DE1492229A1

DE1492229A1 - Verfahren zur Gewinnung von kristallinem Insulin

Info

Publication number: DE1492229A1
Application number: DE19651492229
Authority: DE
Inventors: Katkovsky Semen B; Trostinskaya Geb Gitterman E B; Zamikhovsky Alexandr B; Sarkisova Geb Glazyan Izabel G; Shvarts Sofia I; Shubinskaya Geb Sragovich El S; Tevlina Geb Fedtova Anna S; Tugunov Sergei S; Dmitrenko Leonid V; Samsonov Georgy V
Original assignee: VNIIEX ENDOKRINOLOOEII
Current assignee: VNIIEX ENDOKRINOLOOEII
Priority date: 1965-11-17
Filing date: 1965-11-17
Publication date: 1969-12-11
Also published as: GB1054523A; MY6800099A

Description

Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky 16. Nov.1965

Institut Experimentalnoi Sndokrinologii

UdSSR, Moskau P 8317

Verfahren zur Gewinnung von kristallinem

Insulin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von kristallinem Insulin.

Die bekannten Verfahren zur Gewinnung von kristalLinem Insulin beruhen auf Extraktion von verkleinertem Pankreasgewebe mit angesäuertem wässrigem Alkohol unter anschließendem Konzentrieren des Kxtraktes in einer Vakuum-Destillationsanlage und darauffolgender Reinigung d^s wässerigen Konzentrats durch Fraktionieren und Kristallisieren in an sich bekannter Weise.

Bekannt ist ferner die Gewinnung von kristallinem Insulin nach den lonenaustauschverfahren, das mit Hilfe von Alginsäure sowie von Diäthylaminoathylceliulose durchgeführt wird.

iin Nachteil des erstgenannten Verfahrens ist die Langwierigkeit des Produktionsverlaufs, welcher eine Reihe von mühevollen Maßnahmen beinhaltet, die im Betrieb kostspielige, komplizierte Ausrüstungen, wie Vakuum-Destillationsanlagen, erfordern. Bin weiterer Nachteil dieses Verfahrens ist auch die Notwendigkeit, explosionsgefährliche Gemische anzuwenden.

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Zu den Nachteilen des zweiten Verfahrens gehört das vorhergehende Entfernen von Ionen, welche die Adsorption von Insulin verhindern sowie eine besondere Behandlung der Extrak te. Weitere Nachteile sind die unvollständige Gewinnung von Insulin in den Adsorption-Desorption-Stufen, die ungenügende Selektivität der zur Anwendung gelangenden Adsorptionsmittel gegenüber dem Insulin sowie die Notwendigkeit, die . Adsorptionsmittel zu trocknen und oft zu erneuern.

Der Zweck der vorliegenden Erfindung besteht darin, diese P Nachteile zu beseitisjen und ein v/ii-b schaft lieh durchführbares loiienaustauschveri'ahren zur Gewinnung von kristallinem Insulin aus den primär erhaltoiien v/ässeri^-alkoholiac-ien Paniere as-Extrakt en in einem verkürzten Arbeitsgang der Ionenaustausch-Adsorptionsmethode uniei¹ v>eY;_^:.iir.i.oiotung der vollen Wirksamkeit und. Selektivität ...er Adsorption-DGEorption-iütufen zu schaffen,

Diese Aufgabe wird erfindun^sgemaii dadurca jolo'st, da^ das..

Insulin aus dem wässerig-alkoholischen Pankreas-Extrai.t nach ι.

einer Vorbehandlung bei einem p^-./ert von oberhalb 7,4-, bei einem Ρττ-tfert unterhalb 3>5 rait einem bulfokationenaustauscher selektiv adsorbiert und i.iit acetonlialtiger verdünnter Ammoniaklösung derart selektiv desorbiert v/ird, da^ man bei der anschließenden Fraktionierung des Eluats kristallines Insulin erhält.

Die besten Ergebnisse werden beim Verwenden von Sulfokationen-

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austauschern erzielt, uie --ui." der GruruLa^e dos telomerisierten Mischpolymeren ν >n Styrol und Divinyltr-snzol (.weiterhin

••r
St-DVB-genannt) mit -inen ^uellun^sko^ffizi^nt^n vor· 5»2 bis 6,0 und (iiner Natriunikapazität von .4,5 bis 5»5 Milliäquivalent je G "amm g^won.ien waren, Debei erfolgt der Ionenaustausch nach d^r Gleichung:

R.SO ~H⁺ + ⁺H..yR_oC00" R^öO: ⁺H, WR₀GOOH,

worin R^SO-""!! einen Sulfokationenaustauscher in der V/asssrstofform i-nd"*"H₅NR₂COO"" ein Dipolion (Biweia-Instain) bedeuten. Die selektive D9sorx.t,ion des Insulins wird zweckmäßig bei einem p^-V/ert von 5,2 b^s 10 und die der Begleiteiweißstoffe mit ein?r etwa 20 ,S Aceton enthaltenden 0,25 bis 0,5 η Ammoniaklösung bei ^iuem p_H-V/ert von oberhalb 10 vorgenommen. Die Ausscheidung des Insulins aus dem Bluat und dessen Kristallisation nach den b»kannten Verfahren führen zur Gewinnung des kristallinen JriSviJns, ■„ dienes den juifo-.'d ?r« n.^en der Fharraakopöe entspricht.

Die erf indun^e:;e'iLl durch _*»f'ihrte jew.'nnua^ von kristalLinera Ineilin ermö^lioat f?s, di« Ins lin-Ausbeote zu erhöhen, den Arbeitsve^lauf r.u varkiirzen sowie die Ver«r«?:idun5 explosions- ^efuhrlicher e.^isciie und einer Vakuura-Destillationsap^arauiir zu vsrm^iden.

1:

Zu 10 1 schwefelsaurem wässeriä-allcoholisohem Fankreas-Bxtrakt man Ätznatron bis zu einem pj-.'/e-'t von 7 »4- - 7,6 zu und

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filtriert den Niederschlag ab. Zu dem Filtrat setzt man Schwefelsäure bis zu einem ρττ-Wert von 3|2 zu. Nach dem Abstehenlassen leitet man den klaren Extrakt durch eine Kolonne, die 20 g SuIfokationonenaustauscher ST-DVB-MF in Wasserstoff-* Form mit einem Quellungskoeffizienten von 5»5 und einer Korngröße von 0,1 - 0,5 nun enthält. Vor dem Durchleiten des Extraktes wird der Kationenaustauscher mit SO%*igem Alkohol gewaschen. Die Adsorptionsgeschwindigkeit wird bei 100 ml /Std.

je cm der Kolonne gehalten. Nach beendeter Adsorption wird

der Kationenaustauscher zuerst mit 96^-igem Alkohol, sodann ™ mit destilliertem //asser gewaschen und hierauf mit dem Ammoniumacetatpufier vom pg-Wert von 6,0 neutralisiert.

Die Blution wird mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/std. je cm der Kolonne mit 0,25 η-Ammoniaklösung, die 20$ Aceton enthält und auf 0° bis 2° C abgekühlt ist, durchgeführt. Die BIuatfraktionen werden bei einem ρττ-Wert von 6,2 - *10 gesammelt und sofort mit 5 n-HCl auf einen pg-Wert von 2,5 - 2,8 angesäuert.

Die Kationenaustauscher werden mit 1-2 n-NaOH bis zur negativen Reaktion mit Trichloressigsäure regeneriert, dann mit destilliertem V/assei) 1-2 n-HCl, Wasser und 60^-igem Alkohol gewaschen.

2u 100 ml Bluat, das bei einem p^-Wert von 6,2 - 10 gesammelt wurde, gibt man 100 ml destilliertes Wasser, welches 2,7 nil Bssigsäure und 70 ml Aceton enthält und stellt den pg-Wert auf 2,6 - 2,8 ein. Der Niederschlag wird durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt. Das klare Filtrat wird auf den p^Wert

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von 4,5 - 4,8 oder 6,3 (zwecks besserer Koagulation der Ballaststoffe) eingestellt, und nach 2 Stunden der Niederschlag durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt·

Das Filtrat wird auf den pg-Wert 6,0 eingestellt und mit 10%-iger Zinkacetatlösung, die bis zur maximalen Trübung hinzugegeben wird, das Zink-Insulin ausgefällt. Der Niederschlag wird nach 48-stiindisem Abstehenlassen abgetrennt und aus 0,05M-Zitratpuffer kristallisiert. Die Insulinkristalle werden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser und Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet«

Beispiel 2:

Bs wird wie in dem Beispiel 1 verfahren; die Adsorption von Insulin wird aber aus einem Pankreas-Extrakt vorgenommen, der mit einem mit Orthophosphorsäure angesäuertem Alkohol gewonnen

Beispiel 3?

Man arbeitet nach den Beispielen 1 und 2; die Adsorption von Insulin wird jedoch aus einem Pankreas-Sxtrakt vorgenommen, der mit einem mit Milchsäure angesäuertem Alkohol gewonnen

Beispiel 4:

Es wird wie in den Beispielen 1 bis 3 verfahren; die Adsorption von Jnsulin wird aber aus einem Pankreas-Extrakt vorgenommen, der mit einem mit Salzsäure angesäuertem Alkohol gewonnen war.

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Beispiel 5:

Die Adsorption von Insulin aus wässerig-alkoholischen Pankreas·

Extrakten wird bei einem pjj-Wert von etwa 8 durch Hinzufügen von ST-DVB-MP in Wasserstoff-Form bis zum p_HJ.'/ert von 3,5 3|2 (10-12 g auf 1 1 Bxtrakt) vorgenommen; dann wird der Kgtionenauetauscher in die Kolonne eingebracht) behandelt und eluiert, wie in dem Beispiel 1 beschrieben.

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Claims

Ub)2229 Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky 16. Nov.1965 Institut ßxperimentalnoi Bndokrinologii UdSSR, Moskau P 8317 Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung, von kristallinem Insulin aus wässerig-alkoholischen Pankreas-Bxtrakten mit Hilfe von Ionenau8tan3c: eradsorptionsmittein, daduroh »ekennzeichnet, daß das in dem Extrakt enthaltene Insulin nach einer Vorbehar llung bei einem pjj-Wert von oberhalb 7,4 bei einem pjj-.Ve-t unterhalb 3i5 mit einem Sulfokationen-Austauscier selektiv adsorbiert und mit acetonhaltiger verdünnter Amüioniaklösun^ derart selektiv desorbiert wird, daß men bei αβ^Λ anschließenden Fraktionierun.r des "Bluate kris' al lines Insulin erhält.

2. Verfahren nach ¹VnSp^uCh 1, dadurch ^ekonnzeichnet, daß als Siilfokatioi^ii-Austauscner ein telomerisierr.es Mischpolymar von Styrol und Uivinylhenirol mit einem quellun_:/,s koefficient^n von 5,2 bis ό,Ο una -?iner liatriumkapazität von 4,5 bis 5,5 Miliiäquivalent/Gramm verwendet wird.

3. Verlauten nac:i Anspruch 1 and 2, dacurca gekennzeichnet, daP di^" selektive Desorption mit einer etwa 20 % Aceton

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lt?ridon O_r25 bic 0,5 η - Ajfimoniaklösun^ vorteilotrtraon wird.

4# VörlÄhven η ac η Aaspruch 1 bis J, dadurch ieko die selektive Desorption von Insulin b3i eimern p^'.'I&Tt von 6,2 >* 10 unu di'i der J^e^leiteiwei^stoij e bei ei !βΜ p^-.7erIf von oberhalb 10 vor. enoiitnen wird·

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