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Verfahren zur Herstellung gonadotroper Hormone aus wäßrigen Ausgangslösungen
In der Patentschrift 67I 043 ist die Herstellung des Hypophysenvorderlappenhormons
aus diesen enthaltenden Rohprodukten, wie Schwangerenharn, Placenta, Rinderhypophyse
u. a., durch Aussalzung (z. B. mit Ammonsulfat) und daraulfolgende Reinigung durch
Extraktion der mitausgefallenen unreinen Nebenprodukte mittels Lösungsmitteln, die
die ausgesalzenen gon.adotropen Hormone und das Salz selbst nicht lösen, beschrieben.
Ferner ist durch die deutsche Patentschrift Ego 803 und die schweizerische
Patentschrift 144711 ein Verfahren - bekanntgeworden, nach dem weitgehend gereinigte
gonadotrope Hormone erhalten werden, wenn die Verunreinigungen aus den die Hormone
enthaltenden, wäßrigen Lösungen durch Fällung mittels Erdalkalis,alzen zunächst
entfernt werden.
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Es wurde nun gefunden, daß durch Kombination der beiden vorbeschriebenen
Verfahren in einfacher Weise und in guter Ausbeute besonders hochwertige gonadotrope
Hormone prhalten werden können, -wie sie nach den Einzelverfahren erst nach weiteren
umständlichen Reinigungsmethoden erzielt werdeaL Die Kombination wird in der Weise
durchgeführt, daß das nach dem Verfahren des Patents 671 043 aus dem Harn durch
Aussahen mittels eines wasserlöslichen Alkalisalzes, z. B. Amrnonsulfat, erhaltene
Aussalzprodukt gründlich mit einem organisch Lösungsmittel (Alkohol, Aceton) gewaschen
wird zur Entfernung der außer den gonadotropen Hormonen noch in ihm enthaltenen
Verunreinigungen und oestrogenen. Wirkstufe, welch letztere dann durch Verarbeitung
der Waschlaugen gewonnen werden können, Der Rückstand, welcher die gesamten gonadotropen
Hormoneenthält, wird nun in Wasser gelöst und der Lösung in geringem überschuß
die
Lösung eines in organischen Lösungen löslichen Erdalkalisalzes, z. B. Bariumacetat,
zugesetzt, wodurch weitere Verunreinigungen und überschüssiges Ammonsulfat durch
Ausfällung entfernt werden. Wenn das Ansat@>@=@ produkt- größere Mengen von Ammonsulfat
@' enthält, so ist es zweckmäßig, den Hauptteil desselben zuvor durch Dialyse zu
entfernen.
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Aus dem Filtrat, welches jetzt das gesamte Hormon enthält, wird dieses
nun mittels eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels (Alkohol, Aceton
u. a.) ausgefällt, während die außerdem noch im Filtrat enthaltenen, aber in dem
organischen Lösungsmittel löslichen Salze (überschüssiges Erdalkalisalz und Ammonsalz)
in Lösung bleiben.
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Die Gewinnung der Hormone aus dem Filtrat kann anstatt durch Fällung
auch in der Weise vorgenommen werden, daß das Filtrat im Vakuum zur Trockne gebracht
und der Rückstand mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert wird, welches imstande
,ist, nicht die gonadotropen Wirkstoffe, wohl aber die zum Aussahen und zur Fällung
verwendeten Salze sowie ihre Umsetzungssalze zu lösen.
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Es muß also, um möglichst hochgereinigte Verfahrensprodukte zu erhalten,
bei dem Reinigungsverfahren als Fällungsmittel stets ein solches Salz verwendet
werden, welches sich mit dem zum Aussalzen verwendeten Salz einerseits zu einem
wasserunlöslichen Salz, welches ausfällt und abfiltriert werden kann, und andererseits
zu einem in organischen Lösungsmitteln löslichen Salz umsetzt und selbst auch in
diesem Lösungsmittel löslich ist. Zum Aussalzen eignen sich Alkalisalze, z. B. Phosphate
oder Sulfate, wie Natrium-oder Ammonsulfat, während als Fällungsmittel in mit Wasser
mischbaren organischen Lösungsmitteln lösliche Erdalkalisalze, insbesondere Bariumsalze,
z. B. Bariumacetat, zu verwenden sind.
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L e j w a (Biochemische Zeitschrift, Bd. 256 [19321, S.236 ff.) salzt
zur Gewinnung gonadotroper Wirkstoffe den Harn schwangerer Frauen nach Zusatz ioo:öiger
Essigsäure mit Ammonsulfat aus, nimmt den dabei gebildeten Niederschlag mit Wasser
auf und schüttelt die filtrierte wäßrige Lösung bei pH 3,5 bis 4 mit Permutit. Bei
Nachprüfung dieses Verfahrens mit Säurepermutit ergab sich, daß das pH der Lösung
beim Schütteln mit dem Permutit immer mehr nach der alkalischen Seite verschoben
wird, so daß die Lösung schließlich schwach alkalisch war. Eluiert man nun das Adsorbat
nach den Angaben von L e j w a mit o, i 2 5 0,'o igem Ammoniak, so konnten aus dem
Eluat weniger als 5 % der im Ausgangsmaterial nachgewiesenen Einheiten der gonadotropen
Wirkstoffe gewonnen werden. Da sich weiter die gonadatropen Wirkstoffe aus Harn
im Gegensatz zu den Angaben des Verfassers in Essigester als unlöslich erwiesen
und es unmöglich ist, nach Lejwa die Wirkstoffe in kristallisierter Form zu erhalten,
müssen die Angaben - dieser .'Schrifttumstelle als nicht reproduzierbar bezeichnet
werden.
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Demgegenüber stellt das vorliegende Verfahren eine technisch anwendbare
Methode zur Gewinnung gonadotraper Wirkstoffe in guter Ausbeute dar.
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Beispiel t io 1 Harn schwangerer Frauen mit ioooo RE pro Liter werden
bis zur Sättigungsgrenze mit Ammonsulfat versetzt. Man läßt stehen, bis Ammonsulfat
sich abzuscheiden beginnt und trennt dann den gesamten festen Anteil durch Filtration
oder durch Zentrifugieren ab. Das Aussalzprodukt wird in 11 Wasser aufgenommen und
der Hauptteil des Ammonsulfats durch Dialyse entfernt. Der Lösung wird dann Bariumacetat
in geringem überschuß zugesetzt und der entstandene Niederschlag abfiltriert bzw.
abzentrifugiert. Nun wird die fünffache Menge Methylalkohol zu dem Filtrat hinzugesetzt,
der entstandene Niederschlag abzentrifugiert und mehrmals. mit Alkohol und schließlich
mit Äther gewaschen. Es hinterbleiben nach dem Trocknen o,8 g eines weißen Pulvers.
Die biologische Testier rung ergab einen Gehalt von i i o ooo RE pro Gramm, also
insgesamt 88 ooo Einheiten. Die Ausbeute betrug demnach fast 9o %. Beispiel e iooo
g frische Schafshypophysen werden feinst zermahlen und mit 21 Wasser angerührt.
Durch Zusatz von 211 Natronlauge wird die Mischung auf pH i o eingestellt und Stunden
gerührt. Vian läßt über Nacht bei etwa 2° stehen und bringt dann das pH durch Zusatz
von 2 n Salzsäure auf PH 5,5-Der Niederschlag wird abzentrifugiert und noch einmal
in derselben Weise extrahiert.
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Auf i oo ccm der vereinigten Extrakte werden 55g Ammonsulfat hinzugesetzt,
gut gerührt und über Nacht kalt stehengelassen. Der Niederschlag wird abzentrifugiert
und mit kalter 30%iger Ammonsulfatlösung gewaschen.
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Der Niederschlag wird in 25o ccm Wasser aufgeschwemmt und mit Ammoniak
auf PH 9 eingestellt. Man schüttelt auf der Maschine und zentrifugiert vom Ungelösten
ab. Die Extraktion wird mit 15o ccm Wasser wiederholt. Die vereinigten Lösungen
werden so lange mit Bariumacetat versetzt, bis keine Trübung mehr eintritt. Die
gebildeten Bariumsalze werden abzentrifugiert. Die klare
Lösung
wird mit dem vierfachen Volumen an Alkohol versetzt, und durch Zusatz von Essigsäure
werden die gonadornopen Wirkstoffe zur Ausfällung gebracht. Der Niederschlag wird
abzentrifugiert und mit Alkohol und Äther gewaschen. Man erhält @et*#va 8oo mg eines
weißen Pulvers.