Verfahren aus der Gesamtdrüse gewonnen sind und daher noch Hinterlappenhormone
enthalten. Erfindungsgemäß werden die zu einem Brei fein v erinahlenen frischen
Gesamtdrüsen mit einer geeigneten Base, zweckmäßig Ammoniak, auf ein pg von 9 bis
io gebracht und mit einem geeigneten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel,
zweckmäßig Methanol, bis zu einer Gesamtkonzentration von etwa 8o°/. versetzt. Nach
i2stündigem Rühren wird abgesaugt und der Filterrückstand noch ein- bis zweimal
bei pH 9 bis io mit Soll%igem Methanol ausgezogen. Die vereinigten Extrakte werden
neutralisiert und im Vakuum eingedampft. Sie enthalten die Hinterlappenhormone,
die nach an sich bekannten Verfahren weitergereinigt werden können. Der Extraktionsrückstand
dient ats Ausgangsmaterial zur Gewinnung der Vorderlappenhormone nach an sich bekannten
Verfahren, z. B. nach Patentschrift 65o 803, Beispiel .1, oder nach Patentschrift
681 216, oder nach anderen Verfahren, wie siez. B. aus dem Lehrbuch von B
o in s k o v , :Methodik der Hormonforschung, z. Band (1939)a Seite 777 ff-, 922
ff., 854 ff-, 965 947 ff ., angegeben sind.
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' Bei Verwendung von Acetontrockenpulver als Ausgangsmaterial wird
dieses dreimal bei PH 9 bis io mit der 2ofachen Menge 8o0/0i-,en Methanols oder
einem anderen wasserhaltigen, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert
und wie oben weiterverarbeitet.
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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist zu beachten,
daß man die Menge der Base so bemißt, daß die Extraktionsflüssigkeit zweckmäßig
ein pg zwischen etwa 8 und i i aufweist; doch ist ein pH über i i nicht unbedingt
hinderlich, ergibt aber weniger reine Produkte und schlechtere Ausbeuten.
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Außer mit Hilfe von Alkalien läßt sich der gewünschte pH-Wert auch
durch Zusatz geeigneter aliphatischer oder cyclischer organischer Basen, wie Triäthanol.amin,
Pyridin u. dgl., einstellen.
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Die Menge der zwecks Extraktion zuzusetzenden neutralen organischen
Flüssigkeit wird so bemessen, daß nach Zugabe ihre Konzentration in der Gesamtlösung
etwa 6o bis 9o°/0, vorzugsweise 8o°,%0, beträgt. Die optimale Konzentration der
organischen Flüssigkeit und der optimale pH-Wert bei der Extraktion werden naturgemäß
von der \atur der verwendeten organischen Flüssigkeit und der Zusammensetzung desAusgangsinaterials
abhängig sein. Sie können leicht durch jedem Fachmann geläufige Vorversuche und
biologische Kontrollen jeweils ermittelt werden. Selbstverständlich sind solche
organischen Flüssigkeiten von der Verwendung ausgeschlossen, welche die Hinterlappenbormone
nicht oder nicht hinreichend lösen, z. B. Aceton.
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Das Verfahren wird zweckmäßig bei niederen Temperaturen, vorzugsweise
bei Zimmertemperatur, ausgeführt. Zur Abtrennung des Ungelösten von der Extraktionsflüssigkeit
lassen sich die bekannten Trennungsmethoden, wie Filtrieren, Dekantieren, Zentrifugieren
usw., anwenden.
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Die Hinterlappenhormone sind nach diesem Verfahren fast quantitativ
und um das Dreibis Vierfache angereichert im Filtrat, die Vorderlappenhormone frei
von Hinterlappenhormonen im Extraktionsrückstand vorhanden.
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Es ist zwar aus Bomskov. 'Methodik der Hormonforschung, Band 2, Seite
779 bis 781, 784, 795 und 948, bekannt, Hypophysen oder Acetontrockenpulver aus
diesen Drüsen mit alkalisch gemachtem Alkohol zu extrahieren. Es «-erden aber gemäß
diesen Angaben stets Vorderlappenhormone aus dem Extrakt gewonnen, während erfindungsgemäß
die Bedingungen so gewählt sind, daß ,die Wirkstoffe des Hinterlappens aus der Gesamtdrüse
in diesen Extrakt gehen. Es werden verfahrensgemäß bei Verwendung von Gesamthypophysen
als Ausgangsmaterial durch Extraktion mit mit Wasser mischbaren niederen aliphatischen
Alkoholen oder Ketonen bei alkalischer Reaktion zunächst die Hinterlappenhormone
extrahiert und aus ihrer Lösung frei von Beimischungen von Vorderlappenhormonen
erhalten, dann aus dem Extraktionsrückstand die Vorderlappenhormone in an sich bekannter
Weise frei von Beirnischungen von Hinterlappenhormonen ge-"vonnen.
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Beispiel i io kg zermahlene Gesamtdrüse des Schweines werden mit konzentriertem
Ammoniak auf PH 9 bis io gebracht und mit 32 1 Methanol versetzt, i2 Stunden gerührt
und abgesaugt. Der Extraktionsrückstand wird mit 2,41 Wasser angeteigt, mit Ammoniak
neuerlich auf pH 9 bis io eingestellt, mit 27,6 1 Methanol versetzt und ebenfalls
12 Stunden gerührt, abgesaugt und nochmals mit der gleichen Menge Methanol behandelt.
Die vereinigten Extrakte werden mit Essigsäure neutralisiert und zur Trockne gebracht.
Es werden etwa 400 g Trockenrückstand erhalten, die die Gesamtuterus- und Blutdruckwirksalnkeit
des
Ausgangsmaterials; nämlich etwa % Mill. i. E., enthalten. Dieses Produkt kann in
an sich bekannter Weise zur Gewinnung der Hinterlappenhormone aufgearbeitet werden.
Aus den extrahierten Drüsen kann z. B. durch Behandlung mit Eiweißfällungsmitteln
vom Charakter der Nitrophenole oder mit komplexen Metallsäuren .der 7. Gruppe des
periodischen Systems das thyreotrope Hormon hergestellt und weiter aus dem extrahierten
Rückstand das corticotrope Hormon beispielsweise durch Herstellung eines Kochextraktes,
Enteiweißung desselben und Fällung gewonnen werden. Beispiel 2 5o g eines Acetontrockenpulvers
der Gesamthypophyse vom Schwein werden mit Zoo ccm i°/oi,ger Ammoniaklösung angeteigt
und nach Zugabe von 80o ccm Methanol 12 Stunden in der Kugelmühle gemahlen. Darauf
saugt man ab undwäscht denRückstand mit ammoniakalischem 8o°/oigem Methanol aus.
Den Rückstand extrahiert man noch zweimal gleichartig mit der halben Menge des Extraktionsmittels
und wäscht beim letztenAbsaugen den Rückstand-mit essigsaurem absolutem Methanol
nach.
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Die Methanolextrakte, die nach jeder Trennung vom Extraktionsrückstand
mit Essigsäure neutralisiert wurden und im Eisschrank aufbewahrt werden, werden
nun vereinigt und im Vakuum. vom Lösungsmittel befreit. Es hinterbleibt nach Vakuumtrocknung
ein Rückstand von 14 g. Im Tierversuch konnte keinerlei Wirkung eines Hypophysenvonderlappenhormons
nachgewiesen werden, jedoch wurde hier die Gesamtwirksamkeit der im Ausgangsmaterial
enthaltenen H:interlappenhormone (blutdrucksteigerndes und uteruswirksames Hormon)
wiedergefunden.
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Der nach dreimaliger Extraktion mit ammoniakalischem 8o°%igem Methanol
hinterbleibende Rückstand wurde ebenfalls im Vakuum getrocknet. Sein Gewicht betrug
4o g. Ein von einer Probe in üblicher Weise hergestellter Kochextrakt zeigte am
isolierten Uterus keinerlei Wirkung mehr, ebenso fehlte die Blutdruckwirkung. Dagegen
enthielt ein in bekannter Weise gewonnener essigsaurer Extrakt die gesamte thyreotrope
Wirksamkeit des Acetontrockenpulvers, nämlich 15 ooo MsE. Zudem zeigte dieser Extrakt
keinerlei toxische Wirkung.
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Beisspiel 3 2o g thyreotropes Hormon eines nach Patentschriften 714185
und 726 636 erhaltenen Präparates aus der Gesamthypophyse des Schweines, .das je
Milligramm 10,7 Meerschweinchen-Einheiten (MsE.), insgesamt also 215 000
MSE., daneben aber noch 15 ooo Voegtlin-Einheiten (V.E.) blutdrucksteigerndes Hormon
und 15 ooo internationale Einheiten: (I. E.) uteruswirksames Hormon des Hinterlappens
enthält, werden in 400 ccm Wasser gelöst und mit 12 ccm io°/oigem Ammoniak gegen
Phenolphthalein alkalisch gemacht. Diese Lösung rührt man in 160o ccm eisgekühltem
Methanol ein, welchem zuvor io ccm io°/oiges Ammoniak und i g Kaliumacetat zugesetzt
waren. Den entstehenden Niederschlag zentrifugiert man sofort ab und löst ihn dann
wieder in Zoo ccm Wasser, welches 4 ccm. zo°%iges Ammoniak enthält. DieseLösung
rührt man in $oo ccm eisgekühltem Methanol ein, das mit 5 ccm io°%igem Ammoniak
und i g Kaliumacetat versetzt war. Der Niederschlag wird wiederum sofort abzentrifugiert,
erneut in Zoo ccm Wasser, das 3 ccm io°/oiges Ammoniak enthält, gelöst und die Lösung
in 40o ccm eisgekühltem Methanol, das 5 ccm io°/oiges Ammoniak und 0,5 g Kaliumacetat
enthält, eingerührt. Die abzentrifugierte Fällung ist nun frei von Blutdruck- und
uteruswirksamen Hinterlappenhormonen. Sie wird in Wasser gelöst, mit Salzsäure bis
zur kongosauren Reaktion versetzt und mit dem iofachen Volumen schwach salzsaurem
Aceton gefällt. Der Niederschlag wird abgesaugt, mit Aceton und Äther gewaschen
und im Vakuum getrocknet. Man erhält so 7 g eines reinweißen, in Wasser leicht löslichen
Pulvers. Gemäß den Ergebnissen der biologischen Prüfung ist es frei von Blutdruck-
und uteruswitksamen Hinterlappenhormonen; es enthält je Milligramm 3o,6 MsE., insgesamt
also 2i3ooo MsE.
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Die vereinigten Methanollösungen werden mit Essigsäure neutralisiert,
das Lösungsmittel im Vakuum bei 35° Badtemperatur abdestilliert und der Rückstand
im Vakuum getrocknet. So wurden 22,7 g Trockensubstanz erhalten, die je Milligramm
0,5 V. E. blutdrucksteigerndes Hormon, insgesamt also 1130o V. E. und außerdem
11300 I. E. uteruswirksames Hormon enthielten. Beispiel 4 5 kg zermahlene
Gesamthypophysen vom Schwein werden mit konzentriertem Ammoniak gegen Phenolphthalein
alkalisch gemacht und mit 131- Äthanol versetzt, 12 Stunden gerührt und abgesaugt.
Der Extraktionsrückstand wird mit 2,61 Wasser angeteigt, darauf mit 13.1 Äthanol
versetzt, 12 Stunden gerührt, abgesaugt und der Rückstand mit essigsaurem Äthanol
und neutralem Aceton ausgewaschen und getrocknet. Dieser Rückstand wiegt 8g0 g.
Seine dreimalige Extraktion mit i°%i,ger Essigsäure führt zu einem Extrakt, der
die Gesamtmenge des im Ausgangsmaterial
- enthaltenen thyreotropen
Hormons, nämlich -4ooooo Meerschweinchen-Einheiten, enthält.-- Die vereinigten ammoniakalischen
Äthanolextrakte werden unverzüglich ohne vorherige Neutralisation imVakuum bei 3o°
eingedampft. Man erhält 4oo g eines Sirups, der je Milligramm i,8 i. E. Oxytocin
enthält, also die Gesamtmenge des im Ausgangsmaterial enthaltenen Hinterlappenhormons.
Die Aufarbeitung der Vorder- und Hinterlappenfraktiongeschieht nachBeispiel i. Beispiel
5 5 kg Gesamthypophysen vom Schwein werden nach Zermahlen mit 6 1 n-Propylalkohol
und i6o ccm konzentriertem Ammoniak versetzt. (Da die Frischhypophysen 8o°% Wasser
enthalten, erhält man so eine ungefähr 6o°%ige wäßrige Lösung von ammoniakalischem
Pro-27 Die Mischung wird 1a Stunden gerührt, zentrifugiert und der Rückstand mit
41 Wasser, 50 ccm konzentriertem Ammoniak auf pg 9 bis io eingestellt und
61 n-Propylalkohol hinzugefügt. Darauf wird nochmals 1a Stunden gerührt, abzentrifugiert
und der Rückstand zuerst mit essigsaurem Propylalkohol, dann mit Aceton ausgewaschen
und getrocknet. Ein in bekannter Weise hergestellter essigsaurer Extrakt enthält
die gesamten Vorderlappenhormone. Die vereinigten ammoniakalischen Propylalkoholextrakte
werden bei niedriger Temperatur im Vakuum eingedampft, und man erhält 85o g eines
Sirups, aus dem sich in bekannter Weise die Hinterlappenhormone gewinnen lassen.