DE1417605A1

DE1417605A1 - Verfahren zur Reinigung von Gibberellinen

Info

Publication number: DE1417605A1
Application number: DE19611417605
Authority: DE
Inventors: Louis Roux
Original assignee: APPLIC BIOCHEMIQUES SOC ET
Current assignee: APPLIC BIOCHEMIQUES SOC ET
Priority date: 1960-11-17
Filing date: 1961-10-31
Publication date: 1969-03-13
Also published as: BE609397A; NL270511A; US3118909A; GB936549A; FR1287368A; LU40640A1

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHDNWALD DR. SIEBENEICHER DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES

KÖLN T, DEICHMANNHAUS

Köln, den 23.10.1961 Eg/Ax

Societed*Etudes et d'Applications Biochimiciues, Jouy-en-Josas (Seine & Oiee) (Frankreich).

Verfahren zur Reinigung von Gibherellinen

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Gibberellinen, das es ermöglicht, diese kristallinen Substanzen in einer Reinheit von etwa 95$ zu erhalten, wobei der Begriff "Reinheit" nicht in dem Sinne aufzufassen ist, daß das erhaltene Produkt unbedingt aus einer einzigen chemischen Verbindung besteht, sondern in der angegebenen Menge Substanzen enthält, die zur Gruppe der G-ibberelline gehören und nach chemischen Methoden sowie durch ihre biologische Aktivität quantitativ bestimmt werden können.

Das Verfahren gemäß der Erfindung umfasst zwei nacheinander durchzuführende Stufen?

1) Die Gewinnung der Rohkristalle, die 70 bis 85°A Gibberelline enthalten können, und

2) die Reinigung dieser Kristalle bis zu einer Reinheit von

1. Stufe

Bei der ersten Stufe-·sind, zwei Ausführungsformen möglich. Der ersten von ihnen liegt die Feststellung zugrunde, daß die ersten Fraktionen, die aus einer Kolonne eines schwachen Anionenaustauschharzes, das mit Gibberellinen aus einer Gärflüssigkeit beladen ist, durch Elution mit Ammoniak gewonnen werden, bereits genügend rein sind, um die direkte Gewinnung

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von Rohkristallen einfach durch Extraktion mit Athylacetat und Einengen des Extrakts zu ermöglichen, ohne daß eine weitere Maßnahme zur Reinigung ergriffen werden muß.

Die ersten Fraktionen, die aus der Harzsäule eluiert werden, die zur Extraktion der Gibberelline aus einer Gärflüssigkeit diente, können somit zu diesem Zweck verwendet werden. Diese Fraktionen, die bei einem p^-Wert zwiwohen 5 und 8 austreten, stellen etwa die Hälfte der gesamten Gibberelline dar.

Das Heue des Verfahrens liegt nicht in der Verwendung von Äthylacetat oder irgendeines anderen nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, denn diese Methode ist bereits seit den ersten Arbeiten an Gibberellinen bekannt, sondern in der Vereinfachung, die sich aus der Behandlung von verhältnismäßig reinen Fraktionen ergibt. Die Gewinnung dieser Fraktionen stellt ein Merkmal und einen wichtigen Vorteil der Extraktion durch schwache Aniοnenaustauschharze dar. Bei der technischen Herstellung unter Anwendung dieser Extraktions methode genügt es, diese Fraktionen für die Herstellung von kristallinen Gibberellinen zu reservieren.

Die zweite Ausführungsform der ersten Stufe des Verfahrens gemäß der Erfindung besteht darin, daß von folgenden Produkten ausgegangen wird: Unreine Extraktionsfraktionen oder Fabrikationsrückstände, Mutterlaugen der Kristallisation oder Lösungsmittel, die zum Waschen der Kristalle dienten, oder nach einer anderen Methode erhaltene unreine Extrakte, z.B., aus der Adsorption an Kohle stammende Konzentrate der Extraktion mit Aceton. Es ist jedoch erforderlich, diese Fraktionen einer Vorreinigung zu unterwerfen. Diese besteht aus einer chromatographischen Reinigung an einem schwachen Anionenaustauschharz des Typs IR4B und wird wie folgt durchgeführt:

1) Verdünnung der jeweiligen unreinen Lösung in etwa dem zehnfachen Volumen an gewöhnlichem Wasser.

2) |jfette#«&g durch Entfernung von Kationen durch Durchleiten durch eine Säule eines schwachen Kationenaustauschharzes,

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Typ IRG5O, H-Form, wenn es sich um ein an Kationen reiches Eluat handelt (Fraktion des mit Ammoniak erhaltenen Eluats), oder einfacher durch Zugabe von etwas HOl bis zu einem Ρττ-Wert von 4,5» wenn die Lösung wenig Kationen enthält (mit Aceton erhaltene Eiuate, fabrikationsrückstände).

3) Bindung der Gibberelline durch Durchleiten der lösung durch eine Säule eines schwachen Anionenaustauschharzes, Typ IR4B, das in der Formiatform in einer Menge von 1 cm pro etwa 80 mg Gibberelline verwendet wird.

4) Elution mit Ammoniak von Normalkonzentration bei sehr niedriger Durchlauf geschwindigkeit (,etwa 0,1 cm /cm /Min.).

Die Erfahrung hat gelehrt, daß man bei Verwendung des Harzes in der Formiatform und bei genügend langsamer Elution etwa 80$ der G-ibberelline in verhältnismäßig reinen Fraktionen erhält, die es ermöglichen, durch Anwendung der. gleichen Arbeitsweise, wie sie bei der ersten Ausführungsform angewendet wird, unmittelbar Rohkristalle zu erhalten.

2. Stufe

Das Verfahren der zweiten Stufe besteht im wesentlichen darin, daß die in der ersten Stufe erhaltenen Produkte gereinigt werden, indem die in ihnen enthaltenen Verunreinigungen an Kohle adsorbiert werden, wobei noch in der wäßrigen Phase unter solchen Bedingungen gearbeitet wird, daß die Menge der gleichzeitig adsorbierten Gibberelline vernachlässigbar ist. Die gereinigten Gibberelline werden mit einem Lösungsmittel, wie Äthylacetat, das anschließend abgedampft wird, extrahiert, in reinem Äthylacetat kristallisiert, gewaschen, abgenutscht und getrocknet. Die einzelnen Stufen werden wie folgt durchgeführt:

1) Die in der ersten Stufe erhaltenen Rohkristalle werden in Wasser bis zu einer Konzentration von 15 bis 20 g/l gelöst, üs genügt zu diesem Zweck, sie in der entsprechenden Wassermenge zu suspendieren und langsam unter Rühren eine Alkalilösung bekannter Konzentration, z.B. eine HaOH-Lösung, in

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einer Menge zuzugießen, die etwas niedriger ist, als sie zur vollständigen ITeutralisation der Gibberelline erforderlich wäre, und zwar derart, daß der p^-Wert schließlich bei 5 liegt*

2) Zur lösung wird eine geringe Menge Aktivkohle gegeben

- etwa 5 - 10 Gew.-^ der zu reinigenden Gibberelline -. Nach einer Kontaktzeit von einer halben Stunde^ wird sorgfältig filtriert, wobei eine absolut klare und praktisch farblose lösung erhalten wird.

3) Die Gibberelline werden aus dieser gereinigten Lösung extrahiert und a«f_tbekannter Weise kristallisiert, indem die Lösung bis zu^ptr 3 gedauert wird, die Gibberelline mit Athylacetat extrahiert werden und das Lösungsmittel abgedampft wird, wodurch die Kristallisation bewirkt wird.

4) Die Kristalle werden mehrmals gewaschen., indem sie in etwas Athylacetat, das vorzugsweise mit Gibberellinen gesättigt ist, suspendiert werden, lach jeder Wäsche wird zentrifugiert. Die Kristalle werden abschließend getrocknet, und zwar vorzugsweise im Vakuum und in Gegenwart von Phosphorsäureanhydrid.

Beispiel^

Angewendet wurde das Verfahren der ersten Stufe zur Gewinnung von Eohkristallen aus verhältnismäßig reinen EIutionsfraktionen nach der ersten Ausführungsform. Es wurde" wie folgt gearbeitet:

1) Gewinnung verhältnismäßig reiner Fraktionen

französische Nach dem Verfahren des Patents (Patentanmeldung

847. 7.².²...........) wurden die in 100 1 Gärflüssigkeit enthaltenen Gibberelline an einer Säule eines schwachen Anionenaustauschharzes (IR4B., Aoetatform) gebunden. Nach dem gleichen Verfahren wurden die Gibberelline mit Ammoniak von Normalkonzentration eluiert, wobei Fraktionen erhalten wurden, deren Pg-Wert von 5 auf 9,5 anstieg.

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Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung wurden die zwischen Pj₁ 5 und Pg 8 austretenden !Fraktionen getrennt aufgefangen, da sie reiner waren als die anderen Fraktionen und aus ihnen 'Rohkristalle in guter Ausbeute durch einfache Extraktion mit Äthylacetat ohne die Notwendigkeit einer weiteren Reinigung erhalten werden konnten.

Die 100 1 Gärflüssigkeit enthielten insgesamt 42 g Gibberellin« (gerechnet als reines Produkt).

Die Analyse ergab, daß die gewählten Fraktionen 19,6 g reine Gribberelline enthielten, d.h. etwas weniger als die Hälfte der Gesamtmenge. Ihr Volumen betrug 1,900 1.

Das oberhalb von ρττ 8 austretende restliche Eluat stellte die unreinen Fraktionen dar, die nach der zweiten Ausführungsform der Erfindung verwertbar waren.

2) Säuerung und Extraktion

Die Fraktionen wurden gesäuert, indem sie langsam unter Rühren mit 6 N-Salzsäure versetzt wurden, bis der p-g-Wert auf 3 gefallen war. Das Endvolumen betrug etwa 2 1. Die Gibberelline wurden zweimal mit dem gleichen Volumen Äthylacetat, d.h. insgesamt mit 4 1, extrahiert.

3)" Abdampfen und Kristallisation

Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft, wobei die Temperatur des Fasserbades 60° betrug. Gegen Ende des Abdampfens bildeten sich Kristalle an den Wänden des Destillationskolbens. Es wurde weiterdestilliert, bis das Volumen der Kristalle plus Flüssigkeit etwa 30 cur betrug, worauf der Kolben einige Stunden bei einer Temperatur von 5° stehen gelassen wurde. Nach der Abkühlung bildete das Ganze eine teigige Masse, die mit etwa 10 cm Äthylacetat verdünnt und mit Hilfe eines Spatels durch eine Glasfritte gegeben wurde. Die Kristalle wurden , zweimal mit je 10 cm Äthylacetat, das zur Spülung des Kolbens verwendet worden war, gewaschen, erneut und getrocknet.

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Das erhaltene trockene Produkt wog etwas mehr als 21 g und. enthielt 80Yo₁ d.h. etwas weniger als 17 g reine Gibberelline.

' Beispiel 2

Anwendung des Verfahrens der ersten Stufe zur Gewinnung von Rohkristallen aus unreinen Fraktionen nach der zweiten Aus-■führungsform der Erfindung.

Es wurde wie folgt gearbeitet:

1) "Verdünnung

Die in Beispiel 1 genannten unreinen Fraktionen, die aus der Harzsäule "bei einem p^-Wert über 8 ausgetreten waren, enthielten 19,2 g Gibberelline, gerechnet als reines Produkt. Sie wurden mit den Rückständen der Kristallisation und der Wäsche, die bei der Behandlung gemäß Beispiel 1 erhalten worden waren, vereinigt. Das Gemisch, das 20,7 g reine Gibberelline in Mischung mit Verunreinigungen enthielt, hatte einen ρττ-Wert von etwa 9»5 und eine hellbraune Farbe. Es wurde mit gewöhnlichem Wasser auf ein Volumen von 12 1 verdünnt.

2) Säuerung

Man ließ die verdünnte Fraktion schnell durch eine Säule aus schwachem Kationenaustausehharz (-IRC5O, Η-Form) laufen, um die Säuerung durch Entfernung von Ammoniak zu bewirken. Das Harzvolumen betrug etwa 1 1. Nach dem Durchlauf wurde das Harz mit 1 1 Wasser gewaschen, das mit der Fraktion vereinigt wurde, Der Pjj-Wert der Gesamtflüssigkeit nach der. Vermischung betrug 4,5·

3) Bindung der Gibberelline durch Perkolation über schwaches Anionenaustauschharz.

Die Flüssigkeit ließ man durch eine Säule aus schwachem Anionenaustauschharz (IR4B, Formiat-Form) laufen. Die Säule hatte folgende Abmessungen: Durchmesser 4 cm, Querschnitt

2 ¹^

also etwa 12,5 cm , Höhe der Harzsäule 20 cm, Volumen 250 cm, entsprechend 1 cm Harz auf etwa 90 mg Gibberelline. Die Durchlauf geschwindigkeit betrug 3 cm /cm /Minute, die Dauer des .Durchlaufs etwa 6 Stundei9.Q 981 1/0472

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4) Elution der Gibberelilne und Auswahl von verhältnismäßig reinen !Fraktionen«

Ammoniak von Normalkonzentration ließ man sehr langsam (0,1 cmvcm /Minute) für 9 Stunden durch die Kolonne laufen. Nach dem Durchgang von 160 em Eluat begannen die Gibberelline auszutreten. Es wurden 450 cm Eluat unt«r p_ff 8 und 100 cnr Eluat oberhalb von p^· 8 aufgefangen.

Die 450 cm an verhältnismäßig reinen Fraktionen enthielten 16 g Gibberelline, gerechnet als reines Produkt. Diese verhältnismäßig reinen Fraktionen wurden in der gleichen Weise wie die Fraktionen in Beispiel T behandelt? Säuerung mit HOl, Extraktion mit Äthylacetat, Abdampfen des Lösungsmittels, Waschen, Ausschleudern und Trocknen der Kristalle. Erhalten wurden 17,8 g kristalline Gibberelline einer Reinheit von ' 78$ entsprechend 13*8 g Reinprodukt,

Beispiel 3

Anwendung des Verfahrens der zweiten Stufe. Gewinnung von kristallinen Gibberellinen von 94$iger Reinheit aus Rohkristallen.

Es wurde wie folgt gearbeitet:

1) Auflösung

15 g Rohkristalle, die 80% Gibberelline enthielten, wurden in 950 cm^ Wasser suspendiert. Anschließend wurde ganz langsam unter Rühren eine Natriumhydroxyd-Normallösung bis zur vollständigen Auflösung der Kristalle zugegeben, Der p_H-Wert lag nun bei etwa 5. Erforderlich hierzu waren etwas mehr als 35 cnr NaOH-Lösung. Die Lösung war leicht trübe und gelb gefärbt. ^{: ;}

2) Behandlung mit Aktivkohle

Nach Zugabe von etwa 1-g Aktivkohle und Rühren für etwa 15 Minuten wurde mit einem Faltenfilter filtriert, wobei die ersten !Teile-des Filtrats, die leicht trübe abliefen, auf das Filter zurückgegeben wurden. Schließlich wurde eine vollkommen klare, und-farblose Flüssigkeit erhalten.

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3) Extraktion mit Äthylacetat

Es wurde big zu einem ρττ-Wert von etwa 3 gesäuert, indem tropfenweise unter Rühren etwa 8 cm 5 N-Salzsäure zugegeben wurden. Es wurde zweimal extrahiert, wobei jedes Mal das gleiche Volumen Äthylacetat, d.h. insgesamt 2 Liter, verwendet wurde. Anschließend ließ man das Lösungsmittel eine halbe Stunde in einem gut getrockneten Erlenmeyerkolben stehen und dekantierte es dann vorsichtig, um die letzten Spuren der wäßrigen Phase, die sich am Boden und an den Wänden des Behälters befanden, zu entfernen.

4·) Abdampfen des Lösungsmittels

Das Äthylacetat wurde unter vermindertem Druck bei einer Temperatur des Wasserbades von 60° abgedampft. Gegen Ende des Abdampfens, als nur noch etwa 10 cm Flüssigkeit abzudampfen waren, wurden 10 cm Alkohol zugegeben, worauf zur Trockene eingedampft wurde. Der Rückstand hatte das Aussehen eines harten, transparenten, leicht gelb getönten Gummis.

^) Kristallisation

Der Rückstand wurde mit einem Glasstab in Gegenwart von 25 cur Äthylacetat geknetet, wobei auf dem Wasserbad leicht erwärmt wurde, um ihn aufzulösen. Die zu Beginn klare Lösung trübte sich sehr schnell, bis sie milchig wurde. AIa die Kristalle groß genug geworden waren, um sich am Boden des Behälters abzusetzen, wurde die Lösung allmählich klar. Die Bildung ziemlich großer Kristalle wurde begünstigt, indem die Flüssigkeit fast ständig gerührt und abwechselnd um einige Grade erwärmt und wieder gekühlt wurde. Nach etwa einer Stunde wurde der Behälter an einen kühlen Ort gestellt und einen halben Tag stehen gelassen.

6) Waschen» Abnutsohen und Trocknen der Kristalle

Die Kristalle wurden derart auf eine Glasfritte von kleinem Durchmesser (4- cm) gebracht, daß die Kristallschicht in Gegenwart der Flüssigkeit eine Dicke von etwa 3 cm hatte. Die Kristalle wurden mit mäßigem Vakuum abgenutscht. Nach

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Aufhebung des Vakuums wurden etwa 15 cm Äthylacetat, das nahezu mit Gibberellinen gesättigt war, auf das Filter gegossen. Anschließend wurden die Kristalle durch Rühren mit einem Spatel im Lösungsmittel suspendiert und schließlich abgenutecht. Auf diese Weise wurden drei Waschungen mit anschließendem Abnutschen durchgeführt. Das zum Waschen verwendete Lösungsmittel war mit Gibberellinen gesättigt, wobei die Kristalle verwendet wurden, die an den Wänden des Kristallisationsbehälters hafteten und nicht auf das Filter gebracht werden konnten.

Die gewaschene und abgenutschte, jedoch noch etwas feuchte Kristallmasselirarde in einen Erlenmeyerkolben überführt, wo die Kristalle durch Absaugen des Lösungsmittels grob getrocknet wurden. Anschließend wurden sie in Gegenwart von Phosphorsäureanhydrid und Kaliumhydroxyd in einen Exsiccator überführt.

Erhalten wurden 12 g vollkommen weiße trockene Kristalle, die reine Gibberelline. enthielten. Die Ausbeute betrug also

~ 91»5$, gerechnet als reine Gibberelline.

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Claims

lit! /DUO - lO -

Patentanspruch

Verfahren zur Herstellung von kristallinen una reinen G-ibberellinen, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer 1« Verfahrensstufe die erste !fraktion, die aus einer Kolonne einea schwachen Anionenaustausohharzes, das mit Gibberellinen aus einer-G-ärflüssigkeit beladen ist, durch Elution mit Ammoniak, relativ rein gewonnen werden, mit A'thylaoetat extrahiert und einengt oder unreine Extraktionsfraktionen oder Pabrikationsrückstände zunächst einer Vorreinigung mit einem schwachen

und aabei Anionenaustauschharz unterwirft, die unreine Lösung verdünnt, ansäuert, durch die Säule des Anionenaustauschharzea hindurchleitet und mit Ammoniak eluiert und anschliessend in einear 2_# Verfahrens stufe die aus der 1 _e Verfahrensstufe erhaltenen Rohkristalle über Aktivkohle gereinigt und aus der gereinigten Lösung in bekannter Weise durch Ansäuern der Lösung, Extraktion mit Äthylacetat, Abdampfen des Lösungsmittels., Waschen, Abfiltrieren und Trocknen die Gibberelline kristallin; gewonnen werden.

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