DE708939C - Verfahren zur Herstellung gonadotroper Hormone aus waessrigen Ausgangsloesungen - Google Patents

Description

In der Patentschrift 671 043 ist die Herstellung des Hypophysenvarderlappenhormons aus diesen enthaltenden Rohprodukten, wie Schwangerenharn, Placenta, Rinderhypophyse u.a., durch Aussalzung (z.B. mit Ammonsulfat) und darauffolgende Reinigung durch Extraktion der mitausgefallenen unreinein Nebenprodukte mittels Lösungsmitteln, die die ausgesalzenen gonadotropen Hormone und das Salz selbst nicht lösen, beschrieben. Ferner ist durch die deutsche Patentschrift 650 803 und die schweizerische Patentschrift 144 711 ein Verfahren bekanntgeworden, nach dem weitgehend gereinigte gonadotrope Hormone erhalten werden, wenn die Verunreinigungen aus den die Hormone einthaltenden wäßrigen Lösungen durch Fällung mittels Erdalkalisalzen zunächst entfernt werden.

Es wurde nun gefunden, daß durch Kombination der beiden vorbeschriebenen Verfahren in einfacher Weise und in guter Ausbeute besonders hochwertige gonadotrope Hormone erhalten werden können, wie sie nach den Einzelverfahren erst nach weiteren umständlichen Reinigungsmethoden erzielt werden. Die Kombination wird in der Weise durchgeführt, daß das nach dem Verfahren des Patents 671 043 aus dem Harn durch Aussalzen mittels eines wasserlöslichen Alkalisalzes, z. B. Ammonsulfat, erhaltene Aussalzprodukt gründlich mit einem organischen Lösungsmittel (Alkohol, Aceton) gewaschen wird zur Entfernung der außer den gonadotrop«! Hormonen noch in ihm enthaltenen Verunreinigungen und oestrogenen Wirkstoffe, welch letztere dann durch Verarbeitung der Waschlaugen gewonnen werden können. Der Rückstand, welcher die gesamten gonadotropen Hormone enthält, wird nun in Wasser gelöst und der Lösung in geringem Überschuß

die Lösung eines in organischen Lösungen löslichen Erdalkalisalzes, z. B. Bariumacetat, zugesetzt, wodurch weitere Verunreinigungen und überschüssiges Ammonsulfat durch Ausfällung entfernt werden. Wenn das Ansatz-; produkt größere Mengen von Ammonsulfat enthält, so ist es zweckmäßig, den Haupttett· desselben zuvor durch Dialyse zu entfernen. Aus dem Filtrat, welches jetzt das gesamte Hormon enthält, wird dieses nun mittels eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels (Alkohol, Aceton u. a.) aus gefällt, während die außerdem noch im Filtrat enthaltenen, aber in dem organischen Lösungsx5 mittel löslichen Salze (überschüssiges Erdalkalisalz und Ammonsalz) in Lösung bleiben. Die Gewinnung der Hormone aus dem Filtrat kann anstatt durch Fällung auch in der Weise vorgenommen werden, daß das Filtrat im Vakuum zur Trockne gebracht und der Rückstand mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert wird, welches imstande ist, nicht die gonadotropen Wirkstoffe, wohl aber die zum Aussalzen und zur Fällung verwendeten Salze sowie ihre Umsetzungssalze zu lösen.

Es muß also, um möglichst hochgereinigte Verfahrensprodukte zu erhalten, bei dem Reinigungsverfahren als Fällungsmittel stets ein solches Salz verwendet werden, welches sich mit dem zum Aussalzen verwendeten Salz einerseits zu einem wasserunlöslichen Salz, welches ausfällt und abfiltriert werden kann, und andererseits zu einem in organischen Lösungsmitteln löslichen Salz umsetzt und selbst auch in diesem Lösungsmittel löslich ist. Zum Aussalzen eignen sich Alkalisalze, z. B. Phosphate oder Sulfate, wie Natriumoder Ammonsulfat, während als Fällungsmittel in mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln lösliche Erdalkalisalze, insbesondere Bariumsalze, z. B. Bariumacetat, zu verwenden sind.

Lejwa (Biochemische Zeitschrift, Bd. 256 [1932], S. 236 ff.) salzt zur Gewinnung gonadotroper Wirkstoffe den Harn schwangerer Frauen nach Zusatz ioo/oiger Essigsäure mit Ammonsulfat aus, nimmt den dabei gebildeten Niederschlag mit Wasser auf und schüttelt die filtrierte wäßrige Lösung bei p_H 3,5 bis 4 mit Permutit. Bei Nachprüfung dieses Verfahrens mit Säurepermutit ergab sich, daß das p_H der Lösung beim Schütteln mit dem Permutit immer mehr nach der alkalischen Seite verschoben wird, so daß die Lösung schließlich schwach alkalisch war. Eluiert man nun das Adsorbat nach den Angaben von Lejwa mit 0,1250/oigem Ammoniak, so konnten aus dem Eluat weniger als 5 0/0 der im Ausgangsmaterial nachgewiesenen Einheiten der gonadotropen Wirkstoffe gewonnen werden. Da sich weiter die gonadotropen Wirkstoffe aus Harn im Gegensatz zu den Angaben des Verfassers in Essigester als unlöslich erwiesen und es unmöglich ist, nach ■■•Lejwa die Wirkstoffe in kristallisierter Form i& erhalten, müssen die Angaben dieser

hrifttumstelle als nicht reproduzierbar bezeichnet werden.

Demgegenüber stellt das vorliegende Verfahren eine technisch anwendbare Methode zur Gewinnung gonadotroper Wirkstoffe in guter Ausbeute dar.

Beispieli ₇j

ι ο 1 Harn schwangerer Frauen mit ι ο οοο RE pro Liter werden bis zur Sättigungsgrenze mit Ammonsulfat versetzt. Man läßt stehen, bis Ammonsulfat sich abzuscheiden beginnt und trennt dann den gesamten festen Anteil durch Filtration oder durch Zentrifugieren ab. Das Aussalzprodukt wird in 11 Wasser aufgenommen und der Hauptteil des Ammonsulfats durch Dialyse entfernt. Der Lösung wird dann Bariumacetat in geringem Überschuß zugesetzt und der entstandene Niederschlag abfiltriert bzw. abzentrifugiert. Nun wird die fünffache Menge Methylalkohol zu dem Fittrat hinzugesetzt, der entstandene Niederschlag abzentrifugiert und mehrmals mit Alkohol und schließlich mit Äther gewaschen. Es hinterbleiben nach dem Trocknen 0,8 g eines weißen Pulvers. Die biologische Testierung ergab einen Gehalt von 11 ο οοο RE pro Gramm, also insgesamt 88 000 Einheiten. Die Ausbeute betrug demnach fast oo<y₀.

Beispiel 2

1000 g frische Schafshypophysen werden feinst zermahlen und mit 21 Wasser ange- >oo rührt. Durch Zusatz von 2 η Natronlauge wird die Mischung auf p_H 10 eingestellt und 4 Stunden gerührt. Man läßt über Nacht bei etwa 2° stehen und bringt dann das p_H durch Zusatz von 2 η Salzsäure auf p_H 5,5. »05 Der Niederschlag wird abzentrifugiert und noch einmal in derselben Weise extrahiert.

Auf 100 ecm der vereinigten Extrakte werden 55g Ammonsulfat hinzugesetzt, gut gerührt und über Nacht kalt stehengelassen. "° Der Niederschlag wird abzentrifugiert und mit kalter 300/oiger Ammonsulfatlösung gewaschen.

Der Niederschlag wird in 250 ecm Wasser aufgeschwemmt und mit Ammoniak auf p_H 9 >«5 eingestellt. Man schüttelt auf der Maschine und zentrifugiert vom Ungelösten ab. Die Extraktion wird mit 150 ecm Wasser wiederholt. Die vereinigten Lösungen werden so lange mit Bariumacetat versetzt, bis keine «ao Trübung mehr eintritt. Die gebildeten Bariumsalze werden abzentrifugiert. Die klare

Lösung wird mit dem vierfachen Volumen an Alkohol versetzt, und durch Zusatz von Essigsäure werden jlie gonadotropen Wirkstoffe zur Ausfällung, gebracht. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und mit Alkohol und Äther gewaschen. Man erhält 'etwa mg eines weißen Pulvers.

Claims (3)

1. Patentansprüche:

   i. Verfahren zur Herstellung gonadotroper Hormone aus wäßrigen Ausgangslösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hormone aus den Ausgangslösungen mittels eines in Wasser löslichen Alkalisulfates oder -phosphates aussalzt, welches mit dem zur weiteren Reinigung verwendeten Erdalkalisalz sich einerseits zu einem wasserunlöslichen und andererseits zu einem in ,organischen Lösungsmitteln, nämlich niederen Alkoholen, Aceton oder Dioxan, löslichen Salz umzusetzen vermag, darauf die wäßrige Lösung des Aussalzproduktes mit einem Erdalkalisalz, welches auch selbst in den genanntein organischen Lösungsmitteln löslich ist, behandelt und entweder aus dem Filtrat die gonadotropen Wirkstoffe in an sich bekannter

   • Weise mittels eines der obengenannten organischen Lösungsmittel ausfällt oder das Filtrat zur Trockne bringt und aus dem 3» ■Rückstand die Salze mittels eines der obengenannten Lösungsmittel auszieht.
2. 2. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ' man als Aussalzmittel Ammonsulfat verwendet.
3. 3. Ausführungsform des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fällungsmittel Bariumacetat verwendet.