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Verfahren zur Extraktion von Gibberellin-Säure
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Gibberellin-Säure aus wässerigen Fermen- tatiöns-Substraten.
Es ist bekannt, Gibberellin-Säure, aus einer wässerigen Lösung dieser organischen Säure, z. B. aus einem Fermentationsmedium durch Adsorption dieser Säure aus dem Fermentationsmedium auf Kohle, folgende Elution und Abscheidung der Gibberellin-Säure aus dem Eluat zu isolieren.
Es wurde nun gefunden, dass die direkte Extraktion von Gibberellin-Säure aus wässerigen Fermentations-Substraten mittels bestimmter Lösungsmittel, die bisher zur Extraktion solcher Substrate nicht ver wendet worden sind, ein besonders wirksames und einfaches Verfahren darstellt. Während mit Lösungsmitteln, wie z. B. Benzol und Chloroform zufriedenstellende Resultate nicht erhalten wurden, konnten mittels mit Wasser nicht oder nur teilweise mischbaren Estern, Alkoholen oder Ketonen mit nicht mehr als 8 Kohlenstoffatomen überraschenderweise sehr gute Resultate erzielt werden.
Demnach besteht das erfindungsgemässe Verfahren zur Extraktion von Gibberellin-Säure aus wässeri-
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weise mischbaren Estern, Alkoholen oder Ketonen, die nicht mehr als 8 Kohlenstoffatome enthalten, erfolgt.
Das wässerige, Gibberellin-Säure enthaltende Fermentationsmedium, das als Ausgangsmaterial verwendet wird, kann nach bekannten Verfahren erhalten werden, z. B. kann es ein wässeriges Filtrat dartel- len, das aus einem Gibberellin-Säure enthaltenden Fermentationsmedium erhalten wird, das durch Züchtung eines Gibberellin-Säure bildenden Pilzes auf einem geeigneten wässerigen Nährboden hergestellt wird.
Für diesen Zweck eignet sich der Pilz Gibberella fujikuroi, jedoch können auch andere GibberellinSäure bildende Pilze oder Abkömmlinge derselben verwendet werden.
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xybutylacetat, Diäthylcarbonat, Äthylpropionat, Äthyl-n-butyrat, sek.-Butanol, n-Butanol, Benzylalkohol, Cyclohexanol, Methyläthylketon, Diäthylketon, Methyl- n - propylketon, Methylisobutylketon.
Cyclohexanon, Methylcyclohexanon. Es kann auch ein Lösungsmittelgemisch verwendet werden, z. B. eine Mischung, die aus n-Butanol und n-Butylacetat, oder auch eine Mischung, die aus Isoamylacetat und n-Amylacetat, wie sie im technischen Amylacetat vorliegt, besteht. Als Lösungsmittel vorgezogen werden : Äthylacetat, Isoamylacetat, Methyl-n-propylketon und Methylisobutylketon.
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zugsweise vor der Extraktion mit dem geeigneten organischen Lösungsmittel auf einen PH-Wert eingestellt, der zwischen 1, 5 und 4, 0 liegt. Gibberellin-Säure kann aus dem so erhaltenen Extrakt nach bekannten Verfahren isoliert werden, z. B. indem der Extrakt eingeengt und das so erhaltene Rohprodukt gereinigt wird, um Gibberellin-Säure zu ergeben. Zwecks Reinigung der Gibberellin-Säure kann z.
B. Gibberellin- Säure aus dem organischen Lösungsmittel in eine Pufferlösung mit einem PH-Wert von 6 bis 8 extrahiert werden. Der Extrakt wird dann auf einen pH-Wert von 3 bis 4 gebracht und die so freigesetzte Säure mit Äthylacetat extrahiert. Das Äthylacetat wird mit Natriumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen eingeengt, wonach fast reine Gibberellin-Säure auskristallisiert. Zur Verbesserung der Ausbeute kann Leichtbenzin zugesetzt werden.
Die Erfindung wird an Hand von Beispielen ohne Einschränkung auf dieselben erläutert.
Beispiel 1: 3 1 Kulturfiltrat mit einem Gehalt von ungefähr117 mg Gibberellin-Säure werden auf
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einen pH-Wert von 3 eingestellt und dreimal mit je 1 1/2 l Äthylacetat extrahiert. Die ersten und die zweiten Extrakte werden vereinigt, auf 100 cm* eingedampft und dann zweimal mit je 25 cms eines
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WasserGibberellin-Säure, F = 233-235 C unter Zersetzung.
Beispiel 2 : 1 1 eines Kulturfiltrates mit einem ungefähren Gehalt von 39 mg Gibberellin-Säure wird auf ein PR. von 3 gebracht und zweimal mit je 1 l Butylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden eingedampft und das Rohprodukt wie in Beispiel 1 gereinigt. Man erhält auf diese Weise 8 mg Gibberellin-Säure, F = 233-235 C unter Zersetzung.
Beispiel 3 : 2 I eines Kulturfiltrates mit einem Gibberellin-Säure-Gehalt, der ungefähr zwischen
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werdenÄthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetat-Extrakte werden auf ein kleines Volumen eingeengt und dann Leichtbenzin zugesetzt, wonach Gibberellin-Säure auskristallisiert. Man erhält so 708 mg Gibberellin-Säure, F = 233-235 C unter Zersetzung.
Wenn der dritte Extrakt aus dem Kulturfiltrat in gleicher Weise gereinigt wird, erhält man weitere 38 mg Gibberellin-Säure.
Beispiel 4 : 7, 21 eines Kulturfiltrates mit einem ungefähren Gehalt von 450 mgt GibberellinSäure werden mit Phosphorsäure auf ein PH von 2.. 5 eingestellt und dann dreimal mit je 3, 6 I Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden auf 11 eingeengt und dreimal mit einer wässerigen Natrium- bicarbonatlösung extrahiert, so dass der PH-Wert in der wässerigen'Phase auf 7 eingestellt wird, wobei zunächst 500, dann 150 und beim dritten Mal wieder 150 cms des Lösungsmittels verwendet werden. Der wässerige Extrakt wird hierauf auf einPH von 3, 5 eingestellt und dann dreimal mit Äthylacetat extrahiert.
Die Extrakte werden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Die auskristallisierende Gibberellin-Säure wird durch Filtration entfernt, mit Äthylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält so 2, 55 g Gibberellin-Säure, F = 233-234 C unter Zersetzung.
Das oben beschriebene Verfahren wird wiederholt, wobei jedoch während des ganzen Verfahrens an Stelle von Äthylacetat Amylacetat als Lösungsmittel verwendet wird. Man erhält so in gleicher Weise 2, 33 g Gibberellin-Säure, F = 233-234 C unter Zersetzung.
Beispiel 5: 1125 l eines Kulturfiltrates mit einem ungefähren Gehalt von 400 mgt GibberellinSäure werden mitÄthylacetat bei einem PH von 2, 8 extrahiert, wobei ein Podbielniak-Extraktorverwen- det wird. Der Extrakt (54 l) wird im Vakuum auf 351 eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat wird mit einer wässerigen Pufferlösung, die nach Vermischen auf ein PHvon 5,'9 eingestellt ist, extrahiert, wobei der Reihe nach 10,5 und 2 1 Lösungsmittel verwendet werden.
Der erste Extrakt (10 l) wird, nachdem nach Vermischen mit dem Lösungsmittel auf ein PH von 3 eingestellt worden war, dreimal mit Äthylacetat u. zw. mit 5, 2, 5 bzw. l, 25 l extrahiert. Die zweiten und die dritten Pufferextrakte (insgesamt 5 1) werden vereinigt und zweimal (2, 5 und 1, 5 l) mitÄthylacetat extrahiert. Alle Äthylacetat-Extrakte werden hierauf vereinigt und mit einem Kieselgurfiltermittel filtriert und teilweise mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die vereinigten Extrakte werden in zwei Anteile im Vakuum eingeengt. Sobald das Volumen auf 750 cm3 herabgesetzt ist, beginnt Gibberellin-Säure auszukristallisieren, wonach nicht weiter eingedampft wird. Die Mischung wird abgekühlt, filtriert und der feste Rückstand mit Äthylacetat gewaschen und dann an der Luft trocknen gelassen.
Durch Einengen der Mutterlaugenerhältman weiteres festes Material. Die Gesamtausbeute an Gibberellin-Säure beträgt 313, 2 g. F = ! ; 234 - 2350 C unter Zersetzung.
Beispiel 6 : Der Wirkungsgrad der Extraktion der Gibberellin-Säure aus einem wässerigen Fermentationsmedium mittels verschiedener Lösungsmittel wird nach folgendem Verfahren ermittelt.
Eine wässerige Gibberellin-Säure-Lösung, hergestellt durch Lösung von 0, 5 g fein pulverisierter Gib- berellin-Säure in 250 cm 3 destilliertem Wasser, wird abfiltriert, um ungelöste Substanzen zu entfernen.
25 cms dieser Lösung werden dann mit n/100 wässeriger Natriumhydroxydlösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator titriert und die erforderliche Menge an Natriumhydroxydlösung notiert (X).
25 ems der Lösung der Gibberellin-Säure wird dann ungefähr 1 Minute mit 25 cm eines reinen Lö-
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sungsmittels in einem geschlossenen Scheidetrichter geschüttelt. Die wässerige Phase wird dann abgelassen, unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator mit n/100 wässeriger Natriumhydroxydlösung titriert und der Titer notiert (Y). Hierauf wird einLeerversuch mit25 cm3 destilliertem Wasser und 25. cm 3 Lösungsmittel ausgeführt.
Die wässerige Phase wird wieder abgelassen, mit n/100 wässeriger N atriumhydro- xydlösung titriert und der geringe Verbrauch notiert (B).
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Der in Prozenten angegebene Wirkungsgrad der Extraktion für verschiedene Lösungsmittel ist folgender :
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<tb> Verwendetes <SEP> Lösungsmittel <SEP> Wirkungsgrad <SEP> der <SEP> Extraktion <SEP> (%) <SEP>
<tb> Diäthylketon <SEP> 74
<tb> Methyl-n-propylketon <SEP> 79
<tb> Methyläthylketon <SEP> 57
<tb> Methylisobutylketon <SEP> 72
<tb> Diäthylcarbonat <SEP> 39
<tb> Benzylakohol <SEP> 86
<tb> sek.-Butanol <SEP> 85
<tb> n-Amylalkohol <SEP> 91
<tb> Cyclohexanon <SEP> 95
<tb> Methylcyclohexanon <SEP> 87
<tb> Cyclohexanol <SEP> 98
<tb> Äthylpropionat <SEP> 54
<tb> Äthyl-n-butyrat <SEP> 39
<tb> n-Butyllactat <SEP> 89
<tb> Äthylacetat <SEP> 71
<tb> Isopropylacetat <SEP> 57
<tb> B <SEP> - <SEP> Ä <SEP> thoxy <SEP> äthylaceiat <SEP> 88
<tb> n-Butylacetat <SEP> 54
<tb> 3-Methoxybutylacetat <SEP> 88
<tb> n-Butylacetat <SEP> + <SEP> 10 <SEP> % <SEP> n-Butanol <SEP> 73
<tb> Amylacetat <SEP> 68
<tb>
Beispiel 7 :
53501 eines Kulturfiltrates aus einem Fermentator mit einem ungefähren Gehalt von 1170'g Gibberellin-S ure werden mit Äthylacetat bei einem PR von 2 in einem Podbielniak-Extraktor extrahiert. Das erhaltene Äthylacetat (4050 1) wird unter vermindertem Druck auf 247 l eingeengt. Hierauf werden 243 1 dieses Konzentrates der Reihe nach mit 22,5 18 und wieder 18 l Wasser extrahiert, das 1100,100 bzw. 25 g Kaliumbikarbonat enthält, wobei in den wässerigen Extrakten ein PH von 6, 3 erhalten wird.
Die Menge des bei der ersten Extraktion verwendeten Kaliumbikarbonats wird durch Titration eines Anteiles des eingeengten Konzentrates mit n/10 wässeriger Natriumhydroxydlösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator bestimmt, wobei festgestellt wird, dass der eingeengte Extrakt 0,68 n/10 Säure enthält. Die Menge des bei der ersten Extraktion verwendeten Bikarbonats beträgt 2/3 der nach der Titration berechneten Menge. Die drei Bikarbonat-Extrakte werden voneinander getrennt gehalten und mittels einer Zentrifuge von dem Lösungsmittel befreit. Der dritte Extrakt wird mit wässeriger Salzsäure angesäuert und zweimal mit 7. 6 1 Äthylacetat extrahiert, wobei nach Vermischen das PH auf 3,3 eingestellt wird.
Der zweite Extrakt wird dann der Reihe nach mit dem obigen zwei Äthylacetat-Extrakten ex- trahiert, in gleicher Weise angesäuert und dann noch mit 4,5 l Äthylacetat extrahiert. Der erste Bikarbonat-Extrakt wird hierauf der Reihe nach mit den vorher verwendeten drei Äthylacetat-Extrakten und dann noch mit 4, 5 l Äthylacetat extrahiert, wobei die wässerige Phase wieder auf ein PH von 3,3 eingestellt wird. Die vereinigten Äthylacetat-Extrakte (36 l einschliesslich der Waschungen) sind braun gefärbt und werden bis zur einsetzenden Kristallisation der Gibberellin-Säure unter vermindertem Druck eingeengt.
Die Säure wird, nachdem sie einige Stunden stehen gelassen wurde, durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel weiter eingeengt, wobei zusätzliche Gibberellin-Säure erhalten wird. Hierauf wird zur Ent-
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femung der Färbung mit Äthylacetat gewaschen. Man erhält eine weisse, kristalline Substanz, F =234 bis 2350 C, deren Gewicht nach Trocknung im Vakuum bei 400 C 947 g oder 81 % der Substanz in der ur- sprünglichen Lösung beträgt.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Extraktion von Gibberellin-Säure aus wässerigen Fermentations-Substraten dieser Säure-". dadurch gekennzeichnet, dass die Extraktion mittels mit Wasser nicht mischbaren oder nur teilweise mischbaren Estern, Alkoholen oder Ketonen, die nicht mehr als 8 Kohlenstoffatome enthalten, erfolgt.