PL103507B1 - Sposob wydzielania dwuindoloalkaloidow - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wydzielania uzyskiwanych z roslin rodziny Apocynaceae i wzbogaco¬ nych przez ekstrakcje dwuindoloalkaloidów, zwlaszcza uzyskiwanych z rosliny Catbaranthus roseus G.Don (ewentualnie Vinca rosea L.) dwóch dwuindoloalkaloidów, Vinleurozyny (dalej zwanej skrócona zwykla nazwa leurozyny i vincaleukoblastiny (dalej vinblastiny), ewentualnie ich soli addycyjnych z kwasem, zwlaszcza siarcza¬ nów tych alkaloidów.

Jak wiadomo, vincalalkaloidy: leurozyna, vinblasina i vinkristina maja wlasciwosci cytostatyczne i stosuje sie je coraz czesciej w terapii jako srodki cytostatyczne. Z tej przyczyny waznym zadaniem badawczym jest poszukiwanie coraz bardziej skutecznych metod pozyskiwania tych alkaloidów (por. opisy patentowe St. Zjedn.

Am. nr 3097137 i 3205220, oraz wegierskie opisy patentowe nr 153200 i 154715. Charakterystyczna cecha sposobów opisanych w cytowanych opisach patentowych jest to, ze caly ekstrakt uzyskany z roslin, zawierajacy okolo 80 indoloalkaloidów po róznych przemianach faz rozdziela sie chromatografia adsorbcyjna.

W przeciwienstwie do tego sposób opisany w wegierskim opisie patentowym nr 160967 (austriacki opis patentowy nr 313485) polega na wydzieleniu z indoloalkaloidów, uzyskanych z ekstraktu przez usuniecie zanieczyszczen, trzech dwuindoloalkaloidów, leurozyny, vinblastiny i vinkristiny w postaci ich soli addycyjnych, korzystnie siarczanów, ewentualnie na wzbogaceniu zawartosci dwuindoloalkaloidów do okolo 70-80%, tak, ze z mieszaniny soli addycyjnych mozna oddzielic od siebie wzbogacone trzy dwuindoloalkaloidy metoda chroma¬ tografii kolumnowej. Z tych trzech wymienionych dwuindoloalkaloidów najbardziej korzystnym srodkiem z tera¬ peutycznego punktu widzenia jest vinkristina.

W wegierskim opisie patentowym nr 165599 (austriacki opis patentowy nr 326839) opisano sposób pólsyntetycznego wytwarzania vincristiny przez selektywne utlenianie vinblastiny.Mozliwosc ta podnosi znacze¬ nie praktyczne vinblastiny i tak samej przez sie stosowanej w terapii, poniewaz substancja ta moze byc stosowana obecnie równiez jako substancja wyjsciowa do pólsyntezy vinkristiny. Co wiecej roslina Vinca rosca zawiera okolo dziesieciokrotnie wiecej vinblastiny niz vincristiny i te vinblastine mozna tym sposobem przetwarzac z bardzo wysoka wydajnoscia na bardzo skuteczny srodek cytostatyczny - znana vincristine.2 103 507 W ostatnich czasach wzroslo równiez znaczenie praktyczne leurozyny, poniewaz stwierdzono, ze substan¬ cje ta przez utlenienie mozna przetworzyc na nowy, dotychczas nie opisany w literaturze zwiazek N-formyloleu- rozyne, który równiez ma dzialanie cytostatyczne. Produkt ten ma szczególnie duze znaczenie z tej przyczyny, ze dziala hamujaco w licznych przypadkach chorób z majaczeniem (np. Harding-Passey Melenom, VX-Epithelcar- cinom zajecy, indukowany i nastepnie transplantowany miesak), na które wcale lub prawie wcale nie dzialaly znane srodki cytostatyczne (por.wegierski opis patentowy nr 165986, austriacki opis patentowy nr 322566).

Celem wynalazku jest opracowanie prostego i skutecznego sposobu wydzielania wymienionej wyzej mieszaniny soli addycyjnych dwuindoloalkaloidów, w którym vinblastine bez uzycia chromatografii adsorbcyjnej moznaby otrzymac o tak wysokiej czystosci, ze otrzymany produkt nadawalby sie bezposrednio do wytwarzania vincristiny pfzez selektywne utlenianie, przy czym obok vinblastiny moznaby otrzymac równiez pozostale dwuindolóaTRaloidy.

Stwierdzono, ze leurozyne mozna wydzielic w prosty sposób i z wysoka wydajnoscia z mieszaniny surowych soli addycyjnych, gdy do roztworu wymienionych soli dla uwolnienia dwuindoloalkaloidów doda sie zasade organiczna i nastepnie ochlodzi mieszanine, wydzielajac tym sposobem z roztworu okolo 90-95% zawartosci leurozyny w postaci wolnej zasady. Surowa leurozyne mozna w ten sposób oddzielic przez saczenie.

Gdy przesacz odparuje sie do suchej pozostalosci, mozna ekstrahowac z niej pozostale zasady dwuindolo¬ alkaloidów za pomoca cieklego weglowodoru, przy czym pozostanie tylko odpowiednia sól addycyjna z kwasem, zasady uzytej do uwolnienia dwuindoloalkaloidu. Z tak uzyskanego roztworu organicznego mozna nastepnie asady dwuindoloalkaloidów przeprowadzic do warstwy wodnej za pomoca wodnego roztworu buforu fosforano¬ wego o wartosci pH = 3,7 — 4,3, a z niej, po zakwaszeniu warstwy wodnej kwasem fosforowym do wartosci pH = 3,5 — 4,1 vinblastine mozna ekstrahowac za pomoca chlorowanego weglowodoru i tak wprowadzic do warstwy organicznej, podczas gdy pozostale dwuindoloalkaloidy pozostana w warstwie wodnej.

Sposób wedlug wynalazku wydzielania dwuindoloalkaloidów ze wzbogaconej ich mieszaniny polega na tym, ze mieszanine soli addycyjnych z kwasem, zwlaszcza siarczanów dwuindoloalkaloidów rozpuszcza sie w rozpuszczalniku mieszajacym sie w nieograniczonym lub ograniczony,n zakresie z woda, korzystnie w alkoho¬ lu, do roztworu dodaje sie zasade organiczna, wydzielajaca sie zasade leurozyny oddziela sie, lug macierzysty powstaly po oddzieleniu zasady leurozyny odparowuje sie do suchej pozostalosci, z tej pozostalosci ekstr?huje sie dwuindoloalkaloidy za pomoca cieklego weglowodoru, korzystnie benzeu, otrzymany roztwór organiczny ekstrahuje sie wodnym roztworem buforu fosforanowego o wartosci pH 3,7 — 4,3, korzystnie 4,0 ±0,1, wydzielona warstwe wodna zakwasza sie kwasem fosforowym do wartosci pH = 3,5 — 4,1, korzystnie 4,0 ± 0,1, nastepnie ekstrahuje chlorowanym weglowodorem, korzystnie dwuchlorometanem, warstwy oddziela sie i z warstwy organicznej oddziela vinblastine w postaci zasady, a ewentualnie wydzielone w postaci zasad dwuindo¬ loalkaloidy przetwarza na sole addycyjne z kwasem.

Sposób wedlug wynalazku korzystnie wykonuje sie tak, ze sluzaca jako substancje wyjsciowe mieszanine soli addycyjnych dwuindoloalkaloidów, z kwasem rozpuszcza sie w 3-10 krotnej, korzystnie 4-8 krotnej ilosci organicznego rozpuszczalnika np. acetonu lub nizszego alkoholu alifatycznego, np. metanolu, etanolu, izopropa- nolu lub n-propanolu w temperaturze 0—50°C, korzystnie w temperaturze pokojowej i nastepnie do roztworu dodaje z nieznacznym nadmiarem (obliczajac w stosunku do mieszaniny alkaloid — sól) zasade organiczna, np. jednometyloamine, dwuetyloamine lub pirydyne. Z uwolnionych w ten sposób zasad dwuindoloalkaloidów zasade leurozyny wydziela sie nastepnie w temperaturze 0—25°C. Wydzielanie to moze byc w pelni dokonane przez ochlodzenie roztworu do temperatury 0°C. Wydzielona leurozyne odsacza sie myje tym samym, równiez ochlodzonym rozpuszczalnikiem, suszy i ewentualnie oczyszcza w znany sposób, np. przez przekrystalizowanie.

Tak otrzymana zasade leurozyny mozna ewentualnie przeksztalcic na sól addycyjna z kwasem, korzystnie siarczan. W tym celu np. do roztworu etanolowego zasady dodaje sie 0,5% objetosciowych stezonego roztworu kwasu siarkowego w absolutnym etanolu, do wartosci pH okolo 4. Otrzymany po oddzieleniu zasady leurozyny lug macierzysty odparowuje sie do suchej pozostalosci pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc po odparowaniu rozpuszcza sie nastepnie w rozpuszczalniku organicznym, np. w jednym z weglowodorów szeregu benzenowego np. toluenie, ksylenie lub korzystnie w benzenie. Wydziela sie przy tym z roztworu siarczan uzyty do uwolnienia dwuindoloalkaloidów zasady organicznej, który odsacza sie. Przesacz ekstrahuje sie kilkakrotnie wodnym roztworem buforu fosforanowego o wartosci pH = 3,7-4,3, korzystnie 4,0 ±0,1, kwasne ekstrakty wodne laczy sie i ich wartosc pH ustawia na 3,5 — 4,1, korzystnie 4,0 ± 0,1, za pomoca kwasu fosforowego. Tak otrzymany kwasny roztwór wodny ekstrahuje sie kilkakrotnie chlorowanym weglowodorem, korzystnie dwuchlorometanem. Ekstrakty organiczne laczy sie, suszy nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowuje do suchej pozostalosci pod zmniejszonym cisnieniem. Jako pozostalosc po odparowaniu uzyskuje sie vinblastine, która ewentualnie mozna przeksztalcic na sól addycyjna z kwasem, korzystnie siarczan. Takotrzymany siarczan vinblastiny jest praktycznie czysty i moze bez dalszego oczyszczania byc stosowany jako substancja wyjsciowa do wytwarzania vinkristiny.103 507 3 Przyklad. 50 g surowej mieszaniny siarczanów dwuindoloalkaloidów rozpuszcza sie w temperaturze pokojowej w 300 ml metanolu, a nastepnie dodaje mieszajac 13 ml dwuetyloaminy. Roztwór odstawia sie na godzine do temperatury 0°C. W tym czasie z roztworu krystalizuje surowa zasada leurozyny. Wytracone krysztaly odsacza sie, myje niewielka iloscia metanolu i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie 6,4 g surowej zasady leurozyny, co stanowi 90-95% calej zawartosci leurozyny w mieszaninie siarczanów dwuindolo¬ alkaloidów uzytych jako substancja wyjsciowa. Otrzymana w ten sposób surowa zasade leurozyny mozna oczyscic przez przekrystalizowanie i ewentualnie w znany sposób przeksztalcic na siarczanowa sól addycyjna.

Po odsaczeniu zasady leurozyny, przesacz odparowuje sie do suchej pozostalosci pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc rozpuszcza w 2500 ml benzenu. Siarczan dwuetyloaminy wydziela sie przy tym w postaci krystalicznej. Krysztaly odsacza sie i myje niewielka iloscia benzenu. Moga one sluzyc do regeneracji dwuetyloaminy.

Benzenowy przesacz trzykrotnie ekstrahuje sie porcjami po 2500 ml wodnego roztworu buforu fosforano¬ wego o wartosci pH = 4,0 ± 0,1. (Do wytworzenia roztworu buforu fosforanowego rozpuszcza sie 10% wago¬ wych bezwodnego fosforanu dwuwodorosodowego w wodzie destylowanej i ustawia wartosc pH otrzymanego roztworu na podana wielkosc za pomoca roztworu kwasu N-fosforowego.

Oddzielone fazy wodne laczy sie i ponownie ustawia wartosc pH = 4,0 ± 0,1 roztworem kwasu N-fosforo¬ wego a nastepnie czterokrotnie ekstrahuje porcjami po 2500 ml dwuchlorometanu. Oddzielone fazy dwuchloro- metanowe laczy sie, suszy nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do suchej pozostalosci. Otrzymuje sie jako pozostalosc 25 g vinblastiny. Produkt ten jest praktycznie czysty i moze bez dalszego oczyszczania byc stosowany jako substancja wyjsciowa do pólsyntezy vincristiny.

Do wytwarzania soli siarczanowej rozpuszcza sie otrzymana zasade vinblastiny (25 g) w 80 ml metanolu, ustawia wartosc pH roztworu na 5,0,3% (objetosciowo) etanolowym roztworem kwasu siarkowego i odstawia, co powoduje wydzielanie sie krystalicznego siarczanu vinblastiny.

Claims (3)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wydzielania dwuindoloalkaloidów ze wzbogaconej ich mieszaniny, znamienny tym, ze mieszanine soli addycyjnych, zwlaszcza siarczanów dwuindoloalkaloidów rozpuszcza sie w rozpuszczalniku mieszajacym sie w nieograniczonym lub ograniczonym zakresie z woda, korzystnie w alkoholu, do roztworu dodaje sie zasade organiczna, taka jak dwuetyloamina, jednometyloamina lub pirydyna, w ilosci równomolowej lub z malym nadmiarem, wydzielajaca sie zasade leurozyny oddziela sie, lug macierzysty powstaly po oddzieleniu zasady leurozyny odparowuje sie do suchej pozostalosci, z tej pozostalosci ekstrahuje sie dwuindolo- alkaloidy za pomoca cieklego weglowodoru, korzystnie benzenu, otrzymany roztwór organiczny ekstrahuje sie wodnym roztworem buforu fosforanowego o wartosci pH 3,7 — 4,3, korzystnie 4,0 ± 0,1, wydzielona warstwe wodna zakwasza sie kwasem fosforowym do wartosci pH = 3,5 — 4,1, korzystnie 4,0 ± 0,1, nastepnie ekstrahuje chlorowanym weglowodorem, korzystnie dwuchlorometanem, warstwy oddziela sie i z warstwy organicznej oddziela sie vinblastine w postaci zasady, a ewentualnie wydzielone w postaci zasad dwuindoloalkaloidy przetwa¬ rza w sole addycyjne z kwasem.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako rozpuszczalnik mieszajacy sie z woda w stopniu nieograniczonym stosuje sie metanol lub etanol.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze oddzielanie zasady leurozyny przeprowadza sie przez dodanie metanolowego roztworu mieszaniny soli siarczanowej dwuindoloalkaloidu z dwuetyloamina.