DE2648284A1 - Verfahren zur trennung von diindolalkaloiden aus ihren angereicherten rohen gemischen - Google Patents

Description

DIt. ING. F. WUESTIIOFF

DR. E. τ. PEOHMANN DR. ING. D. BEHRENS DIPL·. ING. R. GOETZ

PATESTiSWiLTE

8 MÜNCHEN SCH WEIG ERSTHASSE TET-EFON C080) ββ 20 TELEI 5 24 070

TEI-EGKAMME t PHOTEOTPATENT MÜNCHEN

1A-48 666

Beschreibung zu der Patentanmeldung

RICHTER GEDEON VEGYESZETI GYAR RT. 21 Gyömroi u„, Budapest X., Ungarn

betreffend

Verfahren zur Trennung von Diindolalkaloiden aus ihren angereicherten rohen Gemischen

-Z-

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DiG ErfxnduJiG' betrifft ein neues Verfahren zur

der ans Pflanzen der Familie Apocynaceae durch Exti'aktion köwonuenen und ang or ei eher ten .Olindolalkaloide, besonders der aus der PfJuriPie Catharanthus roseua. G«Don /baw» Vinca rosea L»/ gewinnbaren zwei Diindolalkaloido VinJourosin /naoH-teilend mit dem üblichen kürzeren Namen Leurosin be;se.telm»?■ e/ und Vinealeukoblastin /nachstehend S Vinblastln/ b^i.¹. c'-:\r SsUu öadditionssalze, besonders der Sulfate dieser AJI-. ..Ioide·

Bekanntlich iseigen die Vincaalkaloide Leurosin, Vinblastin und Vincristin väytostatisohe Eigenschaften und werden in der Therapie in immer steisendem Masa als zy tos tatische Mittel vorwonriet· Deshalb ist es eine wichtige Aufgabe der Forschung immer wirksamere Methoden Hur Gewinnvmtj dieser Alkaloide auszuarbeiten /vgl« USA- -PateKtsclxriften Wr* 3 097 137 und 3 203 220j ungarische Patcmtschriften IMr. 153 200 und 15*1 715/· Es ist charakteristisch für sämtliche, in den Hitierten Patentschriften beschriebene Verfahren, dass sämtliche in dem aus der Pflanze gewonnenen Extrakt anwesende ötwa 80 Indolalkaloide nach verschiedenen Phaseawechseln durch Adsorptionschroma to^raphie von einander getrennt werden»

Demgegenüber wird in der ungarischen Patentschrift ¥r« 160 967 /OE-PS 313 kS>5/- ein Verfahren beschrieben, nach welchem von den aus dem Extrakt durch Entfernen der begleitenden Verunreinigungen gewonnenen Ihdolalkaloiden die drei Diindolalicaloide, das Leurosin, das Vinblastin und das Vincristin in der Form ihrer Säureadditionssalze j vorteilhaft Sulfate abgetrennt, bzw# bis etwa 70 bis 80 $ Diindolalkaloidgohalt angereichert werden können, so dass man nur mehr dieses Gemisch der Säureadditionssalze der angereicherten drei Diindolalkaloide durch SäuleChromatographie von einander

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23o Februar 1977 P 26 48 28 1Α-48 66#

zu trennen hat_o

Von diesen drei erwähnten Diindolalkaloiden ist vom therapeutischen Gesichtspunkt das Vincristin das am meisten bevorzugte zytostatische Mittel. In der ungarischen Patentschrift Nr. 165 599 (OE-PS 326 839) wurde ein Verfahren zur halbsynthetischen Herstellung von Vincristin durch selektive Oxidation von Vinblastin beschrieben. Durch diese Möglichkeit wurde die praktische Bedeutung des in der Therapie auch an sich verwendbaren Vinblastins noch größer, da jetzt diese Substanz auch als Ausgangsstoff der Halbsynthese von Vincristin verwendet werden konnte; um so mehr, da aus der Pflanze Vinca rosea etwa zehnmal mehr Vinblastin als Vincristin gewonnen werden kann und dieses Vinblastin nunmehr in dieser Weise in sehr hoher Ausbeute in das als sehr wirksames zytostatisches Mittel bekannte Vincristin übergeführt werden kann_o

Auch die praktische Bedeutung von Leurosin hat in der letzten Zeit stark zugenommen, da es erkannt wurde, daß diese Substanz durch Oxidation in eine, in der Literatur bis dahin nicht beschriebene neue Verbindung, in das ebenfalls zytostatisch wirkende N-Formyl-leurosin übergeführt werden kann. Dieses Produkt ist besonders deshalb von großer Bedeutung, weil es auf zahlreiche solche maligne Erkrankungen (zoB. Harding-Passey Melanom, VX-Epithelcarcinom von Hasen, induziertes und dann transplantiertes Sarcom) hemmend wirkt, die mit den bisher bekannten zytostatischen Mitteln kaum oder gar nicht beeinflußt werden konnten (vgl. ungarische Patentschrift Nr. 165 986 - OE-PS 332 566 - )_o

Die Zielsetzung der vorliegenden Erfindung war die Schaffung eines einfacheren und wirksameren Verfahrens zur Trennung des oben beschriebenen Gemisches der Säureadditionssalze der Diindolalkaloide, bei welchem man das Vinblastin ohne Anwendung von Adsorptionschromatographie

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in so hoher Reinheit erhält, dass das erhaltene Produkt unmittelbar zur Herstellxmg von Vinoristin durch selektive Oxydation eingesetzt werden kann, wobei neben dem Vinblastin auch die übrigen Diindolalkaloide isoliert werden können·

Es wurde gefunden, dass das Laurosin aus dem Gemisch der rohen Säureadditionssalze der Diindolalkaloide einfach und in hoher Ausbeute isoliert werden kann, wenn man die Lösung des erwähnten Salzgemisches zur Freisetzung der Diindolalkaloide mit einer organischen Base versetzt und dann das Gemisch abkühlt; in dieser Weise scheidet sich etwa 90 bis 95 # des anwesenden Leurosins in der Form von freier Base aus der Lösung ab» Das rohe Leurosin kann so durch Filtrieren abgetrennt werden; wenn man nun das Filtrat zur Irookne verdampft* dann können aus dem Verdampfungsrückstand die übrigen Diindolalkaloid- \ -Basen mit einem flüssigen Kohlenwasserstoff extrahiert werden, wobei nur das entsprechende Säureadditionssalz der zur Freisetzung der Diiudolalkaloide eingesetzten organischen Base zurückbleibt· Aus der so gewonnenen organischen Lösung können dann die Diindolalkaloid-Basen mit einer wässrigen Phosphat-Pufferlösung von pH sz ■ 3» bis 4,3 in wässrige Phase gebracht werden} aus dieser kann dann das Vinblastin nach dem Ansäuern der wässrigen Phase mit Phosphorsäure bis pH α 3,5 bis b_tl mit ohlorierten Kohlenwasserstoffen extrahiert und ao in die organische Phase gebracht werden, während die übrigen DiindolalkalqJ.iJt in der wässrigen Phase bleiben«

Demgemäss ist die Erfindung ein Verfahren zur Trennung von Diindolalkaloiden aus dem angereicherten Gemisch ihrer Säureadditionssalze, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Gemisoh der Säureadditiona«!

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salze, besonders der Sulfate der Diindolalkaloide in einem mit Wasser unbeschränkt oder beschränkt mischbaren Lösungsmittel, vorteilhaft in einem Alkohol löst, die Lösung mit einer organischen Base versetzt, die sich ausscheidende Leurosin-Base abtrennt, die nach der Abtrennung der Leurosin-Base zurückbleibende Mutterlauge zur Trockne verdampft, aus dem Verdampfungsrückstand die Diindolalkaloide mit einem flüssigen Kohlenwasserstoff, vorteilhaft mit Benzol extrahiert, die erhaltene organische Lösung mit einer wäßrigen Phosphat-Pufferlösung von pH-Wert 3,7 bis 4,3 vorteilhaft 4,0 + 0,1 extrahiert, die abgetrennte wäßrige Phase mit Phosphorsäure auf pH 3,5 bis 4,1, vorteilhaft 4,0 + 0,1 ansäuert, dann mit einem chlorierten Kohlenwasserstoff, vorteilhaft mit Dichlormethan extrahiert, die Phasen trennt und aus der organischen Phase die Yinblastin-Base isoliert und gewünschtenfalls die in der Form von Basen isolierten Diindolalkaloide ±n Säureadditionssalze überführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmäßig derart durchgeführt, daß man das als Ausgangsstoff dienende Gemisch von Säureadditionssalzen der Diindolalkaloide in einer 3-bis 10-fachen, vorteilhaft 4- bis 8-fachen Menge von einem organischen Lösungsmittel, Z₀B₀ von Aceton oder von einem niederen aliphatischen Alkohol, z.B«, von Methanl, Äthanol, Isopropanol oder n-Propanol bei 0 bis 50 C, zweckmäßig bei Raumtemperatur löst und dann die Lösung mit einem geringen Überschuß (auf das Alkaloid-Salzgemisch berechnet) von einer organischen Base, z.B. Monomethylamin, Diäthylamin oder Pyridin versetzte Von den in dieser Weise freigesetzten Diindolalkaloid-Basen scheidet sich nun die Leurosin-Base bei 0° bis 25°C aus; die Ausscheidung des Leurosins kann

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durch Abkühlen der Lösung auf O⁰C vervollständigt werden. Das ausgeschiedene Leurosin wird abfiltriert, mit dem selben, ebenfalls abgekühlten Lösungsmittel gewaschen, getrocknet und gewünschtenfalls in an sich bekannter Weise , Z₀B. durch Umkristallisieren gereinigt. Die so erhaltene Leurosin-Base kann gewünschtenfalls in ein Säureadditionssalz, zweckmäßig in das Sulfat übergeführt werden. Zu diesem Zweck wird z.B. eine äthanolische Lösung der Base mit einer 0,5 vol.-%igen Lösung von Schwefelsäure in absolutem Äthanol bis etwa pH = 4 versetzt«

Die nach dem Abscheiden der Leurosin-Base erhaltene Mutterlauge wird dann unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft_o Der Verdampfungsrückstand wird dann in einem organischen Lösungsmittel, Z₀B. in einem Kohlenwasserstoff der Benzolreihe Z₀B₀ in Toluol, Xylol oder vorteilhaft in Benzol gelöst; dabei scheidet sich das Sulfat der zum Freisetzen der Diindolalkaloide verwendeten organischen Base aus der Lösung und wird abfiltriert. Das FiItrat wird mit einer wäßrigen Phosphat-Pufferlösung vom pH-Wert 3,7 bis 4,3, vorteilhaft 4 + 0,1 wiederholt extrahiert, die sauren wäßrigen Extrakte werden vereinigt und mit einer Säure, vorteilhaft mit Phosphorsäure auf pH 3,5 bis 4,1, vorteilhaft 4,0 +0,1 gestellt und die so erhaltene sauere wäßrige Lösung mit einem chlorierten Kohlenwasserstoff, vorteilhaft mit Dichlormethan wiederholt extrahierte Die organischen Extrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft. Als Verdampfungsrückstand wird Vinblastin erhalten, welches dann gewünschtenfalls in ein Säureadditionssalz, vorteilhaft in das Sulfat übergeführt werden kann. Das so erhaltene Vinblastinsulfat ist praktisch rein und kann ohne weitere Reinigung

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als Ausgangsstoff zur Herstellung von Vincristin eingesetzt werden.,

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das nachstehende Beispiel näher veranschaulicht.

Beispiel

50 g rohes Diindolalkaloidsulfat-Gemisch werden bei Raumtemperatur in"300 ml Methanol gelöst, dann werden unter Rühren 13 ml Diäthylamin zugesetzte Die Lösung wird bei 0°C eine Stunde stehen gelassen; während dieser Zeit kristallisiert die rohe Leurosin-Base aus der Lösung. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit wenig Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknete Es werden 6,4 g rohe Leurosin-Base erhalten; dieses Produkt enthält 90 bis 95 % des gesamten Leurosingehalts des als Ausgangsstoff eingesetzten Diindolalkaloidsulfat-Gemisches.

Die auf obige Weise erhaltene rohe Leurosin-Base kann durch Umkristallisieren gereinigt und gewünschtenfalls auf bekannte Weise in das Sulfat-Additionssalz übergeführt werden. ■'·

Das nach dem Abfiltrieren der Leurosin-Base erhaltene Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 2500 ml Benzol gelöst. Dabei scheidet sich das Diäthylaminsulfat in kristalliner Form aus ο Die Kristalle werden abfiltriert, mit wenig Benzol gewaschen und können zur Regenerierung des Diäthylamins verwendet werden.

Das benzolische Filtrat wird mit je 2500 ml wäßriger Phosphat-Pufferlösung vom pH 4,0 +0,1 dreimal extrahierte (Zur Herstellung der Phosphat-Pufferlösung löst man 10 Gew.-% wasserfreies Natriumdihydrogenphosphat in destilliertem Wasser und stellt die erhaltene Lösung mit N Phosphorsäurelösung auf den angegebenen pH-Wert ein).

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Zur I lor· 3 to.llung des SuIf atsalzos wir;· das orhalteiio

JJaso /25 ß/ In 80 ml Methanol üolöst und die I₁ORUn₁J,- mil. 0,3 VoljS-ißer äthanoliscber Sch\iofelsäuro-J ö si υ iß· auf χϊΐΐ :.: 5 eingestellt und stehon gelassen, wobt>i fsioh das Vxriblas tinsulf afc kristallin ausscbeidot«

Patentansprüche;

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ORIGINAL INSPECTED _cOpY

Claims (1)

1. Dr. In-. F. Wues!hoff 1A-48 666

   P;.'.:. ν. Pedunann - Dr. Ing. D. Behrens 2 0 4 0 I 0

   Dipl. Ing. R. Goetz
   8 Mündien 90, Sdweigerstr.2

   Patentansprüche

   I« Verfahren zur Tvemnmg von Diindolallraloiden aus ihren angereicherten rohen Gemischen_f dadurch ge~ Ιςβηηκοlehnet, dass man das Gemisch der Seiureadditions~ salze, besonders der Sulfate der üiindolalkaloide in einem mit tiTassor unbeschränkt odex· beschränkt mischbaren Lösungsmittel, vorteilhaft in einem Alkohol löst, die Lösung mit einer organischen Base versetzt, die sich ausscheidende Leurosin—Baso abtrennt, die nach der Ab~ trennung der I^eurosin—Base zurückbleibende Mut bor lauge zur Trockne ,verdampft, aus dem Verdanpfungs.T-üo.'cstand die Diindolci^caloide mit einem flüssigen Kohlenwasserstoff, vorteilhaft mit iJenzol e3ctrahiex"t, die erhaltene or,^f;aniaohe Lösung mit einex wässrigen Phosphat-Pufferlösung vom pll- -Wert 3,7 bis ^l*ß₃ vorteilhaft *ί,0 ί 0,1 extrahiert, $ie abgotreniii;o wässrige Phase mit Phosphorseiure auf pH 3» 5 bis ^,1, A^rortoilhäft 4,0 - 0,1 ansäuert, daian mit oinem chlorierten Kohlenwasserstoff, vorteilhaft mit üichlor— methan extrahiert, die Phasen trennt und aus der organischen Phase dio Vinblastin—Base isoliert und gewünschteiifalls die in der Form von Basen isolierten Diindolallcaloide in Säureadditionssalzo überfülirt«

   2· Verfalxren nach Anspruch 1, dadurch gokemis:alohnet,

   Il

   dass man llothanol.oder Äthanol als mit Wasser unbegrenzt mischbares Lösungsmittel verv/endot·

   3» Vorfahren nach Anspruch 1, dadurch ,^elconnsoiqh« net, dass man Pyridin, Monomethylamin oder Diethylamin als organische Base verwendet«

   4« Verfahren nach Anspruch 1, daduxOh gekennzeichnet, dass man die Abtrennung der Lourosin~J3ase durch das Versetzen einer methanolischen Lösung des Gemisches der Sulfatsalze der Diindolallcaloide mit Diethylamin durchführt·

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   ORIGINAL INSPECTED