DE708839C - Verfahren zur Herstellung gonadotroper Hormone aus waessrigen Ausgangsloesungen - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung gonadotroper Hormone aus wäßrigen Ausgangslösungen In der Patentschrift 67I 043 ist die Herstellung des Hypophysenvorderlappenhormons aus diesen enthaltenden Rohprodukten, wie Schwangerenharn, Placenta, Rinderhypophyse u. a., durch Aussalzung (z. B. mit Ammonsulfat) und daraulfolgende Reinigung durch Extraktion der mitausgefallenen unreinen Nebenprodukte mittels Lösungsmitteln, die die ausgesalzenen gon.adotropen Hormone und das Salz selbst nicht lösen, beschrieben. Ferner ist durch die deutsche Patentschrift Ego 803 und die schweizerische Patentschrift 144711 ein Verfahren - bekanntgeworden, nach dem weitgehend gereinigte gonadotrope Hormone erhalten werden, wenn die Verunreinigungen aus den die Hormone enthaltenden, wäßrigen Lösungen durch Fällung mittels Erdalkalis,alzen zunächst entfernt werden.
• Es wurde nun gefunden, daß durch Kombination der beiden vorbeschriebenen Verfahren in einfacher Weise und in guter Ausbeute besonders hochwertige gonadotrope Hormone prhalten werden können, -wie sie nach den Einzelverfahren erst nach weiteren umständlichen Reinigungsmethoden erzielt werdeaL Die Kombination wird in der Weise durchgeführt, daß das nach dem Verfahren des Patents 671 043 aus dem Harn durch Aussahen mittels eines wasserlöslichen Alkalisalzes, z. B. Amrnonsulfat, erhaltene Aussalzprodukt gründlich mit einem organisch Lösungsmittel (Alkohol, Aceton) gewaschen wird zur Entfernung der außer den gonadotropen Hormonen noch in ihm enthaltenen Verunreinigungen und oestrogenen. Wirkstufe, welch letztere dann durch Verarbeitung der Waschlaugen gewonnen werden können, Der Rückstand, welcher die gesamten gonadotropen Hormoneenthält, wird nun in Wasser gelöst und der Lösung in geringem überschuß die Lösung eines in organischen Lösungen löslichen Erdalkalisalzes, z. B. Bariumacetat, zugesetzt, wodurch weitere Verunreinigungen und überschüssiges Ammonsulfat durch Ausfällung entfernt werden. Wenn das Ansat@>@=@ produkt- größere Mengen von Ammonsulfat @' enthält, so ist es zweckmäßig, den Hauptteil desselben zuvor durch Dialyse zu entfernen.
• Aus dem Filtrat, welches jetzt das gesamte Hormon enthält, wird dieses nun mittels eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels (Alkohol, Aceton u. a.) ausgefällt, während die außerdem noch im Filtrat enthaltenen, aber in dem organischen Lösungsmittel löslichen Salze (überschüssiges Erdalkalisalz und Ammonsalz) in Lösung bleiben.
• Die Gewinnung der Hormone aus dem Filtrat kann anstatt durch Fällung auch in der Weise vorgenommen werden, daß das Filtrat im Vakuum zur Trockne gebracht und der Rückstand mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert wird, welches imstande ,ist, nicht die gonadotropen Wirkstoffe, wohl aber die zum Aussahen und zur Fällung verwendeten Salze sowie ihre Umsetzungssalze zu lösen.
• Es muß also, um möglichst hochgereinigte Verfahrensprodukte zu erhalten, bei dem Reinigungsverfahren als Fällungsmittel stets ein solches Salz verwendet werden, welches sich mit dem zum Aussalzen verwendeten Salz einerseits zu einem wasserunlöslichen Salz, welches ausfällt und abfiltriert werden kann, und andererseits zu einem in organischen Lösungsmitteln löslichen Salz umsetzt und selbst auch in diesem Lösungsmittel löslich ist. Zum Aussalzen eignen sich Alkalisalze, z. B. Phosphate oder Sulfate, wie Natrium-oder Ammonsulfat, während als Fällungsmittel in mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln lösliche Erdalkalisalze, insbesondere Bariumsalze, z. B. Bariumacetat, zu verwenden sind.
• L e j w a (Biochemische Zeitschrift, Bd. 256 [19321, S.236 ff.) salzt zur Gewinnung gonadotroper Wirkstoffe den Harn schwangerer Frauen nach Zusatz ioo:öiger Essigsäure mit Ammonsulfat aus, nimmt den dabei gebildeten Niederschlag mit Wasser auf und schüttelt die filtrierte wäßrige Lösung bei pH 3,5 bis 4 mit Permutit. Bei Nachprüfung dieses Verfahrens mit Säurepermutit ergab sich, daß das pH der Lösung beim Schütteln mit dem Permutit immer mehr nach der alkalischen Seite verschoben wird, so daß die Lösung schließlich schwach alkalisch war. Eluiert man nun das Adsorbat nach den Angaben von L e j w a mit o, i 2 5 0,'o igem Ammoniak, so konnten aus dem Eluat weniger als 5 % der im Ausgangsmaterial nachgewiesenen Einheiten der gonadotropen Wirkstoffe gewonnen werden. Da sich weiter die gonadatropen Wirkstoffe aus Harn im Gegensatz zu den Angaben des Verfassers in Essigester als unlöslich erwiesen und es unmöglich ist, nach Lejwa die Wirkstoffe in kristallisierter Form zu erhalten, müssen die Angaben - dieser .'Schrifttumstelle als nicht reproduzierbar bezeichnet werden.
• Demgegenüber stellt das vorliegende Verfahren eine technisch anwendbare Methode zur Gewinnung gonadotraper Wirkstoffe in guter Ausbeute dar.
• Beispiel t io 1 Harn schwangerer Frauen mit ioooo RE pro Liter werden bis zur Sättigungsgrenze mit Ammonsulfat versetzt. Man läßt stehen, bis Ammonsulfat sich abzuscheiden beginnt und trennt dann den gesamten festen Anteil durch Filtration oder durch Zentrifugieren ab. Das Aussalzprodukt wird in 11 Wasser aufgenommen und der Hauptteil des Ammonsulfats durch Dialyse entfernt. Der Lösung wird dann Bariumacetat in geringem überschuß zugesetzt und der entstandene Niederschlag abfiltriert bzw. abzentrifugiert. Nun wird die fünffache Menge Methylalkohol zu dem Filtrat hinzugesetzt, der entstandene Niederschlag abzentrifugiert und mehrmals. mit Alkohol und schließlich mit Äther gewaschen. Es hinterbleiben nach dem Trocknen o,8 g eines weißen Pulvers. Die biologische Testier rung ergab einen Gehalt von i i o ooo RE pro Gramm, also insgesamt 88 ooo Einheiten. Die Ausbeute betrug demnach fast 9o %. Beispiel e iooo g frische Schafshypophysen werden feinst zermahlen und mit 21 Wasser angerührt. Durch Zusatz von 211 Natronlauge wird die Mischung auf pH i o eingestellt und Stunden gerührt. Vian läßt über Nacht bei etwa 2° stehen und bringt dann das pH durch Zusatz von 2 n Salzsäure auf PH 5,5-Der Niederschlag wird abzentrifugiert und noch einmal in derselben Weise extrahiert.
• Auf i oo ccm der vereinigten Extrakte werden 55g Ammonsulfat hinzugesetzt, gut gerührt und über Nacht kalt stehengelassen. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und mit kalter 30%iger Ammonsulfatlösung gewaschen.
• Der Niederschlag wird in 25o ccm Wasser aufgeschwemmt und mit Ammoniak auf PH 9 eingestellt. Man schüttelt auf der Maschine und zentrifugiert vom Ungelösten ab. Die Extraktion wird mit 15o ccm Wasser wiederholt. Die vereinigten Lösungen werden so lange mit Bariumacetat versetzt, bis keine Trübung mehr eintritt. Die gebildeten Bariumsalze werden abzentrifugiert. Die klare Lösung wird mit dem vierfachen Volumen an Alkohol versetzt, und durch Zusatz von Essigsäure werden die gonadornopen Wirkstoffe zur Ausfällung gebracht. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und mit Alkohol und Äther gewaschen. Man erhält @et*#va 8oo mg eines weißen Pulvers.

Claims (3)

1. PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Herstellung gonadotroper Hormone aus wäßrigen Ausgangslösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hormone aus den Ausgangslösungen mittels eines in Wasser löslichen Alkalisulfates oder -phosphates aussaht, welches mit dem zur weiteren Reinigung verwendeten Erdalkalis,alz sich einerseits zu einem wasserunlöslichen und andererseits zu einem in organischen Lösungsmitteln, nämlich niederen Alkoholen, Aceton oder Dioxan, löslichen Salz umzusetzen vermag, darauf die wäßrige Lösung des Aussalzproduktes mit einem Erdalkalisalz, welches auch selbst in den genannten organischen Lösungsmitteln löslich ist, behandelt und entweder aus dem Filtrat die gonado.-tropen Wirkstoffe in an sich bekannter Weise mittels .eines der obengenannten ürganischen Lösungsmittel ausfällt oder das Filtrat zur Trockne bringt und aus dem Rückstand die Salze mittels eines der obengenannten Lösungsmittel auszieht.
2. 2. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man als Aussalzmittel Ammonsulfat verwendet.
3. 3. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fällungsmittel B.ariumacetat verwendet. .