DE2648284C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Leurosin und Vinblastin gegebenenfalls in Form ihrer Säureadditionssalze aus den aus Pflanzen der Familie Apo­ cynaceae, vor allem aus der Pflanze Catharantus roseus G. Don bzw. Vinca rosea L. durch Extraktion gewonnen und angereicherten rohen Gemischen von Diindolalkaloiden. Bekanntlich zeigen die Vincaalkaloide Leurosin, Vinbla­ stin und Vincristin zytostatische Eigenschaften und wer­ den in der Therapie in immer steigendem Maß als zyto­ statische Mittel verwendet. Deshalb ist es eine wichtige Aufgabe der Forschung, immer wirksamere Methoden zur Ge­ winnung und Isolierung dieser Alkaloide zu erarbeiten, vgl. US-PS 30 97 137 und 32 05 220 sowie HU-PS 1 53 200 und 1 54 715. Es ist charakteristisch für alle in den zi­ tierten Patentschriften beschriebenen Verfahren, daß sämt­ liche in dem aus der Pflanze gewonnen Extrakt anwesen­ den etwa 80 Indolalkaloide nach verschiedenen Phasenwech­ seln durch Adsorptionschromatographie voneinander getrennt werden. Demgegenüber wird in der HU-PS 1 60 967 und der entsprechenden AT-PS 3 13 485 ein Verfahren beschrieben, bei dem aus dem Gemisch der aus dem Extrakt durch Entfer­ nen der begleitenden Verunreinigungen gewonnenen Indolal­ kaloide die drei Diindolalkaloide Leurosin, Vinblastin und Vincristin in Form ihrer Säureadditionssalze, vor­ teilhaft der Sulfate abgetrennt, bzw. bis etwa 70 bis 80% Diindolalkaloidgehalt angereichert werden können, so daß man nur noch dieses Gemisch der Säureadditions­ salze der angereicherten drei Diindolalkaloide durch Säulenchromatographie voneinander zu trennen hat.

In therapeutischer Hinsicht ist das Vincristin das am meisten bevorzugte zytostatische Mittel. In der HU-PS 1 65 599 und der entsprechenden AT-PS 3 26 839 wurde ein Verfahren zur halbsynthetischen Herstellung von Vincristin durch selektive Oxidation von Vinblastin beschrieben. Durch diese Möglichkeit wurde die praktische Bedeutung des in der Therapie auch an sich verwendbaren Vinblastins noch größer, da jetzt diese Substanz auch als Ausgangs­ substanz für die Halbsynthese von Vincristin verwendet werden konnte; um so mehr, als aus der Pflanze Vinca ro­ sea etwa zehnmal mehr Vinblastin als Vincristin gewonnen werden kann und dieses Vinblastin nunmehr in dieser Wei­ se in sehr hoher Ausbeute in das als sehr wirksames zy­ tostatisches Mittel Vincristin umgewandelt werden kann.

Auch die praktische Bedeutung von Leurosin hat in der letzten Zeit stark zugenommen, da gefunden wurde, daß diese Substanz durch Oxidation in eine, in der Literatur bis dahin nicht beschriebene neue Verbindung, das eben­ falls zytostatisch wirkende N-Formyl-leurosin, umgewan­ delt werden kann. Diese Verbindung ist besonders deshalb von großer Bedeutung, weil sie auf zahlreiche maligne Erkrankungen (z. B. Harding-Passey Melanom, VX-Epithel­ carcinom von Hasen, induziertes und dann transplantiertes Sarcom) hemmend wirkt, die mit den bisher bekannten zy­ tostatischen Mitteln kaum oder gar nicht beeinflußt wer­ den konnten, vgl. HU-PS 1 65 986 und entsprechende AT-PS 3 32 566.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein einfacheres und wirksameres Verfahren zur Trennung des oben beschrie­ benen Gemisches der Säureadditionssalze der Diindol­ alkaloide bereitzustellen, bei welchem man Vinblastin ohne Anwendung von Adsorptionschromatographie in so ho­ her Reinheit erhält, daß es unmittelbar zur Herstellung von Vincristin durch selektive Oxidation eingesetzt wer­ den kann, wobei neben dem Vinblastin auch die übrigen Diindolalkaloide isoliert werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit dem im Patent­ anspruch 1 angegebenen Verfahren zur Trennung von Leu­ rosin und Vinblastin aus angereicherten rohen Gemischen von Diindolalkaloiden gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltun­ gen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erhält man etwa 90 bis 95% des im Gemisch der rohen Diindolalkaloid­ sulfate anwesenden Leurosins in Form der freien Base, die abfiltriert wird. Aus der mit Phosporsäure angesäuerten, wäßrigen Phase, die die übrigen extrahierten Diindolalkaloid-Ba­ sen enthält, läßt sich das Vinblastin mit Dichlormethan extrahieren und so in die organische Phase bringen, wäh­ rend die übrigen Diindolalkaloide in der wäßrigen Phase bleiben.

Das Verfahren wird zweckmäßigerweise so durchgeführt, daß man das als Ausgangsmaterial dienende Gemisch der Sulfate der Diindolalkaloide in der 3 bis 10fachen, vor­ teilhaft 4 bis 8fachen Menge Aceton oder eines niederen aliphatischen Alkohols, wie Methanol, Ethanol, Isopro­ panol oder n-Propanol bei 0 bis 50°C, vorzugsweise Raumtemperatur löst und dann die Lösung mit einem gerin­ gen Überschuß (auf das Alkaloid-Salzgemisch berechnet) einer organischen Base, wie Monomethylamin, Diethylamin oder Pyridin, versetzt. Von den in dieser Weise freige­ setzten Diindolalkaloid-Basen scheidet sich nun die Leu­ rosin-Base bei 0 bis 25°C aus; diese Ausscheidung kann durch Abkühlen der Lösung auf 0°C vervollständigt werden. Das ausgeschiedene Leurosin wird abfiltriert, mit dem gleichen, ebenfalls gekühlten Lösungsmittel gewaschen, getrocknet und gewünschtenfalls in an sich bekannter Weise, z. B. durch Umkristallisieren gereinigt. Die so erhaltene Leurosin-Base kann gewünschtenfalls in ein Säureadditionssalz, zweckmäßig in das Sulfat übergeführt werden. Zu diesem Zweck wird z. B. eine ethanolische Lösung der Base mit einer 0,5 vol.-%igen Lösung von Schwefelsäure in absolutem Ethanol bis etwa pH = 4 ver­ setzt.

Die nach dem Abscheiden der Leurosin-Base erhaltene Mut­ terlauge wird dann unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft. Der Verdampfungsrückstand wird dann in Benzol gelöst. Dabei scheidet sich das Sulfat der zum Freiset­ zen der Diindolalkaloide verwendeten organischen Base aus der Lösung ab und wird abfiltriert. Das Filtrat wird mit einer wäßrigen Phosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 4 ± 0,1 wiederholt extrahiert, die sauren wäßrigen Ex­ trakte werden vereinigt und mit Phosphorsäure auf pH 4,0 ± 0,1 eingestellt; die so erhaltene wäßrige Lösung wird mit Dichlormethan wiederholt extrahiert. Die orga­ nischen Extrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft. Als Verdampfungsrückstand wird Vinblastin erhalten, das dann gewünschtenfalls in ein Säureadditionssalz, vorteilhaft in das Sulfat überge­ führt werden kann. Das so erhaltene Vinblastinsulfat ist praktisch rein und kann ohne weitere Reinigung als Aus­ gangssubstanz für die Herstellung von Vincristin eingesetzt werden.

Beispiel

50 g rohes Diindolalkaloidsulfat-Gemisch wurden bei Raumtemperatur in 300 ml Methanol gelöst; dann wurden unter Rühren 13 ml Diethylamin zugesetzt. Die Lösung wurde bei 0°C eine Stunde stehen gelassen; während die­ ser Zeit kristallisierte die rohe Leurosin-Base aus der Lösung. Die ausgeschiedenen Kristalle wurden abfiltriert, mit wenig Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es wurden 6,4 g rohe Leurosin-Base erhalten, entsprechend 90 bis 95% des gesamten Leurosingehalts des als Aus­ gangsmaterial eingesetzten Diindolalkaloidsulfat-Gemisches.

Das nach dem Abfiltrieren der Leurosin-Base erhaltene Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne ein­ gedampft und der Rückstand in 2500 ml Benzol gelöst. Da­ bei schied sich das Diethylaminsulfat in kristalliner Form aus. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit wenig Benzol gewaschen und konnten zur Regenerierung des Di­ ethylamins verwendet werden.

Das benzolische Filtrat wurde dreimal mit jeweils 2500 ml wäßriger Phosphat-Pufferlösung vom pH 4,0 ± 0,1 extrahiert. (Zur Herstellung der Phosphat-Pufferlösung wurden 10 Gew.-% wasserfreies Natriumdihydrogenphosphat in destillier­ tem Wasser gelöst und die erhaltene Lösung mit n-Phos­ phorsäurelösung auf den angegebenen pH-Wert eingestellt.)

Die Extrakte wurden vereinigt, mit weiterer n-Phosphor­ säurelösung wieder auf pH 4,0 ± 0,1 eingestellt und dann viermal mit jeweils 2500 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit wasserfreiem Natrium­ sulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trock­ ne eingedampft. Als Rückstand wurden 25 g Vinblastin er­ halten, das praktisch rein war und ohne weitere Reinigung zur Halbsynthese von Vincristin eingesetzt werden konnte. Zur Herstellung des Sulfatsalzes wurden die erhaltenen 25 g Vinblastin-Base in 80 ml Methanol gelöst und die Lösung mit 0,3 vol.-%iger ethanolischer Schwefelsäure­ lösung auf pH = 5 eingestellt und stehen gelassen, wo­ bei sich das Vinblastinsulfat kristallin ausschied.

Claims (3)

1. Verfahren zur Isolierung von Leurosin und Vinblastin aus angereicherten rohen Gemischen von Diindolalkaloiden, dadurch gekennzeichnet, daß man das Gemisch der Sulfate der Diindolalkaloide in einem Alkohol oder in Aceton löst, die Lösung mit einer organischen Base versetzt, die sich ausscheidende Leurosin-Base abtrennt, die nach der Abtrennung der Leurosin-Base zurückbleibende Mutterlauge zur Trockne verdampft, den Verdampfungsrück­ stand mit Benzol extrahiert, die erhaltene organische Lösung mit einer wäßrigen Phosphat-Pufferlösung vom pH- Wert 4,0 ± 0,1 extrahiert, die abgetrennte wäßrige Phase mit Phosphorsäure auf pH 4,0 ± 0,1 ansäuert, dann mit Dichlormethan extrahiert, die Phasen trennt und aus der organischen Phase die Vinblastin-Base isoliert und ge­ wünschtenfalls die in der Form von Basen isolierten Di­ indolalkaloide in Säureadditionssalze überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als Alkohol Methanol oder Etha­ nol verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als organische Base Diethyl­ amin verwendet.