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Verfahren zur Abtrennung von Vitamin B12 und/oder ähnlichen Substanzen
aus wäßrigen Lösungen Die Erfindung bezieht sich auf die Abtrennung von Vitaminsubstanzen,
welche LLD-(Lactobacillus Lactis Dorner-) Aktivität und APF-(Tierische Eiweißfaktor-)
Aktivität besitzen, insbesondere auf die Gewinnung von Vitamin B12 und Vitamin-B1,-ähnlichen
Substanzen aus wäßrigen Lösungen.
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Die Gewinnung von Vitamin B12 und/oder Vitamin-Bläähnlichen Verbindungen
aus wäßrigen Lösungen, wie z. B. die betreffenden Verbindungen enthaltende Kulturflüssigkeiten,
ist bisher im allgemeinen derart erfolgt, daß die betreffenden Flüssigkeiten mit
einem adsorbierenden Material, wie Aktivkohle oder Fullererde, in Berührung gebracht
wurde und dadurch Adsorbate gebildet wurden, welche Vitamin B12 und/oder Vitamin-BRähnliche
Verbindungen in Gemeinschaft mit verschiedenen Verunreinigungen enthielten. Die
Adsorbate wurden dann einer Extraktion mit geeigneten Lösungsmitteln, z. B. einer
wäßrigen Lösung von Pyridin oder alkylsubstituiertem Pyridin unterworfen und der
so erhaltene Auszug durch Eindampfen in ein Arbeitsprodukt übergeführt wurde, der
das Vitamin B12 und die Vitamin-B18-ähnlichen Verbindungen enthielt. Das so erhaltene
Arbeitsprodukt wurde mit einem Lösungsmittel, wie z. B. Wasser oder einem niedrigen
aliphatischen, mit Wasser mischbaren Alkohol, extrahiert und der hierbei erhaltene
Auszug einer chromatographischen Fraktionierung unterworfen, z. B. derart, daß der
Auszug in eine Kolonne eingeführt wurde, die mit adsorbierendem Material beschickt
war und die
Kolonne zwecks fraktionierter Gewinnung eines Auszugs
mit einem Lösungsmittel gewaschen wurde, welches das aus dem Adsorptionsmaterial
gewonnene Vitamin B12 und/oder die Vitamin-B12 ähnlichen Verbindungen enthielt.
Der so erhaltene Auszug kann alsdann noch einer zur Gewinnung von reinem Vitamin
B12 oder von reinen Vitamin-B"-ähnlichen Substanzen geeigneten, von Begleitstoffen
befreiten Substanzen unterworfen werden.
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Die Gewinnung eines mit Vitamin angereicherten, für die Chromatographie
geeigneten Extraktes aus einer Vitamin B12 und/oder Vitamin-B"-ähnlichen Verbindungen
enthaltenden Kulturflüssigkeit erforderte bisher die folgenden Reinigungsoperationen:
i. Adsorption des Vitamin B12 und/oder der Vitamin-B12-ähnlichen Verbindungen aus
der Kulturflüssigkeit unter Verwendung von Aktivkohle oder Fullererde als Adsorptionsmittel.
2. Extrahieren des Adsorbates mit Pyridin. 3. Eindampfung des Pyridinauszugs. 4.
Extraktion des Arbeitsproduktes mit einem anderen Lösungsmittel.
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Das bekannte, vorstehend erläuterte Verfahren gestattet zwar die Gewinnung
von Vitamin B12 und Vitamin-B"-ähnlichen Substanzen aus Kulturflüssigkeit, stellt
aber eine teure und insbesondere vom industriellen Standpunkt aus zu unrationelle
Methode dar. Das bekannte Verfahren ist unter anderem mit verhältnismäßig hohen
Verlusten an aktiven Substanzen bei der Behandlung der Auszüge verbunden. Es sind
bereits Versuche gemacht worden, bei denen Kohle als Adsorptionsmittel verwendet
wurde und das hierbei erhaltene Adsorbat mit einer Zweiphasenmischung, bestehend
aus Wasser und Butan, behandelt wurde. Man hat auch, wie bereits oben erwähnt, Fullererde
als Adsorptionsmittel für LLD-aktive Komponenten aus Kulturflüssigkeiten verwendet,
aber die Anwendung von Fullererde bei der Gewinnung von Vitamin B12 macht umständliche
Arbeitsmaßnahmen sowohl bei den Adsorptionsstufen wie auch bei den Extraktionsstufen
erforderlich. Die praktisch sehr wertvollen Kolonnenoperationen haben sich sowohl
bei Anwendung von Aktivkohle wie auch bei Anwendung von Fullererde als nicht anwendbar
erwiesen.
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Erfindungsgemäß werden demgegenüber Vitamin B12 und Vitamin-B"-ähnliche
Verbindungen aus wäßrigen Lösungen, wie z. B. Kulturflüssigkeiten, in besonders
vorteilhafter Weise gewonnen, wenn man als Adsorptionsmittel ein etwa neutrales,
poröses, entfärbendes Harz verwendet, das polare Substituenten in Form von Hydroxylgruppen
oder Aminogruppen aufweist. Diese Harze sind dadurch gekennzeichnet, daß sie keine
oder nur geringfügige basische oder saure Eigenschaften besitzen. Diese etwa.neutralen,
porösen Entfärbungsharze, bei denen Ionenaustauscheigenschaften, wenn überhaupt
vorhanden, stark in den Hintergrund treten, bilden eine wohlbekannte Klasse von
Kunstharzen, welche bereits für die Adsorption von Nebenprodukten bei der Reinigung
von Glukose Verwendung gefunden haben. Die Herstellung und die Eigenschaften derartiger
etwa neutraler, poröser Entfärbungsharze sind unter anderen aus den holländischen
Patentschriften 64 732, 59 499 und der USA.-Patentschrift 2 389 865 bekannt. Für
vorliegende Zwecke haben sich Amin-Formaldehyd-Kunstharze, welche unter der geschützten
Bezeichnung Permutit DR-Harz bekannt sind, als sehr gut geeignet erwiesen. Diese
Harze besitzen eine hochporöse Struktur und enthalten polare Substituenten in Form
von Aminogruppen. Das Harz hat eine niedrigbasische, auf Anwesenheit der Aminogruppe
beruhende Dissoziationskonstante und besitzt nur schwach basische Eigenschaften.
Weiterhin haben sich poröse, entfärbende Harze als gut geeignet erwiesen, welche
phenolische, polare Substituenten enthalten und eine sehr niedrige saure Dissoziationskonstante
und infolgedessen nur ganz schwach saure Eigenschaften besitzen. Derartige phenolische
Adsorptionsmittel können z. B. wie folgt hergestellt werden: Zu einer Mischung von
i Mol Phenol und 2"45 Mol Formaldehyd (= 185 ccm einer handelsüblichen, 37 Gewichtsprozent
Formaldehyd enthaltenden Formaldehydlösung) gibt man eine Lösung von 2 g NaOH in
68 ccm Wasser und erhitzt 2 Stunden in einem Glasgefäß unter Rückfluß auf 94°, wobei
sich ein Harz in Form eines weißen, undurchsichtigen Gels zu bilden beginnt, dessen
Struktur und Härte durch eine etwa einstündige Weitererhitzung noch verbessert werden
kann. Eine geringe Menge Flüssigkeit, die sich bei Durchführung dieses Vorgangs
gebildet hat, wird durch Waschen mit Wasser entfernt. Anschließend erhitzt man das
Gel zur Vervollständigung der Reaktion in einer Bombe i Stunde auf i2o°, wobei keine
wesentliche Schrumpfung mehr stattfindet. Durch Trocknen des Gels bei 45° mit Heißluft
erhält man als Endprodukt einen weißlichen, festen, leichten, porösen Körper.
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Die Verwendung von neutralen bzw. praktisch neutralen, porösen Entfärbungsharzen
mit polaren Substituenten bietet unter anderem den Vorteil, daß besonders reine
Produkte in höheren Ausbeuten gewonnen werden können als bei der bekannten Verwendung
von Aktivkohle oder Fullererde als Adsorptionsmittel. Während bei Verwendung von
Aktivkohle oder Fullererde die Adsorptionsstufe nur zur Konzentration dient und
eine Anzahl von komplizierten Reinigungsstufen angeschlossen werden muß, erhält
man bei Verwendung von Entfärbungsharzen der beanspruchten Art als Adsorptionsmittel
aus den behandelten Kulturflüssigkeiten unmittelbar Produkte, welche bereits weitgehend
frei sind von unerwünschten Bestandteilen. Dies wirkt sich unter anderem in den
sehr hohen Ausbeuten an Vitamin B12 aus, welche nach dem Verfahren der Erfindung
erhalten werden. Dies beruht wesentlich darauf, daß die bisher bei Durchführung
der komplizierten Reinigungsverfahren auftretenden Verluste an Vitamin B12 wegfallen.
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Das an die erfindungsgemäß anzuwendenden Harze adsorbierte Vitamin
B12 und die Vitamin-B1.-ähnlichen Verbindungen können aus den Adsorbaten leicht
extrahiert und in fast quantitativer Ausbeute gewonnen werden. Als Extraktionsmittel
kommen wäßrigorganische Lösungen, insbesondere eine saure wäßrige Acetonlösung,
in Betracht. Das Extraktionsverfahren liefert nicht nur Auszüge, die das in dem
Adsorbat vorhandene Vitamin B12 und ähnliche Verbindungen fast quantitativ enthalten,
sondern es gestattet auch
eine noch weitergehende Reinigung der
aktiven Substanzen, die auf der selektiven Wirkung der Lösungsmittel beruht, welche
die mit den Wirkstoffen gleichzeitig adsorbierten Verunreinigungen im wesentlichen
in dem Harz belassen. Die erfindungsgemäß anwendbaren Extraktionsflüssigkeiten können
leicht wiedergewonnen werden im Gegensatz zu den verhältnismäßig kostspieligen und
mühsamen Verfahren zur Wiedergewinnung des Pyridins, das bisher zur Extraktion der
aktiven Stoffe aus den Aktivkohleadsorbaten verwendet wurde.
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Als Extraktionsmittel für Vitamin B12 und Vitamin-B,2-ähnliche Verbindungen
aus den Harzadsorbaten nach der Erfindung werden vorzugsweise wäßrigorganische Lösungen
verwendet, die verschiedene Grade von Wirksamkeit zu entfalten vermögen. Wie bereits
erwähnt, haben sich saure, wäßrige Acetonlösungen besonders bewährt. Zum Ansäuern
werden vorzugsweise starke Säuren verwendet, welche, wie z. B. Schwefelsäure, mehr
als i Wasserstoffatom besitzen-und welche eine Dissoziationskonstante für das erste
Wasserstoffatom von mehr als i # io-3 aufweisen. Vorteilhaft wird zum Ansäuern eine
o, i-n-Lösung einer solchen Säure verwendet. Die optimale Acetonkonzentration liegt
zwischen etwa 30 und 6o %. Schwache Säuren, wie z. B. Essigsäure, können zwar ebenfalls
zum Ansäuern der wäßrigen Acetonlösung Verwendung finden. Die Wirksamkeit der Lösung
ist aber dann geringer. An Stelle von Aceton können eine Anzahl von anderen organischen
Lösungsmitteln verwendet werden. In Betracht kommen unter anderem andere Ketone,
niedere aliphatische Alkohole, Ester, Benzylalkohol u. dgl. Die anzuwendenden Lösungsmittel
sollen zumindest zum Teil mit Wasser mischbar sein. Die zum Teil mit Wasser mischbaren
Lösungsmittel können in Mengen bis zur Grenze ihrer Löslichkeit in Wasser angewendet
werden. Toluol, Benzol, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid u. dgl. Lösungsmittel
haben sich nicht als gut geeignet erwiesen.
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Saure Extraktion in Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels ist
im allgemeinen nicht gut geeignet für die Entfernung der aktiven Substanzen. Eine
Anzahl von wäßrig-organischen Lösungen, die keine Säure enthalten, können dagegen
zu einer mäßig guten Extraktion Verwendung finden. In Betracht kommt z. B. wäßriges
Aceton, mit n-Butanol gesättigtes Wasser, wäßriger Äthylenglykolmonoäthylester.
Auch mit wäßrigem Methanol, wäßrigem Äthanol, wäßrigem Äthylacetat und auch mit
Wasser gesättigtem Benzylalkohol kann die Extraktion durchgeführt werden. Es ist
aber allgemein vorzuziehen, ein saures wäßrig-organisches Lösungsmittel für die
Extraktion der Adsorbate zu verwenden. Auch wäßrige Lösungen von starken Basen können
zur Extraktion von Vitamin B12 und/oder Vitamin-B1,-ähnlichen Verbindungen aus dem
Adsorbat Verwendung finden. Bei Anwendung derartiger Lösungen werden aber zugleich
auch beträchtliche Mengen von adsorbierten Verunreinigungen entfernt. Es ist infolgedessen
vorzuziehen, zur Extraktion der Vitamin-B1,-Komponente ein saures wäßrig-organisches
Lösungsmittel zu verwenden. Wie gefunden wurde, können wäßrige schwach alkalische
Lösungen zur Entfernung wesentlicher Mengen von adsorbierten Verunreinigungen verwendet
werden, während hierbei Vitamin B12 und/oder Vitamin-13,-ähnliche Verbindungen nicht
oder nur in sehr geringem Ausmaß in Lösung übergeführt werden. Es empfiehlt sich
infolgedessen, der Extraktion der aktiven Substanzen eine Waschbehandlung des Adsorbats
mit einer schwach alkalischen Lösung, die z. B. etwa i o/0 Alkalicarbonat und o,
i o/o Alkalinitrit enthält, vorzuschalten. In diesem Falle enthalten die anschließend
daran gewonnenen Auszüge der aktiven Stoffe weniger Verunreinigungen.
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In Fällen, in denen das adsorbierende Kunstharz erstmals Verwendung
findet, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, das Harz einer die Eigenschaften desselben
verbessernden Vorbehandlung zu unterwerfen. Bei Anwendung der Phenol-Formaldehyd-Kunstharze,
deren Herstellung oben beschrieben wurde, wird z. B. das Harz zunächst in eine Kolonne
gebracht und mit einer wäßrigen alkalischen Lösung gewaschen. Auf 453 g werden dabei
als Waschflüssigkeit etwa 3,785 1 einer 2o/oigen wäßrigen Natriumhydroxydlösung
verwendet. Die Lösung wird mit einer Berührungszeit (Volumen des Harzes in Kubikzentimeter,
dividiert durch die Strömungsgeschwindigkeit in Kubikzentimeter pro Minute) von
etwa 25 bis 30 Minuten durch die Kolonne geführt. Die Behandlung des Phenol-Formaldehyd-Kunstharzes
mit Alkali verursacht eine Farbänderung des Harzes von Lohfarben zu Purpur. An die
alkalische Waschung wird eine Waschung mit Wasser angeschlossen, wobei 453g des
Harzes etwa 7,5701 Wasser mit einer Berührungsdauer, die der vorstehend angegebenen
entspricht, Verwendung findet.
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Vorteilhaft wird an die vorbereitende Wasserwaschung eine Säurebehandlung
angeschlossen, bei der auf je 453 g Harz etwa 3,028 1 einer 2o/oigen wäßrigen
Lösung von Chlorwasserstoff Verwendung findet und die Berührungsdauer etwa 14 Minuten
beträgt. Bei der Behandlung von Phenol-Formaldehyd-Kunstharz mit Säure findet eine
Farbänderung des Harzes von Purpur zu Lohfarben statt. An die Säurebehandlung wird
eine zweite Wasserwaschung angeschlossen, wobei auf je 453 g Kunstharz etwa 37851
Wasser Verwendung findet und die Berührungsdauer etwa 14 Minuten beträgt. Nunmehr
kann noch eine zweite alkalische Waschung des Harzes in der oben beschriebenen Weise
durchgeführt werden, und an diese schließt sich eine Waschung mit Wasser mit etwa
25 bis 30 Minuten dauernder Berührung an, bis der pH-Wert der ablaufenden
Flüssigkeit etwa 7 bis 8 beträgt.
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Nach dieser die Eigenschaften des Kunstharzes für den vorliegenden
Verwendungszweck verbessernden Vorbehandlung befindet sich das Harz in einem für
die Adsorption geeigneten Zustand. Der pH-Wert des Harzes ist nicht von entscheidender
Wichtigkeit, da er sich verhältnismäßig rasch auf den PH-Wert der behandelten Lösung
einstellt.
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Die zu behandelnde Lösung kann mit dem Harz durch einen einfachen
Mischvorgang zusammengebracht werden. Es hat sich aber als vorteilhaft erwiesen,
die Lösung durch eine mit dem Harz
beschickte Kolonne zu leiten.
Hierbei kann der Durchfluß aufwärts oder abwärts erfolgen. Für die Durchführung
des Verfahrens in Kolonnen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, Kunstharz zu verwenden,
dessen Teilchengröße etwa 2o bis 6o Maschen pro 2,54 cm entsprechen.
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Die zu behandelnde Kulturflüssigkeit wird vorzugsweise bei einem pH
Wert von etwa 5 bis 8 zur Anwendung gebracht, um eine unerwünschte Zersetzung von
aktiven Substanzen zu vermeiden, die bei höheren oder niederen pH-Werten eintreten
könnte. Der pH-Wert ist aber nicht als kritisch für die Wirksamkeit der Adsorption
anzusehen. Bei der Auswahl der Methoden, unter denen das Kunstharz erfindungsgemäß
zur Anwendung gebracht wird, ist man nicht an enge Vorschriften, z. B. mit Bezug
auf Mengenverhältnisse, Durchflußgeschwindigkeit usw., gebunden. Diese Bedingungen
sind abhängig von der Beschaffenheit und der Zusammensetzung der behandelten Lösungen
und von wirtschaftlichen Betrachtungen, z. B. mit Bezug auf das Volumen der zu behandelnden
Lösung, die Apparatur und die räumlichen Erfordernisse. Es empfiehlt sich, die optimalen
Bedingungen durch einige Vorversuche zu ermitteln. Bei Anwesenheit einer größeren
Anzahl von unerwünschten Substanzen in der zu behandelnden Ausgangslösung ist im
allgemeinen eine etwas größere Menge von Kunstharz erforderlich. Auch die Art der
vorhandenen unerwünschten Substanzen stellt einen beachtlichen Faktor dar. Im allgemeinen
erhöht sich der Prozentgehalt der adsorbierten Stoffe im Kunstharz mit der Erhöhung
der Berührungsdauer bis zu einem gewissen Punkt, so daß die angewendete Harzmenge
bei längerer Berührungsdauer entsprechend vermindert werden kann. Bei der Extraktion
des Adsorbats kann die Menge des Extraktionsmittels bei längerer Berührungsdauer
bis zu einem gewissen Punkt vermindert werden bei entsprechender Erhöhung der Konzentration
von aktiven Substanzen in den Auszügen.
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Nachstehend sei die Erfindung an Hand einer Kulturflüssigkeit, welche
mit Hilfe von Streptomyces griseus erzeugt worden ist und die Vitamin B12 und/ oder
andere Vitamin-B1,-ähnliche Verbindungen enthält unter Verwendung von Formaldehyd-Phenol-Kunstharz,
beispielsweise veranschaulicht.
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Die Fermentierung der Nährflüssigkeit mit Streptomyces griseus wurde
in üblicher Weise durchgeführt. Die fermentierte Flüssigkeit enthielt eine LLD-Aktivität
von 2ooo bis ioooo E pro Kubikzentimeter. Zur Prüfung wurde L. Lactis Dorner als
Testorganismus und Vitamin B12 als Standardpräparat verwendet. Zur Durchführung
der Kolonnenoperation wurden etwa 170,325 bis 189,25o 1 Kulturflüssigkeit (6ooo
E LLD-Aktivität je Kubikzentimeter) je 453 g Harz verwendet. Die Berührungszeit
betrug etwa io Minuten (der Durchfluß betrug etwa 0,9741 in der Minute durch 453
g Harz). Die in dem Abfluß aus der Kolonne noch befindlichen aktiven Substanzen
können zurückgewonnen werden, indem der Abfluß durch eine zweite mit Harz beschickte
Kolonne geleitet wird. Es können zwei oder mehr Kolonnen in Reihen betätigt werden,
wobei alternativ extrahiert und einzelne Kolonnen regeneriert werden können. Nach
Adsorption wird die Kolonne mit etwa 5,678 1 Wasser je 453 g Harz bei einer Berührungsdauer
von etwa io Minuten ausgewaschen. Hierbei wird die letzte in der Kolonne befindliche
Kulturflüssigkeit verdrängt. Stark gefärbte Verunreinigungen, welche zu Störungen
Veranlassung geben könnten, werden in darauffolgenden Reinigungsoperationen beseitigt.
An die Adsorption und die Verdrängung der Kulturflüssigkeit mit Wasser wird ein
Waschvorgang mit einer wäßrigen Lösung, enthaltend i °/o Alkalicarbonat und o,i
0,1, Alkalinitrit, angeschlossen, wobei je 453 g Kunstharz 1,893 1 Waschflüssigkeit
verwendet werden und die Berührungszeit etwa 6o Minuten betragen kann. Durch diesen
Waschvorgang werden stark gefärbte Verunreinigungen entfernt, indem sie in mit Wasser
extrahierbare Form übergeführt werden. Die Kolonne wird alsdann mit etwa 9,463 1
Wasser je 453 g Harz bei einer Berührungsdauer von etwa io Minuten gewaschen.
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Zur Extraktion des Adsorbats können etwa 3,785 1 Extraktionsflüssigkeit
j e 453 g Harz verwendet werden. Vorzugsweise wird angesäuertes wäßriges Aceton
als Extraktionsmittel verwendet und die Berührungsdauer auf etwa 2o bis 6o Minuten
bemessen. Die erforderliche Menge Extraktionsflüssigkeit kann durch Beobachtung
bestimmt werden. Nachdem das Wasser aus der Kolonne verdrängt ist, geht ein leicht
gelber oder brauner Vorlauf ab, der gesammelt wird, bis der Abfluß dunkel, z. B.
rotschwarz, wird. Diese Farbe zeigt den Beginn des reichen Abflusses an, der separat
aufgefangen wird, bis die Farbe in Hellgelb bis Hellbraun übergeht. Der dann noch
abgehende Nachlauf wird ebenfalls separat aufgefangen. (Ein ähnlicher Vorgang tritt
auch bei Extraktion von Amin-Formaldehyd-Harz in Erscheinung, nämlich von Bräunlichrot
zu Gelb.) Wie gefunden wurde, sind nur geringfügige Mengen von aktiven Substanzen
in dem Vorlauf und dem Nachlauf vorhanden. Man kann sich infolgedessen im allgemeinen
mit der Aufarbeitung des reichen Ablaufs begnügen. Die restliche, in der Kolonne
verbleibende Flüssigkeit kann durch Wasser aus dieser verdrängt werden.
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Das Harz wird alsdann durch Waschen mit einer wäßrigen alkalischen
Lösung regeneriert. Hierbei kann man etwa 3,785 1 Waschflüssigkeit, bestehend aus
einer 2°/oigen Natriumhydroxydlösung je 453 g Harz, anwenden und die Berührungsdauer
auf etwa 25 bis 30 Minuten bemessen. Die Kolonne wird alsdann mit Wasser
gewaschen, bis der pH-Wert des Abflusses etwa 7 bis 8 beträgt. Alsdann ist die Kolonne
wieder für einen neuen Adsorptionsvorgang bereit. Beispiel i In jeder von zwei Glaskolonnen
(5,o8 cm lichte Weite), die in Reihe miteinander verbunden sind, wurden 250o ccm
Phenol-Formaldehyd-Harz (Korngröße 2o bis 6o Maschen auf 2,54 cm) eingefüllt. Das
Harz wurde erstmalig zur Adsorption von LLD-aktiven Substanzen verwendet und infolgedessen
einer verbessernden Vorbehandlung mit abwechselnd
alkalischen und
sauren Waschungen unterworfen und zum Schluß im Anschluß an eine saure Waschung
durch Waschen mit Wasser auf einen pH-Wert von 4 bis 5 eingestellt.
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378,51 einer ursprünglich streptomycinhaltigen Kulturflüssigkeit,
die zuvor von Streptomycin befreit worden ist, wurde bei px 6,2 unter Verwendung
von L. Lactis Dorner als Testorganismus und von Vitamin B12 als Standardpräparat
geprüft, wobei festgestellt wurde, daß die Flüssigkeit 58oo Aktivitätseinheiten
je Kubikzentimeter aufwies (iiooo E sind äquivalent der Aktivität von etwa i Mikrogramm
Vitamin B12) und im ganzen etwa 21,9 - ioe LLD-Aktivitätseinheiten aufwies. Die
Flüssigkeit wurde in aufsteigendem Strom durch die beiden hintereinandergeschalteten
Kolonnen geleitet. Die Gesamtberührungsdauer betrug etwa 2o Minuten (etwa 25o ccm;'Min.).
Der Rest der Flüssigkeit wurde mit Wasser aus der Kolonne verdrängt. Eine Prüfung
des Abflusses ergab, daß insgesamt etwa 2,8 - io8 LLD-Aktivitätseinheiten vorhanden
waren. Demnach sind etwa i9,i - io8 Aktivitätseinheiten (87,2 °/a) in den Kolonnen
adsorbiert worden. Die hintereinandergeschalteten Kolonnen wurden dann mit etwa
15 1 Wasser mit einer Gesamtberührungsdauer von etwa 20 Minuten gewaschen. Die Waschflüssigkeit
zeigte bei Prüfung schwache LLD-Aktivität.
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jede Kolonne wurde alsdann für sich mit einem Gemisch von 4o Raumteilen
Wasser mit 6o Raumteilen Aceton, das mit n/i-Chlorwasserstoffsäure versetzt worden
war, bei einer Berührungsdauer von etwa 2o Minuten extrahiert. Etwa 61oo ccm des
reichen Abflusses wurden aus der ersten Kolonne und etwa 69oo ccm aus der zweiten
Kolonne gesammelt. Die Gesamtaktivität des reichen Extraktes betrug etwa 18,7 -
io8 LLD-Aktivitätseinheiten (etwa 98°/a der adsorbierten Einheiten). Beispiel 2
In jede von zwei hintereinandergeschalteten Glaskolonnen (2,54 bis 4,57 cm lichte
Weite) wurden ioo ccm Phenol-Formaldehyd-Harz (Korngröße 20 bis 6o Maschen auf 2,54
cm) eingefüllt. Das Harz hatte bereits früher zur Adsorption von LLD-aktiven Substanzen
Verwendung gefunden und ist anschließend durch Waschen mit Alkali, Säure und Wasser,
auf PH 4 bis 5 regeneriert worden.
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6 1 einer ursprünglich streptomycinhaltigen Kulturflüssigkeit wurden
nach Befreiung von Streptomycin bei pH 6,3 mit Hilfe von L. Lactis Dorner geprüft.
Hierbei ergab sich, daß die Flüssigkeit etwa 82oo Aktivitätseinheiten je Kubikzentimeter
aufwies oder insgesamt etwa 49,2 - ioe Aktivitätseinheiten hatte. Der Flüssigkeit
wurden o,75 mg radioaktives Vitamin B12" zugefügt. Die totale LLD-Aktivität nach
dieser Zufügung war etwa 55,1 - iog E.
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Die Flüssigkeit wurde dann in abwärts gerichtetem Strom durch die
beiden hintereinandergeschalteten Kolonnen geleitet, und zwar mit einer Gesamtberührungsdauer
von etwa 35 bis 40 Minuten (etwa 5 bis 6 ccm/Min.). Die restliche Flüssigkeit wurde
aus der Kolonne mit Wasser verdrängt. Der Abfluß wurde auf LLD-Aktivität geprüft
und seine Radioaktivität gemessen. Es ergab sich, daß 95 °j, der LLD-aktiven Substanzen
und 9i °/o des radioaktiven Materials in der Kolonne adsorbiert waren. Die hintereinandergeschalteten
Kolonnen wurden dann mit etwa 2,5 1 Wasser bei einer- Berührungsdauer von etwa 2o
'.Minuten ausgewaschen.
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jede Kolonne wurde alsdann mit einem Gemisch von 4o Raumteilen Wasser
mit 6o Raumteilen Aceton, das mit Salzsäure o,i normal gemacht worden war, gewaschen,
Die Berührungszeit betrug hierbei etwa 6o bis 75 Minuten. Das Volumen des Abflusses
aus der ersten Kolonne betrug etwa 6oo ccm. Von diesen wurden 315 ccm als
reiche Fraktion gesammelt. Das Volumen des Abflusses aus der zweiten Kolonne war
etwa 5ooo ccm. Hiervon wurden etwa 2ooo ccm als reiche Fraktion gesammelt. Die reichen
Fraktionen wurden auf LLD-Aktivität geprüft, und ihre Radioaktivität wurde gemessen.
Es ergab sich, daß fast die gesamte LLD-Aktivität und die radioaktive Substanz in
den reichen Fraktionen vorhanden waren. Das Verhältnis der Aktivität der reichen
Fraktion aus der ersten Kolonne zu der Aktivität der reichen Fraktion aus der zweiten
Kolonne war etwa io : i für jede Art der Aktivität.
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Bei Wiederholung des vorstehend beschriebenen Verfahrens unter Verwendung
einer ursprünglich streptomycinhaltigen Kulturflüssigkeit, der radioaktives Vitamin
B12 zugesetzt wurde, wurde ebenfalls gefunden, daß die Adsorption und die Ergebnisse
der Extraktion hoch waren. Es wurde gefunden, daß dieses Verfahren sehr wirksam
ist für die Trennung von LLD-aktiven Substanzen, insbesondere Vitamin B12 und Vitamin-B1,-ähnliche
Verbindungen, wie Vitamin B12, aus fermentierten Kulturflüssigkeiten. Beispiel 3
189,251 einer ursprünglich streptomycinhaltigen Kulturflüssigkeit (pH 6,2) zeigte
nach Abtrennung des Streptomycins eine totale LLD-Aktivität von 5,5 '
108. Die Kulturflüssigkeit wurde durch 3900 ccm Phenol-Formaldehyd-Harz
(px = 8) geleitet. Das Harz wurde in eine Kolonne (lichte Weite 2,54) (140o ccm)
und eine Kolonne (lichte Weite 5,o8 cm) (25oo ccm). eingefüllt und die Flüssigkeit
in abwärts gerichtetem Strom durch die hintereinandergeschalteten Kolonnen geleitet.
Die gesamte Berührungszeit betrug etwa 28 Minuten. Nach Auswaschen mit Wasser waren
etwa 75 °/a der Aktivität in der Kolonne zurückgehalten. jede Kolonne wurde alsdann
für sich extrahiert, und zwar mit einer Mischung von 40 °/o Wasser und 6o °/o Aceton.
Die Berührungszeit betrug etwa 2o Minuten. Es wurden etwa 21,5o ccm des reichen
Abflusses aus der ersten Kolonne und etwa 134 ccm aus der zweiten Kolonne gesammelt.
Die gesamte Aktivität in den reichen Extraktfraktionen betrug etwa 96 °/o der adsorbierten
Einheiten. Beispiel 4 18,9251 einer ursprünglich streptomycinhaltigen Kulturflüssigkeit
(PH 7,4) zeigten nach Abtrennung des Streptomycins eine totale LLD-Aktivität von
i,i - io8 E. Die Flüssigkeit wurde durch i54 ccm
Phenol-Formaldehyd-Harz
(prr 8), das sich in einer Kolonne (lichte Weite 2,54 cm) befand, in abwärts gerichtetem
Strom geleitet. Die Berührungszeit betrug 51/2 Minuten. Nach Waschen mit Wasser
wurde festgestellt, daß 73 °/o der Aktivität in der Kolonne zurückgehalten worden
ist. Die Kolonne wurde dann mit Wasser, das mit n-Butanol gesättigt war, bei einer
Berührungszeit von etwa ii Minuten behandelt. Etwa 95o ccm des reichen, aus der
Kolonne abgehenden Extrakts wurden gesammelt. Die Aktivität in dieser reichen Extraktionsfraktion
war etwa 55 0% der adsorbierten Aktivität. Beispiel 5 Drei Kolonnen (lichte Weite
2,54 cm), von denen jede 154 ccm Phenol-Formaldehyd-Harz (p$ 8) enthielt, wurden
parallel geschaltet. 18,9251 ursprünglich streptomycinhaltige Kulturflüssigkeit
(prr 6,5) zeigten nach Entfernung des Streptomycins eine Gesamt-LLD-Aktivität von
5,2 - io7 E. Die Flüssigkeit wurde durch jede Kolonne von oben nach unten geleitet.
Die Berührungszeit betrug in jedem Falle etwa 5 Minuten. Nach Waschen mit Wasser
wurde festgestellt, daß 84 bzw. 82 bzw. 82 % der Aktivität in den Kolonneni bzw.2
bzw.3 zurückgehalten worden ist. Die einzelnen Kolonnen wurden dann mit verschiedenen
Lösungen extrahiert, und zwar Nr. i mit einer ?Mischung von 40 °/o Wasser und 6o
°/o Aceton, die mit Salzsäure o,i normal gemacht wurde; Nr. 2 mit Wasser, das mit
n-Butanol gesättigt war und mit Salzsäure o,i normal gemacht wurde, und Nr. 3 mit
einer Mischung von 40 % Wasser und 6o °/o Aceton, die mit Phosphorsäure o,i
normal gemacht wurde. Die Berührungszeit betrug in jedem Falle etwa io Minuten.
Etwa 455 bzw. 62o bzw. 365 ccm reichen Extrakts wurden aus den Kolonnen i bzw. 2
bzw. 3 gewonnen. Die Aktivität der reichen Extraktfraktion betrug etwa 96 bzw. 78
bzw. 98°/a derAktivität, die in den Kolonnen i bzw. 2 bzw. 3 adsorbiert worden ist.
Bei einem anderen Versuch wurde festgestellt, daß die Extraktion mit einem Gemisch
von 7o % Wasser und 30 °/o Aceton, welches mit Phosphorsäure o,i normal gemacht
wurde, etwa ebenso wirkungsvoll war als die oben verwendete Mischung von 40 % Wasser
mit 6o °/o Aceton, die ebenfalls mit Phosphorsäure angesäuert worden war. Beispiel
6 Zwei Kolonnen (lichte Weite 2,5q. cm), von denen jede 154 ccm Phenol-Formaldehyd-Harz
(prr 8) enthielt, wurden in Parallelschaltung angeordnet. i8,9251 ursprünglich streptomycinhaltige
Kulturflüssigkeit (prr 6,2), welche nach Entfernung des Streptomycins eine totale
LLD-Aktivität von 6,1 - 107 Einheiten aufwies, wurde durch jede Kolonne in
abwärts gerichtetem Strom geleitet. Nach Waschen mit Wasser wurde festgestellt,
daß in jeder Kolonne etwa 84 °/o der Aktivität zurückgehalten worden waren.
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Die Kolonne I wurde mit einem Gemisch von 40°/0 Wasser mit 6o °/o
Aceton, das mit Schwefelsäure o,i normal gemacht worden war, extrahiert. Die Kolonne
II wurde mit einer Mischung extrahiert, die 40 °/o Wasser und 6o °/o Aceton enthielt
und die mit Essigsäure o,i normal gemacht worden war. Die Berührungszeit betrug
in jedem Falle etwa io Minuten. Aus Kolonne I wurden 4oo ccm reichen Extrakts und
aus Kolonne II etwa. 3oo ccm reichen Extrakts gesammelt. Die Aktivität der reichen
Extraktionsflüssigkeit betrug etwa ioo °/o der Aktivität, die in Kolonne I und etwa
70 °/a der Aktivität, die in Kolonne II adsorbiert worden war. Beispiel 7 Durch
Fermentierung von üblichen Nährflüssigkeiten mit drei repräsentativen Spezies von
Mikroorganismen, die befähigt sind, LLD-aktive und APF-aktive Substanzen zu erzeugen,
wurden Kulturflüssigkeiten hergestellt. Angewendet wurden i. Mycobacterium szemgmatis,
2. Pseudomonas lumichroma (eine neue Spezies von Pseudomonas, die fähig ist, Riboflavin
zu Lumichrom zu oxydieren, vgl. J. W. Foster, I. Bact. 47, 27 bis 41 [19q4]) und
3. Alternaria species.
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Jede der so erhaltenen Kulturflüssigkeiten wurde bei pH 7 in abwärts
gerichtetem Strom durch eine Kolonne (lichte Weite 2,54 bis 4,57 cm) geleitet, von
denen jede ioo ccm Phenol-Formaldehyd-Harz (pa 5) enthielt. Das Harz wurde vorher,
wie beschrieben, durch Waschen mit Alkali, Säure und Wasser regeneriert. Die Berührungszeit
betrug in jedem Falle etwa 3 Minuten. Die Flüssigkeitsvolumina und die total'
3 1 en LLD-Aktivitäten waren i. 3ooo ccm und 1o,8 - los E, 2. 2925 ccm und
19,3 - los E und 3. 2695 ccm und 12,3 - los E.
-
Nach Waschen mit Wasser wurde festgestellt, daß fast die gesamte Aktivität
in den Kolonnen zurückgehalten worden ist. Jede Kolonne wurde dann mit einem Gemisch
von 40 % Wasser mit 6o °/o Aceton, das mit Salzsäure o,i normal gemacht worden war,
extrahiert. Die Berührungszeiten betrugen 50 Minuten. Die Volumina der reichen
Auszüge und die annähernden Prozentgehalte der reichen Extraktfraktionen an adsorbiertenAktivitätenwaren
i. 250 ccm und 50 %, 2. 300 ccm und 65 °%, 3- 270 ccm und 50 °/o. (Diese
Versuche wurden nicht unter Einhaltung optimaler Bedingungen durchgeführt.) Beispiel
8 In einer Glaskolonne (lichte Weite 2,54 bis 4,57 cm) wurden ioo ccm Amin-Formaldehyd-Harz
(Korngröße 2o bis 6o Maschen pro 2,54 cm, PH 8) eingefüllt. 15 1 einer ursprünglich
streptomycinhaltigen Kulturflüssigkeit (PH 7,2) wurden nach vorheriger Entfernung
des Streptomycins geprüft. Hierbei wurden 28oo LLD-aktive Einheiten j e Kubikzentimeter,
d. h. insgesamt 42 # los Aktivitätseinheiten festgestellt. Die Kulturflüssigkeit
wurde in abwärts gerichtetem Strom durch die mit Kunstharz beschickte Kolonne geleitet.
Die Berührungsdauer betrug etwa io Minuten. Hierauf wurde mit 5oo ccm Wasser gewaschen.
Die vereinigten Ausflüsse von Kulturflüssigkeit und Waschwasser zeigten insgesamt
eine Aktivität von etwa
5,2 - Zog Einheiten. Demnach waren etwa
36,8 - zog Aktivitätseinheiten (87,5 °/o) in der Kolonne adsorbiert. Die Kolonne
wurde alsdann mit einem Gemisch von 40 °/o Wasser und 6o 0"', Aceton, das mit Chlorwasserstoffsäure
o,i normal gemacht worden war, extrahiert. Die Berührungszeit betrug etwa 2o Minuten.
Etwa io8o ccm reichen Extrakts wurden gesammelt und geprüft. Die totale Aktivität
des reichen Extrakts betrug etwa 36,7 - Zog LLD-Aktivitätseinheiten, das sind praktisch
Zoo °;!o der adsorbierten wirksamen Substanz. Beispiel 9 4o 1 einer ursprünglich
streptomycinhaltigen Kulturflüssigkeit (pH 6,3) zeigte nach Beseitigung des Streptomycins
insgesamt 325 - Zog LLD-Aktivitätseinheiten. Dies entspricht der Aktivität von etwa
29,6 mg von Vitamin B12. Der Flüssigkeit wurden 4,34 mg radioaktives Vitamin B12
zugesetzt. Diese Flüssigkeit wurde alsdann mit Hilfe von 400 ccm Phenol-Formaldehyd-Harz
der Adsorptionsbehandlung und nachfolgender Extraktion im Sinne des Beispiels 2
unterworfen. Die reichen Extraktfraktionen wurden miteinander vereinigt, auf PH
7 bis 8 eingestellt, konzentriert und mit Kaliumcyanid behandelt, um vorhandene
Vitamin-B12 ähnliche Verbindungen in Vitamin B12 überzuführen. Ein Teil der so erhaltenen
Lösung wurde einem Reinigungsverfahren unterworfen, um ein kristallines Produkt
herzustellen. Erhalten wurden Z4,8 mg mit etwa 15 °/o Wassergehalt. Das Produkt
bestand zu 95 bis Zoo °/o aus reinem Vitamin B12 auf anhydrischer Basis. Umsetzungen
der Radioaktivität zeigten die Wiedergewinnung von etwa 36,6 °j, (das Äquivalent
von etwa Z,59 mg des zugesetzten radioaktiven Vitamins B12). Der Rest des kristallinen
Produkts (etwa i1 mg wasserfrei) wurde auf diese Weise von den LLD-aktiven Substanzen,
die in der Ausgangskulturflüssigkeit vorhanden waren, getrennt. Die Behandlung von
Vitamin B12 und ähnlich wirkenden Stoffen mit Cyanionen ist nicht Gegenstand des
vorliegenden Patentes.