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Verfahren zur Herstellung. von Co-Carboxylase Die Herstellung reiner
Co-Carboxylase ist bisher nicht gelungen. Zur Anreicherung dieses in der Hefe enthaltenen
Co-Ferinents hat man vorgeschlagen, den Wirkstoff aus Kochsäften von Hefen, z. B.
mit Bleiacetat und Phosphorwolframsäure, zu fällen. Man hat auch bereits solche
Kochsäfte mit Bariumacetat und 5o o/oigem Alkohol gefällt, wobei der Wirkstoff zusammen
mit Begleitstoffen als Bariumsalz niedergeschlagen wurde. Man gelangte so zu Präparaten,
die bei einer Ausbeute von io 1/o etwa 5 % wirksame Substanz enthielten.
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Es wurde gefunden, daß die Reindarstelhing von Co-Carboxylase, ausgehend
von Kochsaft 'aus frischer Hefe, durch Kombination dreier Maßnahmen gelingt: i.
die an sich bekannte Fällung des Co-Enzyms mit löslichen Erdalkalimetallsalzen in
Gegenwart wäßriger organischer Löseinittel, 2. Fällung in saurer Lösung mit organischen
Lösungsmitteln, 3. eine Adsorption des Wirkstoffs an die üblichen Adsorbentien mit
anschließender Elution.
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Die Reihenfolge dieser Maßnahmen ist nicht entscheidend. Zweckmäßig
führt inari sie in der obigen Reihenfolge aus. Vor, zwischen und hinter diese Maßnahmen
können weitere für Co-Carboxylase übliche Reinigungsstufen eingeschaltet werden.
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Bei der Herstellung des Kochsaftes aus Frischhefe ist darauf zu achten,
daß der Kochsaft bald mit einem organischen Lösungsmittel versetzt wird. Es wird
vorteilhaft nur kurz aufgekocht.
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Die Fallung mit Erdalkalimetallsalzen erfolgt in bekannter Weise,
zweckmäßig unter Verwendung von löslichen Bariumsalzen, wie Bariumacetat und Bariumchlorid
in wäßrigalkoholischer Lösung. Vorteilhaft wird die Fällung bei schwach alkalischer
Reaktion durchgeführt.
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Die Fällung in saurer Lösung kann z. B. mit Äthanol, Alethanol oder
Aceton vorgenommen
werden. Die Lösung ist vorteilhaft schwach kongosauer.
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Zur Adsorption des Wirkstoffes bedient man sich vorzugsweise der Bleicherdepräparate,
wie sie z. B. unter dem Namen I-' rrinlconit und Clarit im Handel sind. Auch l@ulüe
iäßt sich, alleruings mit etwas sciiieciiterem Ergebnis, verwenden.
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Zur Elution bedient man sich zweckmäßig wäßriger Amine, wie Pyridin.
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Zur weiteren Anreicherung der Co-Carboxylase kann man entweder die
vorgenannten Maßnahmen wiederholen oder aber den Wirkstoff selektiv, z. B. mit Phosphorwolframsäure
oder einem Überschuß an Äther oder Alkoholäther, ausfällen bzw. die Ballaststoffe
durch Ausfällen mit Pikrolonsäure, Pikrinsäure und Bariumsalzen in neutraler Lösung
abtrennen.
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Nach diesem Verfahren erhält man das Hydrochlorid der Co-Carboxylase
in Form von Nadeln, die bei a4.4° schmelzen. Die freie Base besitzt nach der Analyse
die Formel C,_ HIA N4 S P= und ist antineuritisch etwa halb so wirksam wie das Vitamin
B1, von dem sie sich chemisch nur durch ihren Gehalt an Phosphorsäure unterscheidet.
Auf i Molekül Vitamin BI enthält das Co-Enzym zwei Atome P, wovon das eine durch
vorsichtige Hydrolvse in Form von HJ O4 04 abspaltbar ist; dailei entsteht ein Mono-Pliosphorsäureester,
der als Hydrochlorid in schönen farblosen Tafeln kristallisiert. Trockenhefe, die
durch alkalische Auswaschung ihr Gärvermögen verloren hat, wird durch Zusatz der
beschriebenen Co-Carboxylase zur Vergärung von Brenztraubensäure befähigt. Vitamin
B1 ist dazu nicht in der Lage. Beispiel io kg abgepreßte Bierhefe der Löwenbräu-Brauerei
München werden portionsweise unter gutem Rühren in io 1 kochendes Wasser eingetragen
und das Gemisch möglichst schnell zum Aufkochen gebracht. Die Erhitzungsdauer bis
zum Aufkochen der Hefesuspension soll nach Möglichkeit nicht mehr als i o Minuten
betragen. Hierauf wird zwecknläßig durch Einhängen einer Kühlschlange in das Erhitzungsgefäß
die Abkochung möglichst schnell auf Zimmertemperatur abgekühlt und der Hefeschlamm
abzentrifugiert. Der auf diese Weise erhaltene Hefekochsaft (i3 1) wird mit S bis
io 1 vergälltem möglichst ioo o/oigem Alkohol versetzt und der dabei ausfallende
Niederschlag durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt. Man kann übrigens
auch den Alkohol bereits vor den- Abzentrifugieren des Hefeschlammes zusetzen, doch
erniedrigen sich dann die Ausbetttcn an wirksamer Substanz etwas. Die alkoholische,
vorn Niederschlag befreite Lösung wird nunmehr durch Zusatz von to ti-Natronlauge
auf pll - S gebracht, wozu im vorliegenden -Fall 35 ccm erforderlich sind. Außerdem
wird eine aus ioo g Lariumacetat und aoo ccm Wasser hergestellte Lösung hinzugeriigt
und das Ganze nach gutem Durchrühern Tiber 'Nacht stehengelassen. Am folgenden Tag
wird der ausgeschiedene Niederschlag, der die wirksame Substanz enthält, abgetrennt,
was zweckmäßig durch Zentrifugieren erfolgt, und aus dem Sediment durch aufeinanderfolgende
Zugabe von 45 cctn 5fach n-Salpetersäure und hierauf 45 ccm Mach n-Schwefelsäure
die wirksame Substanz herausgelöst. Das Sediment wird schließlichnoch mit Wasser
nachgewaschen.
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Die vereinigten Eluate zeigen schwach kongosaure Reaktion. Aus ihnen
werden die letzten Reste Barium durch Zugabe von Schwefelsäure quantitativ ausgefällt.
Die vom Bariumsulfat befreite Lösung wird alsdann bei schwach kongosaurer Reaktion
(pii 3) mit d. Teilen ioo °/oigem denaturiertem Alkohol gefällt und der Niederschlag
wiederum abzentrifugiert. Hierauf wird der Niederschlag in ioo ccm Wasser gelöst
und erneut mit 5 Teilen Methanol gefällt.
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Nach vorsichtigem Trocknen im Vakuum erhält man auf diese Weise 15
g einer Substanz (Fraktion I), die etwa 6o ofo der Wirksamkeit des obigen Hefekochsaftes
besitzt. Diese Ausbeute läßt sich bei raschem und sorgfältigem Arbeiten sogar bis
auf go o/o steigern.
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Die obigen 15 g (Fraktion I) werden nunmehr in :20o bis
300 ccm. Wasser gelöst und der wirksame Anteil dreimal an je 3 g Frankonit
adsorbiert, wobei bis zu 9o 0[o des Wirkstoffes an das Adsorbens gebunden werden.
An Stelle von Frankonit kann auch Clarit oder ein ähnlich wirkendes Adsorbens 'verwendet
werden.
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Aus dem beladenen Adsorbens eluiert man nunmehr die wirksame Substanz
durch kurzes Aufkochen mit 3o bis q.o ccm eines 30 ojoigen wäßrigen Pyridins. Es
ist hier besonders darauf zu achten, daß die Erhitzungsdauer möglichst .kurz bemessen
ist, im vorliegenden Fall nicht a Minuten überschreitet, und daß hinterher sofort
auf Raumtemperatur abgekühlt wird. Nach drei- bis viermaliger Elution des Adsorbates
in der oben beschriebenen Weise werden die vereinigten Eluate im Vakuum auf ein
Volumen von 3o bis 4o ccm eingeengt und durch Zugabe von verdünnter Salpetersäure
auf einem Säuregehalt von 1J2 ti-Salpetersäure gebracht und mit io Teilen Methanol
und 2,5 Teilen Äther gefällt. Der ausfallende Niederschlag ist wenig wirksam.
Das Filtrat wird zur @usfillung der Hauptmenge
des Wirkstoffes
mit weiteren io Teilen Äther versetzt und der hierbei sich ausscheidende Niederschlag
(Fraktion II), in dem über 70 °f, der Wirksamkeit der Fraktion I enthalten sind,
abgetrennt. Der Reinheitsgrad der Fraktion II ist bis zu dieser Verfahrensstufe
bereits um das 16fache erhöht.
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Fraktion II wird nunmehr wiederum in 4.o ccm Wasser gelöst, mit Essigsäure
schwach angesäuert und so lange zur Entfernung weiterer Ballaststoffe mit einer
Pikrolonsäurelösung versetzt, bis nichts mehr ausfällt, wozu etwa aoo fing erforderlich
sind. Man kann auch an Stelle der Pikrolonsäure Pikrinsäure verwenden. Das Filtrat
vom Pikrolonsäureniederschlag wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Alkoholäther
versetzt, wodurch die wirksame Substanz ausgefällt wird, während zurückbleibende
Reste überschüssiger Pikrolonsäure in Lösung bleiben. Der Niederschlag wird wiederum
durch Abzentrifugieren abgetrennt (Fraktion III). Er enthält So °/o der Substanz
der Fraktion Il. Der Reinheitsgrad ist inzwischen auf das Doppelte gestiegen.
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Fraktion III wird nunmehr in wenig Wasser gelöst und mit Barytlösung
neutralisiert. Nach dein Abtrennen des weniger wirksamen Niederschlages wird das
Barium durch Zusatz von Schwefelsäure entfernt. Aus dem bariumfreien Filtrat kann
man die wirksame Substanz nochmals durch Zusatz von Alkoholäther ausfällen oder
aber die noch verbliebenen unwirksamen Ballaststoffe sofort durch Zugabe von Silbernitratlösung
bei einem pH von 4.,5 niederschlagen. Nach Abtrennen der ausgefällten Verunreinigungen,
die im ultravioletten Licht eine charakteristisch bläulichweiße Fluoreszenz zeigen,
wird das den Wirkstoff enthaltende Filtrat durch Einleiten von Schwefelwasserstoff
oder Zugabe von Salzsäure von gelöstem Silber befreit und das Filtrat nach dem Eindampfen
im Vakuum durch Zugabe von Salzsäure auf ein Volumen von .4o bis 5o ccm und einen
Salzsäuregehalt von etwa 3i12 °jo gebracht.
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Diese Lösung wird nunmehr mit Phosphorwolframsäure gefällt und der
dabei entstehende Niederschlag mit Alkohol und Äther aufgenommen. Aus der Lösung
scheidet sich nunmehr der Wirkstoff in kristallisierter Form aus (Fraktion IV).
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Die Ausbeute beträgt etwa 7o bis So fing und entspricht 15 °f, der
Wirksamkeit des ursprünglichen Kochsaftes. Das Kristallisat kann aus salzsäurehaltigem
Wasser finit Alkohol (oder Aceton usw.) umkristallisiert werden. Es schmilzt in
reinem Zustand bei a44° unter Zersetzen und zeigt die im vorstehenden gekennzeichneten
chemischen und physiologischen Eigenschaften. Die Substanz ist in Wasser leicht
löslich, unlöslich in organischen Lösungsmitteln; sie ist optisch inaktiv.